Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Published: September 13, 2021 doi: 10.3791/62992
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,2,3, 1,2,3,5
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokol er at lede celle vedhæftning og vækst til målrettede områder af net til kryo-elektronmikroskopi. Dette opnås ved at anvende et anti-fouling lag, der er ablated i bruger-specificerede mønstre efterfulgt af aflejring af ekstra cellulære matrix proteiner i de mønstrede områder før celle såning.

Abstract

Helcellet kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er en kraftfuld teknologi, der bruges til at producere nanometer-niveau opløsning strukturer af makromolekyler til stede i cellulære sammenhæng og bevaret i en næsten indfødt frossen-hydreret tilstand. Der er dog udfordringer forbundet med dyrkning og / eller klæbe celler på TEM gitre på en måde, der er egnet til tomografi og samtidig bevare cellerne i deres fysiologiske tilstand. Her præsenteres en detaljeret trinvis protokol om brugen af mikropattering til at lede og fremme eukaryote cellevækst på TEM-net. Under mikropatterning styres cellevæksten ved at deponere ekstra cellulære matrixproteiner (ECM) inden for bestemte mønstre og positioner på folien i TEM-gitteret, mens de andre områder forbliver belagt med et anti-fouling lag. Fleksibilitet i valget af overfladebelægning og mønsterdesign gør micropatterning bredt anvendelig for en lang række celletyper. Mikropattering er nyttig til undersøgelser af strukturer i de enkelte celler samt mere komplekse eksperimentelle systemer såsom værtspatogeninteraktioner eller differentierede multicellulære samfund. Mikropattering kan også integreres i mange downstream helcellede cryo-ET-arbejdsgange, herunder korrelativt lys og elektronmikroskopi (kryo-CLEM) og fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB).

Introduction

Med udviklingen, ekspansionen og alsidigheden af kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har forskere undersøgt en bred vifte af biologiske prøver i en næsten indfødt tilstand fra makromolektær (~ 1 nm) til høj (~ 2 Å) opløsning. Enkelt-partikel cryo-EM og elektron diffraktion teknikker anvendes bedst til renset makromolekyler i opløsning eller i en krystallinsk tilstand, henholdsvis1,2. Mens kryo-elektrontomografi (kryo-ET) er unikt velegnet til næsten indfødte strukturelle og ultrastrukturelle undersøgelser af store, heterologe objekter som bakterier, pleomorfe vira og eukaryote celler3. I cryo-ET opnås tredimensionelle (3D) oplysninger ved fysisk at vippe prøven på mikroskopstadiet og erhverve en række billeder gennem prøven i forskellige vinkler. Disse billeder, eller tilt-serien, dækker ofte et interval på +60/-60 grader i en-til-tre-graders intervaller. Tilt-serien kan derefter beregningsmæssigt rekonstrueres til et 3D-volumen, også kendt som et tomogram4.

Alle cryo-EM teknikker kræver, at prøven skal indlejres i et tyndt lag af amorf, ikke-krystallinsk, glasagtig is. En af de mest almindeligt anvendte kryo-fiksering teknikker er springet frysning, hvor prøven anvendes til EM nettet, blottet, og hurtigt kastet i flydende ethan eller en blanding af flydende ethan og propan. Denne teknik er tilstrækkelig til vitrificering af prøver fra <100 nm til ~ 10 μm i tykkelse, herunder dyrkede menneskelige celler, såsom HeLa celler5,6. Tykkere prøver, såsom mini-organoider eller vævsbiopsier, op til 200 μm i tykkelse, kan vitrificeres ved højtryksfrysning7. På grund af øget elektronspredning af tykkere prøver er prøve og istykkelse til kryo-ET dog begrænset til ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV transmissionselektronmikroskoper. Derfor er hele celle kryo-ET af mange eukaryote celler begrænset til cellen periferien eller udvidelser af celler, medmindre yderligere prøve forberedelse trin anvendes, såsom kryo-sektion8 eller fokuseret-ion stråle fræsning9,10,11.

En begrænsning af mange helcellede cryo-ET billedeksperimenter er dataindsamling gennemløb12. I modsætning til enkelt-partikel cryo-EM, hvor tusindvis af isolerede partikler ofte kan afbildes fra en enkelt TEM gitter firkant, celler er store, spredt ud, og skal dyrkes med lav nok densitet til at tillade cellerne, der skal bevares i et tyndt lag af glasagtig is. Ofte er interesseområdet begrænset til en bestemt funktion eller underområde i cellen. Yderligere begrænsning af gennemløb er tilbøjeligheden af celler til at vokse på områder, der ikke er modtagelige for TEM-billeddannelse, såsom på eller i nærheden af TEM gitter barer. På grund af uforudsigelige faktorer, der er forbundet med cellekultur på TEM-net, er der behov for den teknologiske udvikling for at forbedre stikprøvetilgængelighed og overførselshastighed til dataindsamling.

Substratmikrning med klæbende ekstracellulære matrixproteiner (ECM) er en veletableret teknik til levende cellelysmikroskopi til at lede væksten af celler på stive, holdbare og optisk gennemsigtige overflader som glas og andre vævskultursubstrater13,14. Der er også udført mikromaling på bløde og/eller tredimensionelle (3D) overflader. Sådanne teknikker har ikke kun gjort det muligt præcist at placere celler; de har også støttet oprettelsen af flercellede netværk, såsom mønstrede neurale cellekredsløb15. At bringe mikropatterning til cryo-ET vil ikke kun øge gennemløbet, men det kan også åbne nye undersøgelser for at udforske komplekse og dynamiske cellulære mikromiljø.

For nylig er flere grupper begyndt at bruge mikropatterning teknikker på TEM gitre gennem flere tilgange16,17. Her beskrives brugen af en maskeløs fotopatterningsteknik til TEM-gitre ved hjælp af Alvéole PRIMO mikropatterningssystem, som har høj opløsning og kontaktløse mønstre. Med dette mikropatterningssystem påføres et anti-fouling lag på toppen af substratet, efterfulgt af anvendelse af en fotokatalysator og ablation af anti-fouling lag i brugerdefinerede mønstre med en UV-laser. ECM proteiner kan derefter føjes til mønstrene for den relevante cellekultur. Denne metode er blevet brugt af flere grupper til cryo-ET undersøgelser af retinale pigment epitel-1 (RPE1), Madin-Darby hunde nyre-II (MDCKII), human forhud fibroblast (HFF), og endotelcellelinjer16,17,18. Dette mikropatterningssystem er kompatibelt med flere anti-fouling lag substrater samt enten en væske eller gel photocatalyst reagens. En række ECM-proteiner kan vælges fra og tilpasses til cellelinjens specificitet, hvilket giver brugeren alsidighed.

Micropatterning er med succes blevet anvendt på en række projekter inden for laboratoriet19. Her præsenteres en mikropatterning protokol, herunder specifikke tilpasninger til at studere kultiverede HeLa-celler, respiratorisk syncytial virus (RSV)-inficerede BEAS-2B-celler og primære larve Drosophila melanogaster neuroner20.

Protocol

Protokollen beskrevet her er en samling af cellekultur, micropatterning, og billeddannelse metoder, der anvendes af Wright lab og Cryo-EM Research Center ved University of Wisconsin, Madison. Arbejdsprocessen vises i figur 1. Yderligere undervisnings- og instruktionsmaterialer er tilgængelige på følgende steder: https://cryoem.wisc.edu eller https://wrightlab.wisc.edu

1. Udarbejdelse af gitre til mønstre

  1. Overfør TEM-gitrene på en ren glasrutschebane, kulstofsiden op (kulstoffoliens standardtykkelse er 12 nm). Ved hjælp af en carbon fordamper, ACE600, fordampe 5-8 nm ekstra kulstof på gitre for at øge den samlede kulstoffilm holdbarhed.
    BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt for SiO2-gitre . Dette trin kan også udføres på forhånd. opbevares de coatede gitre i et miljø med lav luftfugtighed, f.eks.
  2. Overfør gitrene til en gitterforberedelsesholder, og skær udled gitrenes kulstofside op. Ved hjælp af et glødeudladningssystem udledes gitrene i 60 s ved 10 mA med en 80 mm arbejdsafstand og vakuumtryk på 1,0 x 10-3 mbar. Gør dette inden for 15-30 minutter efter næste trin.
    BEMÆRK: Grid prep indehavere kan købes kommercielt eller hjemmelaves med et stykke filterpapir på en lille Petri parabol.

2. Anvendelse af anti-fouling lag

BEMÆRK: Korrekt steril teknik skal anvendes ved håndtering af gitrene, og alle opløsninger skal steriliseres og/eller filtreres steriliseret.

  1. Overfør gitrene (kulstofsiden op) til en ren glasrutschebane eller coverlip med mindst 1 cm adskillelse mellem gitrene. Pipette 10 μL på 0,05% poly-L-lysin (PLL) på hvert gitter. Inkuber gitrene i et fugtigt kammer, såsom en lukket plastkasse med fugtige papirhåndklæder, i mindst 30 minutter.
    BEMÆRK: Dette trin kan udvides til natten over. Sørg for, at fugtighedsniveauet i kammeret er tilstrækkeligt til at forhindre, at gitrene tørrer ud.
  2. Vask hvert gitter tre gange med 15 μL på 0,1 M HEPES pH 8,5. For hver vask fjernes det meste af væsken fra gitteret med en pipette uden at lade gitteret tørre. Tilsættes 15 μL frisk buffer, inkuberes i mindst 30 s og gentages. Lad hvert gitter være i 15 μL på 0,1 M HEPES efter den endelige vask.
    BEMÆRK: I dette trin og fremtidige trin er det vigtigt at holde gitteret vådt og undgå kontakt mellem pipetten og gitteret.
  3. Der fremstilles 10 μL på 100 mg/mL polyethylenglycol-succinimidyl valerat (PEG-SVA) i 0,1 M HEPES pH 8,5 for hvert gitter. PEG-SVA opløses hurtigt med skånsom blanding, hvilket resulterer i en klar opløsning.
    BEMÆRK: Peg-SVA-løsningen må ikke forberedes på forhånd. PEG-SVA har en halveringstid på 10 min ved pH 8,5. Undgå at udsætte PEG-SVA-lageret for for stor fugt ved at opbevare det i et udtørrende miljø ved -20 °C og opvarmning til stuetemperatur før åbning.
  4. Umiddelbart efter klargøring af PEG-SVA-opløsningen fjernes 15 μL-dråben HEPES pH 8.5 fra hvert gitter (pas på ikke at tørre nettet) og tilsættes et 10 μL-fald af PEG-SVA-opløsningen. Inkuber gitrene i et fugtigt kammer i mindst 1 time.
    BEMÆRK: Dette trin kan udvides til natten over. Sørg for, at fugtigheden i kammeret er tilstrækkelig til at forhindre, at gitrene tørrer ud.
  5. Vask hvert gitter tre gange med 15 μL sterilt vand. For hver vask fjernes det meste af væsken fra gitteret med en pipette uden at lade gitteret tørre, tilsæt 15 μL ferskvand, inkuberes i mindst 30 s og gentages. Lad hvert gitter stå i 15 μL vand efter den endelige vask.

3. Anvendelse af PLPP gel

  1. Forbered et rent mikroskop coverlip for hvert gitter. Udfør følgende trin for hvert gitter, et gitter ad gangen, for at minimere risikoen for, at gitteret tørrer ud.
  2. Placer en 1,0 μL dråbe vand på midten af dæksler for at hjælpe med at placere gitteret på dæksler og holde gitteret vådt. Overfør forsigtigt gitteret fra 15 μL-vanddråben til vanddråbet på 1,0 μL på dæksledet. Sørg for at placere nettet kulstof side op.
  3. Placer forsigtigt en polydimethylsiloxane (PDMS) stencil over gitteret, idet du sørger for at holde gitteret centreret og minimere stencilkontakten med gitterets kulfolie.
  4. Tilsæt 1,0 μL 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP) gel på nettet. Pipette forsigtigt at blande (rør ikke gitteret med pipettespidsen).
  5. Flyt dæksleren med gitteret til et mørkt sted for at tørre. Gelen tørrer om ca. 15-30 min.

4. Kalibrering og udformning af mikropattern

  1. Farve den ene side af et glas coverlip med en overstregningstusch. Tilføj sorte linjer fra en finspidset permanent markør for at gøre fokusering lettere. Placer coverlip på mikroskopet, således at den farvede side vender mod objektive linse. Brug brightfield-tilstand til at fokusere på overstregningstustus.
  2. Sørg for, at mikroskopet og mikropatterningssystemet er tændt, og den korrekte lyssti er indstillet. Åbn Micromanager og Leonardo-softwaren (Plugins > Leonardo) på mikroskopcomputeren.
  3. Vælg kalibrer, og følg vejledningen på skærmen. Juster mikroskopfokuseret, så det billede, der projiceret på diaset, er i fokus. Eksponeringstiden skal muligvis reduceres. Vælg Mønster nu efter kalibrering.
  4. Registrer det mikrometer/pixel (μm/px) forhold, der rapporteres under kalibreringsdata, i programmets øverste venstre vindue (figur 2, område 1). Brug dette forhold til at bestemme det antal pixel, der skal bruges pr. mikrometer, når du designer et mønster.
  5. Efter kalibrering skal du sikre dig, at softwaren nu er åben med en levende lysmarksvisning fra mikroskopet. Læg et forberedt gitter på en coverlip (afsnit 3) på scenen med gitteret vendt mod mållinsen. Placer scenen, og juster fokus, så gitteret er synligt i softwarevinduet.
  6. Mål størrelsen på gitterkvarter og gitterstænger i mikrometer. Softwaren indeholder en lineal aktiveret af knappen nær nederste venstre hjørne for at måle gitteret (Figur 2, område 2). For eksempel svarer de mønstre, der anvendes her til et 200 mesh gitter, til ~ 87 × 87 μm gitter firkanter og ~ 36 μm gitterstænger.
    BEMÆRK: Softwaren giver fleksibilitet i resizing mønstre i farten, så mindre unøjagtigheder i måling kan tolereres.
  7. Baseret på målinger og nøgletal ovenfor, skabe mønstre med enhver billedoprettelse software. Den mindste funktionsstørrelse med et 20× mål er 1,2 μm. Mønstre skal gemmes som ukomprimerede 8-bit .tiff filer.
    1. Sørg for, at softwaren ikke skalerer billeder igen til en anden pixelstørrelse, når du gemmer. Mønsteret skal passe inden for en 800 × 800 pixel boks, tilstrækkelig til at dække fire gitter firkanter.
      BEMÆRK: Pixels med en værdi på 255 (hvid) vil blive mønstret ved den højeste intensitet (den samlede dosis af laseren), og pixels med en værdi på nul (sort) vil ikke blive mønstret. Alle pixels med en mellemliggende værdi vil blive mønstret med en dosis på ca. (X/255)*total dosis. I figur 3A blev pixelværdier på 255 og 129 brugt til gråtonemønstrene. Når mønsteret er designet, kan det gemmes og genbruges uden modifikation.

5. Micropatterning

  1. Efter kalibrering skal du sikre dig, at softwaren nu er åben med en levende lysmarksvisning fra mikroskopet. Læg et forberedt gitter på en coverlip (afsnit 3) på scenen med gitteret vendt mod mållinsen. Placer scenen og juster fokus for at se gitteret i softwaren.
  2. Design en ny skabelon for at få den første kørsel. I softwaren skal du vælge Tilføj investeringsafkast (ikke vist på placeringen af figur 2-område 3) og vælge en 3.000 μm cirkel. Placer cirklens investeringsafkast over gitteret ved hjælp af brightfield-billedet på skærmen som en vejledning. Tryk på låsen for at sikre investeringsafkast.
  3. Når investeringsafkastet er låst på plads, skal du vælge Tilføj mønster (ikke vist på placeringen af figur 2-område 3). Vælg det mønster, der er designet i afsnit 4. Del nettet op i seks områder for at give mulighed for uafhængig fokusering og positionering i hver region for at faktorisere for ujævne net. En 8 × 8 gitter kvadrat område for hvert hjørne af gitteret og en 2 × 8 gitter kvadrat område på hver side af midten, forlader de midterste fire gitter firkanter unpatterned (Figur 2, center billede).
  4. Brug replikeringsindstillingerne (figur 2, område 4) til at generere kopier af det oprindelige mønster for at nå det ønskede antal samlede kopier af mønsteret. Juster afstanden mellem kopierne, så den svarer til afstanden mellem gitterkvarter, hvis det er nødvendigt.
  5. Indstil den samlede dosis for mønsteret. 30 mJ/mm2 er et godt udgangspunkt. Se diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger.
  6. Under Ekspertindstillinger (figur 2, område 4) justeres vinklen på området, så den svarer til gitterkvartalernes. Områder kan flyttes ved hjælp af musen. Forholdet (størrelse) af mønstrene kan også justeres. Gentagelse ved at justere mønsterets vinkel, position, mellemrum og forhold, indtil mønstrene er på linje med gitterkvartallene. Flyt mikroskopstadiet for at ændre gitterområdet i den dynamiske lysemarksskærm.
  7. Tryk på Lås for at gemme de ændringer, der er foretaget i området.
  8. Hvis du vil kopiere et område, skal du klikke på knappen Dupliker (Figur 2, område 5, to ark papirikon) ud for navnet i panelet Handlinger til venstre. Hvis du vil flytte, omdøbe eller redigere kopien, skal du klikke på navnet i panelet Handling.
  9. Gentag trin 5.4-5.9 efter behov for at udfylde alle de ønskede områder.
  10. Når den komplette skabelon er designet og placeret, Gem skabelonfilen i softwaren (Figur 2, område 6, søjle med pil op-ikon på øverste værktøjslinje).
  11. Når du indlæser en tidligere gemt skabelon (søjle med pil ned-ikon), skal du centrere investeringsafkast over gitteret og trykke på Lås. Klik på hvert område i handlingspanelet for at ændre vinkel-, positions-, dosis- og/eller mønsterfilen.
  12. Når skabelonen og mønstrene er placeret, skal du fjerne markeringen af alle områder i handlingspanelet i softwaren.
  13. Brug mikroskopstadiet til at navigere til den pågældende region og fokusere på kulstoffolien. Hvis du klikker på øjeæblet i panelet Handling (Figur 2, område 5), skiftes visningen af mønsteroverlejringen til eller fra.
  14. Når gitteret er i fokus, skal du lukke brightfield-lukkeren og trykke på Ikonet Afspil i nederste højre hjørne af softwaren for at starte mønsterprocessen, som kan overvåges live.
  15. Vælg feltet for det næste område i handlingspanelet. Åbn brightfield lukkeren, så gitteret er synligt og centrerer det pågældende område ved hjælp af mikroskopstadiet. Gentag trin 5.13-5.14 for hvert område i handlingspanelet.
  16. Fjern dækslet med gitteret fra mikroskopet, og pipette straks 10 μL steril fosfat-buffered saltvand (PBS) på nettet.
  17. Efter 10 min, fjerne stencilen med pincet, derefter vaske gitteret 3x med 15 μL AF PBS. Efter den endelige vask skal hvert gitter placeres i 15 μL PBS og flytte gitrene til et mørkt sted.

6. Aflejring af ECM proteiner

  1. For kultiverede celler skal du følge trin 6.2-6.5; for primære Drosophila neuroner, følg trin 6.6-6.10.
  2. Der skal forberedes mindst 15 μL ECM til hvert gitter. For BEAS-2B-celler skal der udarbejdes en endelig koncentration på 0,01 mg/mL kvægfibronectin og 0,01 mg/mL fluorophore-konjugeret fibrinogen i steril PBS. For HeLa-celler fremstilles 0,01 mg/mL kvægkollagen I og 0,1 mg/mL fluorophore-konjugeret fibrinogen i steril PBS.
  3. Fjern det meste af PBS fra hvert gitter og anvende 15 μL af ECM. Inkuber gitteret i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i mindst 1 time.
    BEMÆRK: Dette trin kan udvides til natten over ved 4 °C.
  4. Efter inkubation i ECM vaskes hvert gitter 5x med steril PBS. For hver vask skal du fjerne det meste af væsken med en pipette uden at lade gitteret tørre, tilsæt 15 μL frisk PBS, inkuberes i mindst 30 s og gentages. Lad hvert gitter stå i PBS efter den endelige vask.
    BEMÆRK: Gitre kan opbevares i op til en uge i PBS ved 4 °C uden observeret forringelse af kvaliteten.
  5. Brug et fluorescensmikroskop til at detektere fluorophoren i ECM for at bekræfte mønstret, og at kulstoffolien forblev intakt. Et par brudte firkanter er generelt tålelige.
  6. For primære Drosophila neuroner, flytte de mønstrede gitre til en 30 mm glas bund skål, der indeholder steril PBS.
  7. Aspirere PBS fra fadet og anvende 2 mL af 0,5 mg/mL fluorophore-konjugeret concanavalin A. Inkubere natten over ved 25 °C i et sterilt miljø.
  8. Fjern concanavalin En opløsning fra fadet (uden at tørre gitre) og vask gitre 3x med PBS. For hver vask tilsættes og fjernes 2 mL PBS fra fadet.
  9. Brug et fluorescensmikroskop til at detektere fluorophoren i ECM for at bekræfte mønstret, og at kulstoffolien forblev intakt. Et par brudte firkanter er generelt tålelige.
  10. Efter den endelige vask fjernes PBS fra glasbunden og der tilsættes 2 mL frisklavet, sterilt filtreret suppleret Schneiders Drosophila media21, der indeholder 20% varmeinaktiveret fosterkvægserum (FBS), 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10 μg/mL tetracyclin. Inkuberes ved 25 °C i et sterilt miljø, indtil neuronerne er klar til at blive forgyldt.

7. Forberedelse af primære Drosophila celler før såning

  1. Sterilisere en 55 mm dissektionsskål med 70% EtOH, og tilsæt derefter skålen 2-3 mL sterilt filtreret 1× dissektionssalin (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 3,3 mM glukose, 43,8 mM saccharose)21.
  2. Vælg 30-40 3. instar larver forsigtigt fra maden ved hjælp af et par pincet.
  3. Placer larverne i røret med 1× PBS, og overfør dem derefter til det andet rør med 1× PBS for at vaske larverne.
  4. Overfør larverne ind i røret med 70% EtOH for at vaske PBS af og overfør dem derefter til det andet rør med 70% EtOH. Lad larverne i det andet rør i 2-3 minutter for at sterilisere larverne.
  5. Overfør larverne til et rør med 1× dissektion saltvand, og overfør dem straks til det andet rør med 1× dissektions saltvand.
  6. Overfør individuelle larver på dissekeringsskålen, der indeholder 1× dissektionssalin. Med et par sammenkæd og et dissektionsmikroskop rives hver larver hurtigt for at udtrække hjernen og overføre den til det tredje rør med 1× dissektions saltvand. Gentag indtil alle hjerner er ekstraheret.
  7. Centrifuge røret indeholder hjerner på 300 x g i 1 min.
  8. Kassér supernatanten, og vask med 1 minut 1× dissektionssalin og centrifugerøret ved 300 x g i 1 min. Gentag dette trin en gang til.
  9. Kassér supernatanten, indtil der er 200-250 μL tilbage i røret, og tilsæt 20 μL på 2,5 mg/mL Liberase i 1x dissektionssalin.
  10. Drej røret på en rotator i 1 time ved stuetemperatur; i løbet af denne time pipette opløsningen 25-30 gange hver 10 min. I slutningen skal opløsningen være lidt uigennemsigtig.
  11. Centrifugere cellerne ved 300 × g i 5 min.
  12. Kassér supernatanten, og tilføj derefter 1 mL suppleret Schneiders medier. Pipette opløsningen 30 gange for at blande.
  13. Centrifugere cellerne ved 300 × g i 5 min.
  14. Kassér supernatanten, og vask cellepillen ved at tilsætte 1 mL supplerede Schneiders medier. Pipette opløsningen 30 gange for at blande.
  15. Centrifugere cellerne ved 300 × g i 5 min.
  16. Kassér supernatanten, og genbrug derefter cellepillen med 300 μL supplerede Schneiders medier. Pipette opløsningen 30-40 gange for at blande.

8. Kultur- og RSV-infektion af BEAS-2B- og HeLa-celler

  1. HeLa-celler og BEAS-2B-celler vedligeholdes i T75-kolber ved 37 °C og 5 % CO2. Passageceller hver 3-4 dage, når de når ca. 80% sammenløb. Vedligehold HeLa celler i DMEM + 10% FBS + 1× Antibiotisk-Antimykotisk. Beas-2B vedligeholdes i RPMI + 10% FBS + 1× Antibiotisk Antimycotic6,22,23.
  2. For såning af ikke-inficerede celler, gå til afsnit 9. BEAS-2B- og HeLa-celler er modtagelige for RSV-infektion; BEAS-2B celler blev brugt til alle eksperimenter, der involverer RSV vist her.
    BEMÆRK: Udfør alle BSL-2 trin i overensstemmelse med institutionelle protokoller ved hjælp af et passende biosikkerhedskab (BSC) og personlige værnemidler (PPE).
  3. Før RSV infektion af celler, passage 5 × 104 celler pr godt ind i en 6-brønds plade (overfladeareal ~ 9,6 cm2) med 2 mL vækst medier og inkubere natten over.
  4. Trypsinize og tælle en brønd af celler. For at trypsinisere, aspirere medier fra en brønd og vaske med 2 mL steril PBS uden Mg2 + og Ca2 + for at fjerne resterende medier. Der tilsættes 500 μL 0,25% trypsinopløsning. Inkuberes ved 37 °C i 5-10 min. Kontroller regelmæssigt cellerne for at se, om de frigives fra overfladen. Når cellerne er frigivet, skal du tilføje 1,5 mL kulturmedier.
  5. Bland 100 μL trypsiniserede celler med 100 μL trypan blå. Pipette 10 μL fortyndet celleblanding i et hæmocytometer. Tæl cellerne og beregn antallet af celler pr. Brønd. Brug dette tal til at beregne MOI nedenfor.
  6. Forbered en fortynding af RSV-A2mK+24 i vækstmedier for at opnå en MOI på 10 pr. brønd i 750 μL medier. MOI af RSV-A2mK + kan beregnes ud fra fluorescerende fokusenheder (FFU) titere af bestanden (For eksempel: for 1,0 × 105 celler pr. brønd og en RSV-bestand på 1,0 × 108 FFU / mL, fortynd viruslageret 1:75 til 1 × 106 FFU/750 μL eller 1,33 × 106 FFU / mL).
  7. Aspirere medierne fra cellerne i 6-brønd skålen og tilsæt 750 μL af den virale opløsning ovenfra til hver brønd.
  8. Rock pladen ved stuetemperatur i 1 time.
  9. Efter 1 time skal det samlede volumen pr. brønd op på 2 mL med vækstmedierne forvarmet op på 37 °C og placere pladen i en inkubator indstillet til 37 °C med 5 % CO2 i 6 timer.
  10. Trypsinize cellerne til at frigive dem og gå videre til såning som beskrevet nedenfor. Efter såning inkuberes gitrene i yderligere 18 timer før dykfrysning (i alt 24 timer efter infektion).

9. Cellesåning på mikropatternede gitre

  1. For kultiverede celler skal du følge trin 9.2-9.8; for primære Drosophila neuroner, følg 9.9-9.11.
  2. Trypsinize cellerne til at frigive dem (se trin 4 i afsnit 8 ovenfor). Hvis du vil reducere celleaggregationen, skal cellerne prøves ved 60 % eller mindre sammenløb.
  3. Bland 100 μL trypsiniserede celler med 100 μL trypan blå. Pipette 10 μL af den fortyndede celle blandes i et hæmocytometer og tælle cellerne.
  4. Fortynd cellerne i medier til 2 × 104 celler/mL.
  5. Tilsæt 1 μL medier til midten af en 30 mm glasbundsfad for at hjælpe med at placere gitteret og forhindre det i at tørre. Overfør gitteret fra PBS på coverlip til midten af glasbundsskålen. Der tilsættes 10 μL celleopløsning til gitteret.
  6. Brug et brightfield mikroskop, observere celle vedhæftning til nettet efter 5 min. Hvis størstedelen af mønstrene forbliver ubesatte, tilsættes yderligere 10 μL-dråbe af celleopløsningen. Net og celleopløsning holdes ved 37 °C under inkubationerne.
  7. Gentag trin 9.6, indtil de fleste mønstre er optaget, eller mange besatte mønstre begynder at have flere celler. Inkuberes nettet i 2 timer i inkubatoren (37 °C, 5% CO2).
  8. Oversvømme fadet med 2 mL forvarmede medier og inkuber natten over (37 °C, 5% CO2).
  9. For primære Drosophila neuroner, fjerne medierne fra gitter-holdige parabol og plade cellerne på fadet.
  10. Vent 30-60 min for cellerne til at vedhæfte, derefter tilføje 2 mL suppleret Schneiders medier.
  11. Kulm neuronerne i en inkubator på 25 °C i mindst 2-3 dage før frysning af dyk.

10. Billedbehandling og vitrificering af mønstrede net

  1. Placer glasbundsskålen, der indeholder det mønstrede gitter og kultiverede celler, på fluorescensmikroskopet.
  2. Erhverve billeder af nettet ved hjælp af brightfield og passende fluorescerende kanaler til at opdage mønsteret og enhver anden mærkning i cellerne. Sørg for, at celletætheden og positionering er egnet til downstream-billeddannelse og analyse.
    BEMÆRK: Brightfield og fluorescerende billeder blev behandlet i FIJI softwarepakke25.
  3. Forbered en kryo-dyk fryser; typen af fryseanordning afhænger af tilgængelighed, omkostninger og funktioner, der er bedst egnede til prøven.
    BEMÆRK: Primære Drosophila neuroner blev fremstillet på en automatiseret fryse-fryser, og BEAS-2B celler blev udarbejdet ved hjælp af en semi-automatiseret stempel-fryser.
  4. Påfør guldfiducials til prøverne for korrekt justering af tilt-serien. Blot prøver for at fjerne overskydende medier, derefter springe-fryse prøverne i en cryogen, såsom flydende ethan afkølet af flydende nitrogen. For primære Drosophila neuroner, blot for 4 s fra bagsiden. For HeLa og BEAS-2B celler, blot fra begge sider for 4-6 s. De frosne gitre kan derefter opbevares i flydende nitrogen, indtil de anvendes yderligere.
  5. Billede vitrified celler i en cryo-elektron mikroskop, der drives ved 300 kV med en direkte elektron detektor kamera. Konfigurer tilt-serie samling for hvert område af interesse med software som SerialEM26 for cryo-EM/cryo-ET dataindsamling.
    BEMÆRK: Tilt-serien af primære Drosophila neuroner blev indsamlet på en direkte elektrondetektor fra -60° til 60° tovejs ved 2° trin ved -8 μm defokusering med en pixelstørrelse på 4.628 Å for en samlet dosis på 70-75 e-/Å2. Tilt-serien af RSV-inficerede BEAS-2B blev indsamlet på en direkte elektrondetektor med et energifilter (20 eV slids) ved -5 μm defokusering med en pixelstørrelse på 4.603 Å og en samlet dosis på ~ 80 e-/Å2.
  6. Behandl tilt-serien for at rekonstruere tomograms.
    BEMÆRK: Tomogrammer præsenteret her blev rekonstrueret ved hjælp af IMOD-pakken27; lowpass filtrering blev gjort ved hjælp af EMAN2 softwarepakke28.

Representative Results

Denne procedure blev brugt til at mønstre EM gitre for hele celle cryo-ET eksperimenter. Hele arbejdsgangen, der præsenteres i denne undersøgelse, herunder indledende cellekulturpræparater, mikromaling (figur 1) og billeddannelse, omfatter 3-7 dage. En totrinsprocedure blev brugt til at generere anti-fouling-laget ved at anvende PLL på nettet og efterfølgende forbinde PEG ved tilsætning af den reaktive PEG-SVA. Anti-fouling lag kan også anvendes i et enkelt trin ved at tilføje PLL-g-PEG i en inkubation. PLPP gelen er en katalysator for UV-mikropatterning, som også fås som en mindre koncentreret væske. Gelen giver mulighed for at mønstre ved en signifikant reduceret dosis sammenlignet med væsken, hvilket resulterer i meget hurtigere mønstre. Med dette system var den faktiske mønstertid for et fuldt TEM-gitter ~ 2 minutter. Mikropatteringsarbejdsgangen alene strækker sig generelt over 5-6 timer og giver en person mulighed for at mønstre otte gitre til standardcellekultur på TEM-gitre.

En række trin under mikropatterningsprocessen kræver lange inkubationstider (se trin 2.1, 2.3, 6.4). Bekvemt, nogle af disse trin, såsom PLL passivation (2.1) eller PEG-SVA passivation (2.3), kan udvides til en overnatning inkubation. Derudover kan gitre mønstres på forhånd og opbevares i en opløsning af ECM-proteinet eller PBS til senere brug. I vores undersøgelse var disse muligheder værdifulde i tilfælde, hvor timingen af celleforberedelse og såning er kritisk, såsom primære Drosophila neuroner og RSV-infektion af BEAS-2B-celler.

Gitre blev udarbejdet i en generel biosikkerhed-niveau 2 (BSL-2) lab indstilling ved hjælp af rene værktøjer, sterile opløsninger, og omfattede antibiotika / antimykotika i vækst media6,22,29,30. For prøver, der er særligt følsomme over for mikrobiel kontaminering, kan anti-fouling-laget og ECM anvendes i en vævskulturhætte eller et andet sterilt miljø. Derudover kunne nettet vaskes i ethanol mellem mønstre og ECM-anvendelse. Hvis du arbejder med smitsomme stoffer, er det vigtigt at tilpasse proceduren for at overholde passende biosikkerhedsprotokoller.

Denne arbejdsgang og de præsenterede procedurer (figur 1) gjorde det muligt at så HeLa-celler (figur 4), RSV-inficerede BEAS-2B-celler (figur 3, figur 5) og primære Drosophila larval-neuroner (figur 6, figur 7) på mønstrede EM-net for optimal indsamling af kryo-ET-dataindsamling.

HeLa celler seedet på mikropatterned TEM gitre forbliver levedygtige som bestemt af fluorescerende farvning ved hjælp af en calcein-AM og ethidium homodimer-1 baseret celle levedygtighed assay (Figur 4A, B). Ved hjælp af en blandet ECM af kollagen og fibrinogen klæber HeLa-celler let til mønstre på tværs af gitteret (Figur 4A, C). Den samlede morfologi af celler, der udvider sig langs mønsteret, svarer til cellerne, der dyrkes på ikke-asfalterede gitre (Figur 4C,D). For HeLa-cellers vedkommende forbliver den samlede celletykkelse ~< 10 μm med betydeligt tyndere områder ~< 1 μm tyk nær celle periferien (Figur 4E,F).

Til RSV-undersøgelser mønstrede vi hele gitterkvaler ved hjælp af en gradient med en lavdosiseksponering på kanterne og et højere dosismønster mod midten (Figur 3A). Gradient mønstre gav bedre resultater, når du søger efter frigivne vira til stede i nærheden af periferien af celler. Med disse mønstre blev det konstateret, at cellerne fortrinsvis overholdt den højere ECM-koncentration, men er også i stand til at klæbe til og vokse på de lavere ECM-koncentrationer. Den relative dosis mellem områder skal optimeres, når du bruger mønstre, der kræver flere doser. Hvis doserne og dermed ECM koncentrationer er for ens eller for forskellige til hinanden, effekten af at bruge flere doser vil gå tabt.

I figur 3 blev et TEM-gitter mønstret og efterfølgende sået med RSV-inficerede BEAS-2B-celler og brugt til indsamling af kryo-EM-dataindsamling. Figur 4A er et fluorescerende billede af ECM mønstret på et TEM-gitter ved hjælp af et gradientmønster. Celle vedhæftning og vækst langs den centrale del af mønsteret kan ses i figur 3B som et lysfelt billede af cellerne 18 timer efter såning. I figur 3C overlejres fluorescsignal (rød) fra replikation af RSV-A2mK+ med signal fra ECM. Størstedelen af de inficerede celler er placeret langs den højere densitet centrale region af gradient mønster. En lav-mag TEM kort over nettet efter kryo-fiksering afslører en række celler, herunder RSV-inficerede celler, placeret på kulstoffolie nær midten af gitter kvadrater. Som tidligere vist for celler dyrket på standard TEM gitre22, tilt-serien blev placeret og indsamlet af RSV virions i umiddelbar nærhed af periferien af inficerede BEAS-2B celler dyrket på mikropatterned gitre (Figur 5A,B). Mange af de strukturelle RSV-proteiner kan identificeres inden for tomogrammet, herunder nukleocapsid (N) og viral fusionsprotein (F) (henholdsvis figur 5C, blå og røde pile).

For primære Drosophila neuron undersøgelser, blev det konstateret, at det smalle mønster, nær opløsning grænse, der tilbydes af softwaren (hvor tykkelsen af mønsteret var 2 μm), tilladt fra en til et par celler, der skal isoleres inden for et gitter firkant (Figur 6). Den neuronale soma var i stand til at udvide sine neuritter over en periode på flere dage inden for mønsteret. Dette gjorde det let at identificere og vippe serie erhvervelse af neurites i forhold til neuroner dyrkes på ikke-asfalterede gitre (Figur 7). Det blev også konstateret, at fluorescerende-mærket concanavalin A, en lectin, der er blevet brugt som en ECM for in vitro Drosophila neuronale kulturer20,21, er modtagelig for mønstre.

Drosophila neuroner fra tredje instar larver blev isoleret i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller20,21,31. De neuronale præparater blev anvendt på mikropatterned cryo-EM gitre, hvor concanavalin A blev deponeret på mønsteret for at regulere celleplacering, spredning og organisation. Neuronerne på mønstrede eller ikke-asfalterede gitre fik lov til at inkubere i mindst 48-72 timer, og gitrene blev derefter kastet frosset. Et repræsentativt billede af et mikropatterned EM-gitter med flere Drosophila neuroner fordelt på tværs af de mønstrede regioner er vist i figur 6A. Disse neuroner, der stammer fra en transgen flyve stamme, der har pan-neuronal GFP udtryk i membranen, kan let spores af lys mikroskopi ikke kun på grund af dens fluorescerende mærkning, men også på grund af dens placering inden for mikropatterns. Mens neuroner, der dyrkes på ikke-asfalterede gitre, også kan spores gennem GFP-signalering ved lysmikroskopi (Figur 7A, gul cirkel), blev det betydeligt vanskeligere at finde dem i kryo-EM på grund af tilstedeværelsen af cellulært snavs og forurening fra medierne (Figur 7B, gul cirkel). En sådan tilstedeværelse blev mindsket for neuroner på mønstrede gitre, sandsynligvis på grund af PEG i anti-fouling lag af de ikke-mønstrede regioner afvise cellerester fra at overholde. På grund af dimensionerne af neuroncellekroppen og de udvidede neuritter (Figur 6A, B, gul cirkel) blev kryo-ET tilt-serien indsamlet langs tyndere områder af cellerne (Figur 6C, D, rød cirkel). Neuronal cellemembranen, en mitokondrie (cyan), mikrotubuler (lilla), actin filamenter (blå), køretøjsstrukturer (orange og grøn) og makromolekyler som ribosomer (rød) blev godt løst i højere forstørrelsesbillagemontører og skiver gennem 3D-tomogrammet (Figur 6E). Mens lignende sub-cellulære funktioner kan ses fra 3D tomogrammer af ikke-asfalterede neuroner (Figur 7E), vanskeligheden ved at lokalisere levedygtige cellulære mål for dataindsamling faldt gennemløb betydeligt.

I figur 8 er repræsentative billeder fra gitre med nogle af disse problemer blevet samlet for at hjælpe med deres identifikation og fejlfinding. Når de optimale forhold er fastlagt, er mikromaling en pålidelig og reproducerbar metode til placering af celler på gitre til kryo-TEM.

Figure 1
Figur 1: Generel arbejdsgang for mikromaling til kryo-EM. Arbejdsgangen kan groft opdeles fire dele: Grid forberedelse, micropatterning, ECM og celle såning, og kryo-forberedelse og dataindsamling. De vigtigste trin i hver sektion er angivet under overskrifterne, og den omtrentlige tid til at fuldføre hver sektion vises til venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skærmbillede af softwaren med mønster placeret på nettet. Område 1 indeholder μm/pix-forholdet for mønsterdesign. Område 2 er linealen til måling af et gitter. Område 3 er hvor man kan tilføje eller ændre mønstre og INVESTERINGSAFKAST. Område 4 indeholder alle oplysninger om mønsterpositionering og dosis. Område 5 indeholder indstillinger for mønstre, herunder tilstyggelige overlejringer, kopiering eller sletning af mønstre og valg af mønstre til mikromaling. Område 6 er, hvor skabeloner kan gemmes og indlæses. Større udsigt over område 4 og 5 er vist nedenfor for klarhed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RSV-inficerede BEAS-2B-celler på det mønstrede kryo-TEM-gitter. (A) Fluorescerende billede af det mønstrede gitter efter tilsætning af fluorescerende mærket ECM. Inputmønsteret vises i nederste venstre hjørne. B) Brightfield-billede af BEAS-2B-celler, der dyrkes på nettet i A. (C) Sammensmeltning af billedet i A (cyan) og B (grå) med fluorescerende billede af RSV-inficerede celler (rød) umiddelbart før frysning af dyk inficerede celler udtrykker mKate-2. Skalastænger er 500 μm. (D) Lavforstørrelse kryo-TEM kort over nettet i B efter dyk-frysning. Fluorescerende billeder er pseudofarvede. Skalastænger er 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levende/død farvning af mønstrede og ikke-asfalterede celler. (A) Fluorescerende billede af HeLa celler dyrket på et mønstret gitter og farves med calcein-AM (levende celle plet, grøn) og ethidium homodimer-1 (døde celle plet, rød). (B) HeLa-celler, der dyrkes på et ikke-malet gitter og farves som i A. (C) Projektion af confocal z-stakke af en HeLa-celle på et mønstret Quantifoil R2/2 gitter med 0,01 mg/mL kollagen og fibrinogen 647 ECM (rød). Cellen var plettet med calcein-AM (grøn) og Hoechst-33342 (blå). (D) HeLa-celler på ikke-malet gitter inkuberet med 0,01 mg/mL kollagen og fibrinogen 647 ECM, inkuberet og farves med calcein-AM og Hoecsht-33342. De fluorescerende billeder blev flettet med transmitteret lys (gråtoner). (E) X, Z projektion af C. (F) X, Z projektion af D. Billeder er pseudofarvede. Vægtstænger i (A) og B) er 500 μm; skalastænger i (C) - (F) er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Cryo-ET af RSV-inficerede BEAS-2B celle på mønstrede cryo-TEM gitter. (A) Cryo-EM gitter firkantet kort over RSV inficeret BEAS-2B celle. Omtrentlig cellegrænse er angivet med den stiplede grønne linje. (B) Billede med højere opløsning af område med rødt i (A). Omtrentlig cellegrænse er angivet med stiplede grønne streg. RSV virions kan ses i nærheden af cellen periferien (hvid pil og gul boks). (C) Enkelt z-skive fra tomogram indsamlet i området af den gule boks i (B). Røde pile peger på RSV F fusion protein, blå pile peger på ribonucleoprotein (RNP) kompleks. Skalalinjerne i (A)-(C) er integreret i billedet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Primære neuroner stammer fra hjernen hos 3rd instar Drosophila melanogaster larver på det mønstrede cryo-TEM gitter. (A) Overlejret levende celle fluorescens mikroskopi gitter montage af Drosophila neuroner udtrykker membran-målrettet GFP på mønstrede gitter firkanter med 0,5 mg/ mL fluorescerende concanavalin A. Grøn: Drosophila neuroner. Blå: Fotopattern. (B) Cryo-EM billede montage af nettet i (A) efter kryo-bevarelse. Gul cirkel noterer den samme gitter firkant som i (A). (C) Cryo-EM billede montage af pladsen fremhævet af den gule cirkel i (A) og (B). (D) Højere forstørrelsesbillede af det område, der afgrænses af den røde cirkel i (C), hvor der blev indsamlet en tilt-serie på cellens neuritter. E. 25 nm tyk skive af et tomogram rekonstrueret fra tilt-serien, der blev erhvervet fra den røde cirkel i (C). Forskellige organeller kan ses i dette tomogram, såsom mitokondrier (cyan), mikrotubuler (lilla), tætte kerne vesikler (orange), lyse vesikler (grøn), endoplasmisk reticulum (gul) og actin (blå). Makromolekyler, såsom ribosomer (rød), kan også ses i øverste højre hjørne. Fluorescerende billeder er pseudofarvede. Skalalinjerne i (A)-(E) er integreret i billedet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Primære neuroner stammer fra hjernen hos 3rd instar Drosophila melanogaster larver på ikke-asfalterede gitre. (A) Live-celle fluorescens mikroskopi gitter montage af Drosophila neuroner udtrykker membran-målrettet GFP på gitter firkanter med 0,5 mg / mL concanavalin A. Grøn: Drosophila neuroner. (B) Cryo-EM gitter montage af samme gitter i (A) efter dyk-frysning. Gul cirkel viser den samme gitter firkant som i (A). Bemærk tilstedeværelsen af cellulær snavs og medieforurening, hvilket gjorde målidentifikation vanskelig sammenlignet med mønstrede gitre. (C) Cryo-EM billede montage af pladsen fremhævet af de gule cirkler i (A) og (B) kort. (D) Højere forstørrelsesbillede af det område, der afgrænses af den røde cirkel i (C), hvor der blev indsamlet en tilt-serie på cellens neuritter. (E) 25 nm tyk skive af det rekonstruerede tomogram fra vippeserien fra (C) og (D). En række organeller er synlige i dette tomogram, såsom mikrotubuler (lilla), actin (blå), endoplasmisk reticulum (gul) og tætte kerne vesikler (orange). Makromolekyler, såsom ribosomer (rød), kan også ses. Fluorescerende billeder er pseudofarvede. Skalalinjerne i (A)-(E) er integreret i billedet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Eksempler på mulige problemer med mønstre. Fluorescerende billeder af mærket ECM deponeret på mikropatterned gitre. (A) Ujævne mønstre på tværs af nettet på grund af ujævn fordeling af PLPP gel. (B) ECM kan ikke overholde områder, der er omfattet af PDMS-stencilen under mønstre. (C) Mættet gradientmønster (højre side) eller omvendt mønster (venstre) på et gitter mønstret med for høj samlet dosis. (D) ECM overholder områder på gitterstængerne samt mønstret område på grund af refleksioner af UV-laseren under mønstre. Billeder er pseudofarvede. inputmønster vises nederst til venstre. skala barer er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Spørgsmål Potentielle årsag(er) Fejlfinding
Mikropattering
Kan ikke se belysning fra PRIMO laser • Lysstien er ikke indstillet korrekt • Kontroller, at mikroskoplyset er sat korrekt op
• PRIMO laser er ikke tændt eller laser er låst
Mange brudte gitter firkanter • Berøring af gitterfolie med pincet eller pipet under håndtering • Håndter gitre med omhu
• Gitter udtørret under inkubationer eller vask • Lad ikke gitteret tørre under vask og inkubationer
Store ikke-asfalterede områder • Utilstrækkelig geldækning • Sørg for, at gelen spredes jævnt over nettet, samtidig med at der tilføjes
• Gitterfolie ude af fokus under mønstre • Tilføj en ekstra mikroliter af gel
•Område dækket af stencil • Kontroller fokus, før du mønstrer hvert område
• Centrer forsigtigt gitteret i stencil
Mættet eller omvendt mønster • Forkert dosis • Prøv en række samlede doser for mønster
• Utilstrækkelig geldækning • Sørg for, at gitteret er jævnt dækket af gel
• Prøv forskellige værdier for gråtonemønstre
Sløret mønster • Dårligt fokus under mønstre • Gentag PRIMO kalibrering i samme højde som prøven
• Forkert kalibrering • Fokuser på gitterfolie før
• Del mønsteret op i yderligere områder til mønstre
ECM klæber uden for mønsteret • Refleksioner fra gel eller støv • Sørg for, at gelen er tør, før du mønstrer
• Sørg for, at coverlip og objektiv linse er rene
ECM ikke synlig efter mønstre • Foto blegning • Minimer lyseksponering for ECM før billeddannelse
• Forkert dosis under • Prøv en række samlede dosisværdier for mønster
• Utilstrækkelig ECM inkubationstid • Øge inkubationstiden for ECM
Cellesåning
Celler klumper sig sammen • Over fordøjelsen • Brug lavere procentdel af trypsin eller tid til frigivelse af klæbende celler
• Høj celletæthed • Passage og/eller fordøje celler ved lavere sammenløb
• Du må ikke omrøre celler under frigivelsen
• Forsigtigt pipet celleopløsning eller bruge cellesienkker
Celler, der ikke overholder mønstrede områder • ECM er ikke egnet til celletype • Prøv forskellige ECM koncentrationer og sammensætning
• Cellernes levedygtighed reduceres før såning • Sørg for, at cellekultur og cellefrigivelsesforhold ikke beskadiger celler
Celler, der ikke udvides efter vedhæftning • ECM eller mønster, der ikke er egnet til celletype • Prøv forskellige mønstre og ECM
• I nogle tilfælde kan en mere kontinuerlig folie (R1.2/20 vs R2/1) fremme celleudvidelse

Tabel 1: Potentielle problemer under mikromaling. I denne tabel beskrives nogle problemer, som en bruger kan opleve under micropatterning eller cellesåning. Der er potentielle årsager og fejlfinding for hvert problem. Repræsentative billeder af nogle problemer kan ses i figur 8.

Discussion

Moderne, avancerede elektronmikroskoper og softwarepakker understøtter nu strømlinet automatiseret kryo-EM og kryo-ET dataindsamling, hvor hundreder til tusinder af positioner kan målrettes og afbildes inden for få dage32,33,34,35. En væsentlig begrænsende faktor for hele celle cryo-ET arbejdsgange har været at opnå et tilstrækkeligt antal samlerobjekter pr nettet. For nylig har en række grupper udviklet protokoller for mikropatteringsnet til kryo-EM, hvor en fordel er forbedret dataindsamlingseffektivitet16,17,18. Her præsenteres en protokol for brug af et kommercielt tilgængeligt mikropatterningssystem til mikropattern TEM-gitre til kryo-ET-undersøgelser af primære Drosophila neuroner og dyrkede menneskelige cellelinjer (ikke-inficerede eller RSV-inficerede). Dette micropatterningssystem er alsidigt, og mange trin kan optimeres og skræddersys til at passe til specifikke eksperimentelle mål. En bruger med TEM og fluorescensmikroskopi erfaring kan hurtigt blive dygtig i gitter forberedelse og micropatterning. Med omhyggelig praksis bør gode resultater være opnåelige efter et par gentagelser. Nedenfor diskuteres nogle af de tilgængelige muligheder, brugerovervejelser, potentielle fordele og fremtidige anvendelser af micropatterning til kryo-EM.

En af de vigtige overvejelser for hele celle cryo-ET er EM gitter udvælgelse. EM-gitre består af to dele: en maskeramme (eller strukturel støtte) og folien (eller filmen), som er den kontinuerlige eller hullede filmoverflade, hvor cellerne vil vokse. Kobbernetgitre bruges almindeligvis til kryo-EM af proteiner og isolerede komplekser. Men de er uegnede til hele celle cryo-ET på grund af cytotoksicitet af kobber. I stedet er et guldnet almindeligt anvendt til cellulær tomografi. Andre muligheder omfatter nikkel eller titanium, som kan give fordele i forhold til guld såsom øget stivhed16. EM-gitre fås med forskellige maskedimensioner, der understøtter en række applikationer. Større maskestørrelser giver mere plads til celler til at vokse mellem gitterstænger og flere områder, der er modtagelige for tilt-serien indsamling, men på bekostning af øget samlet prøve skrøbelighed. Den mest almindeligt anvendte folie er perforeret eller holey amorf kulstof, såsom Quantifoils eller C-flade net. Biologiske mål kan afbildes enten gennem hullerne i kulstof eller gennem elektron-gennemskinnelige kulstof. Gitre som R 2/1 eller R 2/2, hvor hullerne er 2 μm brede, der er fordelt med henholdsvis 1 og 2 μm fra hinanden, giver et stort antal huller og dermed et stort antal potentielle områder til dataindsamling. Nogle celler kan dog vokse og udvide sig bedre på mere ensartede overflader som R 1.2/20-gitre eller kontinuerligt kulstof. Ved downstream-prøvebehandling ved hjælp af fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB) fjernes folien gennem fræsning, hvilket mindsker bekymringerne over den underliggende films fortsatte tilstedeværelse. Som med masken er folier fra andre materialer også tilgængelige, med mønsterprotokollen, der præsenteres her, lige så velegnet til SiO2-gitre . Almindeligt anvendte gitre omfatter guld Quantifoil, kontinuerlig kulstof, eller SiO2 film 200-mesh gitre (~ 90 μm afstand mellem gitre barer) for hele celle cryo-ET.

Der er en række overvejelser, når du designer et mønster. Et flertal af disse beslutninger styres af eksperimentets celletype og formål. Et godt udgangspunkt er at vælge et mønster, der tilnærmer form og dimensioner af cellerne i kulturen. Mange undersøgelser har vist betydelige virkninger af mønsterform på cellevækst og cytoskeletal arrangement13,36,37. Der bør udvises særlig omhu under mønsterdesignet, hvis dette kan ændre målet for interesse. Flere mønstre for hver celletype blev testet for at bestemme, hvilke mønstre fremmes cellulære vedhæftning og vækst. Mikropatterningssystemets fleksibilitet gør det muligt at teste flere mønstre på et enkelt gitter og ændre mønstre for forskellige gitre i et enkelt eksperiment. Større mønstre (~50-90 μm), som dem, der anvendes her, øger sandsynligheden for, at flere celler klæber til et enkelt område af mønsteret og tillader celler at udvide og udvide efter vedhæftning. Mere begrænsede mønstre (20-30 μm) kan være hensigtsmæssige i forsøg, hvor celleisolation er mere kritisk end celleudvidelse, f.eks. For tomografi applikationer, kan man nødt til at overveje virkningen af tilt-aksen. Hvis et mønster er placeret således, at alle celler vokser parallelt med hinanden i en enkelt retning, er det muligt, at alle cellerne vil være vinkelret på tilt-aksen, når de indlæses på mikroskopstadiet, hvilket resulterer i en lavere datakvalitet.

På ikke-asfalterede gitre klæber cellerne ofte fortrinsvis til gitterstængerne, hvor de ikke kan afbildes af TEM. Selv på mønstrede gitre observeres celler ofte at være placeret i hjørnerne af gitter firkanter delvist på både den mønstrede carbonfolie og gitterstang. For nylig blev micropatterning brugt til bevidst at placere en del af cellen over gitterstangen18. Dette kunne overvejes til eksperimenter, hvor det ikke er afgørende at have hele celle periferien på folien. Dette kan især være vigtigt for celler, der kan vokse sig større end en enkelt gitter firkant, såsom primære neuroner vokser over flere dage.

Der er mange værktøjer, der kan bruges til at designe et mønster. Her var mønsteret begrænset til mindre end 800 pixels i enhver dimension, således at mønsteret kan roteres til enhver vinkel og stadig passer inden for det maksimale område, der kan mønstres i en enkelt projektion af dette mikropatterningssystem. Dette gør det muligt for brugeren at rotere mønsteret for at være korrekt orienteret med gitteret uanset retningen af gitteret på mikroskopet. Her blev gitteret opdelt i seks mønsterområder. Dette giver primært mulighed for fokusjustering mellem forskellige områder af nettet. Især guldgitre er meget formbare og må ikke lægge sig helt fladt ned på glasset. Korrekt fokus er afgørende for rene, raffinerede mønstre resultater. Ved at bruge segmenterede mønstre skal der kun foretages mindre justeringer af mønsterpositionen, hvis gitteret skifter lidt under mønsterprocessen, selvom dette normalt ikke er et problem, når du bruger PLPP-gelen med PDMS-stencilerne. Endelig forblev de centrale fire gitter firkanter af nettet ikke asfalteret. Dette understøtter, at en bruger er i stand til klart at identificere midten af gitteret, hvilket er meget nyttigt til korrelative billeddiagnostiske eksperimenter.

Mønstresoftwaren til dette mikropatterningssystem, Leonardo, har også mere avancerede funktioner såsom syninger og evnen til at importere mønstre som PDF-filer, som ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. Denne software omfatter også mikrostrukturdetektering og automatiseret mønsterpositionering, der kan bruges på TEM-gitre. Denne funktion er mest nyttig, når gitteret er meget fladt og kan mønstres uden at skulle justere fokus mellem forskellige områder.

Udvælgelse af et ECM-protein kan have en betydelig indvirkning på celle vedhæftning og ekspansion. Nogle celler er kendt for at gennemgå fysiologiske ændringer, når de dyrkes på specifikke substrater38. Flere ECM-proteiner og koncentrationer blev testet for enhver ny celletype baseret på tidligere arbejde rapporteret i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin, og kollagen er meget udbredt til dyrkede celler og kan bruges som udgangspunkt, hvis andre data ikke er tilgængelige. Andre ECM-proteiner skal dog også tages i betragtning, hvis de almindeligt anvendte ECM-proteiner ikke giver cellerne korrekte tilslutningsegenskaber. Dette var især tilfældet for primære Drosophila neuroner, som en høj koncentration af planten lectin concanavalin A var nødvendig for korrekt cellulær tilslutning. Kompatibiliteten af cellulær vedhæftning og vækst med ECM kan testes ved at mønstre på glasskåle eller dias, før de overgår til TEM-gitre. Denne præscreeningsmetode er tids- og omkostningseffektiv, hvis et stort antal kombinationer skal undersøges. Inkluderingen af et fluorescerende konjugeret ECM-protein er værdifuldt til vurdering af mønstrenes succes og kvalitet.

Celle såning er et af de vigtigste skridt for hele celle cryo-ET, enten med eller uden micropatterning6,16,39. For primære Drosophila eller andre neuroner, som er skrøbelige, ustabile i suspension, og kan være begrænset i mængde, enkelt såning tilgange foretrækkes frem for overvågede, sekventiel celle såning. Et enkelt såning trin på en optimeret celletæthed, som beskrevet i protokollen for Drosophila neuroner, er en levedygtig mulighed for de fleste celletyper. Det er dog også muligt at så celler på substratet ved en lavere indledende koncentration og tilføje flere celler på en overvåget måde som beskrevet her og i anden litteratur18. Denne sekventielle såning kan give mere konsekvente resultater i nogle tilfælde. I lighed med standardcellekulturen skal man altid være forsigtig med at opretholde celle levedygtighed og minimere celleklumpning under isolation.

Når du først starter med micropatterning, er der et par potentielle faldgruber, der er skadelige for det endelige resultat. Omhyggelig nethåndtering og steril teknik, en ensartet fordeling af PLPP gel, korrekt dosis og fokus under mønstre, og vedligeholdelse af celle levedygtighed før såning er blandt de vigtigste overvejelser for succes. En liste over nogle af de potentielle problemer samt løsninger blev samlet i tabel 1.

Mikropatterned gitre kan bruges til at hjælpe med at placere celler til at etablere en ensartet celletæthed på tværs af nettet og til at placere områder af interesse i områder, der er egnede til tilt-serien indsamling16,18. Placering og placering af celler kan bruges som fiducial markører for korrelation i kryo-CLEM eksperimenter, hvilket reducerer behovet for skrøbelige finder-net og fluorescerende fiducial markører. Det skal dog bemærkes, at sådanne fiducial markører stadig kan være nyttige for sub-mikrometer nøjagtighed korrelation29,40. Desuden er en jævn fordeling af isolerede celler også meget gavnlig for fokuseret-ion stråle fræsning (cryo-FIB) eksperimenter for at maksimere antallet af celler, hvorfra lameller kan skæres16.

Tilføjelsen af micropatterning til cryo-EM-arbejdsgange vil resultere i målbare forbedringer i dataoverførselshastigheden og potentielt muliggøre nye eksperimenter. Efterhånden som teknikken er yderligere vedtaget og udviklet, vil mere avancerede anvendelser af mikropatterning, herunder ECM-gradienter, flere ECM-aflejringer og mikrostrukturmontering, yderligere udvide mulighederne i cryo-ET til at studere biologiske mål og processer i fuld cellulær kontekst.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang, og Mrs Josephine W. Mitchell i Institut for Biokemi, University of Wisconsin, Madison for generøst at dele elav-Gal4, UAS-CD8:: GFP flyve stamme (Bloomington stock center, # 5146). Vi vil også gerne takke Dr. Aurélien Duboin, Mr. Laurent Siquier, og Ms Marie-Charlotte Manus fra Alvéole og Mr. Serge Kaddoura fra Nanoscale Labs for deres generøse støtte i løbet af dette projekt. Dette arbejde blev delvist støttet af University of Wisconsin, Madison, Institut for Biokemi ved University of Wisconsin, Madison, og offentlige sundhedsydelser tilskud R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1, og U24 GM139168 til E.R.W. og R01 AI150475 til PW fra NIH. En del af denne forskning blev støttet af NIH tilskud U24 GM129547 og udført på PNCC på OHSU og tilgås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research. Vi er også taknemmelige for brugen af faciliteter og instrumentering på Cryo-EM Research Center i Institut for Biokemi ved University of Wisconsin, Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane Genesee 25-240
22x60-1 Glass cover slip Fisher 12545F
5/15 Tweezers EMS (Dumont) 0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher (Gibco) 15240096
BEAS-2B cells ATCC CRL-9609
Collagen I, bovine ThermoFisher (Gibco) A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) C11254
DMEM Fisher (Lonza) BW12-604F
EtOH Fisher (Decon Labs) 22-032-600
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher (Gibco) 33010018
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C
Glucose VWR 0643-1KG
Grid prep holder EMS 71175-01
HeLa cells ATCC CCL-2
Hemacytometer Fisher (SKC, Inc.) 22600100
HEPES Fisher (ACROS Organics) AC172572500
Hoechst 33342 ThermoFisher (Invitrogen) H3570
Insulin Fisher (Sigma Aldrich) NC0520015
KCl MP Bio 194844
KH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC212595000
Leica-DMi8 Leica Microsystems Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade Fisher (Supply Solutions) 50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit ThermoFisher (Invitrogen) L3224
Microscope camera Hammamatsu C13440-20CU
Motorized stage Märzhäuser Wetzlar 00-24-599-0000
NaCl Fisher (Fisher BioReagents) BP358-1
NaH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC207802500
NaOH Fisher (Alfa Aesar) AAA1603736
PBS Corning 21-040-CV
PDMS stencils nanoscaleLABS PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA nanoscaleLABS PEG-SVA-1GR mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin Fisher (Research Products International Corp) 50-213-641
pH strips Fisher (Millipore Sigma) M1095350001 pH probe can also be used
PLPP gel nanoscaleLABS PLPP-GEL-300UL https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) BEI Resources NR-36460 https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids EMS (Quantifoil) Q2100AR1 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI Fisher (Lonza) BW12-702F
RSV A2-mK+ see entry for pSynkRSV-19F - Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media ThermoFisher (Gibco) 21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers EMS (Dumont) 72812-D
Streptomycin Fisher (Fisher BioReagents) BP910-50
Sucrose Avantor 4097-04
Tetracycline Sigma T8032-10MG
Titan Krios electron microscope ThermoFisher 300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin ThermoFisher (Gibco) 15090046
Tube Revolver/Rotator Fisher (Thermo Scientific) 11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain Bloomington Drosophila Stock Center 5146 http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  2. Martynowycz, M. W., Gonen, T. From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).
  3. Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  4. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
  5. Bäuerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing. bioRxiv. , 437159 (2021).
  6. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).
  7. Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).
  8. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).
  9. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  10. Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. Elife. 8, 45919 (2019).
  11. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  12. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  13. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  14. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  15. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).
  16. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  17. Engel, L., et al. Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).
  18. Engel, L., et al. Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts. bioRxiv. , 272237 (2021).
  19. Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids. bioRxiv. , 447251 (2021).
  20. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  21. Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).
  22. Ke, Z., et al. The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography. Viruses. 10 (8), (2018).
  23. Stobart, C. C., et al. A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation. Nature Communications. 7, 13916 (2016).
  24. Hotard, A. L., et al. A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis. Virology. 434 (1), 129-136 (2012).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  29. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).
  30. Ke, Z., et al. Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein. Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).
  31. Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. A new in situ neuronal model for cryo-ET. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).
  32. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).
  33. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).
  35. Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).
  36. Anderson, D. E., Hinds, M. T. Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications. Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).
  37. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  38. Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. Use of extracellular matrix components for cell culture. Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).
  39. Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
  40. Schellenberger, P., et al. High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers. Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).

Tags

Biokemi Udgave 175 cellekultur maskeløs fotopatterning mikromaling kryo-elektronmikroskopi kryo-EM kryo-elektrontomografi kryo-ET korrelativt lys og elektronmikroskopi CLEM fluorescenslysmikroskopi fLM
Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J.… More

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows. J. Vis. Exp. (175), e62992, doi:10.3791/62992 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter