Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Transplantation von Aortenklappenblättchen unter die Nierenkapsel, um die Alloreaktivität von Herzklappen untersuchen zu können.
Abstract
Es besteht ein dringender klinischer Bedarf an Herzklappenersatz, der bei Kindern wachsen kann. Die Herzklappentransplantation wird als eine neue Art von Transplantation vorgeschlagen, die das Potenzial hat, dauerhafte Herzklappen zu liefern, die in der Lage sind, somatisch zu wachsen, ohne dass eine Antikoagulation erforderlich ist. Die Immunbiologie von Herzklappentransplantationen bleibt jedoch unerforscht, was die Notwendigkeit von Tiermodellen zur Untersuchung dieser neuen Art von Transplantation unterstreicht. Frühere Rattenmodelle für die heterotope Aortenklappentransplantation in die Bauchaorta wurden beschrieben, obwohl sie technisch anspruchsvoll und kostspielig sind. Um diese Herausforderung anzugehen, wurde ein renales subkapsuläres Transplantationsmodell bei Nagetieren als praktische und einfachere Methode zur Untersuchung der Immunbiologie der Herzklappentransplantation entwickelt. Bei diesem Modell wird ein einzelnes Aortenklappenblatt geerntet und in den unterkapsulären Nierenraum eingeführt. Die Niere ist leicht zugänglich, und das transplantierte Gewebe ist sicher in einem subkapsulären Raum enthalten, der gut vaskularisiert ist und eine Vielzahl von Gewebegrößen aufnehmen kann. Da eine einzelne Ratte drei Spenderaortenblättchen und eine einzige Niere mehrere Stellen für transplantiertes Gewebe bereitstellen kann, sind für eine bestimmte Studie weniger Ratten erforderlich. Hier wird die Transplantationstechnik beschrieben, die einen bedeutenden Schritt vorwärts bei der Untersuchung der Transplantationsimmunologie der Herzklappentransplantation darstellt.
Introduction
Angeborene Herzfehler sind die häufigste angeborene Behinderung beim Menschen und betreffen jedes Jahr 7 von 1.000 lebend geborenen Kindern1. Im Gegensatz zu erwachsenen Patienten, bei denen routinemäßig verschiedene mechanische und bioprothetische Klappen implantiert werden, haben pädiatrische Patienten derzeit keine guten Möglichkeiten für einen Klappenersatz. Diese herkömmlichen Implantate haben nicht das Potenzial, bei Empfängerkindern zu wachsen. Infolgedessen sind morbide Reoperationen erforderlich, um die Herzklappenimplantate gegen sukzessive größere Versionen auszutauschen, wenn die Kinder wachsen, wobei betroffene Kinder oft bis zu fünf oder mehr Operationen am offenen Herzen in ihrem Leben benötigen 2,3. Studien haben gezeigt, dass die Freiheit von Intervention oder Tod für Säuglinge signifikant schlecht ist als für ältere Kinder, wobei 60% der Säuglinge mit Herzklappenprothesen innerhalb von 3 Jahren nach ihrer ersten Operation einer erneuten Operation oder dem Tod ausgesetzt sind4. Daher ist es dringend notwendig, eine Herzklappe zu liefern, die bei pädiatrischen Patienten wachsen und ihre Funktion aufrechterhalten kann.
Seit Jahrzehnten konzentrieren sich die Versuche, wachsenden Herzklappenersatz zu liefern, auf Tissue Engineering und Stammzellen. Versuche, diese Ventile in die Klinik zu übersetzen, waren jedoch bisher erfolglos 5,6,7,8. Um dies anzugehen, wird eine Herzklappentransplantation als eine kreativere Operation zur Bereitstellung von wachsendem Herzklappenersatz vorgeschlagen, der die Fähigkeit hat, sich selbst zu reparieren und Thrombogenese zu vermeiden. Anstatt das ganze Herz zu transplantieren, wird nur die Herzklappe transplantiert und wächst dann mit dem Empfängerkind, ähnlich wie bei herkömmlichen Herztransplantationen oder einem Ross-Lungenautogramm 9,10,11. Postoperativ erhalten die Empfängerkinder eine Immunsuppression, bis die transplantierte Klappe gegen eine mechanische Prothese in Erwachsenengröße ausgetauscht werden kann, wenn das Wachstum der Klappe nicht mehr erforderlich ist. Die Transplantationsbiologie von Herzklappentransplantaten bleibt jedoch unerforscht. Daher werden Tiermodelle benötigt, um diese neue Art von Transplantation zu untersuchen.
Mehrere Rattenmodelle wurden zuvor für die heterotope Transplantation der Aortenklappe in die Bauchaorta 12,13,14,15,16,17,18 beschrieben. Diese Modelle sind jedoch unerschwinglich knifflig und erfordern oft ausgebildete Chirurgen, um erfolgreich zu operieren. Darüber hinaus sind sie teuer und zeitaufwendig19. Ein neuartiges Rattenmodell wurde entwickelt, um ein einfacheres Tiermodell für die Untersuchung der Immunbiologie von Herzklappentransplantationen zu erstellen. Einzelne Aortenklappenblättchen werden herausgeschnitten und in den renalen subkapsulären Raum eingeführt. Die Niere eignet sich besonders für die Untersuchung der Transplantatabstoßung, da sie stark vaskularisiert ist und Zugang zu zirkulierenden Immunzellen hat20,21. Während einige andere ein renales subkapsuläres Modell verwendet haben, um die Transplantationsbiologie anderer Allotransplantattransplantationen wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Niere und Hornhaut 22,23,24,25,26,27 zu untersuchen, ist dies die erste Beschreibung der Transplantation von Herzgewebe in dieser Position. Hier wird die Transplantationstechnik beschrieben, die einen bedeutenden Schritt vorwärts bei der Untersuchung der Transplantationsimmunologie der Herzklappentransplantation darstellt.
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Protocol
Die Studie wurde vom Committee of Animal Research nach dem National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals genehmigt.
1. Angaben zum Tiermodell (Ratten)
- Verwenden Sie für alle chirurgischen Eingriffe ein Operationsmikroskop (siehe Materialtabelle) mit bis zu 20-facher Vergrößerung.
- Verwenden Sie syngene (wie Lewis-Lewis) oder allogene (wie Lewis-Brown Norway) Stämme für die Transplantationen, die für das Experiment benötigt werden.
- Verwenden Sie Ratten im Alter zwischen 5-7 Wochen und einem Körpergewicht von 100-200 g, die für die experimentelle Frage geeignet sind.
2. Entfernung von Fell, Vorbereitung der Haut und Anästhesie
- Führen Sie alle Operationen unter sterilen Bedingungen durch.
HINWEIS: Der Schritt wird in einem speziellen Operationsraum und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. - Legen Sie die Ratten in eine Anästhesie-Induktionskammer und induzieren Sie eine Anästhesie mit 5% Isofluran in Sauerstoff. Halten Sie die Anästhesie mit 3,5% Isofluran in Sauerstoff während des gesamten Verfahrens aufrecht.
- Entfernen Sie für die Spenderoperation das Fell der Ratte vom Nabel bis zur Sternalkerbe mit Pelzklippern. Für die Empfängeroperation schneiden Sie die Haare über das Operationsfeld an der hinteren Achsellinie von den Rippen bis zum Becken. Als nächstes bereiten Sie die Haut mit einem chirurgischen Desinfektionsmittel vor.
- Erhalten Sie eine chirurgische Anästhesieebene, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie die Zehen der Ratte mit einer Pinzette fest zusammendrücken. Wenn sich die Ratte vor Schmerzen zurückzieht, titrieren Sie das Anästhetikum nach Bedarf.
- Überwachen Sie die Atemfrequenz und die Tiefe der Anästhesie klinisch während des gesamten Eingriffs; Der Isofluranspiegel wird nach Bedarf angepasst, um eine Atemfrequenz von 55-65 Atemzügen/min aufrechtzuerhalten.
3. Spenderbetrieb
- Bereiten Sie die Ratte vor und betäuben Sie sie, wie in Schritt 2 beschrieben. Schneiden Sie die Haut mit einer Sezierschere vom Xiphoid bis zur sternalen Kerbe ein. Führen Sie eine Sternektomie durch, indem Sie die Rippen auf jeder Seite seitlich zum Brustbein schneiden, bis ein optimaler Zugang zum Herzen erreicht ist.
- Heparinisieren Sie die Ratte mit einer Injektion von 100 U/100 g in den linken Vorhof.
- Opfern Sie den Spender durch Exsanguination.
- Schneiden Sie den Thymus aus, um die Visualisierung der großen Gefäße zu verbessern. Entfernen Sie dann das Herz en bloc mit der aufsteigenden Aorta bis zur Höhe der Arteria innominate.
4. Erstellung von Aortenklappenbeilagen
- Legen Sie das Spenderherz unmittelbar nach der Cardiektomie in eine sterile Petrischale. Sezieren Sie das Spenderherz in einem eiskalten Kühllagerpuffer (siehe Materialtabelle).
- Sezieren Sie mit einer Pinzette und einer Vannas-Federschere das Spenderherz, bis nur noch die Aortenwurzel mit einer 1 mm großen Ventrikelmanschette in der Nähe der Aortenklappe übrig bleibt.
- Öffnen Sie die Aortenklappe, indem Sie einen Längsschnitt machen, um den Sinus von Valsalva zwischen den linken und nicht-koronaren Nebenhöhlen zu öffnen, um alle drei Blättchen zu visualisieren.
HINWEIS: Der Schnitt sollte die gesamte Länge des Sinus von Valsalva betragen. Die tatsächlichen Abmessungen hängen von der Größe der Ratte ab. - Schneiden Sie jede Aortenklappenbeilage einzeln aus. Verwenden Sie insbesondere stumpfe Pinzetten, um den Rand des Blättchens zu greifen, und verwenden Sie Vannas-Federschere, um die Packungsbeilage zu entfernen, indem Sie von einer Kommissur bis zum Ring und dann zur nächsten Kommissur schneiden.
HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, nur den Rand der Packungsbeilage zu greifen, um die Störung der valvulären Endothelzellen zu minimieren. - Lagern Sie die Proben nach der Exzision der Packungsbeilage in eiskalter Speicherpufferlösung, bis sie bereit sind, in die Empfängerratte implantiert zu werden. Implantieren Sie alle Packungsbeilagen innerhalb von 4 Stunden nach der Kühllagerung.
5. Empfängervorgang
- Bereiten Sie die Ratte vor und betäuben Sie sie, wie in Schritt 2 beschrieben. Verwenden Sie ein Heizkissen, das bei 36-38 ° C gehalten wird, um die Operation durchzuführen.
- Verabreichen Sie Buprenorphin (0,03 mg/kg subkutan) allen Empfängerratten vor der Operation und alle 6-12 h postoperativ nach Bedarf, um die Schmerzen zu lindern.
- Bringen Sie die Ratte in eine rechte seitliche Liegeposition, um auf die linke Niere zuzugreifen.
HINWEIS: Die linke Niere wird aufgrund ihrer eher kaudalen Position relativ zur rechten Niere bevorzugt. - Schneiden Sie die Haut über der Flanke mit einer Schere in Längsrichtung über 1 Zoll ein.
HINWEIS: Der Schnitt muss kleiner als die Größe der Niere bleiben, um genügend Spannung zu erzeugen, um zu verhindern, dass sich die Niere während des Eingriffs in die Bauchhöhle zurückzieht. - Ebenso schneiden Sie die darunter liegende Bauchdecke ein.
- Externalisieren Sie die Niere
- Üben Sie mit Daumen und Zeigefinger dorsal und ventral leichten Druck aus, während Sie eine gekrümmte Pinzette verwenden, um den Schwanzpol der Niere durch den Bauch- und Hautschnitt anzuheben. Externalisieren Sie das kraniale Ende der Niere ähnlich.
- Alternativ kann die Niere externalisiert werden, indem das perirenale Fett erfasst und mit leichter Spannung nach oben gezogen wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Niere oder die Nierengefäße nicht direkt zu greifen. - Sobald die Niere externalisiert ist, halten Sie sie feucht mit warmer Kochsalzlösung, die auf die Niere tropft.
- Erstellen Sie eine subkapsuläre Tasche.
- Üben Sie leicht Druck auf die Nierenkapsel aus, indem Sie eine stumpfe Pinzette verwenden, so dass die Nierenkapsel deutlich vom darunter liegenden Parenchym unterschieden werden kann. Greifen Sie gleichzeitig mit einer weiteren stumpfen Pinzette vorsichtig nach der Kapsel und ziehen Sie sie vorsichtig nach oben, um ein Loch in der Kapsel zu erzeugen.
HINWEIS: Aufgrund der empfindlichen Natur der Kapsel ist nur eine minimale Kraft erforderlich, um diesen Schnitt zu etablieren. - Verwenden Sie weiterhin stumpfe Pinzetten, um den Schnitt zu verlängern, bis ein ~ 2 mm großer Raum für die Aufnahme der Aortenklappenbroschüre geschaffen wurde.
- Entwickeln Sie eine flache subkapsuläre Tasche, die etwas größer ist als die Ventilpackung, während Sie den Rand des Einschnitts mit einem Satz Pinzetten anheben und eine stumpfe Sonde unter der Nierenkapsel vorschieben.
- Üben Sie leicht Druck auf die Nierenkapsel aus, indem Sie eine stumpfe Pinzette verwenden, so dass die Nierenkapsel deutlich vom darunter liegenden Parenchym unterschieden werden kann. Greifen Sie gleichzeitig mit einer weiteren stumpfen Pinzette vorsichtig nach der Kapsel und ziehen Sie sie vorsichtig nach oben, um ein Loch in der Kapsel zu erzeugen.
- Transplantieren Sie die Aortenklappe in die subkapsuläre Tasche.
- Holen Sie die Aortenpackung aus dem Kühllager und legen Sie sie in das chirurgische Feld.
- Während Sie die Randfaserkapsel anheben, schieben Sie die Aortenblättchen mit stumpfer Pinzette in die subkapsuläre Tasche.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe weit genug vom Schnitt entfernt ist, damit es fest unter der Kapsel befestigt ist. Es sollte darauf geachtet werden, dass eine Schädigung des darunter liegenden Parenchyms oder ein weiteres Reißen der Faserkapsel vermieden wird. - Der Schnitt in der Nierenkapsel kann offen gelassen werden.
- Drücken Sie die Niere sanft in ihre anatomische Position zurück, indem Sie eine Gegentraktion an den Schnittkanten verwenden.
- Schließen Sie den Bauchschnitt mit einer laufenden sterilen chirurgischen Naht. Schließen Sie die Haut mit Klammern.
- Postoperative Versorgung
- Nach der Operation legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen mit Zugang zu Nahrung und Wasser.
- Überwachen Sie das Tier täglich, um die routinemäßige Wundheilung und Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zu beurteilen. Entfernen Sie die Klammern nach 7-10 Tagen.
6. Entnahme von Gewebe zur Analyse
- An ausgewählten Endpunkten nach der Transplantation das Tier durch Exsanguination einschläfern. Führen Sie insbesondere eine mediane Laparotomie durch und transektieren Sie die Bauchaorta unter 5% Isofluran in Sauerstoff.
- Mobilisieren Sie die Niere und entfernen Sie sie, indem Sie die Nierenarterie, die Vene und den Harnleiter mit einer Schere durchschneiden.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Bereich mit der transplantierten Packungsbeilage nicht zu greifen. - Legen Sie die Niere über Nacht in Formalin, betten Sie sie in Paraffin ein und schneiden Sie sie für die gewünschte Färbung ab. Richten Sie die Probe aus, wobei die Nierenkapsel nach vorne und das Nierenparenchym nach hinten zeigt.
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Representative Results
Eine grafische Darstellung des Versuchsdesigns wird für das Rattenmodell bereitgestellt (Abbildung 1). Zusätzlich sind eine Aortenwurzel, die aus dem Herzen des Spenders seziert wurde, und eine einzelne Aortenklappenbroschüre, die für die Implantation vorbereitet wurde, ebenfalls in Abbildung 2 dargestellt. Als nächstes ist ein repräsentatives Bild der Position der Aortenklappenpackung unter der Nierenkapsel für die Implantation in Abbildung 3A und nach 3, 7 und 28 Tagen innerhalb der Empfängerratte (Abbildungen 3B-D) gezeigt, das die Leichtigkeit der Lokalisierung und Wiederherstellung des transplantierten Gewebes zeigt.
Die Aortenklappenblättchen behalten ihre native Architektur nach der heterotopen Transplantation bei syngenen Tieren, was den Nutzen dieses Modells als Grundlage für den Vergleich der Immunantwort bei allogenen Transplantaten zeigt. Insbesondere zeigte die Histologie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) -Färbung, dass Klappenblättchen bei syngenen Transplantaten nach 7 Tagen strukturell intakt waren und keine Anzeichen einer ödematösen Schwellung auftraten (Abbildung 4A). Die strukturelle Integrität der Klappenbroschüre wurde durch Immunhistochemie für Alpha Smooth Muscle Actin (aSMA) und CD31 weiter bestätigt (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Experimentelles Design der heterotopen Transplantation der Aortenklappe unter der Nierenkapsel bei Ratten. Das Herz wird von der Spenderratte (A) gesammelt. Die Aortenklappenblättchen werden seziert und bis zum Implantationsprozess unter der Nierenkapsel in der Empfängerratte (C) im Kühlhaus (B) aufbewahrt. Die Blättchen werden dann zu festgelegten Zeitpunkten ausgepflanzt und mikroskopisch analysiert (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vorbereitung der Aortenklappenpackung für die Implantation. Beispiel einer Aortenwurzel, die aus dem Spenderherzen (A) seziert wurde, und einer weiteren Dissektion einer Aortenklappenbroschüre zur Implantation (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Visualisierung der Aortenklappenpackung unter der Nierenkapsel. Die Aortenklappenpackung wird unter der Nierenkapsel bei der Implantation (A), nach 3 (B), 7 (C) und 28 Tagen (D) bei syngenen Tieren und nach 3 (E), 7 (F) und 28 Tagen (G) bei allogenen Tieren visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Aortenklappenblättchen bleiben nach der Transplantation unter die Nierenkapsel bei syngenen Tieren für 7 Tage strukturell intakt. Die obere Reihe zeigt H & E-Färbung und Immunfärbung für DAPI, aSMA und CD31 zur Steuerung von Herzklappen, die beschafft, aber nicht transplantiert wurden. Die untere Zeile zeigt H & E-Färbung und Immunfärbung für DAPI, aSMA und CD31 in einer syngenen Klappenbroschüre, die nach 7 Tagen explantiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten
Während mechanische und bioprothetische Herzklappen routinemäßig bei erwachsenen Patienten eingesetzt werden, die einen Klappenersatz benötigen, fehlt diesen Klappen das Wachstumspotenzial und sie sind daher für pädiatrische Patienten suboptimal. Die Herzklappentransplantation ist eine experimentelle Operation, die entwickelt wurde, um wachsenden Herzklappenersatz für Neugeborene und Säuglinge mit angeborenen Herzfehlern zu liefern. Im Gegensatz zur Transplantationsimmunbiologie herkömmlicher Herztransplantationen ist die Transplantationsimmunbiologie dieser neuen Art von Transplantation jedoch noch wenig erforscht. Hier wird ein einzigartiges Rattenmodell für die subkapsuläre Nierentransplantation von Aortenklappenblättchen beschrieben, das einen bedeutenden Schritt vorwärts bei der Untersuchung der Transplantationsimmunbiologie der Herzklappentransplantation darstellt.
Der renale subkapsuläre Raum bietet eine optimale Umgebung, um die Immunbiologie der Herzklappen zu untersuchen. Das transplantierte Gewebe befindet sich sicher an einem gut vaskularisierten Ort mit Zugang zu zirkulierenden Immunzellen20. Darüber hinaus wurden subkapsuläre Modelle zuvor erfolgreich eingesetzt, um die Abstoßung von Allotransplantaten in vielen Geweben wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Niere und den anderen Zelltypen 22,23,24,25,26,27 zu testen, was darauf hindeutet, dass dieses Modell bei der Untersuchung der Immunogenität von Aortenklappenblättchen gerechtfertigt ist.
Dieses Modell hat mehrere protenzielle Anwendungen für die Untersuchung der Transplantationsimmunologie von Aortenklappen. Erstens kann das Modell verwendet werden, um das Niveau der systemischen Immunsuppression zu bestimmen, die für die Herzklappentransplantation erforderlich ist, um eine Abstoßung von Transplantaten wie Tacrolimus, Mycophenolat und Steroide zu verhindern. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass sich Klappengewebe immunologisch von anderem Herzgewebe unterscheiden kann, da die Klappen bei der fulminanten Abstoßung herkömmlicher Herztransplantationen relativ verschont bleiben28,29,30. Dieses Modell ermöglicht die Erforschung dieses Konzepts, da der subkapsuläre Raum verschiedene Gewebetypen wie Klappenblatt und Myokard aufnehmen kann, um die Immunogenität dieser Gewebe zu vergleichen.
Dieses Modell ist vorteilhaft, weil es technisch unkompliziert und schnell ist und eine hohe Überlebensrate mit einem geringen Komplikationsrisiko aufweist. Da jeder Spender drei Aortenklappenblättchen zur Verfügung stellen kann, kann eine Ratte als Spender für drei verschiedene Empfänger dienen. Im Durchschnitt betrug die Dauer der Spenderoperation 27,2 min (n = 12) und die Dauer der Empfängeroperation 29,7 min (n = 36). Die Überlebensrate der Empfängeroperation betrug 97,2% (n = 35/36), mit einem intraoperativen Todesfall aufgrund einer Atemdepression. Minimale Blutungen aufgrund eines Traumas des Nierenparenchyms während der Bildung der subkapsulären Tasche wurden bei 11,1% der Empfängeroperationen festgestellt. Die Blutung konnte jedoch in allen Fällen mit Kompression von einem Baumwollspitzenapplikator leicht kontrolliert werden. Eine Probe wurde aus dem subkapsulären Raum entfernt und nach Erklärung auch nach 7 Tagen nicht wiedergefunden.
Zuvor wurden die Klappenblättchen ausgepflanzt, indem sie aus dem subkapsulären Raum entfernt und ohne angeschlossenes Aortengewebe eingebettet, geschnitten und gefärbt wurden. Diese Methode ist jedoch suboptimal, da die Packungsbeilagen selbst extrem klein, dünn und transparent sind, was zum Verlust mehrerer Proben bei der Verarbeitung führt. Stattdessen wird empfohlen, die Niere en bloc zu entfernen und das Gewebe einzubetten und zu schneiden, während es noch unter der Nierenkapsel gesichert ist, um sicherzustellen, dass keine Proben verloren gehen. Darüber hinaus minimiert dieser Ansatz das Trauma und die Manipulation der Packungsbeilage.
Kritische Schritte
Die kritischen Schritte des Verfahrens bestehen darin, eine chirurgische Anästhesieebene einzurichten, die Bauchdecke über den Nieren zu schneiden, die Niere auszuweiden, den subkapsulären Lappen anzuheben, das heterotope Transplantatgewebe einzuführen, Hämostase zu erhalten, die Niere in die anatomische Position zurückzubringen und die Haut zu schließen.
Änderungen und Fehlerbehebung
Während dies die erste Beschreibung der Transplantation von Herzgewebe unter der Nierenkapsel ist, haben mehrere andere die Transplantation anderer Gewebetypen im renalen subkapsulären Raum 20,22,23,24,25,26,27 beschrieben. In diesem Protokoll wurden kleinere Anpassungen an früheren subkapsulären Modellen vorgenommen, um die Technik zu optimieren und Komplikationen zu minimieren. Während andere empfohlen haben, Vannas Federschere zu verwenden, um den ersten Schnitt in die Nierenkapsel20,26 zu machen, ist es wahrscheinlicher, dass diese Methode ein Trauma des zugrunde liegenden Parenchyms verursacht und zu einer subkapsulären Hämatombildung führt. Zu viel Blutung führt zu einer Dehnung der Kapsel und beeinträchtigt die Sicherheit des transplantierten26. Daher sollte eine stumpfe Pinzette verwendet werden, um die Kapsel zu öffnen. Während einige Protokolle die Platzierung kommerzieller Produkte mit homostatischer Eigenschaft über dem Kapselschnitt26,31 befürworten, ist dieser Schritt unnötig, solange das Gewebe weit genug in die subkapsuläre Tasche vorgeschoben wird.
Bei größeren Ratten kann die Niere mit perirenalem Fett bedeckt sein, und eine Externalisierung der Niere durch Lifting mit gekrümmter Pinzette ist möglicherweise nicht möglich. In diesen Fällen ist es am besten, die Niere zu externalisieren, indem Sie das perirenale Fett sanft mit einer Pinzette ziehen und die Niere aus der Bauchhöhle ziehen, ohne Schäden oder Blutungen zu verursachen.
Vergleich mit bestehenden heterotopen Transplantationsmodellen
Während mehrere andere Tiermodelle für die heterotope Aortenklappentransplantation zuvor beschrieben wurden 12,13,14,15,16,17,18, bietet das aktuelle Protokoll eine einfache und praktischere Alternative, die frühere Modelle in mehrfacher Hinsicht verbessert. Erstens ist aufgrund der technisch einfachen Natur des Verfahrens nur eine sehr geringe Schulung erforderlich, um erfolgreich zu arbeiten. Dies steht in krassem Gegensatz zu zuvor beschriebenen heterotopen Aortenklappentransplantaten in die Bauchaorta. Daher bietet dieses Modell eine praktischere und kostengünstigere Alternative zur Untersuchung der Aortenklappentransplantation und minimiert gleichzeitig die Morbidität, Schmerzen und Mortalität der Ratten. Da für die Empfängeroperation nur eine Aortenklappenbroschüre benötigt wird und jede Spenderratte drei Flugblätter zur Verfügung stellt, sind für ein bestimmtes Experiment weniger Spenderratten erforderlich. Darüber hinaus kann die Implantation von Gewebe in die kontralaterale Niere oder eine separate subkapsuläre Tasche eine interne Kontrolle oder einen Vergleich der Immunantworten auf unterschiedliche Gewebe innerhalb einer einzelnen Ratte ermöglichen. In diesem Fall ist der beste Ansatz ein Mittellinien-Laparotomie-Einschnitt.
Zusätzlich zu den Tiermodellen, die die heterotope Aortenklappentransplantation in die Bauchaorta beschreiben, haben andere Studien ein subkutanes Modell verwendet, um die Immunogenität von Aortenklappenzu untersuchen 32. Während dieser Ansatz zweifellos einfacher ist als die Transplantation in die Bauchaorta, deuten bestehende Beweise darauf hin, dass die subkutane Implantation eine weniger wirksame Methode der Antigenpräsentationist 33,34. Die implantierte Probe ist auch schwierig zu finden und zu analysieren. Daher wird der renale subkapsuläre Raum als ein Ort der Implantation vorgeschlagen, der sowohl vereinfacht als auch optimal für die Untersuchung der Aortenklappentransplantationsbiologie ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das neu vorgeschlagene Modell als Ergänzung zum Arsenal der Wissenschaftler dient, um die Herzklappentransplantation zu untersuchen und die zuvor beschriebenen Modelle zu ergänzen.
Begrenzungen
Obwohl die Transplantation von Aortenklappenblättchen unter die Nierenkapsel eine effiziente Methode zur Untersuchung der Alloimmunität in vivo ist, gibt es einige Einschränkungen dieses Modells. Während der subkapsuläre Raum gut vaskularisiert ist, bietet er nicht die gleiche hämodynamische Umgebung wie die subkoronare Position. Dies kann die Immunantwort auf transplantiertes Gewebe beeinflussen. Einige haben die Hypothese aufgestellt, dass die im Klappengewebe beobachteten eindeutigen Immuneigenschaften aus dem Hochdruckblutfluss über die Aortenklappe in der subkoronaren Position resultieren können, wodurch die chemotaktische Reaktionzunichte gemacht wird 28,35. Darüber hinaus reicht dieses Modell nicht aus, um die Wirkung der Alloreaktivität auf die Klappenfunktion zu untersuchen, da die Packungsbeilagen ihre physiologische Funktion unter der Nierenkapsel nicht erfüllen. Ähnliche Einschränkungen bestehen jedoch für die heterotopen abdominalen Aortentransplantationsmodelle, da der Erfolg dieser Modelle davon abhängt, dass die Klappenblätter inkompetent werden, um eine Transplantatthrombose zu vermeiden15,36.
Zu den Einschränkungen des Protokolls gehört die Möglichkeit, dass sich Gewebe aus dem subkapsulären Nierenraum löst und nicht wiederherstellbar ist (1 von 36 Tieren). Eine weitere Einschränkung ist der Tod des Tieres während der Operation (1 von 36 Tieren); Der Tod wurde jedoch durch die Überdosierung von Buprenorphin verursacht, und andere Methoden zur Dosierung von Analgesie können angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Abbildung 1 wurde mit biorender.com erstellt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch das AATS Foundation Surgical Investigator Program an TKR, den Children's Excellence Fund der Abteilung für Pädiatrie an der Medical University of South Carolina an TKR, ein Stipendium der Emerson Rose Heart Foundation an TKR, Philanthropie von Senator Paul Campbell an TKR, NIH-NHLBI Institutional Postdoctoral Training Grants (T32 HL-007260) an JHK und BG, und das Medical University of South Carolina College of Medicine Pre-clerkship FLEX Research Fund an MAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chlordie, USP | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4-0 Polyglactin 910 | Ethicon | J415H | |
| 7.5% Povidone-Iodine | CareFusion | 29904-004 | |
| 70% ETOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Air-tight inducton chamber for rats |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging |
| Anesthesia Mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Rat anesthesia mask |
| Brown Norway Rats (BN/Crl) | Charles River | Strain Code 091 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 0.03 mg/kg, administered subcutaneously |
| Electric hair clippers | WAHL | 79434 | |
| Electric Heating Pad | Harvard Apparatus | 72-0492 | Maintained at 36-38 °C |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | 100U/100g injection into the left atrium |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Iris forceps curved | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris forceps straight | World Precision Instruments | 15916 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen |
| Lewis Rats (LEW/ Crl) | Charles River | Strain Code 004 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Micro forceps | World Precision Instruments | 500233 | Dumont #5 |
| Micro scissors | World Precision Instruments | 501930 | Spring-loaded Vannas Scissors |
| Needle Driver | World Precision Instruments | 500226 | Ryder Needle Driver |
| Operating microscope | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Stereo Microscope |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Skin staples | Ethicon | PXR35 | Proximate 35 |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile gauze sponges | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Scissors |
| University of Wisconsin Buffer (Servator B) | S.A.L.F S.p.A. | 6484A1 | Stored at 4 °C |
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