Summary
이 프로토콜은 심장 판막의 동종 활성에 대한 연구를 허용하기 위해 신장 캡슐 아래에 대동맥 판막 전단지를 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
소아에서 자랄 수있는 심장 판막 교체에 대한 긴급한 임상 적 필요성이 있습니다. 심장 판막 이식은 항응고에 대한 필요없이 체세포 성장이 가능한 내구성있는 심장 판막을 제공 할 수있는 잠재력을 가진 새로운 유형의 이식으로 제안됩니다. 그러나 심장 판막 이식의 면역 생물학은 아직 탐구되지 않았으며,이 새로운 유형의 이식을 연구하기 위해 동물 모델의 필요성을 강조합니다. 복부 대동맥으로의 이질성 대동맥 판막 이식을위한 이전의 쥐 모델이 설명되었지만 기술적으로 어렵고 비용이 많이 듭니다. 이 과제를 해결하기 위해 신장 피막 이식 모델은 설치류에서 심장 판막 이식 면역 생물학을 연구하기위한 실용적이고 직접적인 방법으로 개발되었습니다. 이 모델에서는 단일 대동맥 판막 전단지를 수확하여 신장 피막 하부 공간에 삽입합니다. 신장은 쉽게 접근 할 수 있으며, 이식 된 조직은 혈관이 잘 형성되고 다양한 조직 크기를 수용 할 수있는 피막 하 공간에 안전하게 포함되어 있습니다. 또한, 단일 쥐가 세 개의 기증자 대동맥 전단지를 제공 할 수 있고 단일 신장이 이식 된 조직에 여러 부위를 제공 할 수 있기 때문에 주어진 연구에 더 적은 수의 쥐가 필요합니다. 여기에서, 이식 기술이 설명되어, 심장 판막 이식의 이식 면역학을 연구하는데 있어서 중요한 진전을 제공한다.
Introduction
선천성 심장 결함은 인간에서 가장 흔한 선천성 장애로 매년 1,000 명의 출생 아동 중 7 명에게 영향을미칩니다. 다양한 기계 및 생체 보철 판막이 일상적으로 이식되는 성인 환자와 달리 소아 환자는 현재 밸브 교체를위한 좋은 옵션이 없습니다. 이러한 종래의 임플란트는 수용자 소아에서 성장할 가능성이 없다. 결과적으로, 병적 인 재 수술은 아이들이 성장함에 따라 심장 판막 임플란트를 연속적으로 더 큰 버전으로 교환해야하며, 영향을받는 어린이는 종종 평생 동안 최대 다섯 개 이상의 개방 심장 수술을 필요로합니다 2,3. 연구에 따르면 개입이나 사망으로부터의 자유는 나이가 많은 어린이보다 유아에게 현저히 좋지 않으며, 보철 심장 판막이있는 유아의 60 %는 초기 수술 후 3 년 이내에 재 수술 또는 사망에 직면합니다4. 따라서, 소아 환자에서 성장하고 기능을 유지할 수 있는 심장 판막을 전달해야 할 긴급한 필요성이 존재한다.
수십 년 동안 성장하는 심장 판막 대체물을 제공하려는 시도는 조직 공학 및 줄기 세포에 집중되어 왔습니다. 그러나 이러한 밸브를 클리닉으로 번역하려는 시도는 지금까지 성공하지 못했습니다 5,6,7,8. 이를 해결하기 위해, 심장 판막 이식은 자기 회복과 혈전 생성을 피할 수있는 능력을 가진 성장하는 심장 판막 교체를 제공하는보다 창의적인 수술로 제안됩니다. 전심을 이식하는 대신, 심장 판막 만 이식되고 기존의 심장 이식 또는 로스 폐 사인9,10,11과 유사하게 수용자 아이와 함께 자랄 것입니다. 수술 후, 수용자 어린이는 판막의 성장이 더 이상 필요하지 않을 때 이식 된 판막이 성인 크기의 기계적 보철물로 교환 될 때까지 면역 억제를 받게됩니다. 그러나 심장 판막 이식 이식편의 이식 생물학은 아직 탐구되지 않았습니다. 따라서이 새로운 유형의 이식을 연구하기 위해서는 동물 모델이 필요합니다.
몇몇 래트 모델은 복부 대동맥 내로의 대동맥 판막의 이종 국소 이식을 위해 이전에 기술되었다 12,13,14,15,16,17,18. 그러나 이러한 모델은 엄청나게 까다 롭고 종종 숙련 된 외과 의사가 성공적으로 수술해야합니다. 또한 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다19. 심장 판막 이식의 면역 생물학을 연구하기위한 간단한 동물 모델을 만들기 위해 새로운 쥐 모델이 개발되었습니다. 단일 대동맥 판막 전단지를 절제하여 신장 피막 하 공간에 삽입합니다. 신장은 순환 면역 세포20,21에 대한 접근으로 고도로 혈관화되어 있기 때문에 이식 거부를 연구하는 데 특히 적합합니다. 몇몇 다른 사람들이 신장 피막 하 모델을 사용하여 췌장, 간, 신장 및 각막 22,23,24,25,26,27과 같은 다른 동종 이식편 이식의 이식 생물학을 연구했지만,이 위치에서이 위치에서 심장 조직의 이식에 대한 첫 번째 설명입니다. 여기에서, 이식 기술이 설명되어, 심장 판막 이식의 이식 면역학을 연구하는데 있어서 중요한 진전을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드에 따라 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물모델(쥐)에 대한 정보
- 모든 수술 절차에 대해 최대 20x 배율의 작동 현미경 ( 재료 표 참조)을 사용하십시오.
- 실험에 필요한 경우 합성(예: 루이스-루이스) 또는 동종이계(예: 루이스-브라운 노르웨이) 균주를 이식에 사용합니다.
- 실험 질문에 적합한 5-7 주와 100-200g의 체중을 가진 쥐를 사용하십시오.
2. 모피 제거, 피부 준비 및 마취
- 멸균 조건에서 모든 작업을 수행하십시오.
참고: 이 단계는 전용 수술 공간 및 멸균 조건에서 수행됩니다. - 래트를 마취 유도 챔버에 넣고 산소 중의 5% 이소플루란으로 마취를 유도한다. 절차 전반에 걸쳐 산소에서 3.5 % 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
- 기증자 수술을 위해 모피 깎기를 사용하여 쥐의 모피를 움빌리쿠스에서 흉골 노치로 제거하십시오. 받는 사람 수술의 경우, 갈비뼈에서 골반까지 후부 겨드랑이 라인의 수술 필드 위에 머리카락을 클립하십시오. 다음으로, 외과 용 소독제로 피부를 준비하십시오.
- 절차를 시작하기 전에 마취의 수술 평면을 얻을. 집게로 쥐의 발가락을 단단히 압축하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 쥐가 통증으로 물러나면 필요에 따라 마취제를 적정하십시오.
- 절차 전반에 걸쳐 임상적으로 호흡률과 마취의 깊이를 모니터링; 이소플루란의 수준은 55-65 호흡 / 분의 호흡 속도를 유지하기 위해 필요에 따라 조정됩니다.
3. 기증자 운영
- 단계 2에 명시된 바와 같이 래트를 준비하고 마취시킨다. 해부 가위를 사용하여 xiphoid에서 흉골 노치까지 피부를 절개하십시오. 심장에 대한 최적의 접근이 달성 될 때까지 흉골에 양쪽의 갈비뼈를 옆으로 절단하여 흉골 절제술을 수행하십시오.
- 왼쪽 심방에 100 U / 100g의 주사로 쥐를 헤파리네이션하십시오.
- exsanguination을 통해 기증자를 희생하십시오.
- 큰 혈관의 시각화를 향상시키기 위해 흉선을 소비하십시오. 그런 다음, 불명타 동맥의 수준까지 상승하는 대동맥으로 심장 en bloc을 제거하십시오.
4. 대동맥판막 전단지의 제조
- 기증자 심장을 cardiectomy 직후에 멸균 된 Petri 접시에 넣으십시오. 얼음처럼 차가운 냉장 저장 버퍼에서 기증자 심장을 해부하십시오 ( 재료 표 참조).
- 포셉과 Vannas 스프링 가위를 사용하여 대동맥 뿌리 만 대동맥 판막에 근위에있는 1mm 심실 커프스로 남을 때까지 기증자 심장을 해부하십시오.
- 왼쪽 및 비 관상 동맥 부비동 사이의 Valsalva의 부비동을 열어 세 개의 전단지를 모두 시각화하기 위해 세로 절단을 만들어 대동맥 밸브를 엽니 다.
참고 : 컷은 Valsalva의 Sinus의 전체 길이가되어야합니다. 실제 치수는 쥐의 크기에 달려 있습니다. - 각 대동맥 판막 전단지를 개별적으로 소비하십시오. 특히, 무딘 포셉을 사용하여 전단지의 가장자리를 잡고 Vannas 스프링 가위를 사용하여 하나의 컴미스 슈어에서 환부로 자른 다음 다음 컴펌으로 절단하여 전단지를 소비하십시오.
참고 : 판막 내피 세포의 파괴를 최소화하기 위해 전단지의 가장자리 만 파악하도록 특별한주의를 기울이십시오. - 전단지 절제 후 샘플을 수용자 쥐에 이식 할 준비가 될 때까지 얼음처럼 차가운 저장 완충 용액에 보관하십시오. 냉장 보관 후 4 시간 이내에 모든 전단지를 이식하십시오.
5. 수신자 작업
- 단계 2에 명시된 바와 같이 래트를 준비하고 마취시킨다. 36-38°C로 유지되는 가열 패드를 사용하여 수술을 수행한다.
- 부프레노르핀 (0.03 mg / kg)을 수술 전에 모든 수혜자 쥐에게 피하 투여하고 통증을 완화하기 위해 필요에 따라 수술 후 6-12 시간마다 투여하십시오.
- 쥐를 왼쪽 신장에 접근하기 위해 오른쪽 측면 재사용 위치에 놓습니다.
참고 : 왼쪽 신장은 오른쪽 신장에 비해 더 많은 인과 적 위치 때문에 선호됩니다. - 가위를 사용하여 옆구리의 피부를 세로 방향으로 1 인치 이상 절개하십시오.
참고: 절개는 신장의 크기보다 작게 유지되어야 신장이 시술 중에 복강으로 후퇴하는 것을 방지하기에 충분한 긴장을 제공할 수 있습니다. - 마찬가지로, 근본적인 복벽을 절개하십시오.
- 신장 외부화
- 엄지와 검지를 사용하여 복부와 피부 절개를 통해 신장의 꼬리 극을 들어 올리기 위해 곡선 포셉을 사용하는 동안 등쪽과 심실로 가벼운 압력을 가하십시오. 유사하게 신장의 두개골 끝을 외부화하십시오.
- 대안으로, 신장은 주변 신장 지방을 파악하고 가벼운 긴장으로 위쪽으로 당겨서 외부화 될 수 있습니다.
주의: 신장이나 신장 혈관을 직접 잡지 않도록 주의하십시오. - 신장이 외부화되면 신장에 흘러 들어간 따뜻한 식염수로 촉촉하게 유지하십시오.
- 피막 아래 포켓을 만듭니다.
- 한 세트의 무딘 포셉을 사용하여 신장 캡슐에 가볍게 압력을 가하여 신장 캡슐이 기본 실질과 명확하게 구별 될 수 있도록하십시오. 동시에 다른 무딘 포셉 세트를 사용하여 캡슐을 조심스럽게 잡고 부드럽게 위쪽으로 당겨 캡슐에 구멍을 만듭니다.
참고 : 캡슐의 섬세한 특성으로 인해이 절개를 확립하기 위해서는 최소한의 힘이 필요합니다. - 무딘 포셉을 계속 사용하여 대동맥 판막 전단지를 수용하기 위해 ~ 2mm 공간이 생성 될 때까지 절개를 연장하십시오.
- 밸브 전단지보다 약간 큰 얕은 피막 하부 포켓을 개발하면서 한 세트의 포셉으로 절개 가장자리를 들어 올리고 신장 캡슐 아래에서 무딘 프로브를 전진시킵니다.
- 한 세트의 무딘 포셉을 사용하여 신장 캡슐에 가볍게 압력을 가하여 신장 캡슐이 기본 실질과 명확하게 구별 될 수 있도록하십시오. 동시에 다른 무딘 포셉 세트를 사용하여 캡슐을 조심스럽게 잡고 부드럽게 위쪽으로 당겨 캡슐에 구멍을 만듭니다.
- 대동맥 판막을 피막 하부 주머니에 이식하십시오.
- 냉장 보관에서 대동맥 전단지를 회수하여 수술 현장에 보관하십시오.
- 가장자리 섬유질 캡슐을 들어 올리면서 대동맥 전단지를 무딘 포셉으로 피막 하부 주머니에 넣으십시오.
참고: 조직이 절개에서 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하여 캡슐 아래에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 근본적인 실질의 손상이나 섬유질 캡슐의 추가 찢어짐을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. - 신장 캡슐의 절개는 열어 둘 수 있습니다.
- 절개 가장자리에 적용된 반대 견인을 사용하여 신장을 해부학 적 위치로 부드럽게 밀어 넣으십시오.
- 실행 멸균 수술 봉합사로 복부 절개를 닫습니다. 스테이플로 피부를 닫으십시오.
- 수술 후 치료
- 수술 후, 쥐를 음식과 물에 접근 할 수있는 가열 패드의 깨끗한 케이지에 넣으십시오.
- 일상적인 상처 치유와 통증이나 고통의 징후를 평가하기 위해 동물을 매일 모니터링하십시오. 7-10 일 후에 스테이플을 제거하십시오.
6. 분석을 위한 조직 수집
- 이식 후 선택된 종점에서 삼출에 의해 동물을 안락사시킨다. 구체적으로, 중간 개복술을 수행하고 복부 대동맥을 산소 중 5% 이소플루란 하에 횡단한다.
- 신장을 동원하고 신장 동맥, 정맥 및 요관을 가위로 절단하여 소비하십시오.
참고 : 이식 된 전단지가 들어있는 영역을 파악하지 않도록주의하십시오. - 신장을 포르말린에 밤새 넣고 파라핀에 묻힌 다음 원하는 염색을 위해 절개하십시오. 신장 캡슐이 앞쪽을 향하고 신장 실질이 후방을 향하도록 표본을 향하게하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
쥐 모델에 대한 실험 설계의 그래픽 묘사가 제공됩니다 (그림 1). 또한, 기증자의 심장에서 해부된 대동맥 뿌리와 이식을 위해 준비된 개별 대동맥 판막 전단지도 도 2에 도시되어 있다. 다음으로, 이식용 신장 캡슐 아래의 대동맥판막 전단지의 위치에 대한 대표적인 이미지를 도 3A 및 수용자 랫트 내 3, 7, 및 28일 후(도 3B-D)에 도시하여, 이식된 조직을 찾아 회수하는 용이성을 입증한다.
대동맥 판막 전단지는 syngeneic 동물에서 이종 국소 이식 후 그들의 본래 건축을 유지하고, 동종 이식에서 면역 반응을 비교하기 위한 기준선으로서 이 모델의 유용성을 입증한다. 특히, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 이용한 조직학은 7일 후 합성이식의 판막 전단지가 부종성 부종의 징후 없이 구조적으로 손상되지 않았다는 것을 밝혀냈다(도 4A). 밸브 리플릿의 구조적 완전성은 알파 평활근 액틴(aSMA) 및 CD31에 대한 면역조직화학에 의해 추가로 확인되었다(도 4B).
도 1: 래트에서 신장 캡슐 아래의 대동맥판막의 헤테로토픽 이식의 실험 설계. 심장은 공여체 래트(A)로부터 수집된다. 대동맥판막 전단지를 해부하고 수용자 래트(C)에서 신장 캡슐 하에 이식 과정이 진행될 때까지 냉장 보관(B)에 보관한다. 그런 다음 전단지를 설정된 시점에서 파싱하고 현미경으로 분석합니다 (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 이식을위한 대동맥 판막 전단지의 제조. 공여체 심장으로부터 해부된 대동맥 뿌리의 예(A) 및 이식을 위한 대동맥 판막 전단지의 추가 해부(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신장 캡슐 아래의 대동맥 판막 전단지의 시각화. 대동맥판막 전단지는 동종 동물에서 합성동물에 이식(A), 3(B), 7일(C), 및 28일(D) 후, 동종이계 동물에서 3(E), 7일(F), 및 28일(G) 후에 신장 캡슐 하에서 시각화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대동맥판막 전단지는 합성 동물에서 7일 동안 신장 캡슐 아래에 이식한 후 구조적으로 온전하게 유지됩니다. 맨 위 행은 조달되었지만 이식되지 않은 심장 판막 조절을 위해 DAPI, aSMA 및 CD31에 대한 H & E 염색 및 면역 염색을 보여줍니다. 하단 행은 7 일 후에 explanted syngeneic valve 전단지에서 DAPI, aSMA 및 CD31에 대한 H & E 염색 및 면역 염색을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
중요성 및 잠재적 응용 프로그램
기계 및 생체 보철 심장 판막은 판막 교체가 필요한 성인 환자에서 일상적으로 사용되지만, 이러한 판막은 성장할 잠재력이 부족하여 소아 환자에게 차선책입니다. 심장 판막 이식은 선천성 심장 질환을 앓고있는 신생아 및 유아에게 성장하는 심장 판막 대체물을 제공하도록 설계된 실험 수술입니다. 그러나 기존의 심장 이식의 이식 면역 생물학과는 달리,이 새로운 유형의 이식의 이식 면역 생물학은 여전히 잘 탐구되지 않았습니다. 여기에서, 대동맥판막 전단지의 피막하 신장 이식을 위한 독특한 래트 모델이 설명되어, 심장 판막 이식의 이식 면역생물학을 연구하는데 있어서 중요한 진전을 제공한다.
신장 피막 하 공간은 심장 판막의 이식 면역 생물학을 연구 할 수있는 최적의 환경을 제공합니다. 이식된 조직은 순환 면역 세포(20)에 접근할 수 있는 잘 혈관화된 위치에 안전하게 함유된다. 추가적으로, 피막 하 모델은 이전에 췌장, 간, 신장 및 다른 세포 유형 22,23,24,25,26,27과 같은 많은 조직에서 동종이식편 거부반응을 시험하는데 성공적으로 활용되었으며, 이는 이 모델이 대동맥 판막 전단지의 면역원성을 연구하는데 정당하다는 것을 나타낸다.
이 모델에는 대동맥 판막의 이식 면역학을 연구하기위한 몇 가지 protentional 응용 프로그램이 있습니다. 먼저, 상기 모델은 타크롤리무스, 마이코페놀레이트 및 스테로이드와 같은 이식편 거부반응을 예방하기 위해 심장 판막 이식에 필요한 전신 면역 억제의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 몇몇 연구에 따르면 판막 조직은 기존의 심장 이식 28,29,30의 완전한 거부 중에 판막이 상대적으로 절약되기 때문에 다른 심장 조직과 면역학적으로 구별 될 수 있습니다. 이 모델은 피막 하부 공간이 밸브 전단지 및 심근과 같은 다양한 조직 유형을 수용 할 수 있기 때문에이 개념의 탐구를 허용하여 이러한 조직의 면역원성을 비교합니다.
이 모델은 기술적으로 간단하고 빠르며 합병증의 위험이 낮고 생존율이 높기 때문에 유리합니다. 각 기증자는 세 개의 대동맥 판막 전단지를 제공 할 수 있기 때문에 한 마리의 쥐가 세 명의 다른 수령인을위한 기증자 역할을 할 수 있습니다. 평균적으로 공여체 수술의 길이는 27.2 분 (n = 12)이었고 수혜자 수술 기간은 29.7 분 (n = 36)이었다. 수술 수용자의 생존율은 97.2 % (n = 35/36)였으며 호흡 억제로 인한 수술 중 한 명이 사망했습니다. 피막 하부 주머니를 만드는 동안 신장 실질에 대한 외상으로 인한 출혈을 최소화하는 것은 수혜자 수술의 11.1 %에서 나타났습니다. 그러나 출혈은 면화 팁 어플리케이터의 압축으로 모든 경우에 쉽게 제어되었습니다. 한 샘플은 피막 하부 공간에서 빠져 나갔고 7 일 후에도 설명시 회복되지 않았습니다.
이전에는 밸브 전단지를 피막 하부 공간에서 제거하여 배설하고 부착 된 대동맥 조직없이 삽입, 절편화 및 염색했습니다. 그러나이 방법은 전단지 자체가 매우 작고 얇고 투명하기 때문에 최적이 아니며 처리 과정에서 여러 샘플이 손실됩니다. 대신, 신장 en bloc을 제거하고 신장 캡슐 아래에 고정되어있는 동안 조직을 삽입하고 절편하여 샘플이 손실되지 않도록하는 것이 좋습니다. 또한이 접근법은 전단지의 외상과 조작을 최소화합니다.
중요한 단계
절차의 중요한 단계는 마취의 수술 평면을 수립하고, 신장 위의 복벽을 절개하고, 신장을 수정하고, 피막 하 플랩을 높이고, 이질적 인 이식 조직을 삽입하고, 지혈을 얻고, 신장을 해부학 적 위치로 되돌리고, 피부를 닫는 것입니다.
수정 및 문제 해결
이것이 신장 캡슐 아래의 심장 조직 이식에 대한 첫 번째 설명이지만, 몇몇 다른 것들은 신장 피막 하부 공간 20,22,23,24,25,26,27에서 다른 조직 유형의 이식을 기술했다. 이 프로토콜에서는 기술을 최적화하고 합병증을 최소화하기 위해 이전의 피막 하 모델을 약간 조정했습니다. 특히, 다른 사람들은 Vannas 스프링 가위를 사용하여 신장 캡슐20,26으로 초기 절개를 할 것을 권장했지만,이 방법은 기저 실질에 외상을 입히고 피막 하 혈종 형성을 초래할 가능성이 더 큽니다. 너무 많은 출혈은 캡슐의 팽창을 초래하고 이식 된26의 보안을 손상시킵니다. 따라서 무딘 포셉을 사용하여 캡슐을 열어야합니다. 또한, 일부 프로토콜은 협막 절개26,31에 대한 동정 성질을 가진 상업용 제품의 배치를 옹호하는 반면, 조직이 피막 하부 주머니로 충분히 멀리 전진하는 한이 단계는 불필요합니다.
더 큰 쥐에서는 신장이 주변 지방으로 덮일 수 있으며 구부러진 포셉 으로 들어 올리 면 신장을 외부화하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이 경우 포셉으로 주변 신장 지방을 부드럽게 잡아 당기고 손상이나 출혈없이 복강 밖으로 신장을 당겨 신장을 외부화하는 것이 가장 좋습니다.
기존 이종 이식 모델과의 비교
이질성 대동맥판막 이식을 위한 몇몇 다른 동물 모델들이 이전에 기술되었지만, 12,13,14,15,16,17,18, 현재의 프로토콜은 여러 가지 방법으로 이전 모델을 개선하는 간단하고 보다 실용적인 대안을 제공한다. 첫째, 절차의 기술적으로 간단한 특성으로 인해 성공적으로 작동하려면 교육이 거의 필요하지 않습니다. 이것은 복부 대동맥으로의 이전에 설명 된 이질적 대동맥 판막 이식과는 뚜렷한 대조를 이룬다. 따라서, 이 모델은 쥐의 이환률, 통증 및 사망률을 최소화하면서 대동맥판막 이식을 연구하기 위한 보다 실용적이고 비용 효율적인 대안을 제공한다. 또한, 수용자 수술을 위해 단 하나의 대동맥 판막 전단지가 필요하고 각 기증자 쥐가 세 개의 전단지를 제공하기 때문에 주어진 실험에 더 적은 수의 기증자 쥐가 필요합니다. 또한, 대측성 신장 또는 별도의 피막 하부 포켓에 조직을 이식하는 것은 단일 래트 내의 다양한 조직에 대한 면역 반응의 내부 조절 또는 비교를 허용할 수 있다. 이 경우 가장 좋은 방법은 중간 선 개복술 절개를 사용하는 것입니다.
복부 대동맥으로의 이종토픽 대동맥 판막 이식을 기술하는 동물 모델 외에도, 다른 연구들은 대동맥 판막(32)의 면역원성을 연구하기 위해 피하 모델을 이용하였다. 이 접근법은 의심 할 여지없이 복부 대동맥으로의 이식보다 더 간단하지만, 기존의 증거는 피하 이식이 항원 제시의 덜 효과적인 방법임을 시사한다33,34. 이식 된 표본은 또한 찾고 분석하기가 어렵습니다. 따라서, 신장 피막 하부 공간은 대동맥판막 이식 생물학을 연구하기 위해 단순화되면서도 최적인 이식 부위로서 제안된다.
요약하면, 새로 제안 된 모델은 심장 판막 이식을 연구하고 이전에 설명 된 모델을 보완하기 위해 과학자들의 군비에 추가 역할을합니다.
제한
신장 캡슐 아래에 대동맥 판막 전단지를 이식하는 것이 생체 내에서 동종 면역을 연구하는 효율적인 방법이지만,이 모델의 몇 가지 한계가 존재합니다. 피막 하부 공간은 혈관이 잘 되어 있지만, 관상동맥 하부 위치와 동일한 혈역학적 환경을 제공하지는 않는다. 이것은 이식 된 조직에 대한 면역 반응에 영향을 줄 수 있습니다. 일부는 판막 조직에서 관찰 된 뚜렷한 면역 특성이 관상 동맥 하부 위치의 대동맥 판막에 대한 고혈압 혈류로 인해 발생할 수 있으며 화학 주성 반응28,35를 무효화 할 수 있다고 가정했습니다. 더욱이, 이 모델은 전단지가 신장 캡슐 하에서 그들의 생리학적 기능을 수행하지 않기 때문에 밸브 기능에 대한 동종 활성의 효과를 연구하기에 불충분하다. 그러나, 이종국소 복부대동맥 이식 모델에 대해서도 유사한 한계가 존재하는데, 이들 모델의 성공은 이식편 혈전증15,36을 피하기 위해 무능한 판막 전단지를 렌더링하는 것에 의존하기 때문이다.
프로토콜의 한계에는 조직이 신장 피막 하부 공간에서 빠져 나와 회복 할 수 없을 가능성이 포함됩니다 (36 마리의 동물 중 1 마리). 또 다른 제한은 수술 중 동물의 죽음입니다 (36 마리의 동물 중 1 마리); 그러나 사망은 buprenorphine의 과다 복용으로 인해 발생했으며 진통제를 투여하기위한 다른 방법이 사용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
그림 1은 biorender.com 로 작성되었습니다. 이 작업은 AATS 재단 외과 연구자 프로그램 TKR, 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 소아과에서 보유한 어린이 우수 기금, TKR에 대한 에머슨 로즈 심장 재단 보조금, 폴 캠벨 상원 의원의 자선 활동 TKR, NIH-NHLBI 기관 박사후 교육 보조금 (T32 HL-007260)에 의해 JHK 및 BG에 부분적으로 지원되었습니다. 그리고 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 의과 대학 사전 서기 FLEX 연구 기금 MAH에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chlordie, USP | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4-0 Polyglactin 910 | Ethicon | J415H | |
| 7.5% Povidone-Iodine | CareFusion | 29904-004 | |
| 70% ETOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Air-tight inducton chamber for rats |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging |
| Anesthesia Mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Rat anesthesia mask |
| Brown Norway Rats (BN/Crl) | Charles River | Strain Code 091 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 0.03 mg/kg, administered subcutaneously |
| Electric hair clippers | WAHL | 79434 | |
| Electric Heating Pad | Harvard Apparatus | 72-0492 | Maintained at 36-38 °C |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | 100U/100g injection into the left atrium |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Iris forceps curved | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris forceps straight | World Precision Instruments | 15916 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen |
| Lewis Rats (LEW/ Crl) | Charles River | Strain Code 004 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Micro forceps | World Precision Instruments | 500233 | Dumont #5 |
| Micro scissors | World Precision Instruments | 501930 | Spring-loaded Vannas Scissors |
| Needle Driver | World Precision Instruments | 500226 | Ryder Needle Driver |
| Operating microscope | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Stereo Microscope |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Skin staples | Ethicon | PXR35 | Proximate 35 |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile gauze sponges | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Scissors |
| University of Wisconsin Buffer (Servator B) | S.A.L.F S.p.A. | 6484A1 | Stored at 4 °C |
References
- Van Der Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Jacobs, J. P., et al. Reoperations for pediatric and congenital heart disease: An analysis of the Society of Thoracic Surgeons (STS) congenital heart surgery database. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 17 (1), 2-8 (2014).
- Syedain, Z. H., et al. Pediatric tri-tube valved conduits made from fibroblast-produced extracellular matrix evaluated over 52 weeks in growing lambs. Science Translational Medicine. 13 (585), 1-16 (2021).
- Khan, M. S., Samayoa, A. X., Chen, D. W., Petit, C. J., Fraser, C. D. Contemporary experience with surgical treatment of aortic valve disease in children. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 146 (3), 512-521 (2013).
- Boyd, R., Parisi, F., Kalfa, D. State of the art: Tissue engineering in congenital heart surgery. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31 (4), 807-817 (2019).
- Feins, E. N., Emani, S. M. Expandable valves, annuloplasty rings, shunts, and bands for growing children. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 23, 17-23 (2020).
- Lintas, V., et al. TCT-795 Human cell derived off-the-shelf tissue engineered heart valves for next generation transcatheter aortic valve replacement: a proof-of-concept study in adult sheep. Journal of the American College of Cardiology. 70 (18), 271 (2017).
- Blum, K. M., Drews, J. D., Breuer, C. K. Tissue-engineered heart valves: A call for mechanistic studies. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (3), 240-253 (2018).
- Bernstein, D., et al. Cardiac growth after pediatric heart transplantation. Circulation. 85 (4), 1433-1439 (1992).
- Delmo Walter, E. M., et al. Adaptive growth and remodeling of transplanted hearts in children. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 40 (6), 1374-1383 (2011).
- Simon, P., et al. Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 19 (2), 118-121 (2001).
- Oei, F. B. S., et al. A size-matching heterotopic aortic valve implantation model in the rat. Journal of Surgical Research. 87 (2), 239-244 (1999).
- Oei, F. B. S., et al. Heart valve dysfunction resulting from cellular rejection in a novel heterotopic transplantation rat model. Transplant International. 13, SUPPL. 1 (2000).
- El Khatib, H., Lupinetti, F. M. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allografts. Transplantation. 49 (4), 765-767 (1990).
- Yankah, A. C., Wottge, H. U. Allograft conduit wall calcification in a model of chronic arterial graft rejection. Journal of Cardiac Surgery. 12 (2), 86-92 (1997).
- Moustapha, A., et al. Aortic valve grafts in the rat: Evidence for rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 114 (6), 891-902 (1997).
- Légaré, J. F., et al. Prevention of allograft heart valve failure in a rat model. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 122 (2), 310-317 (2001).
- Legare, J. F., Lee, T. D. G., Creaser, K., Ross, D. B., Green, M. T lymphocytes mediate leaflet destruction and allograft aortic valve failure in rats. The Annals of Thoracic Surgery. 70 (4), 1238-1245 (2000).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Burgin, M., et al. Kidney Subcapsular Allograft Transplants as a Model to Test Virus-Derived Chemokine-Modulating Proteins as Therapeutics. Methods in molecular biology. 2225, Clifton, N.J. 257-273 (2021).
- Foglia, R. P., DiPreta, J., Donahoe, P. K., Statter, M. B. Fetal allograft survival in immunocompetent recipients is age dependent and organ specific. Annals of Surgery. 204 (4), 402-410 (1986).
- Cunha, G. R., Baskin, L. Use of sub-renal capsule transplantation in developmental biology. Differentiation. 91 (4-5), 4-9 (2016).
- Hori, J., Joyce, N., Streilein, J. W. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule. Investigative Opthalmology & Visual Science. 41 (2), 443-452 (2000).
- Mandel, T., et al. transplantation of organ cultured fetal pig pancreas in non-obese diabetic (NOD) mice and primates (Macaca fascicularis). Xenotransplantation. 2 (3), 128-132 (1995).
- Ricordi, C., Flye, M. W., Lacy, P. E. Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets. Transplantation. 45 (6), 1148-1150 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Subcapsular transplantation of tissue in the kidney. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 737-740 (2014).
- Vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Mitchell, R. N., Jonas, R. A., Schoen, F. J. Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants. Journal of Thoracic and Cardiovasular Surgery. 115 (1), 118-127 (1998).
- Valante, M., et al. The aortic valve after heart transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 60, SUPPL. 2 (1995).
- O'Brien, M. F., Stafford, E. G., Gardner, M. A. H., Pohlner, P. G., McGiffin, D. C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 94 (6), 812-823 (1987).
- Ng, T. F., Osawa, H., Hori, J., Young, M. J., Streilein, J. W. Allogeneic neonatal neuronal retina grafts display partial immune privilege in the subcapsular space of the kidney. The Journal of Immunology. 169 (10), 5601-5606 (2002).
- Heslop, B. F., Wilson, S. E., Hardy, B. E. Antigenicity of aortic valve allografts. Annals of Surgery. 177 (3), 301-306 (1973).
- Steinmuller, D., Weiner, L. J. Evocation and persistence of transplantation immunity in rats. Transplantation. 1 (1), 97-106 (1963).
- Billingham, R. E., Brent, L., Brown, J. B., Medawar, P. B. Time of onset and duration of transplantation immunity. Plastic and Reconstructive Surgery. 24 (1), 410-413 (1959).
- Tector, A. J., Boyd, W. C., Korns, M. E. Aortic valve allograft rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (4), 592-601 (1971).
- Sugimura, Y., Schmidt, A. K., Lichtenberg, A., Akhyari, P., Assmann, A. A rat model for the in vivo assessment of biological and tissue-engineered valvular and vascular grafts. Tissue Engineering Methods (Part C). 23 (12), 982-994 (2017).
