Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kemirgenlerde Heterotopik Kalp Kapağı Transplantasyonu için Basitleştirilmiş Bir Model

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/62948
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, kalp kapaklarının alloreaktivitesinin incelenmesine izin vermek için renal kapsülün altına aort kapak broşürlerinin transplantasyonu için basit ve etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Abstract

Çocuklarda büyüyebilecek kalp kapağı replasmanları için acil bir klinik ihtiyaç vardır. Kalp kapağı transplantasyonu, antikoagülasyona gerek kalmadan somatik büyüme yeteneğine sahip dayanıklı kalp kapakçıkları sağlama potansiyeline sahip yeni bir nakil türü olarak önerilmektedir. Bununla birlikte, kalp kapağı nakillerinin immünobiyolojisi keşfedilmemiş kalmakta ve bu yeni nakil türünü incelemek için hayvan modellerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Abdominal aort içine heterotopik aort kapak transplantasyonu için önceki sıçan modelleri, teknik olarak zor ve maliyetli olmalarına rağmen tanımlanmıştır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, kalp kapağı nakli immünobiyolojisini incelemek için pratik ve daha basit bir yöntem olarak kemirgenlerde bir renal subkapsüler nakil modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, tek bir aort kapak broşürü toplanır ve renal subkapsüler boşluğa yerleştirilir. Böbreğe kolayca erişilebilir ve nakledilen doku, iyi vaskülarize edilmiş ve çeşitli doku boyutlarını barındırabilen bir subkapsüler boşlukta güvenli bir şekilde bulunur. Ayrıca, tek bir sıçan üç donör aort broşürü sağlayabildiğinden ve tek bir böbrek nakledilen doku için birden fazla bölge sağlayabildiğinden, belirli bir çalışma için daha az sıçan gereklidir. Burada, kalp kapağı transplantasyonunun transplantasyon immünolojisinin incelenmesinde ileriye doğru önemli bir adım sağlayan transplantasyon tekniği açıklanmaktadır.

Introduction

Konjenital kalp kusurları, insanlarda en sık görülen konjenital sakatlıktır ve her yıl 1000 canlı doğan çocuktan 7'sini etkilemektedir1. Çeşitli mekanik ve biyoprotez kapakların rutin olarak implante edildiği yetişkin hastaların aksine, pediatrik hastaların şu anda kapak replasmanı için iyi bir seçeneği yoktur. Bu geleneksel implantlar, alıcı çocuklarda büyüme potansiyeline sahip değildir. Sonuç olarak, kalp kapağı implantlarını çocuklar büyüdükçe art arda daha büyük versiyonlarla değiştirmek için morbid yeniden operasyonlar gereklidir, etkilenen çocuklar genellikle yaşamları boyunca beş veya daha fazla açık kalp ameliyatına ihtiyaç duyarlar 2,3. Çalışmalar, müdahale veya ölümden kurtulma özgürlüğünün bebekler için daha büyük çocuklardan daha zayıf olduğunu, protez kalp kapakçıkları olan bebeklerin% 60'ının ilk ameliyatlarından sonraki 3 yıl içinde yeniden ameliyat veya ölümle karşı karşıya kaldığını göstermiştir4. Bu nedenle, pediatrik hastalarda büyüyebilen ve işlevini koruyabilen bir kalp kapağı vermek için acil bir ihtiyaç vardır.

On yıllar boyunca, büyüyen kalp kapağı replasmanları sağlama girişimleri doku mühendisliği ve kök hücrelere odaklanmıştır. Ancak bu kapakların kliniğe çevrilmesi girişimleri şu ana kadar başarısız olmuştur 5,6,7,8. Bunu ele almak için, bir kalp kapağı transplantasyonu, kendi kendini onarma ve trombogenezden kaçınma yeteneğine sahip büyüyen kalp kapağı replasmanları sağlamak için daha yaratıcı bir operasyon olarak önerilmektedir. Tüm kalbin nakli yerine, sadece kalp kapağı nakledilir ve daha sonra geleneksel kalp nakillerine veya Ross pulmoner imzası 9,10,11'e benzer şekilde alıcı çocukla birlikte büyür. Ameliyat sonrasında, alıcı çocuklar, kapağın büyümesi artık gerekli olmadığında, nakledilen kapak yetişkin boyutunda bir mekanik protez ile değiştirilene kadar immünsüpresyon alacaktır. Bununla birlikte, kalp kapağı nakli greftlerinin nakil biyolojisi keşfedilmemiştir. Bu nedenle, bu yeni nakil türünü incelemek için hayvan modellerine ihtiyaç vardır.

Aort kapağının abdominal aort 12,13,14,15,16,17,18 içine heterotopik transplantasyonu için daha önce birkaç sıçan modeli tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu modeller yasaklayıcı bir şekilde zordur ve genellikle eğitimli cerrahların başarılı bir şekilde çalışmasını gerektirir. Ek olarak, pahalı ve zaman alıcı19. Kalp kapağı nakillerinin immünobiyolojisini incelemek için daha basit bir hayvan modeli oluşturmak için yeni bir sıçan modeli geliştirilmiştir. Tek aort kapak broşürleri eksize edilir ve renal subkapsüler boşluğa yerleştirilir. Böbrek, dolaşımdaki bağışıklık hücrelerine erişimi olan yüksek oranda vaskülarize olduğu için özellikle nakil reddini incelemek için uygundur20,21. Diğerleri pankreas, karaciğer, böbrek ve kornea 22,23,24,25,26,27 gibi diğer allogreft nakillerinin transplantasyon biyolojisini incelemek için renal subkapsüler bir model kullanmış olsa da, bu pozisyonda kalp dokusunun transplantasyonunun ilk tanımıdır. Burada, kalp kapağı transplantasyonunun transplantasyon immünolojisinin incelenmesinde ileriye doğru önemli bir adım sağlayan transplantasyon tekniği açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takiben Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hayvan modeli hakkında bilgi (Sıçanlar)

  1. Tüm cerrahi prosedürler için 20 kata kadar büyütmeye sahip bir ameliyat mikroskobu kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Deney için gerektiğinde nakiller için sinjenik (Lewis-Lewis gibi) veya allojenik (Lewis-Brown Norveç gibi) suşlar kullanın.
  3. Deneysel soru için uygun olan 5-7 haftalık ve vücut ağırlığı 100-200 g arasındaki sıçanları kullanın.

2. Kürkün çıkarılması, cildin hazırlanması ve anestezi

  1. Tüm işlemleri steril koşullar altında gerçekleştirin.
    NOT: Adım, özel bir cerrahi alanda ve steril koşullar altında gerçekleştirilir.
  2. Sıçanları anestezik bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijende% 5 izofluran ile anesteziyi indükleyin. İşlem boyunca oksijende% 3.5 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
  3. Donör operasyonu için, kürk makaslarını kullanarak sıçanın kürkünü göbek kemiğinden sternal çentiğe. Alıcı operasyonu için, saçları kaburgalardan pelvise kadar posterior aksiller çizgideki cerrahi alan üzerinden kesin. Daha sonra, cildi cerrahi bir dezenfektan ile hazırlayın.
  4. Prosedüre başlamadan önce cerrahi bir anestezi düzlemi edinin. Sıçanın ayak parmaklarını forseps ile sıkıca sıkıştırarak yeterli anestezi derinliğini onaylayın. Sıçan ağrıya çekilirse, anesteziyi gerektiği gibi titre edin.
  5. İşlem boyunca solunum hızını ve anestezi derinliğini klinik olarak izleyin; izofluran seviyesi, 55-65 nefes / dak solunum hızını korumak için gerektiği gibi ayarlanır.

3. Donör operasyonu

  1. Sıçanı adım 2'de belirtildiği gibi hazırlayın ve anestezi altına alın. Diseksiyon makası kullanarak cildi ksifoidden sternal çentiğe. Kalbe optimal erişim sağlanana kadar sternumun her iki tarafındaki kaburgaları keserek sternektomi yapın.
  2. Sol atriyuma 100 U/100 g enjeksiyonla sıçanı heparize edin.
  3. Donörü exsanguination yoluyla kurban edin.
  4. Büyük damarların görselleştirilmesini iyileştirmek için timusu tüketin. Daha sonra, kalbi innominat arter seviyesine kadar yükselen aort ile blok halinde çıkarın.

4. Aort kapak broşürlerinin hazırlanması

  1. Donör kalbini kardiektomiden hemen sonra steril bir Petri kabına yerleştirin. Donör kalbini buz gibi soğuk bir soğuk hava deposu tamponunda inceleyin (bkz.
  2. Forseps ve Vannas yay makası kullanarak, aort kapağına proksimal 1 mm'lik bir ventriküler manşet ile sadece aort kökü kalana kadar donör kalbi diseke edin.
  3. Üç broşürü de görselleştirmek için sol ve koroner olmayan sinüsler arasındaki Valsalva Sinüsünü açmak için uzunlamasına bir kesim yaparak aort kapağını açın.
    NOT: Kesim, Valsalva Sinüsünün tüm uzunluğu olmalıdır. Gerçek boyutlar sıçanın boyutuna bağlıdır.
  4. Her aort kapak broşürünü ayrı ayrı tüketin. Spesifik olarak, broşürün kenarını kavramak için künt forseps kullanın ve bir komisüsten annulusa ve daha sonra bir komissureye doğru keserek broşürü çıkarmak için Vannas yaylı makas kullanın.
    NOT: Kapak endotel hücrelerinin bozulmasını en aza indirmek için broşürün sadece kenarını kavramaya özellikle dikkat edin.
  5. Broşür eksizyonunu takiben numuneleri, alıcı sıçana implante edilmeye hazır olana kadar buz gibi soğuk depo tampon çözeltisinde saklayın. Tüm broşürleri soğuk hava deposundan 4 saat içinde implante edin.

5. Alıcının çalışması

  1. Sıçanı adım 2'de belirtildiği gibi hazırlayın ve anestezi altına alın. Ameliyatı gerçekleştirmek için 36-38 ° C'de tutulan bir ısıtma yastığı kullanın.
  2. Buprenorfin (deri altından 0.03 mg/kg) ameliyattan önce tüm alıcı sıçanlara ve ağrıyı hafifletmek için gerektiğinde ameliyat sonrası her 6-12 saatte bir uygulayın.
  3. Sol böbreğe erişmek için sıçanı sağ lateral yaslanmış pozisyona yerleştirin.
    NOT: Sol böbrek, sağ böbreğe göre daha kaudal pozisyonda olması nedeniyle tercih edilir.
  4. Makas kullanarak yan taraftaki cildi uzunlamasına 1 inç üzerinde kesin.
    NOT: İşlem sırasında böbreğin karın boşluğuna geri çekilmesini önlemek için yeterli gerginlik sağlamak için kesi böbreğin boyutundan daha küçük kalmalıdır.
  5. Benzer şekilde, altta yatan karın duvarını kesin.
  6. Böbreği dışsallaştırın
    1. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak, böbreğin kaudal kutbunu karın ve cilt insizyonundan kaldırmak için kavisli forseps kullanırken dorsal ve ventralal olarak hafif basınç uygulayın. Böbreğin kraniyal ucunu benzer şekilde dışsallaştırın.
    2. Alternatif olarak, böbrek perirenal yağın kavranması ve hafif gerginlikle yukarı doğru çekilmesiyle dışsallaştırılabilir.
      NOT: Böbreği veya böbrek damarlarını doğrudan kavramamaya dikkat edin.
    3. Böbrek dışsallaştırıldıktan sonra, böbreğe damlatılmış ılık salin ile nemli tutun.
  7. Bir alt kapsüler cep oluşturun.
    1. Bir set künt forseps kullanarak böbrek kapsülüne hafifçe basınç uygulayın, böylece böbrek kapsülü altta yatan parankimden açıkça ayırt edilebilir. Aynı anda başka bir künt forseps seti kullanarak, kapsülü dikkatlice kavrayın ve kapsülde bir delik oluşturmak için yavaşça yukarı doğru çekin.
      NOT: Kapsülün hassas doğası nedeniyle, bu insizyonu oluşturmak için minimum kuvvet gereklidir.
    2. Aort kapak broşürünü yerleştirmek için ~ 2 mm'lik bir alan oluşturulana kadar insizyonu uzatmak için künt forseps kullanmaya devam edin.
    3. Bir forseps seti ile insizyonun kenarını kaldırırken ve böbrek kapsülünün altında künt bir probu ilerletirken, kapak broşüründen biraz daha büyük sığ bir subkapsüler cep geliştirin.
  8. Aort kapağını subkapsüler cebe nakledin.
    1. Aort broşürünü soğuk hava deposundan alın ve cerrahi alana yerleştirin.
    2. Kenar fibröz kapsülü kaldırırken, aort broşürünü künt forseps ile subkapsüler cebe ilerletin.
      NOT: Dokunun insizyondan yeterince uzakta olduğundan emin olun, böylece kapsülün altına sıkıca sabitlenir. Altta yatan parankimin zarar görmesini veya fibröz kapsülün daha fazla yırtılmasını önlemek için özen gösterilmelidir.
    3. Böbrek kapsülündeki kesi açık bırakılabilir.
  9. Kesi kenarlarına uygulanan karşı traksiyonu kullanarak böbreği nazikçe anatomik konumuna geri itin.
  10. Karın insizyonunu çalışan steril bir cerrahi dikişle kapatın. Cildi zımbalarla kapatın.
  11. Ameliyat sonrası bakım
    1. İşlemi takiben, sıçanı yiyecek ve suya erişimi olan bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin.
    2. Rutin yara iyileşmesini ve ağrı veya sıkıntı belirtilerini değerlendirmek için hayvanı günlük olarak izleyin. Zımbaları 7-10 gün sonra çıkarın.

