Summary
在这里，我们描述了一项试点研究的程序，以探索不同频率（1 Hz / 20 Hz / 40 Hz）的重复经颅磁刺激对恒河猴脑脊液中Aβ和tau代谢的影响。
Abstract
先前的研究表明，非侵入性闪烁的光和听觉音调刺激可能会影响大脑中的Aβ和tau代谢。作为一种非侵入性技术，重复经颅磁刺激（rTMS）已被应用于神经退行性疾病的治疗。本研究探讨了rTMS对恒河猴脑脊液（CSF）中Aβ和tau水平的影响。这是一项单盲、自我控制的研究。使用三种不同的频率（低频，1 Hz;高频，20 Hz和40 Hz）的rTMS来刺激恒河猴的双侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）。使用导管插入术收集脑脊液。所有样品均进行液体芯片检测以分析CSF生物标志物（Aβ42，Aβ42 / Aβ40，tTau，pTau）。脑脊液生物标志物水平在rTMS刺激后随时间变化。刺激后，脑脊液中的Aβ42 水平在所有频率（1 Hz，20 Hz和40 Hz）下均呈上升趋势，高频（p<0.05）的差异比低频差异更大。
高频rTMS后，脑脊液总Tau（tTau）水平在rTMS后时间点（p<0.05）立即升高，并逐渐下降24 h。此外，结果表明，磷酸化Tau（pTau）的水平在40 Hz rTMS（p<0.05）后立即增加。Aβ42/Aβ40 的比率在1 Hz和20 Hz时呈上升趋势（p<0.05）。低频（1 Hz）刺激的tau水平没有显着差异。因此，rTMS的高频（20 Hz和40 Hz）可能对恒河猴脑脊液中的Aβ和tau水平产生积极影响，而低频（1 Hz）rTMS只能影响Aβ水平。
Introduction
淀粉样蛋白β（Aβ）和tau是重要的脑脊液生物标志物。Aβ由42个氨基酸（Aβ1-42）组成，是经β和γ分泌酶水解的跨膜淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的产物1。Aβ1-42 由于其溶解度特性，可能在大脑中聚集成细胞外淀粉样蛋白斑块1，2。Tau 是一种微管相关蛋白，主要存在于轴突中，参与顺行轴突转运3。异常的tau过度磷酸化主要是由激酶和磷酸酶之间的不平衡引起的，导致tau从微管中脱离并形成神经原纤维缠结（NFT）1。tau在脑脊液中的浓度增加，因为tau和磷酸化的tau蛋白（pTau）在神经退行过程中被释放到细胞外空间。先前的研究表明，脑脊液生物标志物与阿尔茨海默病（AD）大脑的三种主要病理变化有关：细胞外淀粉样蛋白斑块，细胞内NFT形成和神经元损失4。Aβ 和 tau 浓度异常出现在 AD 的早期阶段，因此可进行早期 AD 诊断5，6。
2016年，Tsai等人发现，非侵入性光闪烁（40 Hz）降低了预沉积小鼠视觉皮层中Aβ1-40 和Aβ1-42 的水平7。最近，他们进一步报告说，听觉音调刺激（40 Hz）改善了识别和空间记忆，降低了5XFAD小鼠海马体和听觉皮层（AC）中的淀粉样蛋白水平，并降低了P301S tauopathy模型8中的pTau浓度。这些结果表明，非侵入性技术可能会影响Aβ和tau代谢。
作为一种非侵入性工具，经颅磁刺激（TMS）可以电刺激神经组织，包括脊髓、周围神经和大脑皮层9。此外，它可以改变大脑皮层在受刺激部位和功能连接中的兴奋性。因此，TMS已被用于治疗神经退行性疾病以及预后和诊断测试。TMS中最常见的临床干预形式rTMS可以诱导皮层激活，改变皮层的兴奋性，并调节认知/运动功能。
据报道，20 Hz rTMS对包括谷氨酸和Aβ在内的氧化应激源具有 体外 神经保护作用，并改善了小鼠单克隆海马HT22细胞的整体活力10。在1 Hz rTMS刺激后，海马体中β位点APP切割酶1，APP及其C端片段显着减少。值得注意的是，海马CA1的长期增强，空间学习和记忆的损害被逆转11，12。Bai等人在工作记忆测试中研究了rTMS对Aβ诱导的γ振荡功能障碍的影响。他们得出结论，rTMS可以逆转Aβ诱导的功能障碍，从而对工作记忆产生潜在的益处13。然而，关于rTMS对tau代谢的影响以及rTMS前后脑脊液中Aβ和tau的动态变化的报道很少。该协议描述了在不同频率（低频，1 Hz;高频，20 Hz和40 Hz）下rTMS对恒河猴CSF中Aβ和tau水平的影响的程序。
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Protocol
所有实验均根据中华人民共和国科技部制定的《实验动物护理和使用指南》以及《巴塞尔宣言》的原则进行。四川大学华西医院动物护理委员会（中国成都）批准。 图1 显示了这里使用的单盲自控研究设计。
1. rTMS 设备
- 使用8形磁场刺激线圈执行rTMS刺激。
2. 动物
- 将雄性恒河猴（玛卡卡穆拉塔，5公斤，5岁）放在一个单独的家庭笼子里，可以自由获得自来水和标准食物。确保控制环境条件以提供60-70的相对湿度，24±2°C的温度，以及12：12小时的光照：暗循环14，15。根据《实验动物护理和使用指南》进行所有实验。
3. 一种连续大水箱脑脊液取样方法
- 让两名训练有素的实验者执行导管插入术，从大水池中取样CSF（图2）。
- 定位
- 通过肌内注射5mg / kg唑西泮 - 帕坦胺麻醉猴子（见 材料表）。为了确保猴子的成功麻醉，寻找深呼吸和缓慢的呼吸，暗沉或缺失的角膜反射，以及四肢肌肉的放松。在此阶段监测其温度，脉搏，呼吸，粘膜颜色和毛细血管再充盈时间。
- 通过肌内注射每4小时给予2mg / kg吗啡。
- 将猴子放在手术台上，以侧卧位。弯曲猴子的脖子，驼背猴子，将膝盖朝向胸部。
- 穿刺
- 为了进行消毒，请使用无菌技术准备下背部周围的区域。在腰椎L4 / L5之间插入脊髓针，将其推入，直到进入容纳黄韧带的腰椎水箱时出现"爆裂"。
- 再次推动针头，直到有第二个"砰"声进入硬脑膜。从脊髓针中取出试样并收集脑脊液滴剂。
- 导管插入
- 在透视引导下，通过穿刺针将硬膜外导管插入蛛网膜下腔，直到它在大蓄水池中浮力。
- 端口植入
- 从穿刺部位到头部方向做一个5厘米的切口，并将皮肤与皮下组织隔离开来，以放置采样口。将端口连接到硬膜外导管的末端，并将端口植入皮肤下;然后，缝合切口。每天对伤口进行消毒，以防止感染。
注意：猴子在手术后的第二天完全恢复。
- 从穿刺部位到头部方向做一个5厘米的切口，并将皮肤与皮下组织隔离开来，以放置采样口。将端口连接到硬膜外导管的末端，并将端口植入皮肤下;然后，缝合切口。每天对伤口进行消毒，以防止感染。
- 脑脊液采集
- 使用笼子的栏杆来约束猴子并保持背部弯曲。
- 将注射器插入采样口的中心，通过导管从大水箱中提取CSF。丢弃前 0.2 mL 脑脊液（导管和端口的总体积为 0.1 mL），然后收集 1 mL 脑脊液进行分析16。
4. 猴子椅适应性训练
- 实验前将猴子固定在猴子椅上，以避免中断rTMS干预的过程（图3A，B）。
- 收集脑脊液在猴子清醒状态下进行生物标志物分析，以避免麻醉药物的影响。
- 在蛛网膜下腔导管插入术后的第三天，在实验开始前2周，用猴子椅子对猴子进行适应性训练，每天两次，每次30分钟。
5. rTMS自适应训练/假刺激
- 在正式实验开始前一周，在正式实验开始前一周，使用猴子椅进行rTMS自适应训练/假刺激，以避免在刺激过程中因振动和声音而阻碍实验进度。
- 使用假线圈（仅产生振动和声音，不产生磁场）来刺激猴子。刺激后向猴子提供食物，以帮助它适应该过程（图3C）。
- 每天两次在猴子椅上进行rTMS适应性训练，每次30分钟，共2周。
6. 治疗方案
- 如前所述，使用三种不同频率（1 Hz/ 20 Hz / 40 Hz）的rTMS来刺激猴子的双侧DLPFC（R-L-DLPFC）17。根据国际10-20系统对DLPFC进行本地化。
- 进行三次不同的rTMS会话，冲刷期超过24小时18，19。
- 对于第一个周期，使用以下参数：rTMS 的频率为 1 Hz，rTMS 模式由 20 个突发列车组成，列车间间隔为 10 秒的 20 个脉冲，以及平均静息电机阈值 （RMT） 的 100% 刺激强度，每天两次，连续三天20，21。
- 对于第二个周期，使用以下参数：高频（20 Hz）rTMS列车，100%RMT，持续时间为2秒，列车间间隔为28秒，每个会话总共2，000个刺激（40个刺激/火车，50个火车），每天两次，连续三天22。
- 对于第三个周期，使用以下参数：伽马频率 （40 Hz） rTMS 列车，100% RMT 在 1 秒的持续时间内交付，以 28 秒的列车间间隔隔开。保持每个会话的脉冲总数与 20 Hz rTMS 相同，每天两次，连续三天7，22。
- 进行三次不同的rTMS会话，冲刷期超过24小时18，19。
7. 脑脊液生物标志物
- 分析四种脑脊液生物标志物：Aβ42、Aβ42/Aβ40、tTau 和 pTau。
8. 脑脊液采集及指标检测方法
- 使用微创导管插入术对脑脊液进行采样。
- 使用笼子的栏杆来约束猴子并保持背部弯曲。指示其他操作员将注射器插入采样口的中心，确保通过导管提取脑脊液。
- 在5个时间点收集CSF（每个时间点4个样本，间隔3分钟）：rTMS前，rTMS后0小时/ 2小时/ 6小时/ 24小时23，24，25。共收集60个样本，3个频率;数量并将它们储存在-80°C冰箱中长达1个月。实验结束后，根据制造商的说明对所有样品进行液体芯片检测（见 材料表）。
9. 统计分析
- 将所有数据显示为均值±标准差 （SD）。
- 执行夏皮罗-威尔克检验，以在样本量较小的情况下检验正态性。执行双向重复测量方差分析和 Tukey 多重比较检验。
注：值（双尾）< 0.05 被认为具有统计学意义。
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Representative Results
结果表明，rTMS可以影响恒河猴脑脊液中的Aβ和tau水平。在不同频率（1 Hz，20 Hz和40 Hz）下进行rTMS刺激后，脑脊液生物标志物水平随时间变化。
Aβ42 和 Aβ42/Aβ40
如图4A所示，在1 Hz rTMS刺激后，Aβ42水平在24 h内逐渐升高（p<0.05），并在冲洗期后返回基线。同样，在用rTMS在20 Hz下刺激猴子的双侧DLPFC后，Aβ42水平随时间增加并在刺激后6 h达到峰值（p<0.05）。然而，在用40 Hz rTMS刺激后，Aβ42水平在rTMS后的时间点立即显着升高（p<0.05），并缓慢下降。一般来说，rTMS的高频（20 Hz和40 Hz）比低频（1 Hz）（p<0.05）更大程度地提高了Aβ42水平。此外，Aβ42水平在高频下增加得更快，特别是在40 Hz时，在刺激后达到峰值。此外，与20 Hz时相比，40 Hz时的Aβ42电平显着上升（p<0.05）。Aβ42/Aβ40的比值在1 Hz和20 Hz rTMS刺激后呈上升趋势，比rTMS刺激后2 h显著增加。此外，在20 Hz rTMS之后，它比1 Hz（p<0.05）增加的程度更大（图4B）。然而，在40 Hz时，Aβ42/Aβ40比值没有显著差异。
pTau 和 tTau
总体而言，猴子脑脊液中的tTau水平在20 Hz和40 Hz rTMS刺激后立即增加（p <0.05），并逐渐下降（图4C）。然而，1 Hz rTMS后没有显着差异。pTau水平在刺激后立即显着增加，具有40 Hz rTMS（p<0.05），并在24 h后降至基线水平以下（图4D）。此外，在1 Hz和20 Hz rTMS刺激后，pTau水平呈下降趋势。因此，与其他两个频率（1 Hz和20 Hz）相比，40 Hz rTMS对Tau水平（p<0.05）显示出更显着的影响。
冲刷后的基线
经过24小时的冲洗期后，在任何脑脊液生物标志物水平上均未观察到与基线（p >0.05）的显着差异。
图1：本试点研究的流程图。 缩写：rTMS = 重复经颅磁刺激。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：用于从大蓄水池连续取样脑脊液的微创导管插入术。 常规腰椎穿刺后进行微创导管插入术，其中硬膜外导管穿透蛛网膜下腔，并在X射线（红色箭头）的指导下保持漂浮在大蓄水池中。在穿刺点旁边皮下放置一个采样口，以便对完全清醒的动物的蓄水池脑脊液进行采样。缩写：脑脊液=脑脊液。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：猴子椅适应性训练。（二）横向;（C） rTMS 适应性训练/假刺激。缩写：rTMS = 重复经颅磁刺激。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：rTMS对恒河猴脑脊液中Aβ和tau水平的影响。 每个频率的五个条形代表五个时间点：rTMS 前、rTMS 后 0 小时、rTMS 后 2 小时、rTMS 后 6 小时和 rTMS 后 24 小时。（A）rTMS后猴脑脊液Aβ42水平的变化;（B）rTMS后猴脑脊液中Aβ42/Aβ40比值的变化;（三）rTMS刺激后猴脑脊液tTau水平的变化;（D）rTMS后猴脑脊液中pTau水平的变化。* 表示与 rTMS 之前的水平 p < 0.05 的显著差异。# 和 ▲ 分别表示与同一时间点的 1 Hz 或 20 Hz 电平的显著差异。p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** 表示 p < 0.0001。缩写：rTMS =重复经颅磁刺激;脑脊液=脑脊液;tTau = 总 Tau;pTau = 磷酸化的 Tau。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
Aβ1-42是AD的一种公认的生物标志物，是一种与大脑中Aβ代谢和淀粉样蛋白斑块形成相关的CSF核心生物标志物，已广泛应用于临床试验和临床26。最近的研究表明，CSF Aβ42 / Aβ40比率是AD的更好的诊断生物标志物，而不是单独的Aβ42，因为它是AD型病理学的更好指标27，28。Tau和pTau蛋白在神经退行过程中释放到细胞外空间，导致CSF20，29中的tau浓度增加。因此，CSF Aβ1-42、Aβ42/Aβ40、tTau 和 pTau 在修订后的 AD1，29 诊断标准中得到了证实并组合了 CSF 生物标志物。
本研究表明，在rTMS刺激后，脑脊液中的Aβ42 水平在所有频率下均呈上升趋势。高频rTMS（20 Hz和40 Hz）比低频更大程度地提高了Aβ42 水平。根据先前的研究30，31，脑脊液中低水平的Aβ42 与AD特异性神经变性（即海马萎缩）有关。然而，rTMS刺激后Aβ的增加逆转了AD的病理特征，表明rTMS可能使Aβ水平正常化。一项临床前研究表明，Aβ水平受神经元活动调节32。因此，与低频rTMS相比，高频rTMS可以通过激活神经网络活动来增加所有Aβ物质（包括Aβ42）的产生。此外，研究发现，在三个不同频率（1 Hz，20 Hz和40 Hz）下进行rTMS24小时后，pTau水平低于基线。这表明异常pTau蛋白的减少，减少了其与微管的结合并维持了神经元的正常结构。然而，在高频rTMS之后，CSF的tTau水平立即升高，并在24 h内逐渐下降。这种现象背后的机制尚不清楚。
本研究客观地证实了rTMS对脑脊液中Aβ和tau代谢的影响。与其他评估方法相比，脑脊液生物标志物可以反映大脑的新陈代谢和病理，为大脑提供窗口。该方法安全且耐受性良好，具有良好的临床适用性33，34。最常见的脑脊液采集技术是进行腰椎穿刺。然而，在短时间内多次采集脑脊液具有挑战性，因为反复硬膜穿刺存在中枢神经系统感染和脑脊液渗漏的风险35，36。
该协议使用一种新颖的CSF采样方法，允许在完全清醒的条件下重复进行CSF采样，并且具有较低上述不良事件的风险。采样口放置在皮肤下，以便猴子不能划伤端口。因此，脑脊液可以通过采样口直接采集，而不是通过腰椎穿刺采集。该方法方便快捷，避免了麻醉剂的影响16。因此，需要多个猴子脑脊液样本的研究人员可以考虑这种连续的蓄水池大脑脊液采样方法。为了避免中断rTMS的过程，猴子椅自适应训练和rTMS自适应训练在开始实验之前很重要。
尽管如此，即使在训练之后，猴子的头部在实验过程中仍然有很小的运动范围。因此，建议使用机器人辅助跟踪系统，以定位刺激点，并在头部移动时同时定位TMS线圈。这项研究有一些局限性：这里使用的动物是正常的猴子，而不是病理模型（如老年犬科动物37），样本量很小。然而，这项试点研究显示，rTMS后Aβ和tau水平发生了有趣的动态变化，表明rTMS对AD的潜在益处，值得进一步研究。
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Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
作者要感谢四川绿屋生物科技有限公司提供的猴子椅和其他相关设备。这项研究没有得到公共，商业或非营利部门任何资助机构的具体资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Puncture Kit for Single Use | Weigao, Shandong, China | ||
| CCY-I magnetic field stimulator | YIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China | ||
| GraphPad Prism version 7.0 | GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human Amyloid Beta and Tau Magnetic Bead Panel | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | liquid chip detection | |
| MILLIPLEX Analyst 5.1 | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA | ||
| Monkey Chair HH-E-1 | Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA | ||
| Zoletil 50 | Virbac, France | zolazepam–tiletamine |
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