Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Automatisering af aggregeret kvantificering i Caenorhabditis elegans

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62997
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, 2Department of Computer and Information Science and Engineering, University of Florida

Summary

Følgende protokol beskriver udviklingen og optimeringen af en arbejdsgang med høj kapacitet til ormedyrkning, fluorescensbilleddannelse og automatiseret billedbehandling for at kvantificere polyglutaminaggregater som en vurdering af ændringer i proteostase.

Abstract

En stigning i forekomsten af neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD'er) har skabt stor interesse for dette emne gennem årene. Denne øgede opmærksomhed har krævet diversificering og forbedring af dyremodeller, der er i stand til at reproducere sygdomsfænotyper observeret hos mennesker med PCD'er. Selvom murine-modeller har vist sig uvurderlige, er de dyre og er forbundet med besværlige metoder med lav kapacitet. Brug af Caenorhabditis elegans nematodemodellen til undersøgelse af PCD'er er blevet begrundet i dens relative lette vedligeholdelse, lave omkostninger og hurtige generationstid, hvilket giver mulighed for applikationer med høj kapacitet. Derudover gør høj bevarelse mellem C. elegans og humane genomer denne model til et uvurderligt opdagelsesværktøj. Nematoder, der udtrykker fluorescerende mærkede vævsspecifikke polyglutamin (polyQ) kanaler udviser alders- og polyQ-længdeafhængig aggregering karakteriseret ved fluorescerende foci. Sådanne journalister anvendes ofte som proxyer til at overvåge ændringer i proteostase på tværs af væv. Manuel aggregeret kvantificering er tidskrævende og begrænser eksperimentel gennemstrømning. Desuden kan manuel focikvantificering introducere bias, da aggregeret identifikation kan være meget subjektiv. Heri blev en protokol bestående af ormedyrkning, billedoptagelse og databehandling standardiseret til at understøtte aggregeret kvantificering med høj kapacitet ved hjælp af C. elegans , der udtrykker tarmspecifik polyQ. Ved at implementere en C. elegans-baseret billedbehandlingspipeline ved hjælp af CellProfiler, en billedanalysesoftware, er denne metode optimeret til at adskille og identificere individuelle orme og opregne deres respektive aggregater. Selvom begrebet automatisering ikke er helt unikt, er behovet for at standardisere sådanne procedurer for reproducerbarhed, eliminering af bias fra manuel tælling og øge gennemstrømningen høj. Det forventes, at disse metoder drastisk kan forenkle screeningsprocessen for store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker ved hjælp af C. elegans-modellen .

Introduction

Aldersafhængige neurodegenerative proteinkonformationssygdomme (PCD'er) såsom Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdomme eller amyotrofisk lateral sklerose er kendetegnet ved proteinfejlfoldning, der fører til aggregering, celledød og vævsdegeneration1. Mens protein misfolding anerkendes som synderen, er etiologien af disse sygdomme ikke klar. Som sådan er udviklingen af effektive terapier blevet hindret af manglende viden om de faktorer og tilstande, der bidrager til sygdomsdebut og progression. Nylige undersøgelser tyder på, at ændringer i mikrobiomet påvirker begyndelsen, progressionen og sværhedsgraden af PCD'er 2,3,4. Kompleksiteten af det menneskelige eller endda murinmikrobiom gør det imidlertid vanskeligt at gennemføre undersøgelser, der ville afsløre mikrobernes nøjagtige indflydelse på deres vært. Derfor bruges enklere organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofte som et opdagelsesværktøj 5,6,7,8. Nylige undersøgelser har anvendt C. elegans til at undersøge virkningen af bakterier på værtsproteostase og sygdomspatogenese 9,10. Bakteriel kolonisering, hormese og genomiske ændringer er blandt eksemplariske tilstande, der påvirker aggregeringen af polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Derudover udviser disse misfoldede proteinklynger polyQ-længde- og aldersafhængig akkumulering inden for værten og er forbundet med nedsat bevægelighed 9,13. Den relativt enkle tilgang til kvantificering af fluorescerende mærket puncta kan generere vigtige data om forhold, faktorer eller lægemidler, der påvirker proteinfoldning og aggregering.

Selvom kvantificering af fluorescerende puncta har vist sig at være en pålidelig og relativt enkel procedure, er udfordringen fortsat at udvikle en protokol, der letter storstilet screening af forbindelser, bakterier eller tilstande, der påvirker proteinaggregering. Begrebet automatiseret C. elegans billedbehandling og punktkvantificering er ikke helt nyt, da der er udviklet en række praktiske støtteværktøjer 14,15. Integrationen af dyrkning, billedoptagelse og en behandlingspipeline er imidlertid afgørende for at eliminere variation i resultater og give mulighed for skærme med højere kapacitet.

Som sådan er hensigten med dette manuskript at standardisere den procedure, der anvendes til at kvantificere polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy til påvisning af ændringer i proteostase. Denne opgave blev udført ved at anvende CellProfiler, en open source billedanalysesoftware16 , der er i stand til automatiseret orm og aggregeret identifikation, og er integreret i en større protokol til dyrkning af orme, erhvervelse af billeder og behandling af data.

Protocol

Alle procedurer fulgte de sikkerhedsretningslinjer, der blev gennemgået og godkendt af Institutional Biosafety Committee ved University of Florida. Der blev truffet passende biosikkerhedsforanstaltninger for at mindske risikoen for eksponering for biologiske sikkerhedsniveau-2-bakterier.

BEMÆRK: For alle forsøg skal C. elegans formeres og vedligeholdes på nematodevækstmedier (NGM) plader podet med Escherichia coli OP50.

1. Fremstilling af 10 cm NGM plader

  1. Kombiner 3 g NaCl, 2,5 g trypticase-pepton og 17 g agar i en 2 L kolbe, og fyld til 1 L med dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Tilsæt magnetisk omrøringsstang inden autoklavering.
  2. Blandingen autoklaveres i 45 minutter ved 121 °C og et tryk på 21 psi. Lad blandingen køle af til 50 °C i et vandbad.
  3. Ved hjælp af aseptiske teknikker tilsættes følgende sterile opløsninger: 1 ml 1 M CaCl2· 2H2O, 1 ml 1 M MgSO4· 7H2O, 1 ml 5 mg / ml kolesterol opløst i 100% ethanol (opvarmet til stuetemperatur) og 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6,0). Bland med en magnetisk omrøringsplade. Blanding kan udføres i 1 minut ved 700 o / min.
  4. Hæld indtil blandingen fylder hele 10 cm pladen. Alternativt kan du bruge en gradueret serologisk pipette til at tilsætte ca. 20 ml blanding pr. plade.
  5. Pladerne tørre i 24 timer ved stuetemperatur inden såning med bakterier eller opbevar de almindelige plader ved 4 °C efter tørring.
    BEMÆRK: Alle mediekomponenter håndteres ved hjælp af aseptiske teknikker. Trin 1.3-1.4 skal udføres i en laminær flowhætte.