6. Analiz için doku toplanması

  1. Transplantasyondan sonra seçilen son noktalarda, ekssanguinasyon ile hayvanı ötenazileştirin. Spesifik olarak, medyan bir laparotomi yapın ve abdominal aortu oksijende% 5 izofluran altında transekte edin.
  2. Böbreği mobilize edin ve böbrek arterini, damarı ve üreteri makasla keserek eksize edin.
    NOT: Nakledilen broşürü içeren alanı kavramamaya dikkat edin.
  3. Böbreği gece boyunca formalin içine yerleştirin, parafine gömün ve istenen boyama için bölümlere ayırın. Örneği, böbrek kapsülü önden bakan ve böbrek parankimi arkaya bakan olacak şekilde yönlendirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sıçan modeli için deneysel tasarımın grafiksel bir tasviri sağlanmıştır (Şekil 1). Ek olarak, donörün kalbinden diseke edilmiş bir aort kökü ve implantasyon için hazırlanan bireysel bir aort kapak broşürü de Şekil 2'de gösterilmiştir. Daha sonra, implantasyon için böbrek kapsülü altındaki aort kapak broşürünün konumunun temsili bir görüntüsü Şekil 3A'da ve alıcı sıçan içinde 3, 7 ve 28 gün sonra gösterilmiştir (Şekil 3B-D), nakledilen dokunun yerini belirleme ve kurtarma kolaylığını göstermektedir.

Aort kapak broşürleri, sinjenik hayvanlarda heterotopik transplantasyondan sonra doğal mimarilerini koruyarak, allojenik transplantasyonlarda immün yanıtı karşılaştırmak için bu modelin bir temel olarak faydasını göstermektedir. Spesifik olarak, hematoksilin ve eozin (H & E) boyaması ile histoloji, 7 gün sonra sinjenik transplantasyonlarda kapak broşürlerinin ödemli şişlik belirtisi olmadan yapısal olarak sağlam olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4A). Kapak broşürünün yapısal bütünlüğü, Alfa Düz Kas Aktin'i (aSMA) ve CD31 için immünohistokimya ile daha da doğrulandı (Şekil 4B).

Figure 1
Şekil 1: Sıçanlarda renal kapsül altında aort kapağının heterotopik transplantasyonunun deneysel tasarımı. Kalp, donör sıçandan (A) toplanır. Aort kapak broşürleri diseke edilir ve alıcı sıçanda (C) renal kapsülün altındaki implantasyon işlemine kadar soğuk depoda (B) tutulur. Broşürler daha sonra belirlenen zaman noktalarında ekilir ve mikroskobik olarak analiz edilir (D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İmplantasyon için aort kapak broşürünün hazırlanması. Donör kalpten diseke edilmiş bir aort kökü örneği (A) ve implantasyon için bir aort kapak broşürünün daha ileri diseksiyonu (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Aort kapak broşürünün renal kapsül altında görüntülenmesi. Aort kapak broşürü, implantasyonda (A) renal kapsülün altında, sinjenik hayvanlarda 3 (B), 7 (C) ve 28 gün (D) sonra ve allojenik hayvanlarda 3 (E), 7 (F) ve 28 gün (G) sonrasında görselleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Aort kapak broşürleri, sinjenik hayvanlarda renal kapsül altında nakledildikten sonra 7 gün boyunca yapısal olarak bozulmadan kalır. Üst sırada, tedarik edilen ancak nakledilmeyen kontrol kalp kapakçıkları için DAPI, aSMA ve CD31 için H&E boyama ve immün boyama gösterilmektedir. Alt sırada, 7 gün sonra eksize edilen sinjenik bir kapak broşüründe DAPI, aSMA ve CD31 için H&E boyama ve immün boyama gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önemi ve potansiyel uygulamaları
Mekanik ve biyoprotez kalp kapakları, kapak replasmanı gerektiren yetişkin hastalarda rutin olarak kullanılırken, bu kapaklar büyüme potansiyelinden yoksundur ve bu nedenle pediatrik hastalar için yetersiz kalmaktadır. Kalp kapağı transplantasyonu, yenidoğanlar ve konjenital kalp hastalığı olan bebekler için büyüyen kalp kapağı replasmanları sağlamak için tasarlanmış deneysel bir operasyondur. Bununla birlikte, geleneksel kalp nakillerinin transplant immünobiyolojisinden farklı olarak, bu yeni nakil türünün transplant immünobiyolojisi zayıf bir şekilde araştırılmıştır. Burada, aort kapak broşürlerinin subkapsüler renal transplantasyonu için benzersiz bir sıçan modeli tanımlanmıştır ve kalp kapak transplantasyonunun transplantasyon immünobiyolojisinin incelenmesinde ileriye doğru önemli bir adım atılmıştır.

Renal subkapsüler boşluk, kalp kapakçıklarının transplant immünobiyolojisini incelemek için en uygun ortamı sağlar. Nakledilen doku, dolaşımdaki bağışıklık hücrelerine erişimi olan iyi vaskülarize edilmiş bir yerde güvenli bir şekilde bulunur20. Ek olarak, subkapsüler modeller daha önce pankreas, karaciğer, böbrek ve diğer hücre tipleri 22,23,24,25,26,27 gibi birçok dokuda allogreft rejeksiyonunu test etmek için başarıyla kullanılmıştır, bu da bu modelin aort kapak broşürlerinin immünojenisitesini incelemede haklı olduğunu göstermektedir.

Bu model, aort kapaklarının transplant immünolojisini incelemek için çeşitli protentional uygulamalara sahiptir. İlk olarak, model, takrolimus, mikofenolat ve steroidler gibi greft reddini önlemek için kalp kapak transplantasyonu için gerekli sistemik immün baskılanma seviyesini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, birçok çalışma, kapak dokusunun immünolojik olarak diğer kalp dokularından farklı olabileceğini göstermiştir, çünkü kapaklar geleneksel kalp nakillerinin fulminan reddi sırasında nispeten korunmaktadır28,29,30. Bu model, subkapsüler boşluk, bu dokuların immünojenitesini karşılaştırmak için kapak broşürü ve miyokard gibi çeşitli doku tiplerini barındırabileceğinden, bu kavramın araştırılmasına izin verir.

Bu model avantajlıdır çünkü teknik olarak basit, hızlıdır ve düşük komplikasyon riski ile yüksek bir hayatta kalma oranına sahiptir. Her donör üç aort kapak broşürü sağlayabildiğinden, bir sıçan üç farklı alıcı için donör olarak hizmet edebilir. Ortalama olarak donör operasyonunun uzunluğu 27.2 dakika (n=12), alıcı operasyonun süresi 29.7 dakika (n=36) idi. Alıcı operasyonun sağkalım oranı %97.2 (n=35/36) idi ve bir intraoperatif solunum depresyonuna bağlı ölüm gerçekleşti. Subkapsüler cebi oluştururken böbrek parankimine bağlı minimal kanama alıcı operasyonların %11.1'inde kaydedildi. Bununla birlikte, kanama, pamuklu uç aplikatöründen sıkıştırma ile tüm vakalarda kolayca kontrol altına alındı. Bir örnek subkapsüler boşluktan çıkarıldı ve 7 gün sonra bile açıklama üzerine kurtarılamadı.

Daha önce, kapak broşürleri subkapsüler boşluktan çıkarılarak ekilir ve herhangi bir aort dokusuna bağlı olmadan gömülür, kesitlenir ve boyanırdı. Bununla birlikte, broşürlerin kendileri son derece küçük, ince ve şeffaf olduğu için bu yöntem yetersiz kalır ve bu da işleme sırasında birkaç numunenin kaybına neden olur. Bunun yerine, böbrek en bloğunun çıkarılması ve hiçbir numunenin kaybedilmemesini sağlamak için böbrek kapsülünün altına sabitlenmişken dokunun gömülmesi ve kesilmesi önerilir. Ek olarak, bu yaklaşım broşürün travmasını ve manipülasyonunu en aza indirir.

Kritik adımlar
İşlemin kritik adımları, cerrahi bir anestezi düzlemi oluşturmak, karın duvarını böbrekler üzerinde kesmek, böbreği çıkarmak, subkapsüler flebi yükseltmek, heterotopik nakil dokusunun yerleştirilmesi, hemostaz elde etmek, böbreği anatomik pozisyona döndürmek ve cildi kapatmaktır.

Değişiklikler ve sorun giderme
Bu, böbrek kapsülü altındaki kalp dokusunun transplantasyonunun ilk tanımı olsa da, diğerleri renal subkapsüler boşluktaki diğer doku tiplerinin transplantasyonunu tanımlamıştır 20,22,23,24,25,26,27. Bu protokolde, tekniği optimize etmek ve komplikasyonları en aza indirmek için önceki alt kapsüler modellerde küçük ayarlamalar yapılmıştır. Spesifik olarak, diğerleri böbrek kapsülü20,26'ya ilk insizyonu yapmak için Vannas yay makası kullanılmasını önerirken, bu yöntemin altta yatan parankimde travmaya neden olması ve subkapsüler hematom oluşumu ile sonuçlanması daha olasıdır. Çok fazla kanama, kapsülün distansiyonuna neden olur ve nakledilen26'nın güvenliğini tehlikeye atar. Bu nedenle, kapsülü açmak için künt forseps kullanılmalıdır. Ek olarak, bazı protokoller homostatik özelliğe sahip ticari ürünlerin kapsüler insizyon26,31 üzerine yerleştirilmesini savunurken, doku subkapsüler cebe yeterince ilerletildiği sürece bu adım gereksizdir.

Daha büyük sıçanlarda, böbrek perirenal yağla kaplı olabilir ve kavisli forseps ile kaldırılarak böbreğin dışsallaştırılması mümkün olmayabilir. Bu durumlarda, perirenal yağları forseps ile hafifçe çekerek ve böbreği hasar veya kanamaya neden olmadan karın boşluğundan çekerek böbreği dışsallaştırmak en iyisidir.

Mevcut heterotopik transplantasyon modelleri ile karşılaştırma
Heterotopik aort kapak nakli için diğer bazı hayvan modelleri daha önce 12,13,14,15,16,17,18 olarak tanımlanmış olsa da, mevcut protokol önceki modelleri çeşitli şekillerde geliştiren basit ve daha pratik bir alternatif sunmaktadır. İlk olarak, prosedürün teknik olarak basit doğası nedeniyle, başarılı bir şekilde çalışmak için çok az eğitim gerekir. Bu, abdominal aort içine daha önce tarif edilen heterotopik aort kapak nakillerinin tam tersidir. Bu nedenle, bu model sıçanların morbiditesini, ağrısını ve mortalitesini en aza indirirken aort kapak transplantasyonunu incelemek için daha pratik ve uygun maliyetli bir alternatif sunmaktadır. Ek olarak, alıcı operasyon için sadece bir aort kapak broşürüne ihtiyaç duyulduğundan ve her donör sıçan üç broşür sağladığından, herhangi bir deney için daha az donör sıçan gereklidir. Ayrıca, kontralateral böbreğe veya ayrı bir subkapsüler cebe doku implante etmek, iç kontrole veya tek bir sıçan içindeki değişen dokulara karşı bağışıklık yanıtlarının karşılaştırılmasına izin verebilir. Bu durumda en iyi yaklaşım orta hat laparotomi insizyonudur.

Abdominal aort içine heterotopik aort kapak transplantasyonunu tanımlayan hayvan modellerine ek olarak, diğer çalışmalar aort kapaklarının immünojenisitesini incelemek için deri altı bir model kullanmıştır32. Bu yaklaşım şüphesiz abdominal aort transplantasyonundan daha basit olmakla birlikte, mevcut kanıtlar subkutan implantasyonun antijen sunumunda daha az etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir33,34. İmplante edilen numuneyi bulmak ve analiz etmek de zordur. Bu nedenle, renal subkapsüler boşluk, aort kapak nakli biyolojisini incelemek için hem basitleştirilmiş hem de optimal olan bir implantasyon yeri olarak önerilmektedir.

Özetle, yeni önerilen model, kalp kapağı transplantasyonunu incelemek için bilim adamlarının silahlanmalarına ek olarak hizmet ediyor ve daha önce açıklanan modelleri tamamlıyor.

Sınırlama
Aort kapak broşürlerinin renal kapsül altına nakli, alloimmünitenin in vivo olarak incelenmesinde etkili bir yöntem olmasına rağmen, bu modelin bazı sınırlamaları mevcuttur. Subkapsüler boşluk iyi vaskülarize olmasına rağmen, subkoroner pozisyon ile aynı hemodinamik ortamı sunmaz. Bu, nakledilen dokuya karşı bağışıklık tepkisini etkileyebilir. Bazıları, kapak dokusunda gözlenen farklı bağışıklık özelliklerinin, koroner alt pozisyondaki aort kapağı üzerindeki yüksek basınçlı kan akışından kaynaklanabileceğini ve kemotaktik yanıtı geçersiz kılabileceğini varsaymıştır28,35. Ayrıca, bu model alloreaktivitenin kapak fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için yetersizdir, çünkü broşürler renal kapsül altında fizyolojik işlevlerini yerine getirmemektedir. Bununla birlikte, heterotopik abdominal aort transplantasyonu modelleri için de benzer sınırlamalar mevcuttur, çünkü bu modellerin başarısı, kapak broşürlerinin greft trombozunu önlemek için yetersiz kalmasına dayanmaktadır 15,36.

Protokoldeki sınırlamalar, dokunun renal subkapsüler boşluktan çıkma ve geri kazanılamaz hale gelme olasılığını içerir (36 hayvandan 1'i). Diğer bir sınırlama, ameliyat sırasında hayvanın ölümüdür (36 hayvandan 1'i); Bununla birlikte, ölüm aşırı dozda buprenorfin tarafından yapılmıştır ve analjezi dozlanması için diğer yöntemler kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Acknowledgments

Şekil 1, biorender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma kısmen TKR'ye AATS Vakfı Cerrahi Araştırmacı Programı, Güney Carolina Tıp Üniversitesi Pediatri Bölümü tarafından TKR'ye düzenlenen Çocuk Mükemmellik Fonu, TKR'ye bir Emerson Gül Kalp Vakfı hibesi, Senatör Paul Campbell'ın TKR'ye Hayırseverliği, JHK ve BG'ye Nih-nhlbi Kurumsal Doktora Sonrası Eğitim Hibeleri (T32 HL-007260), ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi Tıp Fakültesi MAH'a Stajyer Öncesi FLEX Araştırma Fonu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP Baxter NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910 Ethicon J415H
7.5% Povidone-Iodine CareFusion 29904-004
70% ETOH Fisher Scientific BP82031GAL
Anesthesia induction chamber Harvard Apparatus 75-2030 Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine Harvard Apparatus 75-0238 Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask Harvard Apparatus 59-8255 Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl) Charles River Strain Code 091 Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05 0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers WAHL 79434
Electric Heating Pad Harvard Apparatus 72-0492 Maintained at 36-38 °C
Heparin Sagent Pharmaceuticals NDC 25021-400-10 100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL Fisher Scientific 14-841-33
Iris forceps curved World Precision Instruments 15917
Iris forceps straight World Precision Instruments 15916
Isoflurane, USP Piramal Critical Care NDC 66794-017-25 Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl) Charles River Strain Code 004 Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps World Precision Instruments 500233 Dumont #5
Micro scissors World Precision Instruments 501930 Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver World Precision Instruments 500226 Ryder Needle Driver
Operating microscope AmScope SM-3BZ-80S 3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment Dechra NDC 17033-211-38
Skin staples Ethicon PXR35 Proximate 35
Sterile cotton swabs Puritan 25-806 1WC
Sterile gauze sponges Fisher Scientific 22-037-902
Surgical Scissors World Precision Instruments 1962C Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B) S.A.L.F S.p.A. 6484A1 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Der Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  2. Jacobs, J. P., et al. Reoperations for pediatric and congenital heart disease: An analysis of the Society of Thoracic Surgeons (STS) congenital heart surgery database. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 17 (1), 2-8 (2014).
  3. Syedain, Z. H., et al. Pediatric tri-tube valved conduits made from fibroblast-produced extracellular matrix evaluated over 52 weeks in growing lambs. Science Translational Medicine. 13 (585), 1-16 (2021).
  4. Khan, M. S., Samayoa, A. X., Chen, D. W., Petit, C. J., Fraser, C. D. Contemporary experience with surgical treatment of aortic valve disease in children. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 146 (3), 512-521 (2013).
  5. Boyd, R., Parisi, F., Kalfa, D. State of the art: Tissue engineering in congenital heart surgery. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31 (4), 807-817 (2019).
  6. Feins, E. N., Emani, S. M. Expandable valves, annuloplasty rings, shunts, and bands for growing children. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 23, 17-23 (2020).
  7. Lintas, V., et al. TCT-795 Human cell derived off-the-shelf tissue engineered heart valves for next generation transcatheter aortic valve replacement: a proof-of-concept study in adult sheep. Journal of the American College of Cardiology. 70 (18), 271 (2017).
  8. Blum, K. M., Drews, J. D., Breuer, C. K. Tissue-engineered heart valves: A call for mechanistic studies. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (3), 240-253 (2018).
  9. Bernstein, D., et al. Cardiac growth after pediatric heart transplantation. Circulation. 85 (4), 1433-1439 (1992).
  10. Delmo Walter, E. M., et al. Adaptive growth and remodeling of transplanted hearts in children. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 40 (6), 1374-1383 (2011).
  11. Simon, P., et al. Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 19 (2), 118-121 (2001).
  12. Oei, F. B. S., et al. A size-matching heterotopic aortic valve implantation model in the rat. Journal of Surgical Research. 87 (2), 239-244 (1999).
  13. Oei, F. B. S., et al. Heart valve dysfunction resulting from cellular rejection in a novel heterotopic transplantation rat model. Transplant International. 13, SUPPL. 1 (2000).
  14. El Khatib, H., Lupinetti, F. M. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allografts. Transplantation. 49 (4), 765-767 (1990).
  15. Yankah, A. C., Wottge, H. U. Allograft conduit wall calcification in a model of chronic arterial graft rejection. Journal of Cardiac Surgery. 12 (2), 86-92 (1997).
  16. Moustapha, A., et al. Aortic valve grafts in the rat: Evidence for rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 114 (6), 891-902 (1997).
  17. Légaré, J. F., et al. Prevention of allograft heart valve failure in a rat model. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 122 (2), 310-317 (2001).
  18. Legare, J. F., Lee, T. D. G., Creaser, K., Ross, D. B., Green, M. T lymphocytes mediate leaflet destruction and allograft aortic valve failure in rats. The Annals of Thoracic Surgery. 70 (4), 1238-1245 (2000).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Burgin, M., et al. Kidney Subcapsular Allograft Transplants as a Model to Test Virus-Derived Chemokine-Modulating Proteins as Therapeutics. Methods in molecular biology. 2225, Clifton, N.J. 257-273 (2021).
  21. Foglia, R. P., DiPreta, J., Donahoe, P. K., Statter, M. B. Fetal allograft survival in immunocompetent recipients is age dependent and organ specific. Annals of Surgery. 204 (4), 402-410 (1986).
  22. Cunha, G. R., Baskin, L. Use of sub-renal capsule transplantation in developmental biology. Differentiation. 91 (4-5), 4-9 (2016).
  23. Hori, J., Joyce, N., Streilein, J. W. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule. Investigative Opthalmology & Visual Science. 41 (2), 443-452 (2000).
  24. Mandel, T., et al. transplantation of organ cultured fetal pig pancreas in non-obese diabetic (NOD) mice and primates (Macaca fascicularis). Xenotransplantation. 2 (3), 128-132 (1995).
  25. Ricordi, C., Flye, M. W., Lacy, P. E. Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets. Transplantation. 45 (6), 1148-1150 (1988).
  26. Shultz, L. D., et al. Subcapsular transplantation of tissue in the kidney. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 737-740 (2014).
  27. Vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  28. Mitchell, R. N., Jonas, R. A., Schoen, F. J. Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants. Journal of Thoracic and Cardiovasular Surgery. 115 (1), 118-127 (1998).
  29. Valante, M., et al. The aortic valve after heart transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 60, SUPPL. 2 (1995).
  30. O'Brien, M. F., Stafford, E. G., Gardner, M. A. H., Pohlner, P. G., McGiffin, D. C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 94 (6), 812-823 (1987).
  31. Ng, T. F., Osawa, H., Hori, J., Young, M. J., Streilein, J. W. Allogeneic neonatal neuronal retina grafts display partial immune privilege in the subcapsular space of the kidney. The Journal of Immunology. 169 (10), 5601-5606 (2002).
  32. Heslop, B. F., Wilson, S. E., Hardy, B. E. Antigenicity of aortic valve allografts. Annals of Surgery. 177 (3), 301-306 (1973).
  33. Steinmuller, D., Weiner, L. J. Evocation and persistence of transplantation immunity in rats. Transplantation. 1 (1), 97-106 (1963).
  34. Billingham, R. E., Brent, L., Brown, J. B., Medawar, P. B. Time of onset and duration of transplantation immunity. Plastic and Reconstructive Surgery. 24 (1), 410-413 (1959).
  35. Tector, A. J., Boyd, W. C., Korns, M. E. Aortic valve allograft rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (4), 592-601 (1971).
  36. Sugimura, Y., Schmidt, A. K., Lichtenberg, A., Akhyari, P., Assmann, A. A rat model for the in vivo assessment of biological and tissue-engineered valvular and vascular grafts. Tissue Engineering Methods (Part C). 23 (12), 982-994 (2017).

Tags

Tıp Sayı 175
Kemirgenlerde Heterotopik Kalp Kapağı Transplantasyonu için Basitleştirilmiş Bir Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, M. A., Kwon, J. H., Gerry, B., … More

Hill, M. A., Kwon, J. H., Gerry, B., Kavarana, M., Nadig, S. N., Rajab, T. K. A Simplified Model for Heterotopic Heart Valve Transplantation in Rodents. J. Vis. Exp. (175), e62948, doi:10.3791/62948 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter