Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج مبسط لزرع صمام القلب غير المتجانس في القوارض

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/62948
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لزرع وريقات الصمام الأبهري تحت الكبسولة الكلوية للسماح بدراسة الحساسية لصمامات القلب.

Abstract

هناك حاجة سريرية ملحة لاستبدال صمام القلب التي يمكن أن تنمو عند الأطفال. يقترح زرع صمام القلب كنوع جديد من عمليات الزرع مع إمكانية توفير صمامات قلب متينة قادرة على النمو الجسدي دون الحاجة إلى منع التخثر. ومع ذلك، لا تزال البيولوجيا المناعية لعمليات زرع صمام القلب غير مستكشفة، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى نماذج حيوانية لدراسة هذا النوع الجديد من عمليات الزرع. تم وصف نماذج الفئران السابقة لزرع الصمام الأبهري غير المتجانس في الشريان الأورطي البطني ، على الرغم من أنها صعبة تقنيا ومكلفة. لمواجهة هذا التحدي ، تم تطوير نموذج زرع تحت المحفظة الكلوية في القوارض كطريقة عملية وأكثر وضوحا لدراسة البيولوجيا المناعية لزرع صمام القلب. في هذا النموذج ، يتم حصاد وريقة صمام أبهري واحدة وإدخالها في الفضاء تحت المحفظة الكلوية. يمكن الوصول إلى الكلى بسهولة ، ويتم احتواء الأنسجة المزروعة بشكل آمن في مساحة تحت المحفظة التي يتم توعيتها بشكل جيد ويمكن أن تستوعب مجموعة متنوعة من أحجام الأنسجة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الفئران الواحدة يمكن أن توفر ثلاثة منشورات أبهرية من متبرع ويمكن أن توفر كلية واحدة مواقع متعددة للأنسجة المزروعة ، فهناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران لدراسة معينة. هنا ، يتم وصف تقنية الزرع ، مما يوفر خطوة مهمة إلى الأمام في دراسة مناعة الزرع لزرع صمام القلب.

Introduction

عيوب القلب الخلقية هي الإعاقة الخلقية الأكثر شيوعا لدى البشر ، حيث تؤثر على 7 من كل 1000 طفل مولود على قيد الحياة كل عام1. على عكس المرضى البالغين الذين يتم زرع العديد من الصمامات الميكانيكية والاصطناعية الحيوية بشكل روتيني ، لا يملك المرضى الأطفال حاليا خيارات جيدة لاستبدال الصمام. هذه الغرسات التقليدية ليس لديها القدرة على النمو في الأطفال المتلقين. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى إعادة العمليات المرضية لاستبدال غرسات صمام القلب بإصدارات أكبر على التوالي مع نمو الأطفال، وغالبا ما يحتاج الأطفال المصابون إلى ما يصل إلى خمس عمليات جراحية أو أكثر للقلب المفتوح في حياتهم 2,3. أظهرت الدراسات أن التحرر من التدخل أو الوفاة ضعيف بشكل كبير بالنسبة للرضع مقارنة بالأطفال الأكبر سنا ، حيث يواجه 60٪ من الرضع الذين لديهم صمامات قلب اصطناعية إعادة التشغيل أو الوفاة في غضون 3 سنوات من العملية الأولية4. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتقديم صمام القلب الذي يمكن أن ينمو ويحافظ على وظيفته في المرضى الأطفال.

على مدى عقود، تركزت محاولات تقديم بدائل صمامات القلب المتنامية على هندسة الأنسجة والخلايا الجذعية. ومع ذلك ، فإن محاولات ترجمة هذه الصمامات إلى العيادة لم تنجح حتى الآن5،6،7،8. لمعالجة هذا الأمر، يقترح إجراء عملية زرع صمام القلب كعملية أكثر إبداعا لتقديم عمليات استبدال صمام القلب المتنامية التي لديها القدرة على الإصلاح الذاتي وتجنب تكوين الجلطات. بدلا من زرع القلب كله ، يتم زرع صمام القلب فقط ثم ينمو مع الطفل المتلقي ، على غرار عمليات زرع القلب التقليدية أو توقيع روس الرئوي9،10،11. بعد العملية الجراحية، سيتلقى الأطفال المتلقين كبت المناعة حتى يمكن استبدال الصمام المزروع بطرف اصطناعي ميكانيكي بحجم البالغين عندما لا يكون نمو الصمام مطلوبا. ومع ذلك ، فإن بيولوجيا زرع الطعوم زرع صمام القلب لا تزال غير مستكشفة. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية لدراسة هذا النوع الجديد من عمليات الزرع.