2. Fremstilling af NGM-agar med FUDR i 24-brøndplader

  1. Følg trin 1.1-1.3.
  2. Ngm suppleres med 5-Fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) og blandes for at opnå en slutkoncentration på 100 μg/ml.
    BEMÆRK: FUDR hæmmer DNA-replikation og blokerer som følge heraf C. elegans reproduktion ved at målrette kimlinje og embryogenese, hvilket i sidste ende påvirker levetiden. Derfor er det vigtigt at lade orme udvikle sig fuldt ud til unge voksne, før de overføres til FUDR-holdige plader.
    FORSIGTIG: FUDR er giftig og skal håndteres i henhold til producentens sikkerhedsdatablad.
  3. Brug en pipettepistol til at dosere 1 ml NGM-FUDR i hver brønd.
    BEMÆRK: Denne proces kan lettes ved brug af et automatiseret pladehældningssystem.
  4. Lad pladen tørre i 24 timer ved stuetemperatur inden såning med bakterier eller opbevaring af almindelige plader ved 4 °C.

3. Såning af plader: OP50 og yderligere testbakterier

  1. For at forberede en E. coli OP50-kultur natten over tilsættes 200 μL af en bakteriel aliquot fra en frossen bestand til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 250 ml frisk, steril Luria bouillon (LB).
    BEMÆRK: Mediets volumen afhænger af antallet af plader, der skal sås. For at forberede andre bakteriekulturer skal du inokulere et 16 ml kulturrør indeholdende 5 ml vækstmedium med bakterier fra frossent lager ved hjælp af en steril mikropipetspids.
  2. Inkuberes natten over i en 37 °C inkubator, og ryst ved 220 o /min (rotationer pr. Minut).
    BEMÆRK: Brug steriliserede kolber med mindst dobbelt så stort arbejdsvolumen som medier og forsegl med autoklaveret aluminiumsfolie. Udfør podningstrinnet og bakteriel dispensering ved hjælp af aseptiske teknikker.
  3. Hæld 1-2 ml af den natlige E. coli OP50-kultur på midten af hver 10 cm NGM-plade. Denne kultur behøver ikke at blive spredt omkring NGM-pladen.
  4. Lad pladerne tørre ved stuetemperatur inden brug/opbevaring.
    BEMÆRK: Frøplader med låg på kan placeres i en hætte med luftstrøm for at lette tørringen.

4. Dyrkning og såning af plader: plader med 24 brønde

  1. Forbered en overnatningskultur af ønskede bakteriestammer, der overholder dyrkningsinstruktionerne i trin 3.1-3.2.
  2. Overfør 200 μL af hver bakteriekultur til hver brønd i en 24-brøndplade indeholdende NGM-agar. En mængde bakterier på 200 μL dækker hele agarområdet og maksimerer mængden af mad for at sikre, at orme ikke undgår bakterieplænen.
  3. Lad pladerne stå revnede åbne i et biologisk sikkerhedsskab (BSC) for at lette tørringen. Kontroller pladerne med jævne mellemrum for at forhindre overdreven dehydrering og skift pladeorientering for at fremme jævn luftstrøm og tørring. Pladerne skal tørre inden for 5 timer.
    BEMÆRK: Ethvert arbejde med biologiske sikkerhedsniveau-2-bakterier skal udføres i certificerede BSC'er og godkendes af Institutional Biosafety Committee.

5. Alder synkronisering

BEMÆRK: Alle trin skal udføres ved hjælp af korrekte aseptiske teknikker (dvs. arbejde tæt på en flamme eller inde i en BSC).

  1. Hermafroditter vaskes af 10 cm OP50-plader med filtersteriliseret M9-opløsning (5,8 g Na2HPO4· 7H2O, 3,0 g KH2PO4, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO4·7H2O, i 1 liter ddH2O).
    1. Pipetter M9-opløsning på pladen flere gange ved hjælp af et sterilt glas eller plastisk serologisk pipette til at løfte orme fra bakterieplænen.
    2. Saml ormsuspensionen og overfør opløsningen til et 15 ml konisk polystyrenrør.
  2. Centrifuge ved 270 x g, stuetemperatur (RT, ~23 °C), i 2 min.
  3. Aspirer ved hjælp af en vakuumfældekolbe og kassér supernatanten, og lad ormpelleten være uforstyrret.
    1. Resuspender pelleten i 5-10 ml M9 for at vaske ormene og gentag trin 5.2-5.3 to gange.
  4. Tilsæt 5 ml 20% blegeopløsning (8,25 ml ddH2O, 3,75 ml 1 M NaOH, 3,0 ml ikke-bakteriedræbende blegemiddel) til røret og inverter kontinuerligt for at opløse ormene. Orme er klar til at centrifugere, når de næsten er helt opløst.
    BEMÆRK: Blegetider og volumen af blegeopløsning afhænger af prøvens størrelse. Over- og underblegning er almindelige fejl. Som sådan kræver denne proces generelt optimering for at bestemme, hvornår prøven er klar til centrifugering.
  5. Centrifuger i 2 minutter ved 423 x g , og kassér supernatanten.
  6. Tilsæt 10 ml steril M9 for at genoplive ægpillen.
    1. Centrifuger røret i 2 minutter ved 423 x g for at pelletere æggene. Fjern supernatanten med en aspiratorkolbe.
    2. Gentag trin 5.6-5.6.1.
  7. Resuspender ægpillen i 5 ml steril M9 og læg den på en møtrik natten over ved den ønskede temperatur.
    BEMÆRK: Alderssynkroniserede L1 larver vil være klar til at overføre til plader den følgende dag.

6. Ormforberedelse efter alderssynkronisering

  1. Centrifuger de alderssynkroniserede orme ved 270 x g i 3 minutter ved RT (~ 23 ° C).
  2. Opsuge supernatanten i et rent miljø, såsom en flowhætte eller ved siden af en Bunsen-brænder. Efterlad ca. 200 μL af supernatanten og resuspend ormene.
  3. Brug en mikropipette til at overføre den koncentrerede ormesuspension til 10 cm NGM-plader, der tidligere er blevet podet med OP50.
    BEMÆRK: Hver tallerken kan understøtte 1.500 orme uden at løbe tør for mad; Denne koncentration kan dog kræve justering afhængigt af bakterieplænens tæthed og væksttemperaturen. Det anbefales at bruge flere plader for at forhindre orme i at sulte. Det er vigtigt at bemærke, at disse plader ikke må indeholde FUDR.
  4. Lad pladerne tørre; derefter inverteres og opbevares ved 25 °C i 48 timer.
    BEMÆRK: Afhængigt af skærmens tilstand kan orme fra trin 6.1 placeres direkte på testplader (indeholdende bakterier, lægemidler eller testforbindelser). Hvis den ønskede testtilstand påvirker udviklingen, skal orme dyrkes på NGM indeholdende OP50 indtil unge voksne (~ 48 timer), før de udsættes for testbetingelser.
  5. Efter 48 timers inkubation vaskes ormene fra pladerne med steril M9-opløsning og placeres i koniske rør.
    BEMÆRK: Voksne orme vil synke til bunden af røret. Den nøjagtige tid vil variere alt efter antallet af orme, der er genvundet fra 10 cm plader. Under disse forhold sætter ormene sig inden for 10 minutter.
  6. Udfør visuel inspektion for at bestemme varigheden af bundfældningstiden, således at eventuelle resterende æg eller klækkede larver fjernes.
  7. Tilsæt yderligere 10 ml M9 for at skylle de resterende bakterier fra ormlegemer.
    1. Ormene centrifugeres i 2-3 min ved 270 x g ved 23 °C.
    2. Udfør vasketrinnet yderligere 3 gange. For de bedste resultater skal du efterlade ca. 1-1,5 ml M9-opløsning i røret efter den sidste vask.
    3. Overfør 10 μL af ormsuspensionen på et glasglas og tæl antallet af orme.
    4. Ormetætheden justeres til ca. 150 orme pr. 10 μL M9. Koncentrationen af orme i suspension kan justeres ved enten at fjerne eller tilsætte M9-opløsning efter centrifugering.
    5. Bekræft, at den ønskede koncentration er blevet fastslået ved gennemsnit af tællinger fra flere forskellige dråber. Det anbefales at gennemsnitlige tæller fra mindst tre dråber.
  8. Ved hjælp af aseptiske teknikker overføres 10 μL af ormesuspensionen indeholdende ca. 150 orme til hver brønd på prøvepladen.
  9. Undersøg brøndene under et mikroskop for at sikre, at hver har et tilstrækkeligt antal orme. Yderligere orme kan tilsættes inden inkubation.
  10. Lad pladerne tørre i ca. 10 minutter; og derefter inverteres og overføres til en 25 °C inkubator i 72 timer.
    BEMÆRK: Den endelige inkubationsperiode kan justeres for at imødekomme eksperimentets behov. Inkubationstiden på 72 timer er tilstrækkelig til at understøtte væksten af 150 dyr, der fodrer med 200 μL bakterier i en 24-brøndplade ved 25 °C.

7. Forberedelse af orme til billeddannelse

  1. For at lette mere effektiv bundfældning og minimere prøvetab skal du immobilisere ormene inden vask for at forhindre svømning.
    BEMÆRK: Hvis du arbejder med få prøver, kan dette opnås ved eksponering for levamisol (100 μM). Men hvis man arbejder med et stort antal prøver, kan orme immobiliseres ved frysning. Derudover vil udvidet frysning (18-24 timer) forhindre den videre udvikling af polyQ-aggregater under fremstillingen.
    1. Placer plader med flere brønde ved -20 ° C i 15-20 minutter, eller indtil orme ikke længere bevæger sig.
    2. Fjern prøverne fra fryseren og lad dem sidde i 5 min.
  2. Brug en mikropipette til at tilsætte 1 ml M9, kølet til 4 ° C, til en brønd af interesse, tryk gentagne gange og tryk stemplet 4-6 gange for at vaske ormene i hver brønd.
    BEMÆRK: Nogle gange kan orme holde sig til mikropipettespidser. Som sådan bør forskellige tip bruges mellem hver brønd for at forhindre blanding af orme.
  3. Overfør ormsuspensionen til et mikrocentrifugerør og lad ormene synke til bunden.
  4. Aspirere og kassere supernatanten. Prøven vaskes i alt tre gange.
  5. Efter at orme har slået sig ned til bunden under den sidste vask, aspireres 500 μL supernatant, hvilket efterlader 500 μL til resuspend orme.
  6. Overfør den resterende ormesuspension til en ny fladbundet 24-brøndplade, og læg den i en -20 °C fryser i 48 timer.
    BEMÆRK: Frysning af orme reducerer baggrundsfluorescens og giver bedre visualisering af aggregater.

8. Billedbehandling

  1. Fjern pladerne fra fryseren og lad optø, tør overskydende kondens væk, og fjern låget inden billeddannelse.
    BEMÆRK: Detaljerne i billedoptagelse varierer afhængigt af det anvendte udstyr og den anvendte software. Protokoller for dette afsnit bør kun tjene som vejledning, og ændringer kan forventes. Det er også nødvendigt at tage billeder i tiff-filformatet.
  2. Under billedoptagelse skal du bruge følgende mikroskopindstillinger: Eksponeringstid, 500 ms; 40x forstørrelse med 0,63x kameraadapter (25,2x), GFP-intensitet indstillet til 100 %.
    BEMÆRK: Forskellige mikroskopkonfigurationer og systemer kan erhverve billeder, der adskiller sig fra dem, der er angivet i resultatafsnittet. For at opnå en mere universel beskrivelse af de krævede billeder gives der mere objektive detaljer om billeder. Aggregater skal være mellem 1,0-10,0 pixels i diameter med en fluorescerende intensitet på 0,10-1,0 (vilkårlige enheder, skala 0-1) for at blive identificeret korrekt af CellProfiler. Den fluorescerende baggrund for disse aggregerede billeder er generelt under tærsklen på 0,10. For brightfield-billeder varierer ormintensiteten fra 0,7-1,0 med en baggrundsintensitet på 0,1-0,2. Den gennemsnitlige længde af orme i brightfield-billeder varierer fra 250 pixels til 350 pixels i længden fra hoved til hale.
  3. Juster transmitterede lyskontroller, indtil ormene ser stærkt oplyste ud i forhold til den mørke baggrund. Undgå overeksponering; det vil øge ormstørrelsen.
  4. Det kan være nødvendigt at ændre ormenes positioner i brønden for at forhindre overdreven klumpning. Spred klumpede orme ved hjælp af en pipettespids.
  5. Indstil kanalen til GFP for at etablere et fokusplan for begge billeder.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at fokusplanet bestemmes i GFP-kanalen. Enhver ændring i fokus, der foretages under optagelse af brightfield-billeder, vil resultere i forkert justering af aggregater og orme under billedanalyse.
  6. Tag et brightfield-billede, og tag straks det tilsvarende fluorescerende billede uden at forstyrre pladen.
  7. Kør testbilleder gennem pipelinen for at bestemme intensitets- og størrelsesværdier for objekter i billedet i henhold til "BEMÆRK" efter trin 8.2.
    BEMÆRK: CellProfiler kan give alle nødvendige oplysninger om objekternes intensitet og længde inden analyse.
  8. For at vurdere billeder skal du først downloade CellProfiler17. Åbn softwaren, og træk og slip billeder af interesse i feltet Billeder.
  9. Klik på billederne på fillisten for at åbne dem.
  10. I øverste venstre hjørne af skærmen er flere ikoner; brug dem til at måle størrelsen på objekterne eller forstørre et bestemt område. Vælg forstørrelsesglasset for at fremhæve et område af interesse.
  11. Vælg pilikonet for at måle længden af både orme og aggregater.
  12. Hold markøren over det ønskede objekt for at bestemme dets intensitetsværdi, som kan ses på den nederste del af skærmen.
    BEMÆRK: Da alle billeder er taget i gråtoner, vil alle røde, blå og grønne pixelværdier være identiske.

9. Billedanalyse

  1. For at bruge CellProfiler-billedanalysepipelinen skal du navngive billedparene korrekt. Brug følgende format: P1_A01_S1_C1, hvor P1 henviser til den specifikke plade og dens respektive numeriske betegnelse; "A" henviser til rækken og "01" til kolonnen; "S" refererer til et specifikt billedpar for en enkelt brønd; "C" henviser til kanalen, hvor "1" bruges til at betegne brightfield-billeder og "2" til fluorescerende billeder.
  2. Download CellProfiler (version 4.1.3 eller nyere) fra den officielle hjemmeside17.
  3. Download pipelinen (supplerende fil 1). Upload pipelinen (Pipeline) til CellProfiler ved at vælge File > Import > Pipeline from File.
    BEMÆRK: Modul 2 og 3 er blevet deaktiveret, da de er blevet anset for unødvendige. Deres funktion kan genoprettes, hvis billedanalyse ikke giver tilfredsstillende adskillelse og identifikation af orme; dog kræves ændring af rørledningen.
  4. For at inkorporere disse moduler skal du vælge felterne til venstre for hvert modul. Omdøb det binære inputbillede til modulet "UntangleWorms" til outputbilledet fra modulet "convertobjectstoimage".
  5. Der vises muligvis en fejlmeddelelse under første brug relateret til modul 2. Hvis dette sker, skal du fortsætte med analysen.
  6. Upload et træningssæt, der bruges til at identificere orme, til modulet "UntangleWorms". Dette træningssæt findes i supplerende fil 2.
    1. Vælg modulet UntangleWorms for at åbne dets indstillinger.
    2. Identificer navnet på træningssæt, og vælg ikonet uploadfil.
    3. Upload supplerende fil 2 (træningssæt).
  7. Upload billeder ved at vælge modulet Billeder i øverste venstre hjørne. Træk og slip korrekt navngivne billeder som beskrevet i trin 9.1.
  8. Før du analyserer billeder, skal du vælge den ønskede outputmappe, der skal bruges til at gemme resultaterne.
    1. Klik på knappen Outputindstillinger placeret nær nederste venstre hjørne af programmet.
    2. Vælg mappeikonet til højre for Standardoutput for at vælge den ønskede outputplacering.
  9. Vælg ikonet Analysér billeder for at starte billedanalysen.
  10. Hvis analysen tager for lang tid at gennemføre og sidder fast ved at behandle et enkelt billede, skyldes det sandsynligvis problemer fra billedoptagelse. Hvis dette sker, skal du afbryde kørslen og fortsætte med at identificere de ikke-behandlede billeder ved at sortere gennem outputmappen og bemærke, hvilke billednavne der ikke findes.
    BEMÆRK: Billederne kan kræve yderligere behandling for at fjerne store eller intenst oplyste artefakter, der ikke kan behandles af rørledningen. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at udelukke sådanne billeder fra analysen.
  11. Efter fuldstændig analyse organiserer softwaren resultaterne i et Excel-regneark, der indeholder individuelle orme (kolonne N) og deres respektive antal aggregater (kolonne K).
    BEMÆRK: En vellykket kørsel producerer et Excel-regneark, der indeholder antallet af aggregater pr. identificeret orm for hver brønd. Disse data kan manipuleres på en måde, der bestemmes af eksperimentatoren.
  12. Download metadata organizer (grafisk brugergrænseflade) fra Supplemental File 3 (Windows) eller Supplemental File 4 (Mac) for nemt at organisere data fra output CSV-filen fra CellProfiler.
    BEMÆRK: Denne software har ikke en officiel licens og åbnes ikke automatisk efter download.
  13. Følg trin 9.14-9.17, hvis du bruger Windows OS 64-bit. Softwaren fungerer ikke på Windows 32-bit. Følg trin 9.18-9.20, hvis du bruger Mac OS. Trin 9.21-9.22 er de samme for begge operativsystemer.
  14. For Windows OS skal du finde den downloadede fil og udpakke den til det ønskede sted.
  15. Find og åbn den udpakkede mappe med navnet gui_windowsOS_64x og start applikationen ved at klikke på applikationsikonet "gui".
  16. En prompt kan åbne en anmodning om tilladelse til at køre. Vælg Flere oplysninger, og klik derefter på Tillid alligevel.
  17. Metadataarrangøren er klar til at trække og slippe CellProfiler-output CSV-filer. Fortsæt til trin 9.21.
  18. For Mac OS skal du finde den downloadede fil og åbne gui_macOS_64x.zip. Dette trin skal automatisk udpakke alle filer.
  19. Åbn den udpakkede mappe, der findes i "Downloads".
  20. Højreklik på applikationen "gui", og vælg Åbn. Der vises en prompt, der beder om tilladelse til at åbne på grund af manglen på en officiel licens. Vælg Åbn , og fortsæt til trin 9.21.
  21. Klik på Upload dine filer her, eller træk og slip de ønskede CellProfiler CSV-filer.
  22. Klik på knappen Organiser , som bringer brugeren til en ny skærm med knappen Download filer . Klik på knappen, og vælg det ønskede sted for at gemme outputfilen. Outputfilen vises som det originale filnavn med filtypenavnet "_organized" tilføjet til filnavnet.

Representative Results

Beskrevet heri er en C. elegans-arbejdsgang , der inkluderer dyrknings-, billedoptagelses- og behandlingsprotokoller, der muliggør vurdering af polyQ-aggregering i nærværelse af forskellige bakterier ved hjælp af et 24-brønds pladeformat som dyrknings- og billeddannelsesplatform (figur 1). Denne protokol kan justeres for at studere effekten af bakterier, specifikke tilstande, små molekyler, lægemidler eller genomiske manipulationer på værtsproteostase. Den beskrevne metode er optimeret ved hjælp af orme, der konstitutivt udtrykker intestinal polyQ smeltet sammen til et gult fluorescerende protein (vha6p: :p olyQ44: YFP); andre modeller, der rapporterer om proteostase i muskler eller neuroner, kan dog også bruges med yderligere optimering. For eksempel viser foreløbige eksperimenter anvendelsen af disse metoder til kvantificering af proteinaggregater i andre væv såsom muskelpolyQ (supplerende figur 1). Det vil dog være nødvendigt at ændre rørledningen for at justere korrekt for samlet størrelse og lysstyrke, som nævnt i afsnit 8 NOTE.

Figure 1
Figur 1: Visuel repræsentation af arbejdsproces. De vigtigste trin i protokollen omfatter fem forskellige faser: ormforberedelse og alderssynkronisering (trin 1-5), tarmkolonisering / ormebehandling (trin 6), prøveforberedelse til billeddannelse (trin 7), billedoptagelse (trin 8) og billedbehandling (trin 9). Protokollens "sektioner" refereres som "Trin" i figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.

De indledende optimeringseksperimenter afslørede forskellige vanskeligheder forbundet med overbelægning på grund af et stort antal afkom, hvilket resulterede i hurtigere udtømning af fødevarer. Tilskuddet af FUDR i NGM-plader beskrevet i afsnit 2 løste dette problem (figur 2). Derudover havde orme, der blev fodret med forskellige bakterier, i nærværelse af FUDR en mere ensartet kropsstørrelse, hvilket muliggjorde mere ensartet og nøjagtig ormdetektion.

Figure 2
Figur 2: Brugen af FUDR forbedrer billedkvaliteten ved at reducere afkom. FUDR-supplerede plader eliminerer C. elegans afkom sammenlignet med orme dyrket på ikke-FUDR-kontrol NGM-plader podet med E. coli OP50. Billeder blev erhvervet ved 25,2x forstørrelse (40x forstørrelse med en 0,63x kameraadapter). Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Baggrundsfluorescens bidrog til falsk positiv påvisning af polyQ-aggregater. For at reducere et sådant fluorescenssignal i tarmkanalen og forbedre automatiseret påvisning af aggregater var det nødvendigt at fryse orme inden billeddannelse. Frysning af orme ved -20 °C i 18-48 timer forbedrede signifikant polyQ-aggregatdetektion ved at eliminere baggrundsfluorescens (figur 3A). Det menneskelige øje er i stand til at skelne mellem aggregater og baggrundsfluorescens; derfor er den manuelle tælling før og efter frysningen den samme (figur 3B). Automatiseret tælling er dog ikke så nøjagtig, men frysning forbedrede automatiserede tællinger betydeligt med nøjagtighed, der kan sammenlignes med manuel tælling (figur 3B).

Figure 3
Figur 3: Frysning forbedrer den samlede detektion. (A) Fluorescerende billeder af C. eleganer , der udtrykker intestinal polyQ44::YFP før og efter frysning. Indsatser repræsenterer nærbilleder af det markerede område. Skalastænger = 500 μm. (B) Gennemsnitligt antal aggregater pr. tarm i orme koloniseret med P. aeruginosa MPAO1 før og efter frysning ved hjælp af manuel eller automatiseret (rørledning) aggregeret kvantificering. Data repræsenterer to biologiske replikater (n = 60-109). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Student's t-test (**** p < 0,0001). Fejllinjer repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.

Inverteret lysfeltbelysning blev brugt til at detektere hele C. elegans (figur 4A) og GFP-kanalen til billede polyQ44: : YFP-aggregater (figur 4B). Ormedetektion, detangling og aggregeret kvantificering for hver orm blev udført ved at anvende en optimeret CellProfiler-billedbehandlingspipeline (Supplerende fil 1), som gør det muligt at opnå antallet af aggregater pr. individuel orm (figur 4C-D). For at teste gennemførligheden af denne tilgang og nøjagtigheden af den automatiserede aggregatdetektion og kvantificering blev orme, der udtrykker tarmspecifik polyQ44::YFP, dyrket og forberedt til billeddannelse i henhold til de etablerede protokoller (afsnit 1-7). Antallet af aggregater pr. orm blev vurderet ved hjælp af enten den automatiserede rørledning (afsnit 8-9) eller manuel optælling. Hvert eksperiment blev udført i tre uafhængige forsøg med 90-571 orme pr. Tilstand. Mens det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm opnået med to forsøg ikke havde nogen signifikant forskel, havde orme i det tredje forsøg signifikant færre aggregater, når de blev kvantificeret ved hjælp af den automatiserede tilgang (figur 5A). Det gennemsnitlige antal aggregater fra de tre forsøg resulterede i lidt, men signifikant færre aggregater, da kvantificeringen blev udført ved hjælp af CellProfiler-pipelinen (afsnit 8-9) (figur 5B). Ikke desto mindre var forskellen mellem de to tilgange minimal, hvilket indikerer, at den automatiserede metode kan anvendes på store skærme.

Figure 4
Figur 4: Samlet detektion ved hjælp af CellProfiler. (A) Brightfield-billede, der bruges til at identificere ormelegemer. (B) Originalt fluorescerende billede erhvervet ved hjælp af GFP-kanal og brugt til at identificere og kvantificere et samlet antal intestinale polyQ44::YFP-aggregater. (C) Aggregater identificeret ved hjælp af CellProfiler. (D) Et samlet antal identificerede aggregater overlejret over det originale fluorescerende billede med orm og aggregerede konturer. Billedoptagelse og -behandling blev udført ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i afsnit 8-9. Paneler E-H repræsenterer nærbilleder af de tilsvarende skitserede områder på billede A-D. Billeder blev erhvervet ved 25,2x forstørrelse (40x forstørrelse med en 0,63x kameraadapter). Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Effekten af automatiseret aggregeret kvantificering. (A) Gennemsnitligt samlet antal pr. tarm i orme koloniseret med kontrol E. coli OP50 ved hjælp af manuel tælling (Manuel) og automatiseret CellProfiler-baseret kvantificering (Pipeline). Resultaterne repræsenterer data analyseret i tre separate forsøg (T1-T3) (n = 90-571). (B) Det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm blev opnået ved hjælp af manuel eller automatiseret (Pipeline) aggregeret kvantificering. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Student's t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at evaluere reproducerbarheden af resultater blandt forskellige eksperimenter blev billeder fra en plade indeholdende seks brønde orme, der blev fodret med enten Pseudomonas aeruginosa MPAO1 eller Escherichia coli OP50, erhvervet af tre individer, hvoraf to ikke havde nogen tidligere erfaring med billeddannelse af orme ved hjælp af disse protokoller. Billeder indsamlet fra hver brønd indeholdt et sted mellem 30-115 detekterede orme. En ikke-signifikant forskel i aggregering blev påvist i orme fra de samme brønde, som blev afbildet af de tre eksperimenter. Mens det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm forblev meget konsistent mellem de tre eksperimenter for orme fodret med MPAO1 og OP50, var der nogle statistisk signifikante forskelle i det gennemsnitlige antal aggregater, men kun i orme koloniseret af MPAO1 (supplerende figur 2). Disse resultater fremhæver reproducerbarheden af resultaterne selv mellem uerfarne eksperimenter.

For at sikre, at reproducerbarheden af aggregeret kvantificering ikke påvirkes væsentligt af ormposition, blev et sæt på 15 orme valgt og afbildet 15 separate gange efter omrøring mellem hver billedoptagelse ved hjælp af en pipettespids. Billeder af aggregater i orme fodret med E. coli OP50 og P. aeruginosa MPAO1 blev indsamlet og analyseret ved hjælp af CellProfiler. Det gennemsnitlige antal aggregater fra hvert af disse forskellige sæt billeder var lidt, men ikke signifikant forskelligt, hvilket yderligere understøttede reproducerbarheden af denne tilgang (supplerende figur 3).

Kolonisering af C. elegans tarm med gramnegative enteriske patogener har vist sig at forstyrre proteostase på tværs af væv, hvor P. aeruginosa er blandt de mest potente inducere af polyQ-aggregering9. For at afgøre, om disse optimerede protokoller med succes vil detektere og kvantificere P. aeruginosa-medieret forbedring af aggregering, blev orme, der udtrykker intestinal polyQ, koloniseret med E. coli OP50 (kontrolbakterier) og P. aeruginosa MPAO1, afsnit 1-8 blev udført. De erhvervede billeder blev analyseret ved hjælp af CellProfiler (afsnit 9, supplerende fil 1). Resultaterne af automatiseret kvantificering viser en signifikant stigning i antallet af aggregater induceret af P. aeruginosa MPAO1, hvilket konsekvent resulterer i en dobbelt forbedring sammenlignet med orme fodret med kontrol E. coli OP50 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm i orme koloniseret med kontrol E. coli OP50 og P. aeruginosa MPAO1. Antallet af aggregater pr. tarm blev vurderet ved hjælp af CellProfiler (afsnit 8-9). Data er repræsenteret som det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm i orme koloniseret med OP50 (n = 1068) og MPAO1 (n = 1557). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Student's t-test (**** p < 0,0001). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den optimerede rørledning blev designet til at understøtte store skærme til forhold, der påvirker proteostase. For at teste gennemførligheden af denne tilgang til screening af store biblioteker af bakterier for deres virkning på værtsproteostase blev den heri beskrevne rørledning anvendt (afsnit 1-9) til at teste effekten af 90 P. aeruginosa ikke-essentielle gen knock-out mutante stammer på polyQ-aggregering18. Denne pilotskærm er en del af et større projekt designet til at screene alle P. aeruginosa ikke-essentielle mutantstammer for deres evne til at påvirke værtsproteostase. Ud af 90 testede bakteriestammer viste kolonisering af C. elegans tarm med en kandidat et signifikant fald i antallet af aggregater (figur 7). Opfølgningseksperimenter for at evaluere følsomheden af dette assay blev udført via manuelle aggregerede tællinger fra et tilfældigt udvalg af seks P. aeruginosa-mutanter , der ikke adskilte sig signifikant fra MPAO1-kontrollen. Disse eksperimenter blev udført ved hjælp af de mere traditionelle 6 cm NGM-plader, der overførte orme til teststammer som L1'er for at rekapitulere tidligere etablerede metoder9. Bekræftelseseksperimenterne ved manuel tælling afslørede, at ingen af mutanterne, inklusive den, der signifikant reducerede antallet af aggregater (figur 7), påvirkede polyQ-aggregering (supplerende figur 4). Desuden blev de subtile ændringer i aggregering, der blev observeret på skærmen af de 90 mutante stammer, ikke påvist blandt manuelle tællinger af udvalgte kandidater, hvilket indikerer, at sådanne ændringer kunne opstå på grund af biologisk og eksperimentel variabilitet, såsom lav n-værdi. Samlet set indikerer resultaterne, at mens vores metode pålideligt kan afhente betydelige ændringer, vil subtile sandsynligvis blive savnet, og alle potentielle kandidater skal bekræftes individuelt.

Figure 7
Figur 7: Antallet af aggregater pr. tarm i et repræsentativt prøvesæt af orme koloniseret af 92 bakteriestammer. Data er repræsenteret som det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm normaliseret til det for orme koloniseret med MPAO1. Stiplede linjer repræsenterer det gennemsnitlige antal aggregater i orme koloniseret med MPAO1 (øverste, åbne cirkel) og OP50-kontrol (bund, åben firkant). Faste symboler repræsenterer 90 forskellige knock-out mutantstammer af P. aeruginosa MPAO1. Det gennemsnitlige antal aggregater pr. orm mellem orme koloniseret med MPAO1 og en enkelt mutant var statistisk signifikant. Grå cirkler repræsenterer prøver, der blev bekræftet manuelt (supplerende figur 4). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af flere sammenligninger Dunnetts post-hoc test (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at styre den store mængde data, der genereres af CellProfiler, blev der udviklet en grafisk brugergrænseflade (GUI) til automatisering af databehandling og organisering (figur 8). GUI'en blev udviklet ved hjælp af Tkinter, et open source Python-widgetværktøjssæt på tværs af platforme. Fra de givne metadata udtrækker applikationen antallet af aggregater (kolonne K) fra hver brønd (kolonne J), der er til stede i en plade. Et Python-datahåndteringsbibliotek kaldet "Pandas" blev brugt til at udføre den førnævnte proces. GUI-applikationen giver træk-og-slip-understøttelse for brugere til at uploade datafiler. Dataene i hver fil gemmes i form af en todimensionel tabelstruktur kaldet en dataramme. Et tomt ordbogspar initialiseres for hver unik brønd, der findes inden for datarammen. Dernæst tælles de forskellige aggregater, der findes i hver brønd, og føjes til deres respektive ordbogspar. Kolonnen med færre data er polstret med tomme værdistrenge for at sikre, at hver kolonne er lige stor. Endelig konverteres strukturen til en dataramme, der eksporteres i form af et regneark til den mappe, der er angivet af brugeren.

Figure 8
Figur 8: Grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Påvisning af muskelspecifikke polyQ-aggregater. Orme, der udtrykker muskelspecifik polyQ35::YFP, blev belagt som L1'er og dyrket på OP50 i 48 timer. Når orme udviklede sig til unge voksne, blev de overført til 24-brønds NGM-plader, suppleret med 100 μg / ml FUDR og podet med MPAO1 i yderligere 72 timer før billeddannelse. (A) Brightfield-billede, der bruges til at identificere ormekroppe. (B) Originalt fluorescerende billede erhvervet ved hjælp af GFP-kanal. (C) Aggregater identificeret ved hjælp af CellProfiler. (D) Et samlet antal identificerede aggregater overlejret over det originale fluorescerende billede med orm og aggregerede konturer. Billedoptagelse og -behandling blev udført ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i afsnit 8-9. Paneler E-H repræsenterer nærbilleder af de tilsvarende skitserede områder på billede A-D. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Reproducerbarhed af aggregeret kvantificering mellem forskellige eksperimenter. Gennemsnitligt antal aggregater kvantificeret ved hjælp af CellProfiler for seks brønde af orme koloniseret med P. aeruginosa MPAO1 (sorte søjler) og seks brønde af orme koloniseret med kontrol E. coli OP50 (grå søjler). Hver brønd blev afbildet af tre eksperimenter (AVS, DMC, RDH). Data er repræsenteret som det gennemsnitlige antal aggregater pr. Tarm (n = 30-115). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest (* p < 0,05, ** p < 0,01). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Effekten af ormposition på reproducerbarheden af aggregeret kvantificering. Gennemsnitligt samlet antal pr. tarm i orme koloniseret med kontrol E. coli OP50 (grå søjler) og P. aeruginosa MPAO1 (sorte bjælker). Resultaterne repræsenterer det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm (15≥n≥12) kvantificeret ved hjælp af CellProfiler. Ormenes position i brøndene blev ændret ved omrøring mellem hver erhvervelse. Der blev ikke fundet statistisk signifikante forskelle i nogen af grupperne. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest. Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Bekræftelse af pilotskærmen med manuel optælling. Det gennemsnitlige antal aggregater pr. tarm blev kvantificeret manuelt. Data repræsenterer aggregeringsprofiler af orme koloniseret med seks MPAO1 knock-out mutanter (grå cirkler figur 7) sammenlignet med vildtype MPAO1- og OP50-kontroller (n = 30). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af flere sammenligninger Dunnetts post-hoc test (**** p < 0,0001). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Effekten af FUDR på intestinal polyQ-aggregering. Data er repræsenteret som det gennemsnitlige antal polyQ44::YFP-aggregater pr. tarm (n = 20). Orme blev overført til kontrolplader (ingen FUDR) eller FUDR-holdige plader (100 μg/ml) efter 48 timers vækst ved 25 °C på E. coli OP50. Manuelle tællinger blev indsamlet efter yderligere 48 timer. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Student's t-test (ns = ikke signifikant). Fejllinjer repræsenterer SEM. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Proteostase rørledning. Downloadbar billedanalysepipeline til brug i CellProfiler. Instruktioner til anvendelse findes i afsnit 9. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Træningssæt, der løsner orm. Fil, der skal uploades til modulet "UntangleWorms". Dette særlige træningssæt er specifikt for de orme, der blev brugt i den indledende tilgang. Ændringer i ormstørrelse og form vil ændre nøjagtigheden og kvaliteten af identifikationen. Det kan være nødvendigt at oprette en mere personlig træningsfil. Instruktioner til oprettelse af et nyt træningssæt kan findes på det officielle CellProfiler-websted17. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Grafisk brugergrænseflade til Windows-operativsystem. gui_windowsOS_64x.zip. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Grafisk brugergrænseflade til Mac-operativsystem. gui_MacOS_64x.zip. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den beskrevne protokol skitserer procedurer for C. elegans dyrkning, billeddannelse og billedbehandling, der inkorporerer CellProfiler, en open source billedanalysesoftware. De repræsentative resultater viser reproducerbarhed, reduktion af bias og skalerbarhed. Denne standardiserede procedure vil forbedre screeningsstrategier, der anvendes med store bakterielle, genomiske eller lægemiddelbiblioteker. Mens der findes andre automatiserede C. elegans-metoder til objektdetektion, tilbyder den beskrevne teknik en standardiseret pipeline med højere kapacitet, der integrerer dyrkning, billedoptagelse og analyse.

Flere variationer af ormedyrkning måtte testes for at optimere protokollen beskrevet heri. Oprindeligt blev orme overført til prøvebakterier umiddelbart efter alderssynkronisering (L1-trin). En sådan tilgang resulterede imidlertid i en population af orme med varierende størrelser, selv blandt orme inden for samme brønd. C. eleganer er kendt for patogenundgåelse19, hvilket kunne have bidraget til den observerede variation i størrelse og i sidste ende påvirke downstream imaging-ormdetektion, især. For at eliminere en sådan variabilitet blev hele NGM-området i hver brønd dækket af testbakterier. Desuden blev orme fodret med E. coli OP50 og fik lov til fuldt ud at udvikle sig til unge voksne i 48 timer ved 25 °C. At tillade orme at nå voksenalderen på E. coli OP50, før de overføres til testbakterier, resulterede i mere ensartet kropsstørrelse. Derudover blev overbelægning og hurtig udtømning af mad af afkom elimineret ved at supplere NGM-agar med FUDR. Implementeringen af FUDR fjernede afkom og forbedrede automatiseret ormidentifikation, som blev skjult af afkom, der blandede sig med forældrepopulationen. Det er dog vigtigt at være forsigtig og anvende passende kontroller, når du bruger FUDR, da forbindelsen vides at påvirke C. elegans proteostase og levetid20,21. Under de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, påvirkede FUDR ikke intestinal polyQ-aggregering (supplerende figur 5); derfor var dens anvendelse egnet og gavnlig for den beskrevne metode.

Frysning af prøver før billeddannelse viste sig at være et kritisk skridt i den vellykkede anvendelse af rørledningen. De samlede tællinger før frysning var signifikant højere end manuelle tællinger (figur 3B). At holde orme ved -20 °C i 18-48 timer før billeddannelse reducerede baggrundsfluorescens og i sidste ende forbedret samlet detektion (figur 3A). Virkningerne af frysning på aggregeret detektion er kun blevet undersøgt for polyQ og bør ikke generaliseres til andre modeller uden yderligere undersøgelse af sådanne virkninger.

På trods af at alle betingelserne blev holdt de samme, blev det observeret, at det gennemsnitlige antal aggregater pr. orm kunne variere mellem forskellige kørsler, mens forholdet mellem antallet af aggregater hos dyr koloniseret med OP50 versus MPAO1 forblev konsistent (figur 6, supplerende figur 2, supplerende figur 5). Det er derfor vigtigt altid at medtage E. coli OP50-kontrol eller yderligere passende referencekontroller i alle løb. En sådan variation i de samlede tal mellem forsøg kan påvirkes af miljøforhold (temperatur, fugtighed)22,23 eller genetisk baggrund8. Faktisk blev det observeret, at tarmfluorescens efter langvarig kultur faldt drastisk eller var helt tabt, hvilket krævede optøning af en ny stamme fra frossen bestand. Det observerede fald i fluorescens kan være et resultat af genetiske ændringer, der undertrykker giftige transgener, såsom dem, der udtrykker polyQ. Ikke desto mindre understreger den ekstraordinære reproducerbarhed af de observerede resultater mellem forskellige eksperimenter (supplerende figur 2), mellem biologiske replikater (figur 5) og inden for samme prøve (supplerende figur 3) styrken af denne tilgang.

Talrige rapporter har anvendt intestinal polyQ til at studere proteostase 9,11,12,13,24,25. En direkte sammenligning mellem resultaterne kan imidlertid ikke foretages på grund af variabilitet mellem eksperimentelle tilgange og udlæsningsmetoder. Ikke desto mindre rekapituleres nogle få resultater fra tidligere offentliggjorte data ved den automatiserede kvantificering, der er beskrevet heri, herunder bakteriel induktion af aggregering 9,13 og et sammenligneligt antal aggregater11. Samlet set tilbyder den beskrevne rørledning et værdifuldt værktøj til at studere proteostase.

Den metode, der er beskrevet heri, har nogle iboende udfordringer. For eksempel kræver det tilstrækkelig tid til at mestre alle komponenter i denne protokol, hvilket især gælder for afsnit 8 i protokollen, hvilket kræver kendskab til analysen for at afgøre, om de erhvervede billeder er egnede til rørledningsanalyse. Afvigelser fra de billedoptagelsesindstillinger, der bruges i denne protokol, er mulige; dog vil ændring af indstillingerne og ormtræningssættet sandsynligvis være påkrævet. Denne rørledning kan skelne mellem aggregater i forskellige størrelser og dem, der rører ved, hvilket begrænser "blanding" af aggregater og i sidste ende øger detektionsfølsomheden. Der kan dog opstå problemer, når man forsøger at identificere store aggregater, der overskrider det accepterede størrelsesinterval, da en udvidelse af den øvre størrelsestærskel kan føre til fejl forårsaget af dårlig identifikation, f.eks. manglende evne til at skelne mellem aggregater, der rører ved hinanden. En balance mellem nøjagtighed, størrelse og intensitet skal findes inden billedanalyse. Effektiviteten af aggregeret identifikation kan forbedres yderligere ved at inkorporere maskinindlæring for at skabe et neuralt netværk, der er i stand til at forbedre aggregeret detektion. Sådanne forbedringer undersøges i øjeblikket og vil i høj grad hjælpe med at løse aktuelle problemer såsom påvisning af aggregater, der ligger på forskellige fokusplaner, eller som har unormale former.

En bemærkelsesværdig svaghed ved den beskrevne metode er variationen i automatiserede aggregerede tællinger, da de ikke altid rekapituleres ved manuelle tællinger i orme fodret med forskellige bakteriestammer. For eksempel, baseret på automatiserede tællinger, havde orme fodret med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant færre aggregater sammenlignet med vildtypestammen (MPAO1) (figur 7); Bekræftelsen af hittet viste imidlertid ingen signifikant forskel (supplerende figur 4). Generelt har lægemiddelskærme med høj kapacitet en høj grad af falsk-positiv hitdetektion, og den beskrevne metode er ingen undtagelse26. Det er således en kritisk del af protokollen at bekræfte alle potentielle hits.

Mens denne protokol blev optimeret til at passe til en screeningsstrategi for at identificere bakterier, der påvirker værtsproteostase, kan hvert trin ændres yderligere for at teste effekten af genomiske RNAi-biblioteker, små molekyler eller andre tilstande. Yderligere ændringer kan foretages på hvert trin for at passe til kravene i en specifik screeningstrategi. Desuden giver denne teknik et niveau af fleksibilitet, der giver mulighed for optimering af hvert trin, så det passer til en bestemt model. For eksempel kan denne tilgang udvides til polyQ-aggregering i andre væv eller ekstraktion af andre funktioner, der er påvist i billeder, såsom overvågning af genekspression ved hjælp af inducerbare fluorescerende reportere (f.eks. Varmechokgener), vurdering af subcellulær lokalisering af proteiner (f.eks. Nuklear lokalisering af DAF-16), undersøgelse af aggregering i andre sygdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuclein, TDP-43 osv.) eller vurdering af fysiologiske fænotyper, såsom ormstørrelse.

Disclosures

Forfatterne har erklæret, at der ikke findes interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) og Infectious Diseases Society of America finansiering til DMC. Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker medlemmerne af Czyz Lab for korrekturlæsning af manuskriptet. Tegneseriefigurer blev genereret ved hjælp af BioRender betalt licens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Microtubes Olympus Plastics Cat#24-282 Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes GenClone Cat#12-104 Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked Olympus Plastics Cat#28-101 Conical tubes
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Fisher Scientific D2235100MG FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller Genesee Scientific 91-600RB Pipette gun
Agar Fisher Scientific Cat#BP1423-2 Granulated agar
BioRender BioRender Graphical figure generator
Bleach (Regular) Clorox Bar# 044600324111, Splash-less Bleach 4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] Morimoto Lab (Northwestern University) AM140, Q35::YFP Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] Morimoto Lab (Northwestern University) AM738, Q44::YFP Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O Fisher Scientific Cat#C79-500 Calcium chloride dihydrate
CellProfiler Broad Institute Image analysis software
Cholesterol Fisher Scientific Cat#ICN10138201 Cholesterol
Circulating Water Bath Head Lauda 26LE Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO CoolLED 8114931 Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes Olympus Plastics 21-129 Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50 E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof Decon Labs, Inc. 2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen Leica Microsystems 10450910 Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F Leica Microsystems 10450588 Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0 GraphPad Software, Inc. Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180 Thermo 51031562 Refrigerated incubator
Innova 4000 New Brunswick Scientific M1192-0000 Shaking incubator
K5 Camera Leica Microsystems 11547112 Stereomicroscope camera
KH2P04 Fisher Scientific Cat#P285-3 Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software Leica Microsystems Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier Leica Microsystems 10450103 Stereomicroscope
Levamisole Fisher Scientific Cat#0215522805 Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox) Apex Bioresearch Products Cat#11-125 LB
Magnetic Stir Plate Fisher Scientific 11-100-49S Stir plate
MgSO4·7H2O Alfa Aesar A14491 Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides Premiere 8205 Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O Fisher Scientific Cat#S373-500 Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl Fisher Scientific Cat#S671-500 Sodium chloride
NaOH Fisher Scientific Cat#S318-3 Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm Leica Microsystems 10411597 Objective microscope lens
Petri Dishes Genesee Scientific Cat#32-107G 100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library Manoil Lab (University of Washington) P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-102 Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series Leica Microsystems 10450043
Trypticase Peptone ThermoFisher, Difco Cat#211921
TX-400 Rotor Thermo Scientific Cat#75003181 Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System GenClone Cat#25-227 500 mL, PES Membrane, .22 µm
Video Objective with C-Mount Leica Microsystems 10447367 0.63x camera adapter tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soto, C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).
  2. Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk. Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).
  3. Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. Our gut microbiome: The evolving inner self. Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).
  4. Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).
  5. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7 (1), 13023 (2016).
  6. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), 1003466 (2013).
  7. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  8. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  9. Walker, A. C., et al. Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate. PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510 (2021).
  10. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  11. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
  12. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).
  13. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).
  14. Hakim, A., et al. WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms. BMC Biology. 16 (1), 8 (2018).
  15. Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).
  16. Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9 (1), 482 (2008).
  17. CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: http://www.cellprofiler.org (2021).
  18. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  19. Schulenburg, H., Ewbank, J. J. The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans. Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).
  20. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  21. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).
  23. Shinn-Thomas, J. H. Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth. BMC Research Notes. 12 (1), (2019).
  24. Alexander-Floyd, J., et al. Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans. BMC Biology. 18 (1), 18 (2020).
  25. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  26. Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. False positives in the early stages of drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).

Tags

Biologi udgave 176 C. elegans proteostase polyglutamin aggregering
Automatisering af aggregeret kvantificering i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., … More

Vaziriyan-Sani, A. S., Handy, R. D., Walker, A. C., Pagolu, C. N., Enslow, S. M., Czyż, D. M. Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (176), e62997, doi:10.3791/62997 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter