Summary
Los reguladores de las funciones de los melanocitos gobiernan las diferencias visibles en el resultado de la pigmentación. Descifrar la función molecular del gen de pigmentación candidato plantea un desafío. Aquí, demostramos el uso de un sistema modelo de pez cebra para identificar candidatos y clasificarlos en reguladores del contenido de melanina y el número de melanocitos.
Abstract
Los melanocitos son células especializadas derivadas de la cresta neural presentes en la piel epidérmica. Estas células sintetizan pigmento de melanina que protege el genoma de las radiaciones ultravioletas dañinas. Las perturbaciones en el funcionamiento de los melanocitos conducen a trastornos pigmentarios como piebaldismo, albinismo, vitiligo, melasma y melanoma. El pez cebra es un excelente sistema modelo para comprender las funciones de los melanocitos. La presencia de melanocitos pigmentados conspicuos, la facilidad de manipulación genética y la disponibilidad de líneas fluorescentes transgénicas facilitan el estudio de la pigmentación. Este estudio emplea el uso de líneas de pez cebra transgénicas y de tipo salvaje que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes verdes (GFP) bajo promotores mitfa y tyrp1 que marcan varias etapas de los melanocitos.
El silenciamiento basado en morfolino de genes candidatos se logra para evaluar el resultado fenotípico en la pigmentación larvaria y es aplicable a la detección de reguladores de pigmentación. Este protocolo demuestra el método desde la microinyección hasta la disección de fenotipos basada en imágenes y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando dos genes candidatos, anhidrasa carbónica 14 (Ca14) y una variante de histona (H2afv), para evaluar exhaustivamente el resultado de la pigmentación. Además, este protocolo demuestra la segregación de genes candidatos en especificadores y diferenciadores de melanocitos que alteran selectivamente el número de melanocitos y el contenido de melanina por célula, respectivamente.
Introduction
Si bien el uso de melanina para la fotoprotección ha evolucionado varias veces en todo el reino animal, los vertebrados aparentemente han perfeccionado el proceso. Las células dedicadas productoras de pigmento con una maquinaria elaborada para sintetizar y contener melanina se conservan desde los peces hasta los humanos1. Sin embargo, el resultado de la pigmentación es dramáticamente variado, variando en el color a la recipiencia y se presenta como patrones vívidos en los tegumentos, la piel y el cabello2. A pesar de la diversidad, el repertorio de genes implicados en la respuesta de pigmentación se conserva sorprendentemente. Los componentes centrales de la maquinaria sintetizadora de melanina, como las enzimas sintetizadoras de melanina clave, los componentes de los melanosomas y la conectividad aguas arriba a la vía de señalización, siguen siendo esencialmente idénticos en todos los organismos. Las diferencias genéticas sutiles provocan cambios dramáticos en los patrones de pigmentación observados en todas las especies3. Por lo tanto, un enfoque genético inverso en un organismo vertebrado inferior, el pez cebra (Danio rerio), ofrece una excelente oportunidad para descifrar la participación de los genes en la representación del estado pigmentado4.
Los embriones de pez cebra se desarrollan de un cigoto fertilizado unicelular a una larva en un lapso de ~ 24 h después de la fertilización (hpf) 5. Sorprendentemente, las células equivalentes a melanocitos, los melanóforos, son células grandes que están presentes en la dermis y son visibles debido al contenido de melanina oscura6. Estas células derivadas de la cresta neural emanan ~11 hpf y comienzan a pigmentar ~24 hpf 6,7. Los módulos de expresión génica conservados han permitido la identificación de factores clave que orquestan las funciones de los melanocitos y han llevado al desarrollo de líneas reporteras fluorescentes transgénicas Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) y Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 que marcan etapas selectivas del desarrollo de melanocitos. El uso de estas líneas de peces transgénicos permite interrogar la biología celular de los melanocitos a nivel de organismo en el contexto del tejido con señales apropiadas de acuerdo con los plazos de desarrollo. Estos reporteros complementan la cuantificación basada en pigmentos de los melanocitos y permiten una evaluación distinta del número de melanocitos independientemente del contenido de melanina.
Este artículo proporciona un protocolo detallado para descifrar la biología de los melanocitos mediante la evaluación de dos parámetros críticos, a saber, el contenido de melanina y el número de melanocitos. Mientras que el primero es una lectura funcional común que emana de una respuesta de hipopigmentación, el segundo se asocia con una reducción en la especificación o supervivencia de los melanocitos y a menudo se asocia con condiciones de despigmentación genética o adquirida. La estrategia general de esta prueba genética inversa es silenciar genes seleccionados usando un morfolino e investigar los resultados específicos de los melanocitos. El contenido de melanina se analiza utilizando la cuantificación basada en imágenes de los valores grises medios seguida de la confirmación mediante un ensayo de contenido de melanina. El número de melanocitos en diversas etapas de maduración se analiza mediante cuantificación basada en imágenes y se confirma mediante el análisis FACS. Aquí, el protocolo de detección se demuestra utilizando dos genes candidatos, a saber, la anhidrasa carbónica 14, involucrada en la melanogénesis, y una variante de histona H2AFZ.2 involucrada en la especificación de melanocitos de la población precursora de la cresta neural. Mientras que el primero altera el contenido de melanina y no el número de melanocitos, el segundo altera el número de melanocitos especificados y, en consecuencia, el contenido de melanina en el embrión. En general, este método proporciona un protocolo detallado para identificar el papel de un gen candidato en la pigmentación y distinguir su papel en el control del número de melanocitos frente al contenido de melanina.
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Protocol
Los experimentos con pez cebra se realizaron en estricta conformidad con la aprobación ética animal institucional (AICE) del CSIR-Instituto de Genómica y Biología Integrativa (IGIB), India (Propuesta n.º 45a). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
1. Inyección de morfolino en embriones de pez cebra
- Usando un extractor de agujas estándar, dibuje pipetas muy afiladas y de punta cerrada.
- Cargue la solución que contiene morfolino en las micropipetas utilizando una punta de microcargador e insértela en el aparato microinyector. Apriete el tornillo correctamente para bloquear la micropipeta.
NOTA: La estandarización de la dosis de morfolinos es necesaria. La dosis adecuada tiene una tasa de supervivencia del >70% y un fenotipo específico a 24 hpf. - Cortar la punta de la micropipeta con pinzas finas y calibrarla11.
- Para calibrar, inyecte 1 volumen de solución de morfolino en el tubo capilar desde la micropipeta, manteniendo el tiempo de inyección en 1 s. Repita esto cinco veces. Usando el estándar, 1 mm = 30 nL de volumen, encuentre el volumen inyectado en 5 s manteniendo el tubo capilar contra una escala de medición. Utilizando la información anterior, calcule el tiempo (en segundos) requerido para inyectar 1-3 nL por inyección12.
NOTA: El estándar, 1 mm = 30 nL, es específico para los ajustes de presión del microinyector y el diámetro del capilar utilizado para la calibración. Idealmente, la inyección debe hacerse en la interfaz yema-célula, que se forma dentro de los 15-20 minutos posteriores a la fertilización. Para facilitar las inyecciones múltiples, el desarrollo puede retrasarse ligeramente manteniendo los embriones a una temperatura más baja (18 °C). Sin embargo, esto debe mantenerse al mínimo y no extenderse más allá de 30 minutos debido al efecto compuesto de una temperatura más baja sobre los cambios en la expresión génica. - Monte los embriones en una placa de Petri fundida en agarosa (60 mm). Apila los embriones firmemente dentro de las crestas. Usando pipetas de vidrio pulido al fuego, alinéelas en la orientación adecuada para la inyección.
- Bajo un microscopio, use manipuladores para acercar la micropipeta al embrión e inyecte dentro de la interfaz yema-célula presionando el interruptor de pie.
- Inyecte todos los embriones de manera similar; recogerlos en una placa de Petri que contenga un medio acuoso de embrión fresco e incubar a 28 °C.
- Compruebe los embriones inyectados después de 6-8 h. Retire todos los embriones muertos identificables debido a su alta opacidad y siga cambiando el agua del embrión al menos una vez al día para evitar infecciones.
2. Análisis de pigmentación
- Preparación para contar melanóforos laterales de la línea media en embriones de pez cebra de 3 dpf
- Tratar los embriones con anestesia neuromuscular al 0,016% para inmovilizarlos.
- Para montar los embriones para la obtención de imágenes, agregue unos mililitros de metilcelulosa al 1,5-2% en la placa de Petri (60 mm) para que forme una capa delgada. Con una pipeta Pasteur, escoja embriones y colóquelos suavemente en metilcelulosa para restringir el movimiento adicional durante la obtención de imágenes.
- Ajuste su posición para obtener imágenes laterales (franja dorsal, franja ventral, raya vitemina y melanóforos de línea media) o dorsales (melanóforos en la parte dorsal de la cabeza) óptimas. Para una mejor resolución de los melanóforos adyacentes, imagen con mayor aumento (>5x)
- Imágenes de campo claro
NOTA: Las imágenes de campo claro se realizan utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de 8-10x.- Coloque la placa de Petri que contiene los embriones de pez cebra bajo el microscopio. Usando un manipulador, ajuste el pez en tal orientación para que las cinco rayas embrionarias de melanocitos sean visibles (dorsal, ventral, dos laterales, yema) simultáneamente (Figura 1C). Capture imágenes rápidamente con el software de adquisición. En caso de que el animal recupere el movimiento antes de ser fotografiado, vuelva a sumergirlo en anestesia y proceda con la obtención de imágenes una vez que esté lo suficientemente inmovilizado.
- Repita esto con todos los peces y asegúrese de que la ampliación siga siendo la misma para cada imagen.
- Cálculo del valor gris medio con el software ImageJ
- Tomar imágenes dorsales y laterales de embriones de pez cebra de 2 dpf.
- Abra la imagen que se va a cuantificar en ImageJ con la herramienta Abrir . Utilice la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis. Vaya a la opción Establecer medidas y seleccione Valor gris medio | área. Presione M (o Analizar | Medida) para calcular el valor gris medio para el área seleccionada.
- Manteniendo constante el área a analizar, calcule el área gris media para cada animal por separado.
- Trazar un gráfico de barras con los datos adquiridos (Figura 2F).
- Ensayo de contenido de melanina
- A 2 dpf, use una pipeta Pasteur de vidrio para recolectar ~ 25 embriones de pez cebra.
- Realice la descorionación manual con agujas de insulina de 1 ml y agréguelas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Deseche el medio embrionario con cuidado y agregue 1 ml de tampón de lisis helada (20 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) con cóctel inhibidor de proteasa y prepare lisados de proteínas por sonicación.
- Disolver los lisados en 1 ml de NaOH de 1 N e incubar las muestras a 100 °C durante 50 min en un baño maría. Vórtice intermitentemente para homogeneizar los lisados por completo.
- Tome lecturas de absorbancia de las muestras a 490 nm utilizando un espectrofotómetro.
- Calcule el contenido de melanina comparando la absorbancia de la muestra con una curva estándar de concentraciones conocidas de melanina sintética (Figura 2G).
3. Recuento de melanóforos
NOTA: El análisis de fluorescencia en embriones transgénicos de pez cebra se puede realizar por dos métodos: 1) contar células positivas para GFP; 2) medición de la intensidad de la fluorescencia.
- Preparación para el recuento basado en el sistema de control de los datos sobre el terreno de células positivas para GFP en embriones tempranos de pez cebra
- Recoja 200-250 embriones ftyrp:GFP y lávelos en un colador con agua de embriones simple. Como control negativo, procesar embriones de tipo salvaje (Assam Wildtype) negativos para GFP y emparejados en estadio12.
- Según la etapa de interés, transfiera los embriones a una placa de Petri que contenga 0,6 mg / ml de pronasa. Después de 5-10 minutos, utilizando una pipeta Pasteur, transfiera los embriones descorionados a una placa de Petri fresca que contenga agua embrionaria. Con una pipeta de vidrio Pasteur, recoja ~100 embriones y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Deseche el medio con cuidado y agregue 200 μL de solución de Ringer helada (tampón de desyolking). Manteniendo el tubo en hielo, pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo ~ 20 veces hasta que la yema se disuelva. Centrifugar los tubos a 100 × g durante 1 min en una centrífuga de sobremesa a 4 °C. Centrifugar de nuevo y desechar con cuidado el sobrenadante.
- Con una pipeta de 1 ml, transferir los embriones desyemados a una placa de Petri que contenga 10 ml de solución de tripsina (tampón de disociación celular). Realizarlo en múltiples placas de Petri para evitar el hacinamiento de los embriones y la tripsinización ineficiente. Use una pipeta de 1 ml, mezcle la solución que contiene los cuerpos embrionarios una o dos veces para disminuir la agregación.
- Incubar las placas de Petri a temperatura ambiente durante 15 min (embriones de <24 hpf) o 30 min (embriones de 24-30 hpf). Aspirar y dispensar la suspensión ocasionalmente usando una pipeta de 1 ml para ayudar a la desintegración de las células.
- Durante el período de incubación, inicialice la máquina del citómetro de flujo para el recuento de células.
- Coloque un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 ml y pase la suspensión tripsinizada a través del filtro para obtener una suspensión de una sola célula. Lave las placas de Petri con la misma suspensión unas cuantas veces para eliminar las células adheridas a la superficie.
- Girar las muestras a 450 × g, 4 °C durante 5 min en un rotor de cangilón oscilante.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
- Girar de nuevo a 450 × g, 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Finalmente, resuspender el pellet en PBS + 5% de suero bovino fetal y mantenerlo en hielo hasta que se ejecute el FACS.
- Preparación del citómetro de flujo
- Encienda el citómetro de flujo e inicie el arranque.
NOTA: Antes de encender la máquina, vacíe el cubo de basura y llene el tanque de líquido de la vaina. - Normalice el flujo de la corriente para una boquilla de 70 μm (u 85 μm). Déjelo sin perturbaciones durante 10-15 minutos si es inestable.
- Encienda el citómetro de flujo e inicie el arranque.
- Recuento de células marcadas con fluorescencia con un citómetro de flujo
- Inicialice una nueva carpeta de experimentos y haga un diagrama de dispersión de dispersión hacia adelante versus dispersión lateral y un histograma de intensidad de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
- Cargue primero las celdas de tipo comodín para establecer las puertas de dispersión delantera y lateral (para excluir dobletes y escombros) y el umbral FIFC.
- Después de establecer las puertas, retire la muestra y cargue las células aisladas de embriones Tg (ftyrp1: GFP) para contar los melanocitos.
NOTA: Aquí, como ftyrp1:GFP etiqueta específicamente los melanocitos maduros, el número de células GFP positivas bajo la puerta FITC corresponderá al número de melanocitos. - Repita el paso anterior con muestras inyectadas con morfolino para estimar y comparar el número de melanocitos con el control.
- Medición de la intensidad de fluorescencia en embriones de pez cebra
- Usando una pipeta de vidrio Pasteur, recolectar 100-120 embriones y transferirlos a una placa de Petri que contenga agua de embriones simple.
- A ~10-12 hpf, transfiera los embriones a 0.003% 1-fenil-2-tiourea para inhibir la pigmentación.
- Realice la descorionación manual utilizando agujas de insulina para obtener imágenes de embriones de <48 hpf.
- Para inmovilizar embriones, trátelos con tricaína al 0,016%.
- Para montar embriones para imágenes, coloque unos pocos ml de metilcelulosa al 1,5-2% en la placa de Petri (60 mm) para que forme una capa delgada. Agregue los embriones a la metilcelulosa para restringir cualquier movimiento adicional durante la obtención de imágenes. Coloque la placa de Petri que contiene las muestras bajo el microscopio. Con la punta de una pipeta, ajuste el animal en la orientación deseada.
- Adquiera imágenes utilizando el software de adquisición. Para embriones <24 hpf, capture todo el embrión a la vez con un aumento de 10x. Para etapas de >24 hpf, adquiera múltiples campos de escaneo y posteriormente ensamble (cose) juntos.
- Repita esto con todos los peces y asegúrese de que el ajuste para la adquisición permanezca constante durante todo el experimento.
- Cuantificación
- Analice la imagen más a fondo utilizando el software ImageJ.
- Abra la imagen que se va a cuantificar en ImageJ con la herramienta Abrir .
- Utilice la herramienta de forma a mano alzada para delinear el área para el análisis (Figura 3E).
- Presione M (o Analizar | Medida) para adquirir una medida de intensidad de área seleccionada.
- Manteniendo constante el área a analizar, calcule la intensidad media por área para cada animal por separado.
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Representative Results
El flujo de trabajo descrito en la Figura 1 se utilizó para realizar perturbaciones genéticas basadas en morfolinos en la etapa unicelular del pez cebra. El análisis de pigmentación se realizó utilizando varios métodos, como se menciona a continuación. Para ilustrar los resultados representativos, se inyectaron volúmenes estandarizados de morfolino antisentido dirigidos a los genes h2afv y ca14 en la etapa de yema o de una célula del embrión de pez cebra. El fenotipado inicial basado en imágenes de campo claro se realizó a las 48 horas posteriores a la fertilización (hpf), cuando las cinco rayas de melanóforos pigmentadas (dorsal, ventral, yema, dos laterales) eran evidentes.
La Figura 2A,B representa un enfoque para analizar la pigmentación mediante el cálculo del número de melanóforos laterales por embrión. Los melanóforos laterales se contaron manualmente en la etapa de 48 hpf haciendo zoom en la región lateral del pez cebra inclinado. Un método alternativo para cuantificar los melanóforos pigmentados (Figura Suplementaria S1) implica el conteo manual de los melanóforos de la cabeza mediante imágenes de la vista dorsal del pez cebra.
El contenido de melanina por embrión se calcula midiendo el valor gris medio, manteniendo constante la región de interés con la ayuda del software ImageJ. La figura 2C-F muestra que el valor gris medio de los morfantes ca14 y h2afv fue mayor que en los morfantes control. Como el valor gris medio es inversamente proporcional al contenido de melanina, la eliminación de los genes ca14 y h2afv condujo a una disminución en el contenido de melanina por embrión. Otro método robusto para cuantificar el contenido de melanina es un método de absorción espectrofotométrica basado en NaOH. Como se muestra en la Figura 2G, el contenido total de melanina en los morfantes ca14 fue menor que en los morfantes de control.
Las imágenes fluorescentes revelaron dos etapas diferentes del desarrollo de los melanóforos del pez cebra: melanóforos especificados tempranos (mitfa: gfp) y melanóforos diferenciadores (ftyrp: gfp). La alteración basada en morfolino se evaluó mediante imágenes fluorescentes (Figura 3A y Figura 3C). Para validar aún más estas observaciones, la frecuencia de células GFP positivas se calculó utilizando FACS. El derribo de h2afv pero no de ca14 redujo significativamente el número de melanóforos con respecto al control (Figura 3A-D). Además, se puede calcular una reducción en la intensidad / área de fluorescencia media utilizando el software ImageJ, manteniendo constante la región de interés. Los morfantes H2afv muestran una disminución significativa en la intensidad/área fluorescente media en relación con los morfantes control (Figura 3E,F).
Figura 1: Flujo de trabajo para un enfoque genético inverso para identificar reguladores de la biología de los melanocitos utilizando pez cebra. (A) Diagrama de flujo que representa el flujo de trabajo experimental desde la microinyección hasta la evaluación de la pigmentación por varios métodos. (B) El soporte de la aguja de microinyección y el micromanipulador, junto con un microscopio de disección, es una configuración típica para la microinyección de embriones de pez cebra en etapa de una célula. (C) Patrón embrionario de melanocitos en pez cebra a 3 dpf que muestra las cinco rayas: dorsolateral, dos líneas medias laterales (puntiagudas por cuatro flechas rojas), franja ventral y raya de yema. (D) Para estudiar el resultado de la pigmentación tras la inyección de morfolino, los melanóforos laterales de la línea media se pueden contar bajo un microscopio estereoscópico. Imagen de campo claro de una región dorsal a 2 dpf; El contenido de melanina se puede cuantificar midiendo el valor gris medio. (E) Los valores grises medios son inversamente proporcionales al contenido de melanina del embrión. Melanóforos llenos de melanina a 2 dpf en embriones de tipo salvaje. (F) Se puede realizar un ensayo de contenido de melanina para estimar la producción de melanina dentro de estos melanóforos. Pez cebra transgénico marcando las células que expresan la proteína TYRP1 a 2 dpf. (G) Las células marcadas con fluorescencia pueden cuantificarse utilizando FACS; barra de escala = 100 μm. Pez cebra transgénico que marca las células que expresan la proteína Mitfa a 1 dpf. La intensidad media de fluorescencia por animal se puede medir utilizando el software ImageJ. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Recuento de melanóforos laterales de la línea media, medición del valor gris medio y ensayo de contenido de melanina. Se utilizaron imágenes microscópicas de campo claro de la vista lateral de morfantes para cuantificar el contenido de melanina utilizando el software ImageJ. (A) morfantes de control y variante de histona h2afv (h2afv) a 3 dpf; A la derecha hay regiones del tronco ampliadas de estos embriones que representan el número de melanocitos. (B) El número de melanóforos en los morfantes h2afv se reduce drásticamente en relación con el control, n > 10 cada uno en 3 réplicas biológicas. (C) Imagen representativa de morfantes de control vs anhidrasa carbónica 14 a 2 dpf. (D) Cuantificación de melanina de ca14 vs morfantes de control, n > 10 a través de 3 réplicas biológicas. (E) Vista lateral de h2afv vs morfantes de control a 2 dpf. (F) Cuantificación del contenido de melanina de h2afv vs morfantes de control. Los rectángulos rojos representan el ROI elegido para el análisis basado en ImageJ. (G) Ensayo del contenido de melanina realizado en embriones inyectados con morfolino para cuantificar el contenido total de melanina. Media de tres experimentos independientes ± SEM.; **P < 0.01, **** P < 0.0001. Prueba t de Student; las barras de error son la media ± error estándar de la media (SEM). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: MO = morfolino; DPF = días después de la fertilización; ROI = región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de células marcadas con fluorescencia utilizando FACS y medición de la intensidad media de fluorescencia. (A) Imágenes de fluorescencia de embriones de ca14 y control morfante a 2 dpf de la línea Tg (ftyrp1: GFP), donde los melanocitos diferenciadores están marcados por la expresión de GFP. (B) El número de melanóforos en embriones morfantes ca14 y control a 2 dpf permanece sin cambios, n = 3 réplicas biológicas. (C) Imágenes de fluorescencia a 2 dpf de h2afv y morfantes de control de la línea Tg(ftyrp1:GFP). (D) El número de melanóforos en los morfantes h2afv se reduce significativamente en comparación con los embriones morfantes control a 2 dpf, n = 3 réplicas biológicas. (E) Imágenes de fluorescencia de embriones morfantes control y h2afv a 36 hpf de Tg(mitfa:GFP) con melanocitos marcados. (F) MFI por animal se calcula utilizando el software ImageJ y se representa como un gráfico de barras que representa conjuntos de datos individuales. La IMF se reduce significativamente en los morfantes h2afv en comparación con el control. El rectángulo rojo representa el ROI elegido para el análisis basado en software ImageJ. n = 3 réplicas biológicas; P < 0,001, ****P < 0,0001. Prueba t de Student; las barras de error son la media ± error estándar de la media (SEM); barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: MO = morfolino; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; GFP = proteína verde fluorescente; DPF = días después de la fertilización; ROI = región de interés; MFI = intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Cuantificación de melanóforos de la cabeza. (A) Vista dorsal de h2afv y morfantes de control a 48 hpf mostrando melanóforos de la cabeza. El cuadro rojo representa el ROI. Manteniendo constante el área de interés, el número de melanóforos de cabeza se puede cuantificar manualmente. (B) Número de melanóforos de cabeza significativamente reducidos tras el derribo de h2afv. Las barras representan la media geométrica con IC del 95% del número de melanóforos de cabeza por embrión con >30 embriones cada uno. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: MO = morfolino; IC = intervalo de confianza; HPF = horas después de la fertilización; ROI = región de interés. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura Suplementaria S2: Microarray de melanocitos primarios humanos tratados con PTU. El mapa de calor muestra la expresión de genes de pigmentación (mitf, tirosinasa, dct, mc1r) tras el tratamiento en melanocitos primarios humanos. Abreviaturas: PTU = 1-fenil-2-tiourea; tyr = tirosinasa. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El fenotipo de pigmentación a menudo se manifiesta como alteraciones en el contenido de melanina o en el número de melanocitos que contienen pigmento. El método descrito en este documento permite la disección de esta dicotomía y permite una evaluación cualitativa y cuantitativa del contenido de melanina y del número de melanóforos por embrión, independientemente del contenido de melanina. La alta fecundidad del pez cebra, la naturaleza visible de los melanocitos pigmentados y la falta de transferencia de melanosomas permiten la disección de la biología de los melanocitos utilizando este enfoque genético inverso que es susceptible de detección de rendimiento medio.
La elección del silenciamiento basado en morfolino emana de la facilidad de silenciamiento y la capacidad de probar múltiples candidatos en paralelo. Existen ciertas limitaciones en el uso de un enfoque de silenciamiento basado en morfolino, y las pautas para usar e interpretar estas valiosas herramientas se han descrito previamente13. Esencialmente, la validación del fenotipo en el knockdown utilizando múltiples MO proporciona una solución tangible a este problema. Una estrategia alternativa es el uso de perturbaciones genéticas basadas en CRISPR. La penetrancia del fenotipo es limitada debido a la frecuencia inherentemente menor de eventos genéticos y podría verse agravada por mutaciones heterogéneas. Eso limita su uso para el cribado genético inverso14.
La evaluación fenotípica de las perturbaciones selectivas de melanocitos a menudo resulta en una disminución del contenido de pigmento debido a la respuesta melanogénica alterada. Sin embargo, hay varios genes que perturban la especificación de los melanocitos y, por lo tanto, causan una reducción en la pigmentación debido a una disminución en el número total de melanocitos. Una disección sistemática de los dos escenarios es esencial para atribuir la función molecular del gen en la pigmentación. La medición del contenido de melanina se ve agravada por la naturaleza compleja del polímero de melanina. De los dos métodos disponibles, a saber, la solubilización de melanina por NaOH y la detección basada en HPLC de productos estables de oxidación de melanina 1H-pirrol-2,3,5-ácido tricarboxílico y ácido pirrol-2,3-dicarboxílico, el primer método puede realizarse rutinariamente en un entorno de laboratorio, mientras que el segundo requiere estándares específicos e instrumentación sofisticada15.
Además, el número de embriones requeridos por el método NaOH también es mayor debido a varios pasos involucrados en la detección. La hidrólisis basada en NaOH solubiliza la melanina y permite la cuantificación espectrofotométrica. Si bien este método es robusto y puede adoptarse para una pantalla de rendimiento medio (10-15 candidatos a la vez), la xantina presente en los xantóforos es una sustancia potencialmente interferente debido a su absorción inherente en el rango de 400-450 nm16. Por lo tanto, se debe llevar a cabo una concordancia entre la determinación del valor gris medio basada en el análisis de imágenes y el ensayo del contenido de melanina para confirmar la reducción en el contenido de melanina.
PTU ofrece una herramienta fácil para reducir la pigmentación y visualizar el embrión transparente. El uso podría resultar en cambios de retroalimentación e invocar alteraciones en los melanocitos. Sin embargo, hemos observado cambios mínimos en la expresión de los genes de pigmentación (Figura Suplementaria S2).
El recuento de melanocitos es más fácil en la línea media lateral y la región de la cabeza, ya que los melanocitos son relativamente claramente observables en estas regiones (Figura suplementaria S1). Los melanóforos de la línea lateral surgen de la población de células madre de melanocitos que reside cerca de los ganglios de la raíz dorsal18. La obtención de imágenes de esta población tiene varias ventajas, como el número fijo por embrión y una clara distinción. Sin embargo, las dos líneas contralaterales necesitan ser fotografiadas inclinando ligeramente el embrión; de lo contrario, los dos se fusionan debido a la naturaleza transparente del embrión, lo que dificulta el recuento (Figura 1C versus Figura 2C).
Los melanóforos del pez cebra son distintos de las células pigmentadas del ojo que se derivan del neuro-ectodermo. Estos se distinguen por su posicionamiento dentro del embrión y son evidentes en el ojo frente al patrón corporal. En el experimento basado en FACS, las células derivadas del ojo se pueden distinguir por su tamaño, ya que son significativamente más pequeñas que los melanóforos y pueden cerrarse utilizando criterios de tamaño o dispersión.
Las estimaciones de melanocitos en diferentes etapas de maduración utilizando líneas transgénicas se llevan a cabo fácilmente utilizando cuantificación basada en imágenes. La cuantificación del número de melanóforos de línea lateral es robusta ya que su número varía en una ventana entre 2 dpf y 5 dpf a cada lado del embrión17. Sin embargo, el número de melanóforos de línea lateral está determinado por la migración y el establecimiento de un conjunto de células madre asociadas al ganglio de la raíz dorsal18. Por lo tanto, cualquier alteración en estos procesos puede conducir a una observación similar. Para eludir este factor de confusión, la estimación basada en el sistema de control de los bienes sobre el terreno de todos los melanóforos es una solución tangible.
Alternativamente, la cuantificación de melanóforos de cabeza se puede realizar como se delinea en la Figura Suplementaria S1 como un sustituto para el número de melanóforos. Es interesante observar que las alteraciones en los niveles de estado estacionario del número de melanocitos podrían significar dos funciones opuestas para el gen candidato en cuestión. Podría resultar en una disminución de la especificación de melanocitos de precursores de la cresta neural o causar la muerte específica de los melanocitos y debe abordarse utilizando métodos como el ensayo de túnel. Variaciones como las microinyecciones seguidas de imágenes de células vivas permitirían monitorear otros fenotipos específicos de melanocitos, como la migración y el patrón. De interés para los investigadores de células pigmentarias sería el proceso de transferencia de melanosomas, que no está operativo en el sistema de peces. Sin embargo, el movimiento concertado del melanosoma en los melanóforos se puede estudiar con alteraciones en las imágenes de células vivas descritas en este documento con modificaciones. En general, el protocolo detallado presentado en este artículo de video permitiría a los investigadores de biología de células pigmentarias consultar genes candidatos y evaluar su papel en la biología de los melanocitos.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero del Consejo de Investigación Científica e Industrial vide proyecto MLP2008 y del Departamento de Ciencia y Tecnología para el proyecto GAP165 para apoyar el trabajo presentado en este manuscrito. Agradecemos a Jeyashri Rengaraju y Chetan Mishra por su ayuda con los experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
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