تم وصف العديد من نماذج الفئران سابقا لزرع الصمام الأبهري غير المتجانس في الشريان الأبهري البطني12،13،14،15،16،17،18. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج صعبة للغاية ، وغالبا ما تتطلب جراحين مدربين للعمل بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، فهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا19. تم تطوير نموذج جديد للفئران لإنشاء نموذج حيواني أبسط لدراسة البيولوجيا المناعية لعمليات زرع صمام القلب. يتم استئصال وريقات الصمام الأبهري المفردة وإدخالها في الفضاء تحت المحفظة الكلوية. الكلى مناسبة بشكل خاص لدراسة رفض الزرع لأنها شديدة الأوعية الدموية مع إمكانية الوصول إلى الخلايا المناعية المتداولة20,21. في حين أن العديد من الآخرين قد استخدموا نموذجا تحت المحفظة الكلوية لدراسة بيولوجيا الزرع لعمليات زرع اللوغراف الأخرى مثل البنكرياس والكبد والكلى والقرنية 22،23،24،25،26،27 ، هذا هو الوصف الأول لزرع أنسجة القلب في هذا الموقف. هنا ، يتم وصف تقنية الزرع ، مما يوفر خطوة مهمة إلى الأمام في دراسة مناعة الزرع لزرع صمام القلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة البحوث الحيوانية بعد دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. معلومات عن النموذج الحيواني (الفئران)

  1. استخدم مجهر التشغيل (انظر جدول المواد) مع تكبير يصل إلى 20x لجميع العمليات الجراحية.
  2. استخدم سلالات syngeneic (مثل Lewis-Lewis) أو الخيفية (مثل Lewis-Brown Norway) لعمليات الزرع حسب الحاجة للتجربة.
  3. استخدم الفئران التي يتراوح عمرها بين 5-7 أسابيع ووزن الجسم 100-200 جم المناسبة للسؤال التجريبي.

2. إزالة الفراء ، وإعداد الجلد ، والتخدير

  1. إجراء جميع العمليات في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوة في مساحة جراحية مخصصة وتحت ظروف معقمة.
  2. ضع الفئران في غرفة تحريض مخدرة وحث التخدير مع 5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين. الحفاظ على التخدير مع 3.5 ٪ من الايزوفلوران في الأكسجين طوال العملية.
  3. بالنسبة لعملية المتبرع ، قم بإزالة فرو الفئران من السرة إلى الشق القصي باستخدام مقصات الفراء. بالنسبة لعملية المتلقي، قم بقص الشعر فوق المجال الجراحي عند خط الإبط الخلفي من الأضلاع إلى الحوض. بعد ذلك ، قم بإعداد الجلد بمطهر جراحي.
  4. الحصول على مستوى جراحي من التخدير قبل البدء في الإجراء. تأكد من عمق التخدير الكافي عن طريق ضغط أصابع الفئران بإحكام باستخدام الملقط. إذا انسحب الفئران إلى الألم ، فقم بمعايرة المخدر حسب الحاجة.
  5. مراقبة معدل التنفس وعمق التخدير سريريا طوال العملية ؛ يتم ضبط مستوى الايزوفلوران حسب الحاجة للحفاظ على معدل التنفس من 55-65 نفسا / دقيقة.

3. تشغيل المتبرع

  1. تحضير وتخدير الفئران كما هو مذكور في الخطوة 2. شق الجلد من الخنفساء إلى الشق القصي باستخدام مقص تشريح. قم بإجراء استئصال القص عن طريق قطع الأضلاع على كل جانب جانبي للقص حتى يتم تحقيق الوصول الأمثل إلى القلب.
  2. هيبارين الفئران مع 100 U / 100 غرام من الحقن في الأذين الأيسر.
  3. التضحية بالمتبرع عن طريق التفريغ.
  4. استئصال الغدة الصعترية لتحسين تصور الأوعية الكبيرة. ثم ، قم بإزالة القلب في كتلة مع الشريان الأورطي الصاعد حتى مستوى الشريان المرشح.

4. إعداد وريقات الصمام الأبهري

  1. ضع قلب المتبرع في طبق بتري معقم مباشرة بعد استئصال القلب. تشريح قلب المتبرع في مخزن مؤقت للتخزين البارد المثلج (انظر جدول المواد).
  2. باستخدام ملقط ومقص نابض Vannas ، قم بتشريح قلب المتبرع حتى يبقى جذر الأبهر فقط مع كفة بطينية 1 مم قريبة من الصمام الأبهري.
  3. افتح الصمام الأبهري عن طريق إجراء قطع طولي لفتح الجيوب الأنفية في فالسالفا بين الجيوب الأنفية اليسرى وغير التاجية لتصور جميع الوريقات الثلاث.
    ملاحظة: يجب أن يكون القطع كامل طول الجيوب الأنفية في فالسالفا. تعتمد الأبعاد الفعلية على حجم الفئران.
  4. قم باستئصال كل وريقة صمام أبهري على حدة. على وجه التحديد ، استخدم ملقط حاد للإمساك بحافة النشرة واستخدم مقص فاناس الربيعي لاستئصال النشرة عن طريق القطع من كوميشور واحد وصولا إلى الحلقة ، ثم نحو الكومسيسور التالي.
    ملاحظة: احرص بشكل خاص على الإمساك بحافة النشرة فقط لتقليل اضطراب الخلايا البطانية الصمامية.
  5. قم بتخزين العينات بعد استئصال النشرة في محلول مخزن مؤقت للتخزين البارد حتى تصبح جاهزة للزرع في الفئران المتلقية. زرع جميع المنشورات في غضون 4 ساعات من التخزين البارد.

5. عملية المستلم

  1. تحضير وتخدير الفئران كما هو مذكور في الخطوة 2. استخدم وسادة تدفئة يتم الحفاظ عليها عند 36-38 درجة مئوية لإجراء الجراحة.
  2. إعطاء البوبرينورفين (0.03 مغ/كغ تحت الجلد) لجميع الفئران المتلقية قبل الجراحة وكل 6-12 ساعة بعد العملية الجراحية حسب الحاجة لتخفيف الألم.
  3. ضع الفئران في وضع الراقد الجانبي الأيمن للوصول إلى الكلى اليسرى.
    ملاحظة: يفضل استخدام الكلى اليسرى بسبب وضعها الذيلي بالنسبة للكلية اليمنى.
  4. شق الجلد فوق الجناح طوليا أكثر من 1 بوصة باستخدام مقص.
    ملاحظة: يجب أن يظل الشق أصغر من حجم الكلى لتوفير توتر كاف لمنع الكلى من التراجع مرة أخرى إلى تجويف البطن أثناء العملية.
  5. وبالمثل ، شق جدار البطن الأساسي.
  6. إضفاء الطابع الخارجي على الكلى
    1. باستخدام الإبهام والسبابة ، قم بتطبيق ضغط خفيف ظهريا وبطنيا أثناء استخدام ملقط منحني لرفع القطب الذيلي للكلية من خلال شق البطن والجلد. إضفاء الطابع الخارجي على نهاية الجمجمة من الكلى بالمثل.
    2. بدلا من ذلك ، قد تكون الكلى خارجية عن طريق الإمساك بالدهون المحيطة بالكلى وسحبها لأعلى مع توتر خفيف.
      ملاحظة: احرص على عدم الإمساك بالكلى أو الأوعية الكلوية مباشرة.
    3. بمجرد أن تصبح الكلى خارجية ، اجعلها رطبة مع محلول ملحي دافئ يتسرب إلى الكلى.
  7. قم بإنشاء جيب تحت الكبسولة.
    1. اضغط برفق على الكبسولة الكلوية باستخدام مجموعة واحدة من الملقط الحاد بحيث يمكن تمييز الكبسولة الكلوية بوضوح عن الحمة الأساسية. في وقت واحد باستخدام مجموعة أخرى من الملقط الحاد ، أمسك الكبسولة بعناية واسحبها بلطف لأعلى لإنشاء ثقب في الكبسولة.
      ملاحظة: نظرا للطبيعة الدقيقة للكبسولة ، يلزم الحد الأدنى من القوة لإنشاء هذا الشق.
    2. استمر في استخدام ملقط حاد لتمديد الشق حتى يتم إنشاء مساحة ~ 2 مم لاستيعاب وريقة الصمام الأبهري.
    3. قم بتطوير جيب ضحل تحت المحفظة أكبر قليلا من نشرة الصمام أثناء رفع حافة الشق بمجموعة واحدة من الملقط وتقدم مسبار حاد تحت الكبسولة الكلوية.
  8. زرع الصمام الأبهري في الجيب تحت الكبسولة.
    1. استرجع نشرة الأبهر من التخزين البارد وضعها في المجال الجراحي.
    2. أثناء رفع الكبسولة الليفية الطرفية ، قم بإدخال نشرة الأبهر في الجيب تحت المحفظة باستخدام ملقط حاد.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة بعيدة بما فيه الكفاية عن الشق بحيث يتم تثبيتها بإحكام تحت الكبسولة. يجب توخي الحذر لتجنب تلف الحمة الأساسية أو مزيد من تمزيق الكبسولة الليفية.
    3. يمكن ترك الشق في الكبسولة الكلوية مفتوحا.
  9. ادفع الكلى بلطف إلى وضعها التشريحي باستخدام الجر المضاد المطبق على حواف الشق.
  10. أغلق شق البطن باستخدام خياطة جراحية معقمة جارية. أغلق الجلد بالدبابيس.
  11. رعاية ما بعد الجراحة
    1. بعد العملية ، ضع الفئران في قفص نظيف على وسادة تدفئة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
    2. راقب الحيوان يوميا لتقييم التئام الجروح الروتيني وعلامات الألم أو الضيق. قم بإزالة الدبابيس بعد 7-10 أيام.

6. جمع الأنسجة لتحليلها

  1. في نقاط النهاية المختارة بعد الزرع ، قم بالقتل الرحيم للحيوان عن طريق الطرد. على وجه التحديد ، قم بإجراء بضع البطن المتوسط وعبر الشريان الأورطي البطني تحت 5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين.
  2. تعبئة الكلى واقتطاعها عن طريق قطع الشريان الكلوي والوريد والحالب بالمقص.
    ملاحظة: احرص على عدم فهم المنطقة التي تحتوي على النشرة المزروعة.
  3. ضع الكلى في الفورمالين بين عشية وضحاها ، وقم بتضمينها في البارافين ، وقسمها للتلطيخ المطلوب. توجيه العينة مع كبسولة الكلى التي تواجه الأمامي وحمة الكلى التي تواجه الخلف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم توفير تصوير رسومي للتصميم التجريبي لنموذج الفئران (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يظهر في الشكل 2 جذر أبهري تم تشريحه من قلب المتبرع ونشرة صمام أبهري فردية معدة للزرع. بعد ذلك ، تظهر صورة تمثيلية لموضع نشرة الصمام الأبهري تحت الكبسولة الكلوية للزرع في الشكل 3A وبعد 3 و 7 و 28 يوما داخل الفئران المتلقية (الأشكال 3B-D) ، مما يدل على سهولة تحديد موقع الأنسجة المزروعة واستعادتها.

تحتفظ وريقات الصمام الأبهري ببنيتها الأصلية بعد الزرع غير المتجانس في الحيوانات المتجانسة، مما يدل على فائدة هذا النموذج كخط أساس لمقارنة الاستجابة المناعية في عمليات الزرع الخيفي. على وجه التحديد ، كشفت الأنسجة مع تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) أن وريقات الصمامات في عمليات الزرع المتجانسة بعد 7 أيام كانت سليمة هيكليا مع عدم وجود علامات على تورم ذمي (الشكل 4A). تم تأكيد السلامة الهيكلية لنشرة الصمام بشكل أكبر من خلال الكيمياء النسيجية المناعية لأكتين ألفا للعضلات الملساء (aSMA) و CD31 (الشكل 4B).

Figure 1
الشكل 1: التصميم التجريبي لزرع الصمام الأبهري غير المتجانس تحت الكبسولة الكلوية في الفئران. يتم جمع القلب من الفئران المانحة (A). يتم تشريح وريقات الصمام الأبهري والاحتفاظ بها في التخزين البارد (B) حتى عملية الزرع تحت الكبسولة الكلوية في الفئران المتلقية (C). ثم يتم زرع المنشورات في نقاط زمنية محددة وتحليلها مجهريا (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحضير وريقة الصمام الأبهري للزرع. مثال على تشريح جذر الأبهر من قلب المتبرع (A) وتشريح آخر لنشرة الصمام الأبهري للزرع (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصور وريقة الصمام الأبهري تحت الكبسولة الكلوية. يتم تصور وريقة الصمام الأبهري تحت الكبسولة الكلوية عند الزرع (A) ، وبعد 3 (B) و 7 (C) و 28 يوما (D) في الحيوانات المتجانسة وبعد 3 (E) و 7 (F) و 28 يوما (G) في الحيوانات الخيفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تبقى وريقات الصمام الأبهري سليمة هيكليا بعد الزرع تحت الكبسولة الكلوية لمدة 7 أيام في الحيوانات المتلازمة. يظهر الصف العلوي تلطيخ H&E والتلطيخ المناعي ل DAPI و aSMA و CD31 للتحكم في صمامات القلب التي تم شراؤها ولكن لم يتم زرعها. يظهر الصف السفلي تلطيخ H&E والتلطيخ المناعي ل DAPI و aSMA و CD31 في نشرة صمام متزامنة مزروعة بعد 7 أيام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأهمية والتطبيقات المحتملة
في حين يتم استخدام صمامات القلب الميكانيكية والاصطناعية الحيوية بشكل روتيني في المرضى البالغين الذين يحتاجون إلى استبدال الصمام، فإن هذه الصمامات تفتقر إلى القدرة على النمو، وبالتالي، فهي دون المستوى الأمثل للمرضى الأطفال. زرع صمام القلب هو عملية تجريبية مصممة لتقديم بدائل صمام القلب المتنامية لحديثي الولادة والرضع المصابين بأمراض القلب الخلقية. ومع ذلك ، على عكس البيولوجيا المناعية لزرع القلب التقليدي ، فإن البيولوجيا المناعية للزرع لهذا النوع الجديد من عمليات الزرع لا تزال غير مستكشفة بشكل جيد. هنا ، يتم وصف نموذج الفئران الفريد لزرع الكلى تحت المحفظة من وريقات الصمام الأبهري ، مما يوفر خطوة مهمة إلى الأمام في دراسة البيولوجيا المناعية لزرع صمام القلب.

توفر المساحة تحت المحفظة الكلوية بيئة مثالية لدراسة البيولوجيا المناعية المزروعة لصمامات القلب. يتم احتواء الأنسجة المزروعة بشكل آمن في موقع وعائي جيد مع إمكانية الوصول إلى الخلايا المناعية المتداولة20. بالإضافة إلى ذلك ، سبق أن تم استخدام النماذج تحت المحفظة بنجاح لاختبار رفض allograft في العديد من الأنسجة مثل البنكرياس والكبد والكلى وأنواع الخلايا الأخرى 22،23،24،25،26،27 ، مما يشير إلى أن هذا النموذج له ما يبرره في دراسة مناعة وريقات الصمام الأبهري.

يحتوي هذا النموذج على العديد من التطبيقات الأولية لدراسة علم المناعة المزروع للصمامات الأبهرية. أولا ، يمكن استخدام النموذج لتحديد مستوى قمع المناعة الجهازية المطلوبة لزرع صمام القلب لمنع رفض الكسب غير المشروع ، مثل تاكروليموس ، ميكوفينولات ، والمنشطات. علاوة على ذلك ، أشارت العديد من الدراسات إلى أن أنسجة الصمام قد تكون متميزة من الناحية المناعية عن أنسجة القلب الأخرى ، حيث يتم تجنيب الصمامات نسبيا أثناء الرفض الخاطف لعمليات زرع القلب التقليدية28،29،30. يسمح هذا النموذج باستكشاف هذا المفهوم حيث يمكن للمساحة تحت المحفظة استيعاب أنواع الأنسجة المختلفة ، مثل نشرة الصمام وعضلة القلب ، لمقارنة مناعة هذه الأنسجة.

هذا النموذج مفيد لأنه مباشر تقنيا وسريع ولديه معدل بقاء مرتفع مع انخفاض خطر حدوث مضاعفات. نظرا لأن كل متبرع يمكنه توفير ثلاث وريقات صمام أبهري ، يمكن لفأر واحد أن يكون بمثابة المتبرع لثلاثة متلقين مختلفين. في المتوسط ، كان طول عملية المتبرع 27.2 دقيقة (n = 12) ، وكانت مدة عملية المتلقي 29.7 دقيقة (n = 36). كان معدل البقاء على قيد الحياة للعملية المتلقية 97.2٪ (n = 35/36) ، مع وفاة واحدة أثناء الجراحة بسبب الاكتئاب التنفسي. لوحظ الحد الأدنى من النزيف بسبب صدمة الحمة الكلوية أثناء إنشاء جيب تحت المحفظة في 11.1٪ من عمليات المتلقي. ومع ذلك ، كان من السهل السيطرة على النزيف في جميع الحالات مع الضغط من قضيب طرف القطن. تم إزاحة عينة واحدة من الفضاء تحت المحفظة ولم يتم استردادها عند التفسير حتى بعد 7 أيام.

في السابق ، تم زرع وريقات الصمام عن طريق إزالتها من المساحة تحت المحفظة وتضمينها وتقسيمها وتلوينها دون أي أنسجة أبهرية مرفقة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة دون المستوى الأمثل لأن المنشورات نفسها صغيرة للغاية ورقيقة وشفافة ، مما يؤدي إلى فقدان العديد من العينات في المعالجة. بدلا من ذلك ، يوصى بإزالة الكلى في كتلة وتضمين الأنسجة وتقسيمها مع الاستمرار في تأمينها تحت الكبسولة الكلوية لضمان عدم فقدان العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يقلل هذا النهج من الصدمة والتلاعب بالمنشور.

خطوات حاسمة
الخطوات الحاسمة للإجراء هي إنشاء مستوى جراحي للتخدير ، وشق جدار البطن فوق الكلى ، وإزالة الكلى ، ورفع الرفرف تحت المحفظة ، وإدخال أنسجة زرع غير متجانسة ، والحصول على الإرقاء ، وإعادة الكلى إلى الوضع التشريحي ، وإغلاق الجلد.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في حين أن هذا هو الوصف الأول لزرع أنسجة القلب تحت الكبسولة الكلوية ، فقد وصف العديد من الآخرين زرع أنواع الأنسجة الأخرى في الفضاء تحت المحفظة الكلوية 20،22،23،24،25،26،27. في هذا البروتوكول ، تم إجراء تعديلات طفيفة على النماذج الفرعية السابقة لتحسين التقنية وتقليل المضاعفات. على وجه التحديد ، في حين أوصى آخرون باستخدام مقص فاناس الربيعي لإجراء الشق الأولي في الكبسولة الكلوية20,26 ، فمن المرجح أن تسبب هذه الطريقة صدمة للحمة الأساسية وتؤدي إلى تكوين ورم دموي تحت الكبسولة. سيؤدي الكثير من النزيف إلى انتفاخ الكبسولة ويعرض أمن ال26 المزروع للخطر. لذلك ، يجب استخدام ملقط حاد لفتح الكبسولة. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن بعض البروتوكولات تدعو إلى وضع المنتجات التجارية ذات الخاصية المتجانسة فوق شق المحفظة 26,31 ، فإن هذه الخطوة غير ضرورية طالما أن الأنسجة متقدمة بما فيه الكفاية في الجيب تحت الكبسولة.

في الفئران الكبيرة ، قد تكون الكلى مغطاة بالدهون المحيطة بالكلى ، وقد لا يكون من الممكن إخراج الكلى عن طريق الرفع باستخدام ملقط منحني. في هذه الحالات ، من الأفضل إخراج الكلى عن طريق سحب الدهون حول الكلى بلطف باستخدام الملقط وسحب الكلى من تجويف البطن دون التسبب في تلف أو نزيف.

مقارنة مع نماذج زراعة الأعضاء غير المتجانسة الحالية
في حين تم وصف العديد من النماذج الحيوانية الأخرى لزرع الصمام الأبهري غير المتجانس سابقا 12،13،14،15،16،17،18 ، فإن البروتوكول الحالي يوفر بديلا مباشرا وأكثر عملية يحسن النماذج السابقة بعدة طرق. أولا ، نظرا للطبيعة البسيطة تقنيا للإجراء ، هناك حاجة إلى القليل جدا من التدريب للعمل بنجاح. هذا في تناقض صارخ مع عمليات زرع الصمام الأبهري غير المتجانسة الموصوفة سابقا في الشريان الأورطي البطني. لذلك ، يوفر هذا النموذج بديلا أكثر عملية وفعالية من حيث التكلفة لدراسة زرع الصمام الأبهري مع تقليل المراضة والألم والوفيات للفئران. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لأن هناك حاجة إلى وريقة صمام أبهري واحدة فقط لعملية المتلقي وكل فأر متبرع يوفر ثلاث منشورات، فإن هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران المانحة لأي تجربة معينة. علاوة على ذلك ، فإن زرع الأنسجة في الكلى المقابلة أو جيب منفصل تحت المحفظة قد يسمح بالتحكم الداخلي أو مقارنة الاستجابات المناعية للأنسجة المختلفة داخل فأر واحد. في هذه الحالة ، يكون أفضل نهج هو عن طريق شق بضع البطن في خط الوسط.

بالإضافة إلى النماذج الحيوانية التي تصف زرع الصمام الأبهري غير المتجانس في الشريان الأورطي البطني ، استخدمت دراسات أخرى نموذجا تحت الجلد لدراسة مناعة الصمامات الأبهرية32. في حين أن هذا النهج هو بلا شك أكثر وضوحا من الزرع في الشريان الأورطي البطني ، تشير الأدلة الحالية إلى أن الزرع تحت الجلد هو وسيلة أقل فعالية لعرض المستضد33,34. العينة المزروعة هي أيضا صعبة للعثور عليها وتحليلها. لذلك ، يتم اقتراح الفضاء تحت المحفظة الكلوية كموقع للزرع مبسط ولكنه مثالي لدراسة بيولوجيا زرع الصمام الأبهري.

باختصار ، يعمل النموذج المقترح حديثا كإضافة إلى تسليح العلماء لدراسة زراعة صمام القلب ويكمل النماذج الموصوفة سابقا.

القيود
على الرغم من أن زرع وريقات الصمام الأبهري تحت الكبسولة الكلوية هو طريقة فعالة لدراسة المناعة الأليومنعة في الجسم الحي ، إلا أن بعض القيود على هذا النموذج موجودة. في حين أن الفضاء تحت المحفظة هو الأوعية الدموية بشكل جيد ، فإنه لا يوفر نفس البيئة الديناميكية الدموية مثل الوضع تحت الشريان التاجي. قد يؤثر هذا على الاستجابة المناعية للأنسجة المزروعة. افترض البعض أن الخصائص المناعية المميزة التي لوحظت في أنسجة الصمام قد تنتج عن تدفق الدم عالي الضغط فوق الصمام الأبهري في وضع الشريان التاجي الفرعي ، مما يلغي الاستجابة الكيميائية28,35. علاوة على ذلك ، هذا النموذج غير كاف لدراسة تأثير الحساسية على وظيفة الصمام لأن الوريقات لا تؤدي وظيفتها الفسيولوجية تحت الكبسولة الكلوية. ومع ذلك ، توجد قيود مماثلة على نماذج زرع الشريان الأورطي البطني غير المتجانس لأن نجاح هذه النماذج يعتمد على جعل وريقات الصمام غير كفؤة لتجنب تجلط الكسب غير المشروع15,36.

وتشمل القيود المفروضة على البروتوكول إمكانية إزاحة الأنسجة من الفضاء تحت المحفظة الكلوية وغير قابلة للاسترداد (1 من كل 36 حيوانا). قيد آخر هو وفاة الحيوان أثناء الجراحة (1 من كل 36 حيوانا) ؛ ومع ذلك ، كانت الوفاة ناجمة عن جرعة زائدة من البوبرينورفين ، ويمكن استخدام طرق أخرى لجرعات التسكين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم إنشاء الشكل 1 باستخدام biorender.com. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج الباحث الجراحي التابع لمؤسسة AATS إلى TKR ، وصندوق التميز للأطفال الذي يعقده قسم طب الأطفال في جامعة ساوث كارولينا الطبية إلى TKR ، ومنحة مؤسسة Emerson Rose Heart Foundation إلى TKR ، والعمل الخيري من قبل السيناتور بول كامبل إلى TKR ، ومنح التدريب المؤسسي لما بعد الدكتوراه NIH-NHLBI (T32 HL-007260) إلى JHK و BG ، وكلية الطب بجامعة ساوث كارولينا الطبية قبل التدريب صندوق أبحاث فليكس إلى MAH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP Baxter NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910 Ethicon J415H
7.5% Povidone-Iodine CareFusion 29904-004
70% ETOH Fisher Scientific BP82031GAL
Anesthesia induction chamber Harvard Apparatus 75-2030 Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine Harvard Apparatus 75-0238 Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask Harvard Apparatus 59-8255 Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl) Charles River Strain Code 091 Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05 0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers WAHL 79434
Electric Heating Pad Harvard Apparatus 72-0492 Maintained at 36-38 °C
Heparin Sagent Pharmaceuticals NDC 25021-400-10 100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL Fisher Scientific 14-841-33
Iris forceps curved World Precision Instruments 15917
Iris forceps straight World Precision Instruments 15916
Isoflurane, USP Piramal Critical Care NDC 66794-017-25 Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl) Charles River Strain Code 004 Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps World Precision Instruments 500233 Dumont #5
Micro scissors World Precision Instruments 501930 Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver World Precision Instruments 500226 Ryder Needle Driver
Operating microscope AmScope SM-3BZ-80S 3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment Dechra NDC 17033-211-38
Skin staples Ethicon PXR35 Proximate 35
Sterile cotton swabs Puritan 25-806 1WC
Sterile gauze sponges Fisher Scientific 22-037-902
Surgical Scissors World Precision Instruments 1962C Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B) S.A.L.F S.p.A. 6484A1 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  2. Jacobs, J. P., et al. Reoperations for pediatric and congenital heart disease: An analysis of the Society of Thoracic Surgeons (STS) congenital heart surgery database. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 17 (1), 2-8 (2014).
  3. Syedain, Z. H., et al. Pediatric tri-tube valved conduits made from fibroblast-produced extracellular matrix evaluated over 52 weeks in growing lambs. Science Translational Medicine. 13 (585), 1-16 (2021).
  4. Khan, M. S., Samayoa, A. X., Chen, D. W., Petit, C. J., Fraser, C. D. Contemporary experience with surgical treatment of aortic valve disease in children. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 146 (3), 512-521 (2013).
  5. Boyd, R., Parisi, F., Kalfa, D. State of the art: Tissue engineering in congenital heart surgery. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31 (4), 807-817 (2019).
  6. Feins, E. N., Emani, S. M. Expandable valves, annuloplasty rings, shunts, and bands for growing children. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 23, 17-23 (2020).
  7. Lintas, V., et al. TCT-795 Human cell derived off-the-shelf tissue engineered heart valves for next generation transcatheter aortic valve replacement: a proof-of-concept study in adult sheep. Journal of the American College of Cardiology. 70 (18), 271 (2017).
  8. Blum, K. M., Drews, J. D., Breuer, C. K. Tissue-engineered heart valves: A call for mechanistic studies. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (3), 240-253 (2018).
  9. Bernstein, D., et al. Cardiac growth after pediatric heart transplantation. Circulation. 85 (4), 1433-1439 (1992).
  10. Delmo Walter, E. M., et al. Adaptive growth and remodeling of transplanted hearts in children. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 40 (6), 1374-1383 (2011).
  11. Simon, P., et al. Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 19 (2), 118-121 (2001).
  12. Oei, F. B. S., et al. A size-matching heterotopic aortic valve implantation model in the rat. Journal of Surgical Research. 87 (2), 239-244 (1999).
  13. Oei, F. B. S., et al. Heart valve dysfunction resulting from cellular rejection in a novel heterotopic transplantation rat model. Transplant International. 13, SUPPL. 1 (2000).
  14. El Khatib, H., Lupinetti, F. M. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allografts. Transplantation. 49 (4), 765-767 (1990).
  15. Yankah, A. C., Wottge, H. U. Allograft conduit wall calcification in a model of chronic arterial graft rejection. Journal of Cardiac Surgery. 12 (2), 86-92 (1997).
  16. Moustapha, A., et al. Aortic valve grafts in the rat: Evidence for rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 114 (6), 891-902 (1997).
  17. Légaré, J. F., et al. Prevention of allograft heart valve failure in a rat model. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 122 (2), 310-317 (2001).
  18. Legare, J. F., Lee, T. D. G., Creaser, K., Ross, D. B., Green, M. T lymphocytes mediate leaflet destruction and allograft aortic valve failure in rats. The Annals of Thoracic Surgery. 70 (4), 1238-1245 (2000).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Burgin, M., et al. Kidney Subcapsular Allograft Transplants as a Model to Test Virus-Derived Chemokine-Modulating Proteins as Therapeutics. Methods in molecular biology. 2225, Clifton, N.J. 257-273 (2021).
  21. Foglia, R. P., DiPreta, J., Donahoe, P. K., Statter, M. B. Fetal allograft survival in immunocompetent recipients is age dependent and organ specific. Annals of Surgery. 204 (4), 402-410 (1986).
  22. Cunha, G. R., Baskin, L. Use of sub-renal capsule transplantation in developmental biology. Differentiation. 91 (4-5), 4-9 (2016).
  23. Hori, J., Joyce, N., Streilein, J. W. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule. Investigative Opthalmology & Visual Science. 41 (2), 443-452 (2000).
  24. Mandel, T., et al. transplantation of organ cultured fetal pig pancreas in non-obese diabetic (NOD) mice and primates (Macaca fascicularis). Xenotransplantation. 2 (3), 128-132 (1995).
  25. Ricordi, C., Flye, M. W., Lacy, P. E. Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets. Transplantation. 45 (6), 1148-1150 (1988).
  26. Shultz, L. D., et al. Subcapsular transplantation of tissue in the kidney. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 737-740 (2014).
  27. Vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  28. Mitchell, R. N., Jonas, R. A., Schoen, F. J. Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants. Journal of Thoracic and Cardiovasular Surgery. 115 (1), 118-127 (1998).
  29. Valante, M., et al. The aortic valve after heart transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 60, SUPPL. 2 (1995).
  30. O'Brien, M. F., Stafford, E. G., Gardner, M. A. H., Pohlner, P. G., McGiffin, D. C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 94 (6), 812-823 (1987).
  31. Ng, T. F., Osawa, H., Hori, J., Young, M. J., Streilein, J. W. Allogeneic neonatal neuronal retina grafts display partial immune privilege in the subcapsular space of the kidney. The Journal of Immunology. 169 (10), 5601-5606 (2002).
  32. Heslop, B. F., Wilson, S. E., Hardy, B. E. Antigenicity of aortic valve allografts. Annals of Surgery. 177 (3), 301-306 (1973).
  33. Steinmuller, D., Weiner, L. J. Evocation and persistence of transplantation immunity in rats. Transplantation. 1 (1), 97-106 (1963).
  34. Billingham, R. E., Brent, L., Brown, J. B., Medawar, P. B. Time of onset and duration of transplantation immunity. Plastic and Reconstructive Surgery. 24 (1), 410-413 (1959).
  35. Tector, A. J., Boyd, W. C., Korns, M. E. Aortic valve allograft rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (4), 592-601 (1971).
  36. Sugimura, Y., Schmidt, A. K., Lichtenberg, A., Akhyari, P., Assmann, A. A rat model for the in vivo assessment of biological and tissue-engineered valvular and vascular grafts. Tissue Engineering Methods (Part C). 23 (12), 982-994 (2017).

Tags

الطب، العدد 175،
نموذج مبسط لزرع صمام القلب غير المتجانس في القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, M. A., Kwon, J. H., Gerry, B., … More

Hill, M. A., Kwon, J. H., Gerry, B., Kavarana, M., Nadig, S. N., Rajab, T. K. A Simplified Model for Heterotopic Heart Valve Transplantation in Rodents. J. Vis. Exp. (175), e62948, doi:10.3791/62948 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter