Summary
Regulatorer av melanocytfunktioner styr synliga skillnader i pigmenteringsresultatet. Att dechiffrera den molekylära funktionen hos kandidatpigmenteringsgenen utgör en utmaning. Här demonstrerar vi användningen av ett zebrafiskmodellsystem för att identifiera kandidater och klassificera dem i regulatorer av melanininnehåll och melanocytantal.
Abstract
Melanocyter är specialiserade neurala crest-härledda celler som finns i epidermal hud. Dessa celler syntetiserar melaninpigment som skyddar genomet från skadliga ultravioletta strålningar. Störningar i melanocytfunktionen leder till pigmentära störningar som piebaldism, albinism, vitiligo, melasma och melanom. Zebrafisk är ett utmärkt modellsystem för att förstå melanocytfunktioner. Förekomsten av iögonfallande pigmenterade melanocyter, enkel genetisk manipulation och tillgänglighet av transgena fluorescerande linjer underlättar studien av pigmentering. Denna studie använder användningen av vildtyp och transgena zebrafisklinjer som driver grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck under mitfa och tyrp1 promotorer som markerar olika stadier av melanocyter.
Morfoliobaserad nedtystning av kandidatgener uppnås för att utvärdera det fenotypiska resultatet på larvpigmentering och är tillämpligt på screening för pigmenteringsregulatorer. Detta protokoll demonstrerar metoden från mikroinjektion till avbildning och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad dissektion av fenotyper med användning av två kandidatgener, karbanhydras 14 (Ca14) och en histonvariant (H2afv), för att omfattande bedöma pigmenteringsresultatet. Vidare demonstrerar detta protokoll segregerande kandidatgener i melanocytspecificerare och differentiatorer som selektivt förändrar melanocytantal respektive melanininnehåll per cell.
Introduction
Medan användningen av melanin för fotoprotektion har utvecklats flera gånger över djurriket, har ryggradsdjur till synes fulländat processen. Dedikerade pigmentproducerande celler med ett utarbetat maskineri för att syntetisera och innehålla melanin bevaras från fisk till människor1. Resultatet av pigmentering är dock dramatiskt varierat, sträcker sig i färg till recipience och presenterar som levande mönster på integritet, hud och hår2. Trots mångfalden bevaras repertoaren av gener som är involverade i pigmenteringsrespons påfallande bevarad. Kärnkomponenterna i melaninsyntetiseringsmaskineriet, såsom de viktigaste melaninsyntetiserande enzymerna, melanosomernas komponenter och uppströms anslutning till signalvägen, förblir väsentligen identiska över organismer. Subtila genetiska skillnader medför dramatiska förändringar i pigmenteringsmönstren som observerats över art3. Därför erbjuder ett omvänt genetiskt tillvägagångssätt i en lägre ryggradsorganism, zebrafisken (Danio rerio), ett utmärkt tillfälle att dechiffrera involveringen av gener i att göra det pigmenterade tillståndet4.
Zebrafiskembryon utvecklas från en encellig befruktad zygot till en larv inom ett spann av ~ 24 timmar efter befruktning (hpf)5. Slående är de melanocytekvivalenta cellerna - melanoforerna - stora celler som finns i dermis och är iögonfallande på grund av det mörka melanininnehållet6. Dessa neurala vapen-härledda celler utstrålar ~ 11 hpf och börjar pigmentera ~ 24 hpf 6,7. Bevarade genuttrycksmoduler har möjliggjort identifiering av nyckelfaktorer som orkestrerar melanocytfunktioner och lett till utvecklingen av transgena fluorescerande reporterlinjer Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) och Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10 som märker selektiva stadier av melanocytutveckling. Genom att använda dessa transgena fisklinjer kan man undersöka melanocyternas cellbiologi på organismnivå i vävnadskontexten med lämpliga ledtrådar enligt utvecklingstidslinjerna. Dessa rapportörer kompletterar pigmentbaserad kvantifiering av melanocyter och möjliggör en distinkt bedömning av melanocytantal oavsett melanininnehåll.
Denna artikel ger ett detaljerat protokoll för att dechiffrera melanocyternas biologi genom att bedöma två kritiska parametrar, nämligen melanininnehåll och melanocytnummer. Medan den förra är en vanlig funktionell avläsning som härrör från ett hypopigmenteringssvar, är det senare förknippat med en minskning av specifikationen eller överlevnaden av melanocyter och är ofta associerad med genetiska eller förvärvade depigmenteringsförhållanden. Den övergripande strategin för denna omvända genetiska skärm är att tysta utvalda gener med hjälp av en morfolino och undersöka de melanocytspecifika resultaten. Melaninhalten analyseras med hjälp av bildbaserad kvantifiering av gråmedelvärden följt av bekräftelse med hjälp av en melaninhaltsanalys. Antalet melanocyter vid olika mognadsstadier analyseras med hjälp av bildbaserad kvantifiering och bekräftas ytterligare med hjälp av FACS-analys. Här demonstreras screeningprotokollet med hjälp av två kandidatgener, nämligen karbanhydras 14, involverat i melanogenes, och en histonvariant H2AFZ.2 involverad i specifikationen av melanocyter från neuralkamprekursorpopulationen. Medan den förra förändrar melaninhalten och inte melanocytnumren, förändrar den senare antalet specificerade melanocyter och följaktligen melaninhalten i embryot. Sammantaget ger denna metod ett detaljerat protokoll för att identifiera rollen för en kandidatgen i pigmentering och skilja dess roll i att kontrollera melanocytnummer kontra melanininnehåll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafiskförsöken utfördes i strikt överensstämmelse med det institutionella djuretiska godkännandet (IAEC) från CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indien (förslag nr 45a). Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande.
1. Injicera morfolino i zebrafiskembryon
- Använd en vanlig nåldragare och dra mycket vassa och slutna pipetter.
- Fyll lösningen innehållande morfolino i mikropipetterna med hjälp av en mikrolastarspets och sätt in den i mikroinjektorapparaten. Dra åt skruven ordentligt för att låsa mikropipetten.
OBS: Doseringsstandardisering av morfoliner är nödvändig. Den lämpliga dosen har en överlevnad på >70% och en specifik fenotyp vid 24 hpf. - Skär spetsen på mikropipetten med fina pincett och kalibrera den11.
- För att kalibrera, injicera 1 volym morfolinlösning i kapillärröret från mikropipetten och håll injektionstiden på 1 s. Upprepa detta fem gånger. Använd standarden, 1 mm = 30 nL volym, hitta volymen injicerad i 5 s genom att hålla kapillärröret mot en mätskala. Med hjälp av ovanstående information beräknar du den tid (i sekunder) som krävs för att injicera 1-3 nL per injektion12.
OBS: Standarden, 1 mm = 30 nL, är specifik för mikroinjektorns tryckinställningar och diameter på kapillären som används för kalibrering. Helst måste injektionen göras i äggula-cellgränssnittet, som bildas inom 15-20 minuter efter befruktning. För att underlätta flera injektioner kan utvecklingen fördröjas något genom att embryon hålls vid en lägre temperatur (18 °C). Detta bör dock hållas till ett minimum och inte förlängas längre än 30 minuter på grund av den sammansatta effekten av lägre temperatur på genuttrycksförändringar. - Montera embryon på en agarosgjuten petriskål (60 mm). Stapla embryon tätt inom åsarna. Använd eldpolerade glaspipetter och rikta in dem i rätt riktning för injektion.
- Under ett mikroskop, använd manipulatorer för att föra mikropipetten närmare embryot och injicera inuti äggulacellgränssnittet genom att trycka på fotbrytaren.
- Injicera alla embryon på samma sätt; Samla dem i en petriskål som innehåller färskt embryovattenmedium och inkubera vid 28 °C.
- Kontrollera de injicerade embryon efter 6-8 timmar. Ta bort alla döda embryon som kan identifieras på grund av deras höga opacitet och fortsätt att byta embryovatten minst en gång per dag för att undvika infektion.
2. Pigmentering analys
- Förberedelse för räkning av laterala mittlinjemelanoforer i 3 dpf zebrafiskembryon
- Behandla embryon med 0,016% neuromuskulär bedövning för att immobilisera dem.
- För att montera embryon för avbildning, tillsätt några milliliter 1,5-2% metylcellulosa i petriskålen (60 mm) så att den bildar ett tunt skikt. Använd en Pasteur-pipett, plocka embryon och placera dem försiktigt i metylcellulosa för att begränsa ytterligare rörelse under avbildning.
- Justera deras position för optimal lateral (dorsal rand, ventral rand, äggula rand och mittlinje melanoforer) eller dorsal (melanoforer på den dorsala delen av huvudet) avbildning. För bättre upplösning av intilliggande melanoforer, bild med högre förstoring (>5x)
- Brightfield bildbehandling
OBS: Brightfield-avbildning utförs med hjälp av ett stereomikroskop med 8-10x förstoring.- Placera petriskålen som innehåller zebrafiskembryon under mikroskopet. Använd en manipulator, justera fisken i sådan orientering så att alla fem melanocytembryonala ränder är synliga (dorsala, ventrala, två laterala, äggula) samtidigt (figur 1C). Ta snabbt bilder med hjälp av förvärvsprogramvaran. Om djuret återfår rörelse innan det avbildas, fördjupa det i bedövning och fortsätt med avbildning när det är tillräckligt immobiliserat.
- Upprepa detta med alla fiskar och se till att förstoringen förblir densamma för varje bild.
- Beräkna medelgrått värde med hjälp av ImageJ-programvaran
- Ta dorsala och laterala bilder av 2 dpf zebrafiskembryon.
- Öppna bilden som ska kvantifieras i ImageJ med hjälp av verktyget Öppna . Använd verktyget för frihandsform för att skissera området för analys. Gå till alternativet Ange mått och välj Genomsnittligt grått värde | område. Tryck på M (eller Analysera | Mått) för att beräkna det genomsnittliga gråvärdet för det valda området.
- Håll området som ska analyseras konstant, beräkna den genomsnittliga gråzonen för varje djur separat.
- Rita ett stapeldiagram med inhämtade data (figur 2F).
- Analys av melanininnehåll
- Vid 2 dpf, använd en glaspasteurpipett för att samla ~ 25 zebrafiskembryon.
- Utför manuell dekorionering med 1 ml insulinnålar och tillsätt dem till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Kassera embryomediet försiktigt och tillsätt 1 ml iskall lysbuffert (20 mM natriumfosfat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) med proteashämmarecocktail och förbered proteinlysat genom ultraljudsbehandling.
- Lös upp lysaterna i 1 ml 1 N NaOH och inkubera proverna vid 100 °C i 50 minuter i vattenbad. Virvel det intermittent för att homogenisera lysaterna helt.
- Ta absorbansavläsningar av proverna vid 490 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Beräkna melaninhalten genom att jämföra provabsorbansen med en standardkurva med kända koncentrationer av syntetiskt melanin (figur 2G).
3. Antal melanoforer
OBS: Fluorescensanalys i transgena zebrafiskembryon kan göras med två metoder: 1) räkning av GFP-positiva celler; 2) mätning av fluorescensintensitet.
- Förberedelse för FACS-baserad räkning av GFP-positiva celler i tidiga zebrafiskembryon
- Samla 200-250 ftyrp:GFP-embryon och tvätta dem i en sil med vanligt embryovatten. Som en negativ kontroll, bearbeta GFP-negativa, stegmatchade vildtypembryon (Assam Wildtype)12.
- Baserat på det aktuella stadiet, överför embryon till en petriskål innehållande 0,6 mg / ml pronas. Efter 5-10 minuter, med hjälp av en Pasteur-pipett, överför de dekorionerade embryona till en färsk petriskål som innehåller vanligt embryovatten. Använd en glaspasteurpipett, samla ~ 100 embryon och överför dem till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
- Kassera mediet försiktigt och tillsätt 200 μL iskall Ringers lösning (deyolking buffert). Håll röret på is, pipettera innehållet upp och ner ~ 20 gånger tills äggulan är upplöst. Centrifugera rören vid 100 × g i 1 min i en bordscentrifug vid 4 °C. Centrifugera igen och kassera försiktigt supernatanten.
- Använd en 1 ml pipett och överför de deyolked embryona till en petriskål innehållande 10 ml trypsinlösning (celldissociationsbuffert). Utför det i flera petriskålar för att undvika överbeläggning av embryon och ineffektiv trypsinisering. Använd en 1 ml pipett, blanda lösningen som innehåller embryokropparna en eller två gånger för att minska aggregeringen.
- Inkubera petriskålarna vid rumstemperatur i 15 min (<24 hpf embryon) eller 30 min (24-30 hpf embryon). Aspirera och dosera suspensionen ibland med en 1 ml pipett för att underlätta sönderdelning av celler.
- Under inkubationsperioden initiera flödescytometermaskinen för cellräkning.
- Placera en 70 μm cellsil ovanför ett 50 ml koniskt rör och för den trypsiniserade suspensionen genom silen för att erhålla en encellssuspension. Tvätta petriskålarna med samma suspension några gånger för att ta bort celler som fästs vid ytan.
- Snurra proverna vid 450 × g, 4 °C i 5 min i en svängande skoprotor.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Snurra igen vid 450 × g, 4 °C i 5 min och kasta supernatanten.
- Slutligen suspendera pelleten i PBS + 5% fetalt bovint serum och håll den på is tills FACS-körningen.
- Förbereda flödescytometern
- Slå på flödescytometern och starta start.
OBS: Innan du slår på maskinen, töm papperskorgen och fyll mantelvätsketanken. - Normalisera strömflödet för ett munstycke på 70 μm (eller 85 μm). Lämna den ostörd i 10-15 min om den är instabil.
- Slå på flödescytometern och starta start.
- Räkna fluorescerande märkta celler med hjälp av en flödescytometer
- Initiera en ny experimentmapp och skapa ett spridningsdiagram över spridning framåt mot sidospridning och ett histogram med fluoresceinisotiocyanatintensitet (FITC).
- Läs in cellerna av vildtyp först för att ställa in spridningsgrindarna framåt och på sidan (för att utesluta dubbletter och skräp) och FITC-tröskeln.
- När grindarna är inställda, ta bort provet och ladda cellerna isolerade från Tg (ftyrp1: GFP) embryon för att räkna melanocyter.
OBS: Här, eftersom ftyrp1: GFP specifikt märker mogna melanocyter, kommer antalet GFP-positiva celler under FITC-grinden att motsvara antalet melanocyter. - Upprepa ovanstående steg med morfolinoinjicerade prover för att uppskatta och jämföra antalet melanocyter med kontrollen.
- Mätning av fluorescensintensitet i zebrafiskembryon
- Använd en glaspasteurpipett och samla 100-120 embryon och överför dem till en petriskål som innehåller vanligt embryovatten.
- Vid ~ 10-12 hpf, överför embryon till 0,003% 1-fenyl-2-tiourea för att hämma pigmentering.
- Utför manuell dekorionering med insulinnålar för avbildning <48 hpf embryon.
- För att immobilisera embryon, behandla dem med 0,016% tricaine.
- För att montera embryon för avbildning, lägg några ml 1,5-2% metylcellulosa i petriskålen (60 mm) så att den bildar ett tunt skikt. Tillsätt embryon till metylcellulosa för att begränsa ytterligare rörelser under avbildning. Placera petriskålen som innehåller proverna under mikroskopet. Justera djuret i önskad riktning med hjälp av en pipettspets.
- Hämta bilder med hjälp av förvärvsprogramvaran. För embryon <24 hpf, fånga hela embryot på en gång under 10x förstoring. För >24 hpf-steg, skaffa flera skanningsfält och montera (sy) dem sedan ihop.
- Upprepa detta med all fisk och se till att inställningen för förvärv förblir konstant under hela experimentet.
- Kvantifiering
- Analysera bilden ytterligare med hjälp av ImageJ-programvaran.
- Öppna bilden som ska kvantifieras i ImageJ med hjälp av verktyget Öppna .
- Använd verktyget för frihandsform för att skissera analysområdet (bild 3E).
- Tryck på M (eller Analysera | Mått) för att få en vald mätning av områdesintensiteten.
- Håll det område som ska analyseras konstant, beräkna medelintensiteten per område för varje djur separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet som beskrivs i figur 1 användes för att utföra morfolinobaserad genetisk störning vid zebrafiskens encellsstadium. Pigmenteringsanalys utfördes med olika metoder, som nämnts nedan. För att illustrera de representativa resultaten injicerades standardiserade volymer av antisensmorfolino riktade mot H2AFV - och Ca14-gener i gulan eller encellsstadiet i zebrafiskembryot. Den initiala fenotypningen baserad på ljusfältsavbildning utfördes 48 timmar efter befruktning (hpf), när alla de fem pigmenterade melanoforränderna (dorsala, ventrala, äggula, två laterala) var uppenbara.
Figur 2A,B representerar ett tillvägagångssätt för att analysera pigmentering genom att beräkna antalet laterala melanoforer per embryo. Laterala melanoforer räknades manuellt vid 48 hpf-steget genom att zooma in på den lutande zebrafiskens laterala region. En alternativ metod för att kvantifiera de pigmenterade melanoforerna (kompletterande figur S1) innefattar manuell räkning av huvudmelanoforerna genom att avbilda zebrafiskens dorsala vy.
Melaninhalten per embryo beräknas genom att mäta det genomsnittliga gråvärdet, vilket håller intresseområdet konstant med hjälp av ImageJ-programvaran. Figur 2C-F visar att det genomsnittliga gråvärdet för ca14- och h2afv-morfanter var högre än i kontrollmorfanter. Eftersom det genomsnittliga gråvärdet är omvänt proportionellt mot melanininnehållet ledde knockdown av ca14- och h2afv-gener till en minskning av melaninhalten per embryo. En annan robust metod för att kvantifiera melaninhalten är en NaOH-baserad spektrofotometrisk absorptionsmetod. Som visas i figur 2G var den totala melaninhalten i ca14-morfanter mindre än i kontrollmorfanter.
Fluorescerande avbildning avslöjade två olika stadier av zebrafiskmelanoforutveckling: tidiga specificerade melanoforer (mitfa: gfp) och differentierande melanoforer (ftyrp: gfp). Den morfolinobaserade förändringen utvärderades med fluorescerande avbildning (figur 3A och figur 3C). För att ytterligare validera dessa observationer beräknades frekvensen av GFP-positiva celler med hjälp av FACS. Knockdown av h2afv men inte ca14 minskade signifikant antalet melanoforer med avseende på kontroll (figur 3A-D). Dessutom kan en minskning av den genomsnittliga fluorescensintensiteten/arean beräknas med hjälp av ImageJ-programvaran, vilket håller intresseområdet konstant. H2afv-morfanter visar en signifikant minskning av den genomsnittliga fluorescerande intensiteten/arean i förhållande till kontrollmorfanter (figur 3E,F).
Figur 1: Arbetsflöde för ett omvänt genetiskt tillvägagångssätt för att identifiera regulatorer av melanocytbiologi med zebrafisk. (A) Flödesschema som visar det experimentella arbetsflödet från mikroinjektion till utvärdering av pigmentering med olika metoder. (B) Mikroinjektionsnålhållare och mikromanipulator, tillsammans med ett dissekerande mikroskop, är en typisk inställning för mikroinjektion av zebrafiskembryon i encellsstadium. (C) Embryonalt melanocytmönster i zebrafisk vid 3 dpf som visar alla fem ränderna: dorsolaterala, två laterala mittlinjer (spetsade med fyra röda pilar), ventral rand och äggula rand. (D) För att studera pigmenteringsresultatet vid morfolinoinjektion kan laterala mittlinjemelanoforer räknas under ett stereomikroskop. Brightfield-bild av en dorsal region vid 2 dpf; Melaninhalten kan kvantifieras genom att mäta medelvärdet för gråton. (E) De genomsnittliga gråvärdena är omvänt proportionella mot melaninhalten i embryot. Melaninfyllda melanoforer vid 2 dpf i vildtypembryon. (F) Melaninhaltsanalys kan utföras för att uppskatta melaninproduktionen inom dessa melanoforer. Transgen zebrafisk märker cellerna som uttrycker TYRP1-protein vid 2 dpf. (G) Fluorescerande märkta celler kan kvantifieras med hjälp av FACS; skalstång = 100 μm. Transgen zebrafisk märker cellerna som uttrycker Mitfa-protein vid 1 dpf. Genomsnittlig fluorescensintensitet per djur kan mätas med hjälp av ImageJ-programvaran. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Räkna laterala mittlinjemelanoforer, mäta medelvärde grått värde och melaninhaltsanalys. Brightfield mikroskopiska bilder av sidovy av morfanter användes för att kvantifiera melanininnehåll med hjälp av ImageJ-programvara. a) Kontrollmorfanter och histonvarianter av h2afv (h2afv) vid 3 dpf. Till höger finns inzoomade stamregioner av dessa embryon som visar melanocytnummer. (B) Antalet melanoforer i h2afv-morfanter reduceras drastiskt i förhållande till kontroll, n > 10 vardera i 3 biologiska replikat. (C) Representativ bild av kontroll vs karbanhydras 14 morfanter vid 2 dpf. (D) Melaninkvantifiering av ca14 vs kontrollmorfanter, n > 10 över 3 biologiska replikat. (E) Sidovy av h2afv vs kontrollmorfanter vid 2 dpf. (F) Kvantifiering av melaninhalten av H2AFV jämfört med kontrollmorfanter. Röda rektanglar representerar ROI som valts för ImageJ-baserad analys. G) Melaninhaltstest utfört på embryon som injicerats med morfolinoinjektion för kvantifiering av den totala melaninhalten. Medelvärde av tre oberoende experiment ± SEM .; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Studentens t-test; felstaplar är medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: MO = morpholino; dpf = dagar efter befruktning; ROI = region av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av fluorescerande märkta celler med hjälp av FACS och mätning av genomsnittlig fluorescensintensitet. (A) Fluorescensbilder av ca14 och kontrollmorfantembryon vid 2 dpf från Tg (ftyrp1: GFP) linje, där de differentierande melanocyterna markeras med GFP-uttryck. (B) Antalet melanoforer i ca14 och kontrollmorfantembryon vid 2 dpf förblir oförändrat, n = 3 biologiska replikat. (C) Fluorescensbilder vid 2 dpf h2afv och kontrollmorfanter från Tg(ftyrp1:GFP)-linjen. (D) Antalet melanoforer i h2afv-morfanter är signifikant reducerat jämfört med kontrollmorfantembryon vid 2 dpf, n = 3 biologiska replikat. (E) Fluorescensbilder av kontroll- och h2afv-morfantembryon vid 36 hpf från Tg(mitfa:GFP) med märkta melanocyter. (F) MFI per djur beräknas med hjälp av ImageJ-programvaran och representeras som ett stapeldiagram som visar enskilda datamängder. MFI reduceras signifikant i h2afv-morfanter jämfört med kontroll. Röd rektangel representerar ROI som valts för ImageJ-programvarubaserad analys. n = 3 biologiska replikat, P < 0,001, ****P < 0,0001. Studentens t-test; felstaplar är medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM); skalstänger = 100 μm. Förkortningar: MO = morpholino; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; GFP = grönt fluorescerande protein; dpf = dagar efter befruktning; ROI = region av intresse; MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Kvantifiering av huvudmelanoforer. (A) Ryggvy av h2afv och kontrollmorfanter vid 48 hpf som visar huvudmelanoforer. Röd ruta representerar ROI. Genom att hålla intresseområdet konstant kan antalet huvudmelanoforer kvantifieras manuellt. (B) Antalet huvudmelanoforer signifikant reducerat vid h2afv knockdown. Staplar representerar geometriskt medelvärde med 95% CI av antalet huvudmelanoforer per embryo med >30 embryon vardera. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: MO = morpholino; CI = konfidensintervall; HPF = timmar efter befruktning; ROI = region av intresse. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Microarray av humana primära melanocyter behandlade med PTU. Värmekartan visar uttrycket av pigmenteringsgener (mitf, tyrosinas, dct, mc1r) vid behandling i humana primära melanocyter. Förkortningar: PTU = 1-fenyl-2-tiourea; tyr = tyrosinas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pigmenteringsfenotyp manifesteras ofta som förändringar i innehållet av melanin eller antalet pigmentbärande melanocyter. Den metod som beskrivs här möjliggör dissekering av denna dikotomi och möjliggör såväl kvalitativ som kvantitativ bedömning av melaninhalten och antalet melanoforer per embryo, oberoende av melaninhalten. Zebrafiskens höga fecunditet, den synliga naturen hos pigmenterade melanocyter och brist på melanosomöverföring möjliggör dissektion av melanocytbiologi med hjälp av detta omvända genetiska tillvägagångssätt som är mottagligt för screening med medelhög genomströmning.
Valet av morfolinobaserad ljuddämpning härrör från den enkla ljuddämpningen och möjligheten att testa flera kandidater parallellt. Det finns vissa begränsningar med att använda en morfolinobaserad ljuddämpningsmetod, och riktlinjer för att använda och tolka dessa värdefulla verktyg har beskrivits tidigare13. I huvudsak ger valideringen av fenotyp vid knockdown med flera MO en konkret lösning på detta problem. En alternativ strategi är användningen av CRISPR-baserad genetisk störning. Fenotypens penetrans är begränsad på grund av den i sig lägre frekvensen av genetiska händelser och kan förvärras av heterogena mutationer. Detta begränsar dess användning för omvänd genetisk screening14.
Fenotypbedömning av melanocytselektiva störningar resulterar ofta i minskat pigmentinnehåll på grund av förändrat melanogent svar. Det finns emellertid flera gener som stör specifikationen av melanocyter och därmed orsakar en minskning av pigmentering på grund av en minskning av det totala melanocytantalet. En systematisk dissektion av de två scenarierna är avgörande för att tillskriva genens molekylära funktion vid pigmentering. Mätningen av melaninhalten förvärras av melaninpolymerens komplexa natur. Av de två tillgängliga metoderna, nämligen melaninsolubilisering med NaOH och HPLC-baserad detektion av stabila melaninoxidationsprodukter 1H-pyrrol-2,3,5-trikarboxylsyra och pyrrol-2,3-dikarboxylsyra, kan den förra metoden rutinmässigt utföras i laboratoriemiljö medan den senare kräver specifika standarder och sofistikerad instrumentering15.
Dessutom är antalet embryon som krävs av NaOH-metoden också högre på grund av flera steg som är involverade i detektionen. NaOH-baserad hydrolys solubiliserar melanin och möjliggör spektrofotometrisk kvantifiering. Även om denna metod är robust och kan antas för en skärm med medelhög genomströmning (10-15 kandidater åt gången), är xantin närvarande i xanthoforer en potentiell störande substans på grund av dess inneboende absorption i intervallet 400-450 nm16. Därför måste en överensstämmelse mellan bildanalysbaserad bestämning av medelgråtonvärde och melaninhaltsanalys utföras för att bekräfta minskningen av melaninhalten.
PTU erbjuder ett enkelt verktyg för att minska pigmenteringen och visualisera det annars transparenta embryot. Användningen kan eventuellt resultera i återkopplingsförändringar och åberopa förändringar i melanocyter. Vi har dock observerat minimala förändringar i uttrycket av pigmenteringsgener (kompletterande figur S2).
Räkningen av melanocyter är lättast i den laterala mittlinjen och huvudregionen, eftersom melanocyterna är relativt tydligt observerbara i dessa regioner (kompletterande figur S1). Laterala linjemelanoforer uppstår från melanocytstamcellspopulationen som ligger nära dorsalrotganglierna18. Avbildning av denna population har flera fördelar såsom fast antal per embryo och tydlig skillnad. De två kontralaterala linjerna måste dock avbildas genom att luta embryot något; annars smälter de samman på grund av embryots transparenta natur, vilket gör det svårt att räkna (figur 1C kontra figur 2C).
Zebrafiskmelanoforer skiljer sig från de pigmenterade cellerna i ögat som härrör från neuroektoderm. Dessa kan särskiljas genom sin placering i embryot och är uppenbara i ögat kontra kroppsmönstret. I det FACS-baserade experimentet kan de ögonhärledda cellerna särskiljas genom sin storlek eftersom de är betydligt mindre än melanoforerna och kan gated med hjälp av storleks- eller spridningskriterier.
Uppskattningar av melanocyter vid olika mognadsstadier med transgena linjer utförs enkelt med hjälp av bildbaserad kvantifiering. Kvantifieringen av antalet laterala linjemelanoforer är robust eftersom deras antal varierar i ett fönster mellan 2 dpf och 5 dpf på vardera sidan av embryot17. Antalet laterala linjemelanoforer bestäms emellertid av migrationen och etableringen av en dorsalrotganglionassocierad stamcellspool18. Därför kan eventuella förändringar i dessa processer leda till en liknande observation. För att kringgå denna förvirrande faktor är FACS-baserad uppskattning av alla melanoforer en konkret lösning.
Alternativt kan kvantifiering av huvudmelanoforer utföras som avgränsas i kompletterande figur S1 som ett surrogat för melanofortal. Det är intressant att notera att förändringarna i steady-state-nivåer av melanocytantal kan innebära två motsatta funktioner för kandidatgenen i fråga. Det kan antingen resultera i minskad specifikation av melanocyter från neuralvapen prekursorer eller orsaka melanocytspecifik död och måste åtgärdas med hjälp av metoder som tunnelanalysen. Variationer som mikroinjektioner följt av levande cellavbildning skulle möjliggöra övervakning av andra melanocytspecifika fenotyper såsom migration och mönstring. Av intresse för pigmentcellforskare skulle vara processen för melanosomöverföring, som inte är operativ i fisksystemet. Emellertid kan samordnad melanosomrörelse i melanoforer studeras med förändringar i levande cellavbildning som beskrivs här med modifieringar. Sammantaget skulle det detaljerade protokollet som presenteras i denna videoartikel göra det möjligt för pigmentcellbiologiforskare att fråga kandidatgener och bedöma deras roll i melanocytbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare deklarerar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar för finansieringsstödet från Rådet för vetenskaplig och industriell forskning vide projekt MLP2008 och Institutionen för teknik och naturvetenskap för projektet GAP165 för att stödja det arbete som presenteras i detta manuskript. Vi tackar Jeyashri Rengaraju och Chetan Mishra för deras hjälp med experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. Fluorescent quantification of melanin. Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
