Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en eksperimentell protokoll- og dataanalysearbeidsflyt for å utføre live celle dual-color fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) kombinert med Förster Resonance Energy transfer (FRET) for å studere membranreseptordynamikk i levende celler ved hjelp av moderne fluorescensmerkingsteknikker.

Abstract

Vi presenterer en protokoll og arbeidsflyt for å utføre levende celle tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) kombinert med Förster Resonance Energy transfer (FRET) for å studere membranreseptordynamikk i levende celler ved hjelp av moderne fluorescensmerkingsteknikker. I dual-color FCCS, hvor svingningene i fluorescensintensiteten representerer det dynamiske "fingeravtrykket" til den respektive fluorescerende biomolekylen, kan vi sondere ko-diffusjon eller binding av reseptorene. FRET, med sin høye følsomhet for molekylære avstander, fungerer som en kjent "nanoruler" for å overvåke intramolekylære endringer. Samlet sett blir konformasjonsendringer og nøkkelparametere som lokale reseptorkonsentrasjoner og mobilitetskonstanter tilgjengelige i cellulære innstillinger.

Kvantitativ fluorescens tilnærminger er utfordrende i celler på grunn av høye støynivåer og sårbarheten i prøven. Her viser vi hvordan du utfører dette eksperimentet, inkludert kalibreringstrinnene ved hjelp av tofarget merket β2-adrenergereseptor(β2AR) merket med eGFP og SNAP-tag-TAMRA. En trinnvis dataanalyseprosedyre tilbys ved hjelp av programvare og maler med åpen kildekode som er enkle å tilpasse.

Vår retningslinje gjør det mulig for forskere å avdekke molekylære interaksjoner av biomolekyler i levende celler in situ med høy pålitelighet til tross for de begrensede signal-til-støy-nivåene i levende celleeksperimenter. Det operative vinduet til FRET og spesielt FCCS ved lave konsentrasjoner tillater kvantitativ analyse ved nesten fysiologiske forhold.

Introduction

Fluorescensspektroskopi er en av de viktigste metodene for å kvantifisere proteindynamikk og proteinproteininteraksjoner med minimal perturbasjon i en cellulær kontekst. Confocal fluorescence correlation spectroscopy (FCS) er en av de kraftige metodene for å analysere molekylær dynamikk, da den er enkeltmolekylssensitiv, svært selektiv og levende cellekompatibel1. Sammenlignet med andre dynamikkorienterte tilnærminger, har FCS et bredere målbart tidsområde som spenner fra ~ ns til ~ s, viktigst dekker de raske tidsskalaene som ofte er utilgjengelige ved avbildningsbaserte metoder. Videre gir det også romlig selektivitet slik at membran, cytoplasmatisk og kjernemolekylær dynamikk lett kan skille 2. Dermed kan molekylær blinking, den gjennomsnittlige lokale konsentrasjonen og diffusjonskoeffisienten analyseres kvantitativt med FCS. Intermolekylær dynamikk som binding blir lett tilgjengelig ved probing co-diffusjon av to molekylære arter i fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS) analyse3,4,5 i en dual-color tilnærming.

Det viktigste underliggende prinsippet i korrelasjonsspektroskopi er den statistiske analysen av intensitetssvingninger som slippes ut av fluorescerende merkede biomolekyler som sprer seg inn og ut av laserfokus (Figur 1A). De resulterende auto- eller krysskorrelasjonsfunksjonene kan deretter analyseres ytterligere ved kurvetilpasning for til slutt å utlede rentekonstantene av interesse. Med andre ord gir de statistiske metodene FCS og FCCS ikke enkeltmolekylspor som i enkeltpartikkelsporing, men et dynamisk mønster eller "fingeravtrykk" av en probed specimen med høy temporal oppløsning. Når den kombineres med Förster resonansenergioverføring (FRET), kan intramolekylær dynamikk som konformasjonsendringer overvåkes samtidig i et felles konfokalt oppsett5,6. FRET sonderer avstanden til to fluoroforer og blir ofte referert til som en molekylær "nanoruler". Energioverføring skjer bare når molekylene er i nærheten (< 10 nm), utslippsspekteret til donoren overlapper betydelig med absorpsjonsspekteret til akseptormolekylet, og dipolorretningen til donoren og akseptoren er (tilstrekkelig) parallell. Dermed gir kombinasjonen av FRET og FCCS en teknikk med svært høy romlig-temporal oppløsning. Når romlig selektivitet, følsomhet så vel som live-celle kompatibilitet er nødvendig, FRET-FCCS har åpenbar fordelaktig i forhold til andre metoder som Isotermisk titrering Calorimetry (ITC)7, Surface Plasmon Resonance (SPR)8, eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 for måling av proteindynamikk og interaksjoner.

Til tross for evnene og løftet om tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi (dc-FCCS), er det teknisk utfordrende å utføre dc-FCCS i levende celler på grunn av spektralblødning eller krysstale mellom kanalene3,4, forskjellen i kondokale volumer på grunn av de spektralt distinkte laserlinjene3,4,11, bakgrunnssignal og støy eller begrenset fotostabilitet av prøvene12, 13,14,15. Innføringen av puls sammenflettet eksitasjon (PIE) til FCCS var en viktig justering for å midlertidig koble de forskjellige lasereksitasjonene for å redusere spektral krysstale mellom kanalene16. Andre korrigeringsmetoder for å motvirke spektralblødning17,18,19 og bakgrunnskorreksjoner har også blitt godt akseptert17,18,19. Hvis du vil ha mer informasjon og grunnleggende informasjon om FCS, PIE eller FRET, refereres leseren til følgende referanser2,4,6,16,20,21,22,23,24.

Her presenteres alle nødvendige kalibreringseksperimenter og analyser sammen med de eksperimentelle resultatene av en prototypisk G-protein koblet reseptor, β2-adrenergereseptor(β 2 AR), for tre forskjellige scenarier: (1) enkeltmerkede molekyler som bærer enten en "grønn" (eGFP) eller en "rød" (SNAP-tag-basert merking)25 fluorofor; (2) en dobbeltmerket konstruksjon, som bærer en N-terminal SNAP-tag og intracellulær eGFP (NT-SNAP) [i dette tilfellet er begge etikettene på samme protein. Dermed forventes 100% ko-diffusjon]; og (3) en dobbeltmerket prøve, der begge fluoroforene er på samme side av cellemembranen (CT-SNAP). Den har en C-terminal SNAP-tag og en intracellulær eGFP. Her er begge etikettene igjen på samme protein med igjen 100% ko-diffusjon forventet. Siden begge etikettene er svært nær hverandre, på samme side av cellemembranen, viser det potensialet til å observere FRET og antikorrelert oppførsel. Alle konstruksjoner ble transfektert i kinesiske Hamster Ovary (CHO)-celler og senere merket med et rødt fluorescerende substrat som er membran-ugjennomtrengelig for NT-SNAP-konstruksjonen og membrangjennomtrengelig for CT-SNAP-konstruksjonen. Til slutt eksemplifiserer simulerte data påvirkningen av eksperimentelle parametere på fret-indusert antikorrelasjon, og effekten av proteinproteininteraksjoner på ko-diffusjonsamplituden.

Dermed gir denne protokollen en komplett veiledning for å utføre den kombinerte FRET-FCCS i levende celler for å forstå proteindynamikk og proteinproteininteraksjoner mens du gjør deg oppmerksom på tekniske / fysiske artefakter, utfordringer og mulige løsninger.

Protocol

1. Eksperimentell protokoll

  1. Prøvepreparering
    MERK: Utfør cellesåing og transfeksjon under sterile forhold.
    1. Legg en rengjort deksler per brønn i en 6-brønns kulturplate og vask tre ganger med steril fosfatbufret saltvann (PBS).
      MERK: Coverlip-rengjøringsprotokollen er beskrevet i Tilleggsmerknad 1.
    2. Til hver brønn, tilsett 2 ml av hele cellekulturmediet som inneholder fenolrødt (supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 100 μg / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) og hold platen til side.
    3. Kultur CHO-cellene i samme medium som inneholder fenolrød ved 37 °C og 5 % CO2. Vask cellene med 5 ml PBS for å fjerne de døde cellene.
    4. Tilsett 2 ml trypsin og inkuber i 2 min ved romtemperatur (RT).
    5. Fortynn de frittliggende cellene med 8 ml medium som inneholder fenolrød og bland forsiktig ved pipettering.
    6. Tell cellene i et Neubauer-kammer og frø med en tetthet på 1,5 x 105 celler/brønn i den 6-brønns cellekulturplaten som inneholder dekslene (utarbeidet i trinn 1.1.1-1.1.2).
    7. La cellene vokse i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 24 timer for å oppnå ca. 80 % samløp.
    8. Fortynn 2 μg av ønsket vektor-DNA (f.eks. CT-SNAP eller NT-SNAP) og 6 μL av transfeksjonsreagenset i to separate rør, som hver inneholder 500 μL av det reduserte serummediet for hver brønn og inkuberer i 5 min ved RT.
    9. Bland de to løsningene sammen for å oppnå transfeksjonsblandingen og inkubere den i 20 minutter ved RT.
    10. I mellomtiden vasker du frø CHO-cellene en gang med steril PBS.
    11. Bytt ut PBS med 1 ml/brønn fenol rødfritt medium supplert med 10% FBS uten antibiotika.
    12. Tilsett hele 1 ml transfeksjonsblanding dråpevis til hver brønn og inkuber cellene over natten ved 37 °C, i 5 % CO2.
    13. For merking av SNAP-konstruksjonen, fortynn den aktuelle SNAP-substratbestandsløsningen i 1 ml av mediet supplert med 10% FBS for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 μM.
    14. Vask de transfekterte cellene en gang med PBS og tilsett 1 ml per brønn med 1 μM SNAP-substratløsning. Inkuber cellene i 20 min ved 37 °C i 5 % CO2.
    15. Vask cellene tre ganger med fenol rødfritt medium og tilsett 2 ml per brønn fenol rødfritt medium. Inkuber cellene i 30 min ved 37 °C i 5 % CO2.
    16. Overfør dekslene til alle prøvene senere inn i bildekammeret og vask med 500 μL bildebuffer. Tilsett 500 μL bildebuffer før du går til FRET-FCS-oppsettet.
  2. Kalibreringsmålinger
    MERK: FRET-FCS-oppsettet er utstyrt med et konfokalt mikroskopvannmål, to laserlinjer, et tidkorrelert TCSPC-system (Single Photon Counting), to hybride fotomultiplierrør (PMT) og to skredfotodioder (APD) for fotoninnsamling og datainnsamlingsprogramvaren. Det er svært viktig å justere oppsettet hver gang før live cellemålinger. Du finner den detaljerte oppsettbeskrivelsen i Tilleggsmerknad 2. Både lasere og alle detektorer (to PMT-er og to APDer) er alltid PÅ under målingene, da alle målinger må utføres under identiske forhold. For kalibreringsmålingene, bruk en dekslelip fra samme tomt som cellene ble sådd på, dette reduserer variasjonen i krageringkorrigering.
    1. For å justere fokus-, pinhole- og krageringsposisjonen, plasser 2 nM grønn kalibreringsløsning på en glassdeksleslip og slå på 485 nm og 560 nm laser. Bruk laser i Pulsed Interleaved Excitation (PIE)-modus16.
    2. Fokuser på løsningen og juster pinhole- og krageringsposisjonen slik at den høyeste tellehastigheten og det minste konfektvolumet oppnås for å få maksimal molekylær lysstyrke.
    3. Gjenta denne prosessen for de røde kanalene med 10 nM rød kalibreringsløsning og en blanding av både grønn og rød kalibreringsløsning.
    4. Plasser 10 nM DNA-løsningen på et glassdeksler og juster fokus-, pinhole- og krageringsposisjonen slik at krysskorrelasjonen mellom de grønne og røde deteksjonskanalene er høyest, det vil si viser den høyeste amplituden.
      MERK: Trinn 1.2.1 og 1.2.4 må kanskje gjentas frem og tilbake for å finne den optimale justeringen. Ta 3-5 målinger fra hver kalibreringsløsning i 30 s - 120 s etter at fokus, hull og krageringposisjon er justert optimalt for de grønne og røde deteksjonskanalene og det konfiske overlappingsvolumet.
    5. Mål en dråpe ddH2O, bildemediet og en ikke-transfektert celle 3-5 ganger hver i 30 s - 120 s for å bestemme antall bakgrunnsfrekvenser.
    6. Samle instrumentets responsfunksjon med 3-5 målinger for 30 s - 120 s. Dette er valgfritt, men anbefales på det sterkeste.
  3. Måling av aktive celler
    1. Finn en passende celle ved å belyse med kvikksølvlampen og observere gjennom okulæren.
      MERK: Egnede celler er i live og viser den typiske morfologien til den respektive tilhengercellelinjen. Fluorescensen av proteinet av interesse, her en overflatereseptor, er synlig over hele overflaten. Mindre lyse celler er mer egnet enn lysere på grunn av bedre kontrast i FCS når et lavt antall molekyler er i fokus.
    2. Slå på begge laserne i PIE-modus og fokuser på membranen ved å se på maksimalt antall per sekund.
      MERK: Lasereffekten må kanskje reduseres for celleprøvene (mindre enn 5 μW på målet). Dette avhenger av de brukte fluoroforene og oppsettet.
    3. Følg auto- og krysskorrelasjonskurvene til eGFP eller merket SNAP-tag festet til β2AR i den elektroniske forhåndsvisningen av datainnsamlingsprogramvaren og samle inn flere korte målinger (~ 2 -10) med en anskaffelsestid mellom 60 -180 s.
      MERK: Ikke opphisse cellene i lang tid kontinuerlig, da fluoroforene kan bleke. Det vil imidlertid avhenge av lysstyrken til hver celle, hvor lenge målingene kan være, og hvor mange målinger totalt kan utføres.

2. Dataanalyse

  1. Eksport av data
    1. Eksporter korrelasjonskurvene G(tc) og tellehastighetene, CR, fra alle målinger.
    2. Pass på at du definerer tidsvinduene "rask" og "forsinkelse" riktig og bruker alternativet "microtime gating" i datakorrelasjonsprogramvaren.
      MERK: Totalt kreves det tre forskjellige korrelasjoner: (1) autokorrelasjon av den grønne kanalen i ledetekstvinduet (ACFgp), (2) autokorrelasjon av de røde kanalene i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd), og til slutt (3) krysskorrelasjonen til det grønne kanalsignalet i ledetekstvinduet med det røde kanalsignalet i forsinkelsestidsvinduet (CCFPIE). Dataeksporten vises trinn for trinn for annen programvare i Tilleggsmerknad 3.
  2. Kalibreringsmålinger
    1. Bruk autokorrelasjonsfunksjonene til de grønne (ACFgp) og røde (ACFrd) fluoroforløsningene, og monter dem til en 3D-diffusjonsmodell med et ekstra trillingsbegrep om nødvendig (eq. 1) for å kalibrere formen og størrelsen på det konfokale deteksjonsvolumet for de to brukte fargekanalene:
      Equation 1 eq. 1
      Her er b kurvens grunnlinje, N antall molekyler i fokus, tD diffusjonstiden (i ms) og s = z0/w0 formfaktoren til det kondokale volumelementet. Trilling blinking eller annen fotofysikk er beskrevet av sin amplitude enR og avslapningstid tR.
      MERK: Alle variabler og symboler som brukes i protokollen er oppført i tabell 1.
    2. Bruk de kjente diffusjonskoeffisientene D for den grønne26 og røde kalibreringsstandarden 27 og de oppnådde formfaktorene grønt og rødt for å bestemme dimensjonene (bredde w0 og høyde z0) og volum Veff av det konfokale volumelementet (eq. 2a-c).
      Equation 2eq. 2a
      Equation 3eq. 2b
      Equation 4eq. 2c
      MERK: Maler for beregning av kalibreringsparameteren leveres som tilleggsfiler (S7).
    3. Beregn den spektrale krysstale α av det grønne fluorescenssignalet (samlet inn i kanal 0 og 2) i de røde deteksjonskanalene (kanal nummer 1 og 3) som et forhold mellom bakgrunnskorrigerte (BG) signaler (eq. 3).
      Equation 5
      eq. 3
    4. Bestem den direkte eksitasjonen av akseptorfluoreore δ av donoreksitasjonsbølgelengden ved forholdet mellom bakgrunnskorrigert tellehastighet for de røde kalibreringsmålingene i "ledetekst" tidsvinduet (eksitasjon med grønn laser) til bakgrunnskorrigert tellehastighet i "forsinkelse" tidsvinduet (eksitasjon med rød laser) (eq. 4).
      Equation 6
      eq. 4
    5. Beregn den molekylære lysstyrken B for både de grønne og røde fluoroforene (eq. 5a-b) basert på bakgrunnskorrigerte tellehastigheter og det oppnådde antall molekyler i fokus, N, fra 3D diffusjonspasning (eq. 1):
      Equation 7eq. 5a
      Equation 8eq. 5b
    6. Monter både ACFgp og ACFrd samt CCFPIE av dobbeltmerket DNA til 3D diffusjonsmodellen (eq. 1). Hold de oppnådde formfaktorene, sgrønne og srøde, konstante for henholdsvis ACFgp og ACFrd. Figurfaktoren for CCFPIE, sPIE, er vanligvis mellom disse to verdiene.
      MERK: I et ideelt oppsett, både Veff,grønn og Veff, ville rødt ha samme størrelse og overlappe perfekt.
    7. Bestem amplituden ved null korrelasjonstid, G0(tc), basert på de funnet verdiene til det tilsynelatende antallet molekyler i fokus (Ngrønn, Nrød og NPIE).
    8. Beregn amplitudeforholdet rGR og rRG for en prøve med 100 % kodiffusjon av grønne og røde fluoroforer (eq. 6). Vær oppmerksom på at NPIE ikke gjenspeiler antall dobbeltmerkede molekyler i fokus, men gjenspeiler bare 1 /G0(tc).
      Equation 9og Equation 10 eq. 6
  3. Eksperimenter med levende celler
    1. For konstruksjoner med én etikett tilpasser du celleeksemplene til en passende modell. For den viste membranreseptoren oppstår diffusjon på en bimodal måte med kort og lang diffusjonstid. I tillegg må fotofysikk og blinking av fluoroforene vurderes:
      Equation 11 eq. 7
      Her er td1 og td2 de to nødvendige diffusjonstidene, og en1 er brøkdelen av den første diffusjonstiden.
      MERK: I motsetning til kalibreringsmålingene, der frie fargestoffer og DNA-tråder fritt diffuserer i alle retninger, viser membranreseptoren bare 2D-diffusjon langs cellemembranene. Denne forskjellen mellom 3D- og 2D-spredning gjenspeiles av den modifiserte diffusjonsbetingelsen (sammenlign eq. 1), der tD i 2D-tilfellet ikke avhenger av formfaktoren til det konfiske volumelementet.
    2. Beregn konsentrasjonen c av grønne eller rødmerkede proteiner fra den respektive N- og V-eff ved hjelp av grunnleggende matematikk (eq. 8):
      Equation 12eq. 8
      der NA = Avokopos nummer
    3. For N-terminal SNAP-etikett og intracellulær eGFP passer de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd) til den dobbeltmerkede prøven med samme modell som for enkeltmerkede konstruksjoner for ACF-ene (eq. 7) og CCFPIE ved hjelp av en bimodal diffusjonsmodell (eq. 9):
      Equation 13eq. 9
      MERK: For en global beskrivelse av systemet må alle tre kurvene passe sammen: Diffusjonsbegrepet er identisk for alle tre kurvene, og den eneste forskjellen er avslapningsbegrepet for CCFPIE. Siden fotofysikk av to fluoroforer vanligvis ikke er relatert, er det ikke nødvendig med korrelasjonsbegrep. Dette fraværet av avslapningsbetingelser resulterer i en flat CCFPIE på korte korrelasjonstider. Imidlertid kan krysstale og direkte eksitasjon av akseptoren på grunn av donorfluofor vise falske positive amplituder og bør kontrolleres nøye for bruk av kalibreringsmålingene.
    4. Beregn konsentrasjonen c av grønne eller rødmerkede proteiner fra den respektive N- og V-eff ved hjelp av ligning 8.
    5. Beregn brøkdelen eller konsentrasjonen, cGR eller cRG, for interaksjon av grønne og røde merkede proteiner fra celleprøvene ved hjelp av korreksjonsfaktorene hentet fra DNA-prøvene, amplitudeforholdene rGR og rRG i celleprøven og deres respektive oppnådde konsentrasjoner (eq. 10).
      Equation 14 og Equation 15 eq. 10
    6. For SNAP-etikett og intracellulær eGFP passer de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd) til FRET-prøven som enkeltmerkede prøver (formel 7) og CCFFRET til en bimodal diffusjonsmodell som inneholder et antikorrelasjonsbegrep (ligning 11)
      Equation 16 eq. 11
      der enf reflekterer amplituden til den totale antikorrelasjonen og enR og tR den respektive amplituden og avslapningstiden.
      MERK: Ved antikorrelerte fluorescensendringer på grunn av FRET, kan det være nødvendig med ett eller flere antikorrelasjonsvilkår (eq. 11), noe som resulterer i en "dukkert" av CCFFRET ved lave korrelasjonstider sammenfallende med en økning i de to autokorrelasjonene (ACFgp og ACFrd). Vær imidlertid oppmerksom på at fotofysikk som trilling blinker kan maskere antikorrelasjonsbegrepet ved å dempe fret-indusert antikorrelasjon. En felles analyse supplert med filtrerte FCS-metoder kan bidra til å avdekke antikorrelasjonsbegrepet. I tillegg bør tekniske gjenstander som stammer fra døde tider i telleelektronikken i nanoseconds-serien utelukkes16. En mer detaljert trinnvis prosedyre for hvordan du utfører analysen i ChiSurf28 og maler for beregning av konfokalt volum eller molekylær lysstyrke er gitt på Github-repositoriet (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) og som tilleggsfiler (Tillegg Note 4 og Supplementary Note 6). I tillegg kan python-skriptene for batcheksport av data som er samlet inn med Symphotime-programvaren i .ptu-format, bli funnet der.

Representative Results

Eksemplariske resultater av kalibrering og live-celle målinger er diskutert nedenfor. I tillegg er effekten av FRET på krysskorrelasjonskurvene demonstrert basert på simulerte data ved siden av effekten av proteinprotein-interaksjon som øker CCF PIE-amplituden.

PIE-basert FCS-dataeksport
I PIE-eksperimenter samles data i tidsflagget tids løst modus (TTTR)29,30. Figur 1B viser fotonankomsttids histogrammer av en PIE-måling av en dobbeltmerket DNA-streng på det beskrevne oppsettet (Tilleggsmerknad 1). Oppsettet har fire gjenkjenningskanaler. Fluorescensutslippet deles først av polarisering i "S" og "P" retninger (refererer til det vinkelrette og parallelle planet der det elektriske feltet av en lysbølge svinger). For det andre deles hver polariseringsretning i to fargekanaler (grønn, rød) før deteksjon, noe som resulterer i fire kanaler (S-grønn, S-rød, P-grønn, P-rød). I det "raske" tidsvinduet blir den grønne fluoroforen begeistret, og signalet oppdages i både de grønne og røde kanalene på grunn av FRET. I forsinkelsestidsvinduet er bare den røde fluoroforen (i den røde kanalen) synlig. Basert på deteksjonskanalene og "ledetekst" kontra "forsinkede" tidsvinduer, kan minst fem forskjellige korrelasjonskurver (3 autokorrelasjonskurver (ACFer) og 2 krysskorrelasjonskurver (CCFer)) oppnås (Figur 1C-D): (1) grønt signal i ledetekstvinduet (ACFgp), (2) rødt signal i ledetekstvinduet (i tilfelle FRET, ACFrp), og (3) rødt signal i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd). Disse ACF-ene rapporterer om proteinmobilitet, fotofysikk (f.eks. trillingblinking) og andre tidskorrelerte lysstyrkeendringer i fluoroforene (f.eks. på grunn av FRET). (4) Pie-basert krysskorrelasjon CCFPIE av det grønne signalet i ledeteksten tidsvinduet med det røde signalet i forsinkelsestidsvinduet gjør det mulig å bestemme brøkdelen av co-diffusjon av den grønne og røde fluoroforen16. (5) Den FRET-baserte krysskorrelasjonen CCFFRET i greenen med det røde signalet i ledetekstvinduet er relatert til FRET-induserte, antikorrelerte lysstyrkeendringer i de grønne og røde signalene31,32,33.

Figure 1
Figur 1: Pulsert-sammenflettet eksitasjon (PIE) basert fluorescens (kryss) korrelasjonsspektroskopi (F(C)CS). (A) I FCS diffusescerende merkede molekyler diffuserer fritt inn og ut av et (diffraksjonsbegrenset) fokusvolum formet av en fokusert laserstråle som induserer fluorescens i dette lille volumet. De resulterende intensitetssvingningene i molekyler som kommer inn og forlater volumet, korreleres og gir informasjon om molekylenes mobilitet. (B) I PIE brukes to forskjellige laserlinjer ("ledetekst" og "forsinkelse") til å begeistre prøven merket med to forskjellige fluoroforer ("grønn" og "rød"). Tidsforskjellen mellom begge eksitasjonspulsene er tilpasset fluorescenslevetidene til de respektive fluoroforene slik at den ene har forfalt før den andre er spent. I den dobbeltmerkede prøven som vises, er begge fluoroforene tilstrekkelig nær å gjennomgå Förster Resonance Energy Transfer (FRET) fra den "grønne" donorfluoforen til den "røde" akseptorfluoreore. Dermed kan rød fluorescensutslipp oppdages i "rask" tidsvindu ved eksitasjon av den grønne donoren. I det brukte oppsettet (Tilleggsmerknad 2) brukes to detektorer for hver farge, en orientert parallelt med eksitasjonsstråleretningen (betegnet "p") og den andre vinkelrette (betegnet "s"). (C) Tre forskjellige autokorrelasjonsfunksjoner kan bestemmes i et PIE-eksperiment: Korrelasjon av i) grønne kanalsignaler i ledetekstvinduet (ACFgp), ii) røde kanalsignaler i ledetekstvinduet (ACFRP) og iii) røde kanalsignaler i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd). (D) To forskjellige krysskorrelasjonsfunksjoner kan bestemmes: iv) Krysskorrelasjonen "PIE" (CCFPIE) med grønne kanalsignaler i ledetekstvinduet korrelert med de røde kanalsignalene i forsinkelsesvinduet, hvor amplituden til denne kurven er relatert til ko-diffusjon av fluoroforer; og v) krysskorrelasjonen "FRET" (CCFFRET) med de grønne kanalsignalene i ledetekstvinduet korrelert med de røde kanalsignalene i samme ledetekstvindu; her er formen på denne kurven til tider raskere enn diffusjon relatert til fret-indusert intensitet endres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kalibrering
Figur 2A-B viser en kalibreringsmåling av henholdsvis de syngende diffuserende grønne og røde fluoroforene. Basert på en passform med eq. 1 og den kjente diffusjonskoeffisienten Dgrønn26 og Drød27 figuren (z0 og w 0) og størrelsen ( Veff) på deteksjonsvolumet beregnes ved hjelp av eq. 2a-c. Passformresultatene fra ACFgp fra den grønne fluoroforen og ACFrd fra den røde fluoroforen er oppsummert i figur 2C. Begge fluoroforene viser en ekstra avslapningstid konstant på henholdsvis 8,6 μs (18%) og 36 μs (15%). Den molekylære lysstyrken (eq. 5a-b) av den grønne og røde fluoroforen utgjør henholdsvis 12,5 kHz per molekyl og 2,7 kHz per molekyl.

For en pålitelig estimering av konfokal volumstørrelse og form samt molekylær lysstyrke, anbefales det å utføre 3-5 målinger per kalibreringsforsøk og en felles (eller global) passform av alle repetisjoner.

Tverrstangen α (Figur 2D, eq. 3) og den direkte eksitasjonen av akseptor av den grønne laseren δ (Figur 2E, eq. 4) for dette fluoroforparet ligger på henholdsvis ~ 15% og ~ 38%.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringsmålinger av fritt diffuserende grønn og rød kalibreringsstandard. (A-B) Representativ 60-talls måling av en 2 nM grønn (A) og en kalibreringsstandardmåling på 10 nM(B) montert på 3D-diffusjonsmodellen, inkludert en ekstra avslapningstid (eq. 1). Tabellen i panelet (C) viser tilpasningsresultatene og den avledede parameteren basert på eq. 2a-c og eq. 5a-b. *Diffusjonskoeffisienter ble hentet fra litteratur26,27. (D) Bestemmelse av tverrstangen α av det grønne signalet inn i de røde kanalene (eq. 3). Eksitasjonsspekteret av den grønne standarden er vist i cyan, utslippsspekteret i grønt. Eksitasjonslaserlinjene på 485 nm (blå) og 561 nm (oransje) vises som stiplede linjer. Gjennomsiktige grønne og magentafargede bokser viser det innsamlede utslippsområdet (Tilleggsmerknad 2). (E) Bestemmelse av direkte eksitasjon δ av den røde fluoroforen av 485 nm laser (eq. 4). Fargekode er identisk med (D), lys og mørk oransje viser henholdsvis eksitasjons- og utslippsspekteret til den røde standarden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å bestemme og kalibrere overlappingen av det grønne og røde eksitasjonsvolumet, brukes en dobbeltmerket DNA dobbel tråd (figur 3A) som beskrevet ovenfor. Her er fluoroforene fordelt 40 bp fra hverandre slik at ingen FRET kan forekomme mellom de grønne og røde fluoroforene festet til endene av DNA-doble tråder. Figur 3B viser autokorrelasjonene fra både fluoroforer i grønt (ACFgp) og magenta (ACFrd) og PIE-krysskorrelasjonen, CCFPIE, i cyan. Vær oppmerksom på at for CCFPIE er signalet i de grønne kanalene i ledetekstvinduet korrelert med signalet i de røde kanalene i forsinkelsestidsvinduet16.

Her oppnås en gjennomsnittlig diffusjonskoeffisient for DNA-strengen til DDNA = 77 μm²/s. Du finner mer informasjon om beregningen i den trinnvise protokollen Tilleggsmerknad 4. Denne verdien oppnås ved å sette inn den kalibrerte grønne og røde deteksjonsvolumstørrelsen (figur 2) og de respektive diffusjonstidene til ACFgp og ACFrd av DNA-strengen (figur 3C) i ligning 2a. Deretter kan mengden co-diffusjon, det vil si dobbeltmerkede molekyler (eller proteinkomplekser i tilfelle co-transfeksjon av to forskjellige proteiner) bestemmes fra celleprøvene.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering av det grønnrøde overlappingsvolumet ved hjelp av en DNA-prøve. (A) DNA-strengen som brukes til kalibrering bærer en grønn og en rød kalibreringsfluofor, med en avstand på 40 bp i mellom. Interdyeavstanden må være tilstrekkelig stor til å utelukke FRET mellom fluoroforene. (B) Representativ 60-s måling av en 10 nM DNA-løsning. Autokorrelasjoner fra både fluoroforer i grønt (ACFgp, grønn standard) og magenta (ACFrd, rød standard) og PIE-crosscorrelation, CCFPIE, i blått. Tabellen i panelet (C) viser tilpasningsresultatene basert på 3D Diffusjonsmodellen, inkludert et ekstra avslapningsbegrep (eq. 1) og den avledede parameterdiffusjonskoeffisienten til DNA, DDNA (eq. 2a), størrelsen og formen på overlappingsvolumet (eq. 2a-c) og korreksjonsforholdene rGR og rRG (eq. 6 ). Vær oppmerksom på at verdiene for det grønne og røde deteksjonsvolumet (merket med *) ble tatt fra passformen til de enkelte fluoroforene som er vist i figur 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Live-celle eksperimenter
I den følgende delen presenteres analysen av live-celleeksperimenter for forskjellige β2AR-konstruksjoner. Siden β2AR er et membranprotein, er diffusjonen i stor grad begrenset til en todimensjonal diffusjon (figur 4A) langs cellemembranen (unntatt transport- eller resirkuleringsprosesser til eller fra membranen) 2. Med begrensningen til 2D-diffusjonen blir formfaktoren s = z0/w0 i eq. 1 foreldet, noe som resulterer i en forenklet diffusjonsmodell (eq. 9).

Enkeltmerkede konstruksjoner: β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR
Figur 4 viser eksemplariske målinger av enkeltetikettkonstruksjonen β2AR-IL3-eGFP (figur 4B), der eGFP settes inn i den intracellulære sløyfen 3, og konstruksjonen NT-SNAP-β2AR (figur 4C), der SNAP-koden konjugeres til N-terminus for β2AR. SNAP-koden er merket med et membran-ugjennomtrengelig SNAP-overflatesubstrat. De representative kurvene viser gjennomsnittet av 4-6 gjentatte målinger med oppkjøpstider på 120 - 200 s hver. De respektive autokorrelasjonene ACFgp og ACFrd av eGFP- og SNAP-signalet er montert på en bimodal, todimensjonal diffusjonsmodell (eq. 9). Når det gjelder rask dynamikk, viser eGFP bare den forventede trillingen som blinker ved tR1 ~ 9 μs mens SNAP-signalet krever to avslapningstider, en på den typiske trilling blinkende tiden på tR1 ~ 5 μs og en andre på tR2 ~ 180 μs.

Fluoroforenes molekylære lysstyrke i levende celler er 0,8 KHz (eGFP) og 1,7 kHz (SNAP) per molekyl under de gitte eksitasjonsforholdene (eqs. 5a-b). Konsentrasjonen av de merkede β2AR-konstruksjonene som er innlemmet i cellemembranen, bør være i nano-molarområdet og kan bestemmes av gjennomsnittlig antall molekyler (eq. 9, figur 4C) og størrelsen på det respektive konfokale volumet for den grønne og røde kanalen (figur 2) ved hjelp av eq. 8.

Figure 4
Figur 4: Representativ måling av enkeltmerkede konstruksjoner. (A) I denne studien ble membranreseptoren β2AR brukt som eksempel. I motsetning til fluoroforene og DNA-strengen som brukes til kalibrering, som fritt kan flyte gjennom deteksjonsvolumet, diffuserer membranproteiner hovedsakelig lateralt langs membranen, beskrevet som 2-dimensjonal diffusjon. (B, D) ACFgp og ACFrd av enkeltmerkede konstruksjoner β2AR-IL3-eGFP (B) og NT-SNAP-β2AR (D). Vist er gjennomsnittet av 4-6 målinger hver samlet for 120 - 200 s. Tabellen i panelet (C) viser tilpasningsresultatene av dataene til den todimensjonale todimensjonale diffusjonsmodellen, inkludert ekstra avslapningsbetingelser (eq. 7). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dobbeltmerket konstruksjon: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
I den dobbeltmerkede konstruksjonen NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (kort NT-SNAP) settes eGFP inn i den intracellulære løkken 3, og SNAP-koden konjugeres til N-terminus for β2AR (figur 5A). I denne konfigurasjonen er eGFP på innsiden av membranen og SNAP på yttersiden med for store avstander for FRET. I et ideelt tilfelle vil denne konstruksjonen vise 100% ko-diffusjon av den grønne og røde fluoroforen, og ingen FRET-signal. Figur 5B-D viser to målinger av NT-SNAP i to celler på to forskjellige målingsdager. Montering av ACFgp og ACFrd av den "bedre" målingen vist i figur 5B med eq. 7 og CCFPIE med eq. 9, avslører 50-60 molekyler i fokus for ACFgp og ACFrd, mens Napp, dermed 1/G0(tc) ~ 114 for CCFPIE (Figur 5C ). Konsentrasjonen av merkede reseptorer ligger i ~100 nM-området som bestemt med eq. 8. For å bestemme den gjennomsnittlige konsentrasjonen av dobbeltmerkede molekyler beregnes først forholdet mellom G0(tc) (representert av 1 /N(app)) av CCFPIE til HENHOLDSVIS ACFgp og ACFrd(eq. 6). Deretter sammenlignes disse verdiene, rGRcell= 0,43 og rRGcell = 0,53, med verdiene som er oppnådd fra DNA-målingen (rGR, DNA= 0,51 og rRG,DNA = 0,79 på denne måledagen). Ved hjelp av regelen for proporsjoner reflekterer en rGRcell= 0,43 fra ACFgp for eGFP-signalet til en brøkdel av kospredning (rGRcell/rGR, DNA) på 0,84, hvor for det andre tilfellet av ACFrd av SNAP-substratsignalet utgjør denne verdien 0,67. Den gjennomsnittlige konsentrasjonen av den dobbeltmerkede NT-SNAP-konstruksjonen kan endelig beregnes basert på eq. 10. I motsetning, i målingen vist i figur 5D fra en annen dag, er konsentrasjonen av reseptorer ganske lav og dataene svært støyende slik at tilpasningsområdet er begrenset opp til ~ 10 μs. I tillegg observeres bare en lav mengde co-diffusjon (15-26%).

Figure 5
Figur 5: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruksjon med dobbeltmerkede. (A) I den dobbeltmerkede konstruksjonen settes eGFP inn i den intracellulære løkken 3 og SNAP-koden som er knyttet til N-terminus for β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd og CCFPIE av to målinger av den dobbeltmerkede konstruksjonen. Dataene passer til en bimodal todimensjonal diffusjonsmodell (eq. 9, CCFPIE) og inkluderer ytterligere avslapningsbetingelser (eq. 7, ACFgp og ACFrd). Tabellen i panelet (C) viser tilpasningsresultatene og den avledede parameterkonsentrasjonen (eq. 8), forholdet mellom korrelasjonsamplituden ved null korrelasjonstid (G0(tc)) og brøkdelen av co-diffuserende molekyler (eq. 10). Vær oppmerksom på at målingene ble anskaffet på forskjellige dager, og dermed ble det brukt litt forskjellig faktor for amplitudekorreksjonen (B: rGR, DNA = 0,51 og r RG, DNA = 0,79; D: rGR, DNA = 0,51 og r RG, DNA = 0,56). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dobbeltmerket konstruksjon som gjennomgår FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
I den dobbeltmerkede konstruksjonen β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (figur 6A) settes eGFP inn i den intracellulære løkken 3 som er identisk med NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruksjonen med SNAP-koden festet til C-terminus. Her er begge etikettene på samme side av cellenes plasmamembran, slik at fluoroforene er i nærheten slik at FRET oppstår som angitt i den slokkede eGFP-levetiden (Tilleggsmerknad 5). Tatt i betraktning fleksibiliteten til relativt ustrukturerte proteinregioner som C-terminus34 og minst to forskjellige proteinkonformasjoner av GPCRs35, "high FRET" (HF) eller "low FRET" (LF), kan dynamiske endringer i FRET-effektiviteten på grunn av eGFP-SNAP-avstandsendringer observeres og identifiseres ved et antikorrelasjonsbegrep i CCFFRET (oransje kurve i figur 6B ). FRET-svingninger har vist seg å være antikorrelert, da reseptoren bare kan være i en tilstand om gangen, enten HF eller LF. Felles (eller global) passform av alle fem korrelasjonskurver (Figur 6B) avslører ~ 70% av sakte diffuserende molekyler på ~ 100 ms mens resten diffuserer med ~ 1 ms. Alle autokorrelasjoner og CCFFRET viser avslapningsbetingelser ved 37 μs og 3 μs; Disse korrelasjonene dominert av rødt signal (ACFRP, ACFrd og CCFFRET) viser en ekstra langsom komponent ~ 50 ms (Figur 6C).

FRET-induserte endringer på CCFFRET under ulike forhold (figur 6D) demonstreres ved en serie simuleringer av et totilstandssystem med en svingningstid på 70 μs mellom LF- og HF-tilstander. Ved bytte fra LF til HF-tilstand observeres endringer i det antikorrelerte signalet i hurtigtidsvinduet: Det grønne signalet reduseres og det røde signalet øker (omvendt for HF-> LF-veksling). Hvis HF-LF-veksling skjer på tidsskalaer raskere enn diffusjonstiden, med andre ord i løpet av molekylets oppholdstid i fokus, kan frekvensen avledes fra antikorrelasjonen i CCFFRET6,31,36. Vær oppmerksom på at dynamiske prosesser som er langsommere enn diffusjonstiden, ikke kan observeres i FCS.

I denne demonstrasjonen ble det antatt to forskjellige FRET-scenarier, som viser enten en moderat eller maksimal endring i FRET-effektiviteten mellom de to tilstandene. Simuleringene ble utført ved hjelp av Burbulator37 og vurderer fravær eller tilstedeværelse av trilling blinker og økende mengde donor crosstalk inn i de røde kanalene. Diffusjonsbegrepet ble modellert som en bimodal fordeling med 30% av raskt diffuserende molekyler ved tD1 = 1 ms og resten av molekylene diffuserer sakte med tD2 = 100 ms. Totalt ble 107 fotoner simulert i et 3D Gaussian-formet volum med w0 = 0,5 μm og z0 = 1,5 μm, en boksstørrelse på 20 og NFCS = 0,01.

Figur 6E-F viser simuleringsresultatene for den FRET-induserte krysskorrelasjonen CCFFRET for moderat (figur 6E) og maksimal FRET-kontrast ( figur6F) i fraværet (heltrukne linjer) og tilstedeværelse av trippel blinking (stiplede linjer). FRET-indusert antikorrelasjon kan lett ses i figur 6F. Den "dempende" effekten ved å legge til en ekstra trillingtilstand reduserer korrelasjonsamplituden (Figur 6E-F)38,39.

Figure 6
Figur 6: Simulering av dobbeltmerkede prøver som viser dynamisk FRET. (A) Dobbeltmerket β2AR med en eGFP satt inn i den intracellulære løkken 3 og en SNAP-kode for C-terminalen. Begge fluoroforene er nær nok til å gjennomgå FRET og vise endringer i FRET-effektiviteten hvis reseptoren gjennomgår proteindynamikk. (B) Autokorrelasjon (ACFgp, ACFrp og ACFrd, passer med eq. 7) og krysskorrelasjonskurver (CCFFRET (eq. 7) og CCFPIE (eq. 9)) i et eksempelmål. Tabell i panel (C) viser tilpasningsresultatene. (D-F) For å vise påvirkningen av eksperimentell parameter på forventet, FRET-indusert antikorrelasjonsbegrep, ble det utført 12 simuleringer, der endringen i FRET-effektiviteten (liten eller stor), forskjellig mengde donorkryssing i akseptorkanalene (0%, 1% eller 10%) og fraværet og tilstedeværelsen av trillingblinking ble modellert. Likevektsfraksjonen av begge FRET-statene ble antatt til 50:50 og deres valutakurser justert slik at den oppnådde avslapningstiden tR = 70 μs. Flere detaljer om simuleringene se i teksten. (E) CCFFRET av simuleringsresultatene med moderat FRET-kontrast og i fravær av krysstale (mørk oransje), 1% krysstale (oransje) og 10% krysstale (lys oransje). Heltrukne linjer viser resultater i fravær av trillinger, stiplede linjer i nærvær av trilling. (F) CCFFRET av simuleringsresultatene med maksimal FRET-kontrast. Fargekoden er identisk med (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Men i simuleringen som ligner mest på de eksperimentelle forholdene (α = 10%, 15% trilling blinkende og moderat FRET-kontrast, stiplet gul linje i figur 6E), er antikorrelasjonsbegrepet nesten redusert. Figur 7 viser resultatet av å analysere disse simulerte dataene ved hjelp av informasjonen som er kodet i histogrammer for fotonankomsttid (dvs. levetiden til fluorescens) ved hjelp av Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS)17,19 eller artsfiltrert FCS (fFCS)18. Her brukes fluorescenslevetidene til de kjente HF- og LF-artene (figur 7A) til å generere vekter eller "filtre" (figur 7B) som brukes under korrelasjonsprosedyren. I de oppnådde art-auto- og krysskorrelasjonskurvene (Figur 7C-D) kan antikorrelasjonen tydelig observeres.

Figure 7
Figur 7: Livstidsfiltrert FCS kan bidra til å avdekke proteindynamikkbaserte svingninger i FRET-effektivitet i prøver med høy krysstale, betydelig trilling blinker eller andre fotofysiske eller eksperimentelle egenskaper som maskerer FRET-indusert antikorrelasjon i CCFFRET. Her vises tilnærmingen eksemplarisk for dataene som vises i figur 6E for simuleringen som inneholder 10% krysstale og 5% trilling blinker. (A) Normaliserte fluorescensintensitetsforfallsmønstre for de to FRET-artene (henholdsvis lys og mørkegrønn for høy og lav FRET) og IRF (grå). Mønsteret for parallellregistreringskanalen vises i heltrukne linjer, stiplede linjer for den vinkelrette deteksjonskanalen. (B) Vektingsfunksjonen eller "filteret" ble generert basert på mønstrene som vises i (A), fargekode er identisk med (A). Vær oppmerksom på at bare signalet i de grønne deteksjonskanalene, og dermed FRET-indusert donorslukking, vurderes her. (C) Fire forskjellige arts-selektive korrelasjoner oppnås: arts-autokorrelasjoner av lav FRET-tilstand (sACFLF-LF, mørkegrønn) og høy FRET-tilstand (sACFHF-HF, lysegrønn), og de to artene-krysskorrelasjoner mellom lav FRET til høy FRET-tilstand(sCCFLF-HF, mørk oransje) og omvendt (sCCFHF-LF , oransje). SCCF viser tydelig antikorrelasjonen i μs-området. Stiplede, svarte linjer viser anfallene. sACF var egnet med eq. 9 og sCCF med eq. 11. Tabell i panel (D) viser tilpasningsresultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

CCFPIE amplitude for å studere proteinproteininteraksjon (PPI)
Til slutt er et vanlig brukstilfelle for PIE-basert FCS i levende celler å studere samspillet mellom to forskjellige proteiner. Her er avlesningsparameteren amplituden til CCFPIE, eller mer presist forholdet mellom autokorrelasjonsamplitudene ACFgp og ACFrd til amplituden til CCFPIE. For å vise effekten av å øke kospredningen på CCFPIE, er det utført simuleringer basert på de to enkeltmerkede konstruksjonene, β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR (Figur 8A). Figur 8B viser hvordan amplituden til CCFPIE øker når brøkdelen av kospredningsmolekyler endres fra 0% til 100%. Vær oppmerksom på at en 1% krysstale av grønt signal inn i de røde kanalene i forsinkelsestidsvinduet ble lagt til med diffusjonskomponentene ellers modellert som vist ovenfor.

Figure 8
Figur 8: CCFPIE kan brukes til å studere samspillet mellom to proteiner. (A) Her ble en co-transfection studie av β2AR-IL3-eGFP med NT-SNAP-β2AR (med en "rød" SNAP-etikett) simulert. (B) For en økende mengde ko-diffuserende molekyler (0% (mørkeblå) -> 100% (lyseblå)) øker amplitude G(tc). Diffusjonsbegrepet ble igjen modellert som en bimodal fordeling med 30% av raske diffuserende molekyler ved tD1 = 1 ms og resten av molekylene diffuserer sakte med tD2 = 100 ms. I tillegg ble 1% krysstale av grønt signal inn i det røde forsinkelsestidsvinduet lagt til. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Symbol Betydning (felles enhet)
α krysstale av den grønne fluoroforen etter grønn eksitasjon i de røde deteksjonskanalene (%)
a1 brøkdel av første diffusjonskomponent i bimodal diffusjonsmodell av membranreseptorer
af total amplitude av antikorrelasjonsbegrepet
enR amplitude av fotofysikk /triplet blinker
b baseline/offset for en korrelasjonskurve
B molekylær lysstyrke av en fluorofor ((kilo-)teller per molekyl og andre)
BG bakgrunn (f.eks. fra et passende referanseeksempel: ddH2O, buffer, ikke-overført celle osv.)
c konsentrasjon
CR antallshastighet (KHz eller (kilo-) antall per sekund)
δ direkte eksitasjon av den røde fluoroforen etter grønn eksitasjon (%)
D diffusjonskoeffisient (μm²/s)
G(tc) korrelasjonsfunksjon
N antall molekyler i fokus
NA Avokopos nummer (6,022*1023 Mol-1)
rGR, rRG amplitudeforholdet for grønn eller rød autokorrelasjonsfunksjon og den PIE-baserte krysskorrelasjonsfunksjonen
s formfaktor for konfektvolumelement
tc korrelasjonstid (vanligvis i millisekunder)
tD diffusjonstid (vanligvis i millisekunder eller mikrosekund)
tR avslapningstid for fotofysikk (vanligvis i mikrosekund)
tT avslapningstid for trilling blinking (vanligvis i microsecond)
w0 halv bredde av konfektvolumelement (μm)
z0 halv høyde på konfektvolumelement (μm)

Tabell 1: Liste over variabler og forkortelser. For bruk av symboler og definisjon i fluorescens- og FRET-eksperimenter anbefales retningslinjene for FRET-samfunnet40.

TILLEGGSFILER:

SuppNote1_Coverslip rengjøring.docx Klikk her for å laste ned denne filen.

SuppNote2_Confocal installasjonsprogrammet.docx Klikk her for å laste ned denne filen.

SuppNote3_Data eksport.docx Klikk her for å laste ned denne filen.

SuppNote4_FCCS kalibreringsanalyse ved hjelp av ChiSurf.docx Klikk her for å laste ned denne filen.

SuppNote5_Fluorescence levetid histogrammer.docx Klikk her for å laste ned denne filen.

S6_Scripts.zip Klikk her for å laste ned denne filen.

S7_Excel_templates.zip Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

FCS-teknikker i GPCRs gjør det mulig å vurdere mobilitet og interaksjoner mellom reseptorer i levende celler41. Fordelen med FRET-FCS-teknikken er at, sammen med mobilitet, kan konformasjonsdynamikken til GPCRs undersøkes. Det er imidlertid utfordrende å utføre FRET-FCS i levende celler og krever celler som viser lavt (eller maksimalt moderat) uttrykk for det fluorescerende merkede proteinet av interesse, et godt kalibrert oppsett og en god rørledning for å analysere data. Her diskuteres først de kritiske punktene i prøvepreparering og eksperimentell prosedyre om de biologiske, spektroskopiske og tekniske synspunktene.

Kritiske eksperimentelle trinn inkluderer å minimere bakgrunnen og autofluorescensen (ved å bruke omfattende rensede deksler og fenolrøde frie medier), optimalisering av transfeksjonsforhold (f.eks. mengde plasmid DNA og tid etter transfeksjon) for å oppnå lave uttrykksnivåer og effektiv merking. Selvfølgelig er det også viktig å sikre at funksjonen til det merkede proteinet ikke hemmes. I live-celleeksperimenter tas derfor beslutningen om merkingsstrategi og etikettposisjon ofte til fordel for fluorescerende proteiner eller SNAP/CLIP-tagg festet til den fleksible N- eller C-terminus42,43. Alternative merkingsstrategier som å sette inn en unaturlig aminosyre med en reaktiv sidekjede for merking med organisk fluorofor har dukket opp de siste årene44.

For dual-color PIE-FCS, hvor bare samspillet mellom to molekyler av interesse skal undersøkes, kan fluoroforene velges fra et stort utvalg av etablerte fluorescerende proteiner eller SNAP / CLIP-substrater. Her bør spektroskopimessig målet være å velge et par slik at liten krysstale eller direkte akseptoreksitasjon oppstår. I tillegg bør de valgte fluoroforene være fotostabile og vise liten eller ingen bleking under de valgte eksperimentelle forholdene. Det anbefales å velge fluoroforer i det røde spektralområdet som (1) autofluorescensbakgrunnen fra cellen reduseres og (2) eksitasjonslyset er av lengre bølgelengde, og dermed mindre fototoksisk14. Photobleaching kan minimeres ved å gjennomføre en såkalt "kraftserie" først, der laserkraften økes trinnvis, og den molekylære lysstyrken observeres. Det optimale eksitasjonsintensitetsområdet ligger i det lineære området for resultatene45.

Hvis de to etikettene også skal rapportere om proteinkonformasjonsdynamikk gjennom FRET, er valget av tilgjengelige fluoroforer mer begrenset. Her bør den mulige minimale/maksimale avstanden mellom de to fluoroforene estimeres på forhånd, for eksempel basert på tilgjengelige strukturer eller molekylstørrelse, og et fluoroforpar valgt med en rimelig Förster radius R0 slik at FRET faktisk kan forekomme20.

Her ble eGFP og en SNAP-kode valgt for merking, og SNAP-koden ble merket med enten et intracellulært eller et membran-ugjennomtrengelig overflatesubstrat. Spektra ligner på de som er vist i figur 2C-D. Denne kombinasjonen av fluoroforer viser høy krysstale av eGFP inn i de røde deteksjonskanalene og direkte akseptoreksitasjon av SNAP-substratet ved den grønne eksitasjonen i ledetekstvinduet og resulterer i et betydelig "falskt" signal i de røde kanalene i ledetekstvinduet. Ideelt sett bør både verdier, kryssprat og direkte akseptoreksitasjon ikke overstige 5%5,6,38. Men med en Förster-radius på 57 Å er den ideelt egnet til å sondere avstanden mellom etikettene i β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-konstruksjon som kan evalueres fra den slukkede eGFP-levetiden (tilleggsmerknad 5).

Teknisk sett, når det gjelder fluorescensspektroskopieksperiment, bør enheten være godt justert og bør ha egnede eksitasjonskilder, utslippsfilter og følsomme detektorer. For å unngå artefakter fra detektorutjevning på μs tidsskala, bør minst to detektorer av hver farge være til stede, som kan krysskorreleres. I moderne tidskorrelert enkeltfotontellingselektronikk spiller dødtiden til deteksjonskortet i ns-tidsområdet knapt en rolle på grunn av de uavhengige rutingskanalene, men det kan kontrolleres som foreslått av Müller et al 16 forutsatt at tidsintervallet av interesse ligger i under-μs / ns tidsintervall. I tillegg, for enda høyere tidsoppløsninger i PS-området, bør hver deteksjonskanal dobles, det vil si fire detektorer per farge, for å også omgå detektorens dødtider2,15,29,46. Mens den gjennomsnittlige fluorescenslevetiden kan estimeres ved hjelp av ikke-polarisert fluorescensdeteksjon, må utslippet samles inn polariseringsavhengig for analyse av avstanden (~-fordelingen). Dette skyldes det faktum at effektiviteten av energioverføringen i FRET er avhengig av orienteringen av de to fluoroforene. Mer detaljert informasjon finner du her20,28,47. Til slutt, i PIE-eksperimenter, er avstanden mellom ledeteksten og forsinkelsespulsen kritisk og bør velges slik at fluorescensintensiteten til fluoroforene i stor grad har blitt forfalt (Figur 1B). En vanlig regel er å plassere de to pulsene 5x fluorescenslevetiden fra hverandre, det vil si for eGFP med en fluorescenslevetid på 2,5 ns avstanden skal være 12,5 ns minst22.

Etter å ha detaljert alle hensyn for den eksperimentelle prosedyren, diskuteres dataene og analysen mer detaljert. Som nevnt i protokolldelen, må justeringen av oppsettet kontrolleres daglig, inkludert analysen av kalibreringsmålingene. Dataene som vises i figur 2A-C, viser for eksempel en ekstra avslapningskomponent i området 8-40 μs. Typisk trilling blinker av den grønne kalibrering fluorofor er kjent for å forekomme i 2-10 μs området13,15,48. Den langsomme avslapningskomponenten som kreves i alle kurver i DNA-prøven (Figur 3C), for langsom for faktisk trilling blinker, kan stamme fra interaksjoner av DNA med fluoroforene39. Denne komponenten forventes imidlertid ikke i CCFPIE, og sannsynligvis stammer fra gjenværende krysstale. Dermed er det sterkt tilrådelig å utføre analysen av kalibreringsprøvene direkte før du går videre til celleeksperimentene for å bedømme kvaliteten på dagens justering.

Riktig kalibrering av det konfokale overlappingsvolumet krever en prøve med 100% kospredning av den grønne og røde etiketten. Her brukes fluorescerende merket dobbeltstrenget DNA. Begge DNA-trådene kan skreddersys for å ha de ønskede fluoroforene i ønsket avstand fra hverandre. De designede trådene kan annealeres med høyt utbytte. Good Laboratory Practice anbefaler imidlertid å sjekke integriteten og merkegraden til DNA-trådene ved agarose gelelektroforese og måle absorpsjonsspekteret. Utbyttet av den dobbeltstrengede monteringen bør også kontrolleres, da denne kalibreringsmålingen kritisk er avhengig av antagelsen om at det er en 100% kospredning av greenen med den røde etiketten. Hvis forutsetningen ikke er gyldig, kan det hende at korreksjonsfaktorer må brukes16,22. I kalibreringsmålingene som er vist i figur 2 og figur 3, ble det oppnådd et deteksjonsvolum på henholdsvis 1,4 ml og 1,9 ml i den grønne og røde kanalen. Denne størrelsesforskjellen forventes for et oppsett med nesten diffraksjonsbegrensede eksitasjonsvolumer (Tilleggsmerknad 2). Under denne tilstanden skalerer størrelsen på eksitasjonsvolumet med eksitasjonsbølgelengden. Dette forklarer igjen de forskjellige korrelasjonsamplitudene som er observert i figur 3B. De avledede korreksjonsfaktorene rGR = 0,56 og rRG = 0,72 riktig for dette størrelsesavviket og potensiell ikke-perfekt overlapping av de to eksitasjonsvolumene3,4.

Figur 4, Figur 5, Figur 6og Figur 7 viser arbeidsflyten til en PIE-F(C)CS-basert studie som tar sikte på å forstå konformasjonsproteindynamikk. For det første fungerer de to enkeltmerkede konstruksjonene β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR som kontroller for å karakterisere fluoroforegenskapene i celler i fravær av den respektive andre fluoroforen (figur 4). Deretter fungerer den dobbeltmerkede konstruksjonen NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP med en SNAP-kode vendt mot celleeksteriøret og en eGFP på den cytoplasmatiske siden som en "100 % kospredningskontroll" (figur 5). Den siste konstruksjonen, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, bærer begge fluoroforene på den cytoplasmatiske siden og nær nok sammen til å gjennomgå FRET. Her forventes igjen en 100% ko-diffusjon i takt med antikorrelerte intensitetssvingninger i det grønne og røde kanalsignalet i ledetekstvinduet, det vil si etter donoreksitasjon, på grunn av proteindynamikk som påvirker FRET-effektiviteten31,32,33. Denne dynamikken kan vises som antikorrelasjon i CCFFRET (Figur 6-7).

Alle GPCR-β2AR-konstruksjoner viser bimodal diffusjon på cellemembranen (figur 4A). Mens β2AR-IL3-eGFP bare viser forventet trippel blinking (Figur 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR viser en ekstra langsom avslapningstid (Figur 5C-D). Det er sannsynlig at tR2 kan stamme fra ubundet SNAP-substrat. Dette kan belyses ved ytterligere eksperimenter, for eksempel ved også å måle diffusjons- og fotofysiske egenskapene til det brukte SNAP-substratet i en vandig løsning. Vær oppmerksom på at et enkelt eksperiment for å skille mellom diffusjons- og avslapningstider er å endre pinhole av det konfokale oppsettet, det vil si å øke det effektive volumet: Mens diffusjonstidene øker med økende effektive volumer, er avslapningsbetingelsene uendret13. Når du bestemmer konsentrasjonen av fluorescerende protein (FP) basert på passformresultatene, vær oppmerksom på at FPs generelt gjennomgår en modningsprosess, der til slutt kromofor dannes12. Denne modningstiden kan variere fra FP til FP i tillegg til fotofysikk som avhenger av det lokale kjemiske miljøet13,15. Dermed er den faktiske proteinkonsentrasjonen som er tilstede i prøven rapportert av FCS vanligvis undervurdert, noe som kan korrigeres hvis brøkdelen av ikke-fluorescerende FPs kan bestemmes i forsøket. Til slutt er det tilrådelig å sjekke fluoroforspektraet i levende celler for å korrigere verdiene for α og δ, om nødvendig, da de fleste fluoroforer reagerer følsomme for deres miljø13,15,48. Bakgrunnen for å trekke fra bestemmes av signalet som samles inn i ikke-transfekerte celler. I tillegg bør autokorrelasjonen til den respektive andre fargekanalen og CCFPIE kontrolleres for å kunne identifisere falske signaler (Tilleggsmerknad 4 - Figur 30).

De to målingene fra NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (figur 5D), der fluoroforene ligger på forskjellige sider av membranen, ble anskaffet på forskjellige dager og viser viktigheten av statistikk i tidsavklart enkeltmolekylfluorescens. Her kan de forskjellige resultatene skyldes ulik grad av merking: I en celle kunne den høyere graden av merking og gjennomsnitt av målinger resultere i relativt lav støy (figur 5B), mens fra den andre cellen kunne bare to målinger samles inn (Figur 5A). I tillegg til å samle inn tilstrekkelig mengde data, er det viktig å evaluere resultatene i tide, og kanskje optimalisere merkingsstrategien. Når du designer forsøkene, er det viktig å huske at FRET er følsom, men begrenset til avstander opp til 10 nm og "blind" ellers. I vårt tilfelle er denne "blindheten" indikert av den uendrete eGFP-fluorescenslevetiden (tilleggsmerknad 5). I den β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-konstruksjonen (figur 6A) kan FRET fastslås fra den slokkede levetiden til eGFP (tilleggsmerknad 5). Det observeres imidlertid ikke noe antikorrelasjonsbegrep (figur 6B), noe som betyr at FRET enten ikke svinger eller på et tidspunkt skaleres langsommere enn diffusjonstiden. Det kreves opptil tre ekstra avslappingsvilkår i ACFgp, ACFRP, ACFrd og CCFFRET (figur 6C). Den langsomme komponenten i ACFRP, ACFrd og CCFFRET kan skyldes akseptorbleking og påvirker selvfølgelig den oppnådde verdien av den langsomme diffusjonen som finnes i disse kurvene (~ 350 ms sammenlignet med 117 ms i ACFgp). tD i den røde kanalen skal være litt større enn i den grønne kanalen på grunn av konfokale volumer av forskjellig størrelse (figur 2) - men bare med en faktor som kan sammenlignes med størrelsesforskjellen. Den svært raske avslapningstiden på 3 μs gjenspeiler trilling blinking av fluoroforene13,15,48, mens den langsommere avslapningstiden på 37 μs kan skyldes FRET: På samme måte som FRET induserer en antikorrelasjon i CCFFRET, forventes positive korrelasjoner i autokorrelasjonene31,32,33. Tilstedeværelsen av dette begrepet som "positiv" i CCFFRET og dens tilstedeværelse i ACFrd kan forklares med den høye krysstale og bør belyses ytterligere. Legg merke til at CCFPIE er flat på korte korrelasjonstider som forventet.

På den annen side bør det bemerkes at forekomsten av FRET i et interessesystem fører til ikke-lineære effekter på korrelasjonskurvene6. Den molekylære lysstyrken, for eksempel, av et molekyl skalerer inn i korrelasjonsamplituden kvadrert og hver FRET-tilstand (og de alltid tilstedeværende molekylene uten en aktiv reseptor) viser forskjellig molekylær lysstyrke. Faktisk reduserer FRET den tilsynelatende konsentrasjonen av grønne molekyler som oppdages (dvs. øker ACFgp amplitude) og antall røde molekyler (bestemt fra rød ledetekst) er overvurdert5. Begge effektene påvirker mengden interaksjon som er avledet fra både CCFFRET og CCFPIE. Imidlertid kan global analyse som vist for eksempel for den intramolekylære dynamikken i Calmodulin 31,32 eller Syntaxin33 avsløre proteindynamikken. Når den er nøye kalibrert, kan den gjennomsnittlige FRET-effektiviteten trekkes ut fra den relative CCFPIE- og ACF-amplitudene22, mens de begrensende tilstandene kan bestemmes ut fra analysen av donorfluorescenslevetidsfordelingen33.

Tatt i betraktning det faktum at i live celle eksperimenter med store fluoroforer som eGFP FRET kontrasten er sannsynlig å være enda lavere enn antatt for simuleringer vist i figur 6 og at direkte eksitasjon av akseptoren ikke ble lagt til i simuleringen, kan forklare hvorfor identifisering av anticorrelation i levende celle eksperimenter er svært utfordrende. Et lovende analysealternativ er avhengig av å høste informasjonen som er kodet i histogrammer for fotonankomsttid (figur 1B) som er tilgjengelige på grunn av den tidskorrelerte enkeltfotontellingsdatasamlingen29,30. Hvis fluorescenslevetiden (~mønstrene) til de to (eller flere) (FRET)-artene i prøven er kjent (figur 7A), kan det velges "filter" eller vekter som brukes under korrelasjonsprosessen (Figur 7B)17,18,19. Korrelasjonskurvene som oppnås, representerer ikke lenger korrelasjonen mellom deteksjonskanaler, men snarere auto- eller krysskorrelasjonene mellom to forskjellige (FRET) arter, og dermed omdøpt til arter-ACF (sACF) eller arter-CCF (sCCF). Hvis du bruker denne fremgangsmåten på de simulerte dataene med moderat FRET-kontrast, gjenoppretter høy krysstale og trippel blinking antikorrelasjonsbetingelsen (Figur 7C-D). Det skal imidlertid bemerkes at avslapningstider kan oppnås, men forholdet til amplitude går tapt18. Denne tilnærmingen har tidligere blitt brukt i levende celleeksperimenter, for eksempel for å studere samspillet mellom EGFR og dens antagonist49 eller for å skille fluorescensen fra proteiner festet til eGFP-varianter med usedvanlig korte og lange fluorescenslevetider50.

Mens PIE-baserte FRET-målinger i rensede proteiner i stor grad brukes til å studere proteindynamikk3622, i levende celler fokuserer den på å forstå proteinproteininteraksjoner. Denne tilnærmingen er brukt til å studere reguleringen av MAP kinase aktivitet i gjær51 eller for å løse samspillet mellom membranproteiner med deres cytosoliske bindende partner som oppsummert i denne siste artikkelen52. Her kan det oppstå komplikasjoner når betydelig krysstale av grønne fluoroforer fortsatt er til stede i forsinkelsestidsvinduet til de røde kanalene eller rødt signal i de grønne kanalene i ledetekstvinduet. Førstnevnte kan være forårsaket av en utilstrekkelig forsinkelse av den røde pulsen med hensyn til den grønne pulsen, mens begge effektene stammer fra for sterkt overlappende eksitasjon og utslippsspektra av de valgte fluoroforene. Det anbefales å sjekke de respektive enkeltmerkede konstruksjonene nøye og korrekt for falske positive CCF PIE-amplituder, spesielt i celler der autofluorescens med svært kort fluorescenslevetid kan være en annen kompliserende faktor22.

For å konkludere har FRET-FCS-tilnærmingen som er beskrevet her, et stort potensial for å forstå proteinproteininteraksjoner og proteindynamikk i levende celler ved nær fysiologiske konsentrasjoner. I denne protokollen ble det lagt fokus på de nødvendige kalibreringsmålingene og den nødvendige kvantitative analysen som skal utføres under live cellemålinger. Til dette formål ble forskjellige live cellemålinger vist supplert med simuleringer. Simuleringene gir den generelle forståelsen her, da parameteren kan varieres systematisk med skreddersydde passformmodeller som beskriver de spesifikke mobilitets- og fotofysiske egenskapene til de respektive dataene. Analysen ble utført med programvareverktøy med åpen kildekode med en omfattende trinnvis protokoll og maler som er enkle å tilpasse. Til slutt vil de tekniske fremskrittene, og dermed tilgjengeligheten av klare til å kjøpe stabile PIE-FCS-systemer sammen med spredningen av åpen kildekode-programvare for dataanalyse, gjøre denne teknikken mer og mer tilgjengelig for et større forskningsmiljø for til slutt å avdekke proteininteraksjon og dynamikk i levende celler med høyest følsomhet.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å deklarere.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, prosjektnummer 374031971, Project INF) til J.B. og K.G.H.

Vi takker Rudolf Virchow Center for økonomisk støtte og Core Unit Fluorescence Imaging for teknisk støtte. I tillegg takker vi Ashwin Balakrishnan for grundig korrekturlesing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) --- Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA --- tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) --- Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany --- Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany --- Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

Biokjemi utgave 178
Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hemmen, K., Choudhury, S.,… More

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter