Summary
该协议描述了一种简单有效的方法，用于在肾囊下移植主动脉瓣叶，以允许研究心脏瓣膜的同种异性。
Abstract
临床上迫切需要在儿童中生长的心脏瓣膜置换术。心脏瓣膜移植被提议为一种新型移植，具有提供能够体细胞生长的耐用心脏瓣膜的潜力，而不需要抗凝治疗。然而，心脏瓣膜移植的免疫生物学仍未被探索，这凸显了动物模型研究这种新型移植的必要性。已经描述了先前用于异位主动脉瓣移植到腹主动脉中的大鼠模型，尽管它们在技术上具有挑战性且成本高昂。为了应对这一挑战，在啮齿动物中开发了肾囊下移植模型，作为研究心脏瓣膜移植免疫生物学的实用且更直接的方法。在该模型中，收获单个主动脉瓣小叶并将其插入肾囊下间隙。肾脏易于接近，移植的组织安全地包含在血管化良好的囊下空间中，并且可以容纳各种组织大小。此外，由于一只大鼠可以提供三个供体主动脉瓣小叶，而单个肾脏可以为移植组织提供多个位点，因此给定研究所需的大鼠更少。这里描述了移植技术，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫学提供了重要的一步。
Introduction
先天性心脏缺陷是人类最常见的先天性残疾，每年每1000名活产儿中就有7名受到影响1。与常规植入各种机械和生物假体瓣膜的成年患者不同，儿科患者目前没有瓣膜置换的良好选择。这些传统的植入物没有在受体儿童中生长的潜力。因此，随着儿童的成长，需要病态的再手术来将心脏瓣膜植入物更换为连续更大的版本，受影响的儿童在其一生中通常需要多达五次或更多的心脏直视手术2，3。研究表明，与年龄较大的儿童相比，婴儿免受干预或死亡的自由度明显较差，60%的心脏瓣膜假体婴儿在初始手术后3年内面临再手术或死亡4.因此，迫切需要提供一种能够在儿科患者中生长和维持功能的心脏瓣膜。
几十年来，提供不断增长的心脏瓣膜置换术的尝试一直集中在组织工程和干细胞上。然而，到目前为止，将这些瓣膜移植到诊所的尝试都没有成功5，6，7，8。为了解决这个问题，心脏瓣膜移植被提议作为一种更具创造性的手术，用于提供具有自我修复和避免血栓形成能力的不断增长的心脏瓣膜置换术。而不是移植整个心脏，只有心脏瓣膜被移植，然后与受者的孩子一起生长，类似于传统的心脏移植或Ross肺签名9，10，11。术后，受者儿童将接受免疫抑制，直到移植的瓣膜可以换成成人大小的机械假体，当不再需要瓣膜的生长时。然而，心脏瓣膜移植移植物的移植生物学仍未被探索。因此，需要动物模型来研究这种新型移植。
先前已经描述了几种大鼠模型将主动脉瓣异位移植到腹主动脉12，13，14，15，16，17，18。然而，这些模型非常棘手，通常需要训练有素的外科医生才能成功操作。此外，它们既昂贵又耗时19.开发了一种新的大鼠模型，以创建一种更简单的动物模型，用于研究心脏瓣膜移植的免疫生物学。切除单主动脉瓣小叶并将其插入肾囊下间隙。肾脏特别适合研究移植排斥反应，因为它高度血管化，可进入循环免疫细胞20，21。虽然其他几个人利用肾脏囊下模型来研究其他同种异体移植的移植生物学，如胰腺，肝脏，肾脏和角膜22，23，24，25，26，27，但这是心脏组织移植的第一个描述。这里描述了移植技术，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫学提供了重要的一步。
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Protocol
该研究根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南，由动物研究委员会批准。
1. 动物模型信息（大鼠）
- 所有外科手术均使用放大倍率高达20倍的手术显微镜（见 材料表）。
- 根据实验需要使用同源（如刘易斯-刘易斯）或同种异体（如挪威刘易斯-布朗）菌株进行移植。
- 使用年龄在5-7周之间，体重为100-200克的大鼠，适合实验问题。
2.去除毛皮，准备皮肤和麻醉
- 在无菌条件下执行所有操作。
注意：该步骤在专用的手术空间和无菌条件下进行。 - 将大鼠放入麻醉诱导室中，用氧中5%异氟醚诱导麻醉。在整个过程中用氧气中的3.5%异氟醚维持麻醉。
- 对于供体操作，使用毛皮剪将大鼠的皮毛从脐部移除到胸骨切口。对于受体手术，将头发夹在从肋骨到骨盆的腋窝后线的手术区域上。接下来，用手术消毒剂准备皮肤。
- 在开始手术之前获得手术麻醉平面。通过用镊子牢牢地压缩大鼠的脚趾来确认足够的麻醉深度。如果大鼠止痛，根据需要滴定麻醉剂。
- 在整个过程中临床上监测呼吸频率和麻醉深度;根据需要调整异氟醚的水平，以保持55-65次呼吸/分钟的呼吸速率。
3. 捐赠者操作
- 按照步骤2所述准备和麻醉大鼠。使用解剖剪刀将皮肤从剑突切到胸骨切口。通过切除胸骨外侧两侧的肋骨进行胸骨切除术，直到达到进入心脏的最佳途径。
- 用100 U / 100g注射到左心房中肝化大鼠。
- 通过流血牺牲捐赠者。
- 切除胸腺以改善大血管的可视化。然后，将心脏与上升的主动脉整体移除，直到无名动脉的水平。
4. 主动脉瓣单的制备
- 将供体心脏放在心脏切除术后立即的无菌培养皿中。在冰冷的储存缓冲液中解剖供体心脏（见 材料表）。
- 使用镊子和Vannas弹簧剪刀，解剖供体心脏，直到只有主动脉根部保留，主动脉瓣近端有1毫米的心室袖带。
- 通过纵向切开打开主动脉瓣，以打开左侧和非冠状动脉窦之间的Valsalva窦，以可视化所有三个小叶。
注意：切口应该是瓦尔萨尔瓦窦的整个长度。实际尺寸取决于大鼠的大小。 - 单独切除每个主动脉瓣叶。具体来说，使用钝镊子抓住传单的边缘，并使用Vannas弹簧剪刀从一个副本向下切除小叶，然后向下切到环，然后向下一个副本。
注意：特别注意仅抓住小叶的边缘，以尽量减少瓣膜内皮细胞的破坏。 - 将小叶切除后的样品储存在冰冷储存缓冲溶液中，直到它们准备好植入受体大鼠体内。在冷藏4小时内植入所有传单。
5. 收件人操作
- 按照步骤2所述准备和麻醉大鼠。使用保持在36-38°C的加热垫进行手术。
- 手术前向所有受体大鼠施用丁丙诺啡（皮下注射0.03mg / kg），术后根据需要每6-12小时一次以减轻疼痛。
- 将大鼠置于右侧侧卧位以进入左侧肾脏。
注意：左肾是首选，因为它相对于右肾的尾部位置更多。 - 用剪刀将皮肤纵向切入两侧，超过1英寸。
注意：切口必须小于肾脏的大小，以提供足够的张力，以防止肾脏在手术过程中缩回腹腔。 - 同样，切入下面的腹壁。
- 肾脏外化
- 使用拇指和食指，在背部和腹侧施加轻压，同时使用弯曲的镊子通过腹部和皮肤切口抬起肾脏的尾极。类似地将肾脏的颅端外化。
- 或者，肾脏可以通过抓住肾周脂肪并以轻微的张力向上拉来外化。
注意：注意不要直接抓住肾脏或肾脏血管。 - 一旦肾脏外化，用温热的盐水滴到肾脏上保持湿润。
- 创建一个囊下口袋。
- 使用一组钝镊子轻轻地对肾囊施加压力，以便可以清楚地将肾囊与下面的实质区分开来。同时使用另一组钝镊子，小心地抓住胶囊并轻轻向上拉，在胶囊上形成一个洞。
注意：由于胶囊的微妙性质，建立这个切口需要最小的力。 - 继续使用钝镊子延长切口，直到产生约2mm的空间以容纳主动脉瓣叶。
- 形成一个比瓣膜小叶稍大的浅囊下袋，同时用一组镊子抬起切口的边缘，并在肾囊下方推进钝探针。
- 使用一组钝镊子轻轻地对肾囊施加压力，以便可以清楚地将肾囊与下面的实质区分开来。同时使用另一组钝镊子，小心地抓住胶囊并轻轻向上拉，在胶囊上形成一个洞。
- 将主动脉瓣移植到囊下袋中。
- 从冷藏库中取出主动脉瓣传单并将其放置在手术室中。
- 在抬起边缘纤维囊的同时，用钝镊子将主动脉瓣小叶推进到包膜下袋中。
注意：确保组织离切口足够远，以便将其牢固地固定在胶囊下方。应注意避免损伤下层实质或纤维囊的进一步撕裂。 - 肾囊中的切口可以保持打开状态。
- 使用施加在切口边缘的反向牵引力将肾脏轻轻推回其解剖位置。
- 用运行的无菌手术缝合线关闭腹部切口。用订书钉闭合皮肤。
- 术后护理
- 手术后，将老鼠放在干净的笼子里，放在加热垫上，以获得食物和水。
- 每天监测动物，以评估常规伤口愈合和疼痛或痛苦的迹象。7-10天后取下订书钉。
6. 收集用于分析的组织
- 在移植后的选定终点，通过放血对动物实施安乐死。具体而言，进行正中剖腹手术，并在氧中异氟醚低于5%的腹主动脉。
- 动员肾脏，并用剪刀切开肾动脉、静脉和输尿管。
注意：注意不要抓住包含移植传单的区域。 - 将肾脏置于福尔马林中过夜，将其包埋在石蜡中，然后将其切片以进行所需的染色。标本的方向为肾囊朝前，肾实质朝后。
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Representative Results
为大鼠模型提供了实验设计的图形描述（图1）。此外，从供体心脏解剖的主动脉根部和准备植入的单个主动脉瓣叶也如图2所示。接下来，图3A显示了主动脉瓣叶在肾囊下植入的位置的代表性图像，并在受体大鼠内3，7和28天后（图3B-D），表明易于定位和恢复移植的组织。
在同基因动物中异位移植后，主动脉瓣小叶保留了其天然结构，证明了该模型作为比较同种异体移植中免疫反应的基线的效用。具体而言，苏木精和曙红（H&E）染色的组织学显示，7天后同源移植的瓣膜小叶结构完整，没有水肿肿胀的迹象（图4A）。通过α平滑肌肌动蛋白（aSMA）和CD31的免疫组织化学进一步证实了瓣膜叶的结构完整性（图4B）。
图1：大鼠肾囊下主动脉瓣异位移植的实验设计。 心脏从供体大鼠（A）收集。解剖主动脉瓣小叶并保存在冷藏（B）中，直到接受者大鼠（C）的肾囊下植入过程。然后将小叶在设定的时间点外植并进行显微镜分析（D）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：准备用于植入的主动脉瓣叶。 从供体心脏（A）中解剖主动脉根部和进一步解剖用于植入的主动脉瓣小叶（B）的示例。 请点击此处查看此图的大图。
图3：肾囊下主动脉瓣叶的可视化。 主动脉瓣小叶在植入时（A），同源动物3（B），7（C）和28天（D）后以及同种异体动物3（E），7（F）和28天后（G）后，主动脉瓣小叶可见。 请点击此处查看此图的大图。
图4：在同源动物的肾囊下移植7天后，主动脉瓣小叶在结构上保持完整。 最上面一行显示了用于获取但未移植的对照心脏瓣膜的 DAPI、aSMA 和 CD31 的 H&E 染色和免疫染色。底行显示 7 天后外植的同源瓣膜小叶中 DAPI、aSMA 和 CD31 的 H&E 染色和免疫染色。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
重要性和潜在应用
虽然机械和生物假体心脏瓣膜常规用于需要瓣膜置换术的成年患者，但这些瓣膜缺乏生长潜力，因此对于儿科患者来说并不理想。心脏瓣膜移植是一项实验性手术，旨在为患有先天性心脏病的新生儿和婴儿提供不断增长的心脏瓣膜置换术。然而，与传统心脏移植的移植免疫生物学不同，这种新型移植的移植免疫生物学仍然没有得到很好的探索。本文介绍了一种独特的主动脉瓣瓣囊下肾移植大鼠模型，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫生物学提供了重要的一步。
肾囊下间隙为研究心脏瓣膜移植免疫生物学提供了最佳环境。移植的组织安全地包含在血管化良好的位置，可进入循环免疫细胞20。此外，囊下模型以前已成功用于测试许多组织中的同种异体移植物排斥反应，例如胰腺，肝脏，肾脏和其他细胞类型22，23，24，25，26，27，表明该模型在研究主动脉瓣叶的免疫原性方面是合理的。
该模型在研究主动脉瓣移植免疫学方面有几个潜在的应用。首先，该模型可用于确定心脏瓣膜移植所需的全身免疫抑制水平，以防止移植物排斥反应，例如他克莫司，霉酚酸酯和类固醇。此外，一些研究表明，瓣膜组织可能在免疫上与其他心脏组织不同，因为在常规心脏移植的暴发性排斥期间瓣膜相对较少28，29，30。该模型允许探索这一概念，因为囊下空间可以容纳各种组织类型，例如瓣膜小叶和心肌，以比较这些组织的免疫原性。
该模型是有利的，因为它在技术上简单，快速，并且具有高存活率和低并发症风险。因为每个供体可以提供三个主动脉瓣叶，所以一只大鼠可以作为三个不同受体的供体。平均而言，供体操作的长度为27.2分钟（n = 12），受体操作的持续时间为29.7分钟（n = 36）。受者手术的存活率为97.2%（n = 35/36），其中一例术中因呼吸抑制而死亡。在11.1%的受者手术中，在形成包膜下袋时，由于肾实质创伤而引起的轻微出血。然而，在所有情况下，通过棉尖涂药器的压缩都很容易控制出血。一个样本从囊下间隙脱落，即使在7天后也没有在解释后恢复。
以前，瓣膜小叶通过从囊下间隙中取出并嵌入，切片和染色而没有任何附着的主动脉组织来外植。然而，这种方法并不理想，因为小叶本身非常小，薄且透明，导致在处理过程中损失了几个样品。相反，建议整体移除肾脏并嵌入并切片组织，同时仍固定在肾囊下方，以确保没有样品丢失。此外，这种方法最大限度地减少了传单的创伤和操作。
关键步骤
该手术的关键步骤是建立手术麻醉平面，在肾脏上切开腹壁，掏空肾脏，抬高包膜下皮瓣，插入异位移植组织，止血，将肾脏返回到解剖位置，并关闭皮肤。
修改和故障排除
虽然这是对肾囊下心脏组织移植的第一次描述，但其他几个人已经描述了在肾囊下间隙20，22，23，24，25，26，27中移植其他组织类型。在该协议中，对以前的囊下模型进行了微小的调整，以优化技术并最大限度地减少并发症。具体而言，虽然其他人建议使用Vannas弹簧剪刀将初始切口插入肾囊20，26，但这种方法更有可能对下面的实质造成创伤并导致囊下血肿形成。出血过多会导致胶囊膨胀，损害移植26的安全性。因此，应使用钝镊子打开胶囊。此外，虽然一些方案主张将具有同质性的商业产品放置在包膜切口26，31上，但只要组织足够深入包膜下袋，这一步骤是不必要的。
在较大的大鼠中，肾脏可能被肾周脂肪覆盖， 并且通过 用弯曲的镊子提升肾脏外化可能不可行。在这些情况下，最好通过用镊子轻轻拉扯肾周脂肪并将肾脏从腹腔中拉出而不会造成损伤或出血来使肾脏外化。
与现有异位移植模型的比较
虽然其他几种用于异位主动脉瓣移植的动物模型之前已经描述过12，13，14，15，16，17，18，但目前的方案提供了一种直接且更实用的替代方案，以多种方式改进了以前的模型。首先，由于该程序在技术上很简单，因此成功操作所需的培训非常少。这与前面描述的腹主动脉瓣异位主动脉瓣移植形成鲜明对比。因此，该模型为研究主动脉瓣移植提供了一种更实用和更具成本效益的替代方案，同时最大限度地降低了大鼠的发病率，疼痛和死亡率。此外，由于受体操作只需要一个主动脉瓣叶，并且每个供体大鼠提供三个传单，因此任何给定的实验所需的供体大鼠更少。此外，将组织植入对侧肾脏或单独的囊下袋中可以允许内部控制或比较对单只大鼠内不同组织的免疫反应。在这种情况下，最好的方法是 通过 中线剖腹切口。
除了描述异位主动脉瓣移植到腹主动脉的动物模型外，其他研究还利用皮下模型来研究主动脉瓣32的免疫原性。虽然这种方法无疑比移植到腹主动脉更直接，但现有证据表明皮下植入是抗原呈递的一种不太有效的方法33，34。植入的标本也很难找到和分析。因此，提出将肾囊下间隙作为植入部位，既简化又最适合研究主动脉瓣移植生物学。
总之，新提出的模型作为科学家武器的补充，用于研究心脏瓣膜移植，并补充了先前描述的模型。
局限性
虽然在肾囊下移植主动脉瓣小叶是研究 体内同种异体免疫的有效方法，但该模型存在一些局限性。虽然囊下间隙血管化良好，但它不提供与冠状动脉下位置相同的血流动力学环境。这可能会影响对移植组织的免疫反应。一些人假设，在瓣膜组织中观察到的独特免疫特性可能是由于冠状动脉下位置的主动脉瓣上的高压血流引起的，使趋化反应无效28，35。此外，该模型不足以研究同种异物对瓣膜功能的影响，因为小叶在肾囊下不执行其生理功能。然而，异位腹主动脉移植模型也存在类似的局限性，因为这些模型的成功依赖于使瓣膜小叶无法避免移植血栓形成15，36。
该方案的限制包括组织从肾囊下间隙脱落和无法恢复的可能性（每36只动物中就有1只）。另一个限制是动物在手术过程中死亡（每36只动物中就有1只）;然而，死亡是由丁丙诺啡过量引起的，可以采用其他方法来加药镇痛。
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Disclosures
作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
Acknowledgments
图 1 是使用 biorender.com 创建的。这项工作得到了AATS基金会TKR外科研究者计划的部分支持，南卡罗来纳州医科大学儿科系为TKR举办的儿童卓越基金，爱默生玫瑰心脏基金会对TKR的赠款，参议员保罗坎贝尔对TKR的慈善事业，NIH-NHLBI机构博士后培训补助金（T32 HL-007260）给JHK和BG， 和南卡罗来纳医科大学医学院预职的FLEX研究基金给MAH。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chlordie, USP | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4-0 Polyglactin 910 | Ethicon | J415H | |
| 7.5% Povidone-Iodine | CareFusion | 29904-004 | |
| 70% ETOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Air-tight inducton chamber for rats |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging |
| Anesthesia Mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Rat anesthesia mask |
| Brown Norway Rats (BN/Crl) | Charles River | Strain Code 091 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 0.03 mg/kg, administered subcutaneously |
| Electric hair clippers | WAHL | 79434 | |
| Electric Heating Pad | Harvard Apparatus | 72-0492 | Maintained at 36-38 °C |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | 100U/100g injection into the left atrium |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Iris forceps curved | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris forceps straight | World Precision Instruments | 15916 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen |
| Lewis Rats (LEW/ Crl) | Charles River | Strain Code 004 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Micro forceps | World Precision Instruments | 500233 | Dumont #5 |
| Micro scissors | World Precision Instruments | 501930 | Spring-loaded Vannas Scissors |
| Needle Driver | World Precision Instruments | 500226 | Ryder Needle Driver |
| Operating microscope | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Stereo Microscope |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Skin staples | Ethicon | PXR35 | Proximate 35 |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile gauze sponges | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Scissors |
| University of Wisconsin Buffer (Servator B) | S.A.L.F S.p.A. | 6484A1 | Stored at 4 °C |
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