Summary
Denne protokol beskriver et minigen reporter-assay for at overvåge virkningen af 5'-splejsningsstedsmutationer på splejsning og udvikler suppressor U1 snRNA til redning af mutationsinduceret splejsningshæmning. Reporter- og suppressoren U1 snRNA-konstruktioner udtrykkes i HeLa-celler, og splejsning analyseres ved primerudvidelse eller RT-PCR.
Abstract
Under genekspression involverer det vitale trin i præ-mRNA-splejsning nøjagtig genkendelse af splejsningssteder og effektiv samling af splejsosomale komplekser til at forbinde exons og fjerne introner inden cytoplasmatisk eksport af det modne mRNA. Splejsningseffektivitet kan ændres ved tilstedeværelsen af mutationer på splejsningssteder, indflydelsen af transvirkende splejsningsfaktorer eller aktiviteten af terapi. Her beskriver vi protokollen for et cellulært assay, der kan anvendes til overvågning af splejsningseffektiviteten af en given exon. Assayet bruger en tilpasningsdygtig plasmidkodet 3-exon/2-intron minigen reporter, som kan udtrykkes i pattedyrceller ved forbigående transfektion. Efter transfektion isoleres totalt cellulært RNA, og effektiviteten af exon-splejsning i reporter-mRNA'et bestemmes ved enten primerudvidelse eller semikvantitær omvendt transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR). Vi beskriver, hvordan virkningen af sygdomsrelaterede 5 ′ splejsningsstedsmutationer kan bestemmes ved at introducere dem i reporteren; og hvordan undertrykkelsen af disse mutationer kan opnås ved co-transfektion med U1 lille nukleart RNA (snRNA) konstruktion, der bærer kompenserende mutationer i sin 5 ′ region, der baseparer med 5 ′-splejsningsstederne ved exon-intron-kryds i præ-mRNA'er. Reporteren kan således bruges til design af terapeutiske U1-partikler for at forbedre genkendelsen af mutante 5′ splejsningssteder. Indsættelse af cis-virkende reguleringssteder, såsom splejsningsforstærker eller lyddæmpersekvenser, i indberetteren kan også bruges til at undersøge U1 snRNP's rolle i regulering formidlet af en specifik alternativ splejsningsfaktor. Endelig kan reporter, der udtrykker celler, inkuberes med små molekyler for at bestemme virkningen af potentielle terapier på konstitutiv præ-mRNA-splejsning eller på exoner, der bærer mutante 5 ′ splejsningssteder. Samlet set kan reporteranalysen anvendes til at overvåge splejsningseffektiviteten under en række forskellige forhold for at studere grundlæggende splejsningsmekanismer og splejsningsrelaterede sygdomme.
Introduction
Pre-mRNA-splejsning er et vigtigt behandlingstrin, der fjerner ikke-kodende introner og præcist ligerer kodende exoner til dannelse af modent mRNA. Genkendelse af konsensussekvenser ved exon-intron-kryds, kaldet 5′-splejsningssted og 3′-splejsningssted, ved hjælp af komponenter i splejsningsmaskineriet initierer splejsningsprocessen. U1 lille nukleart ribonukleoprotein (snRNP) genkender 5′-splejsningsstedet ved baseparring af U1-snRNA'et til præ-mRNA1. Genetisk arvelige mutationer, der ændrer 5′-splejsningsstedssekvenser, er forbundet med mange sygdomme2,3. Det forudsiges, at tabet af baseparring af U1 snRNA med de mutante 5′-splejsningssteder forårsager afvigende splejsning, hvilket kan kompromittere oversættelsen af det berørte transkript. En potentiel terapeutisk tilgang til at korrigere splejsningsdefekterne involverer undertrykkelse af mutationer ved modificeret U1-snRNA, der bærer kompenserende nukleotidændringer i dets 5′-region, der baseparer med 5′-splejsningsstedet. Sådanne modificerede U1-snRNA'er, også kaldet exonspecifikke U1-snRNA'er, har vist sig at være effektive til at vende splejsningsdefekter, hvilket resulterer i øget proteinekspression fra det reddede mRNA4,5,6,7,8.
Her beskriver vi U1 snRNP-komplementeringsassayet, et reporterbaseret cellulært splejsningsassay, der muliggør vurdering af effekten af 5′-ss-mutationer på splejsning af en exon og kan også bruges til udvikling af modificerede U1-snRNA'er for at muliggøre redning af exon-inklusion. Vi leverer også protokoller til overvågning af de splejsede reporterudskrifter ved primerudvidelse og RT-PCR og til bestemmelse af ekspressionen af modificerede U1-snRNA'er ved primerudvidelse og RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser og buffere
BEMÆRK: Al sterilisering ved hjælp af vakuumfiltre skal udføres med 0,2 μm polyethersulfon (PES) membran i et biosikkerhedsskab.
- Forbered RNase-frit vand ved at tilsætte 1,0 ml diethylpyrocarbonat (DEPC) til 1,0 liter deioniseret vand, bland i mindst 1 time ved stuetemperatur (RT), autoklave to gange og afkøl derefter til RT før brug.
- Forbered Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) ved at blande en pakke DMEM-pulver (13,4 g), 3,7 g natriumbicarbonat, 100 ml føtalt kvægserum (FBS), penicillin og streptomycin til ~ 800 ml sterilt deioniseret vand. Den endelige koncentration af penicillin og streptomycin i DMEM bør være henholdsvis 50 U/ml og 50 μg/ml. Juster pH til 7,4 og lav derefter volumenet til 1,0 L med sterilt deioniseret vand. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 10x fosfatbufret saltvand (10x PBS) ved tilsætning af 25,6 g dinatriumhydrogenheptahydrat (Na2HPO4· 7H2O), 2 g kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 2 g kaliumchlorid (KCl) og 80 g natriumchlorid (NaCl) til 800 ml deioniseret vand. Bland for at opløse og udgøre volumenet til 1,0 L. Steriliser ved filtrering og opbevar ved 4 °C.
- Forbered 0,5 M ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) ved at opløse 186,1 g Na2•EDTA•2H2O i ~800 ml deioniseret vand. Juster pH til 8,0, og opskru derefter for volumenet til 1,0 L med sterilt deioniseret vand. Steriliseres ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 1x trypsin-EDTA-opløsning ved at blande 100 ml 10x trypsin (2,5%), 2 ml 0,5 M EDTA, og tilsæt 1x PBS op til 1,0 L. Steriliser ved filtrering og alikvote i 50 ml koniske rør. Opbevares ved 4 °C i 1-2 uger eller fryses ved -20 °C til langvarig brug.
- Der fremstilles 2x formamid DNA/RNA-belastningsfarvestof ved at blande 14,4 ml formamid og 0,6 ml 0,5 M EDTA til et endeligt volumen på 15 ml. Der tilsættes bromphenolblåt og xylencyanolpulver til en endelig koncentration på 0,02 % og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Formamid er giftigt og ætsende. Læs sikkerhedsdatabladene for at få yderligere sikkerhedsanbefalinger. - Forbered 5x Tris / Borat / EDTA (5x TBE) buffer ved at blande 54,0 g tris base, 27,5 g borsyre og 20 ml 0,5 M EDTA i ~ 800 ml deioniseret vand. Bland for at opløse og udgøre volumenet til 1,0 L med deioniseret vand.
- Forbered urinstof-polyacrylamidgelelektroforese (urinstof-PAGE) opløsning ved at blande 200 ml 5x TBE, 250 ml 40% 19:1 bis/acrylamid og 450,5 g urinstof. Tilsæt derefter deioniseret vand op til 1,0 l. Bland, indtil ingredienserne er helt opløst, steriliser derefter ved filtrering og opbevar ved 4 °C i en ravfarvet glasflaske.
BEMÆRK: Bis/acrylamid er giftigt. Læs sikkerhedsdatabladene for at få yderligere sikkerhedsprocedurer. - 10 % ammoniumpersulfat (APS) fremstilles ved at opløse 1 g APS i 10 ml deioniseret vand og opbevares ved 4 °C.
2. Cotransfektion af HeLa-celler med reporteren og U1 snRNA-plasmider
BEMÆRK: Transfektionen af Hela-celler skal udføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhedsskab. Den ydre overflade af alle materialer skal sprøjtes med 70% ethanol, inden den indføres i det biologiske sikkerhedsskab.
- Oprethold Hela-celler i DMEM i en 37 °C-inkubator med 5 % CO2 ved at passere hver 2-3 dag, når cellerne er ca. 80-90 % sammenflydende.
- Til passaging HeLa-celler aspirerer det brugte medium og inkuberer derefter celler med 3 ml 0,25% trypsin indeholdende 1 mM EDTA ved 37 ° C i 3 minutter.
- Efter inkubation tilsættes 7 ml frisk DMEM. Overfør cellesuspensionen til et 10 ml rør, centrifuge ved 1.000 x g i 5 minutter.
- Resuspend cellepillen i 10 ml frisk DMEM, og tallerken derefter cellerne på en ny vævskulturskål ved 20% sammenløb.
- For forbigående transfektioner tælles Hela-celler med et rent hæmocytometerglide og forberedes en suspension med en densitet på 2,5 x 105 celler / ml.
- Frø 1,0 ml 2,5 x 105 celler/ml Hela-cellesuspension i hver brønd på en 12-brønds plade og inkuberes natten over ved 37 °C.
- Den næste dag aspirerer det brugte medium og tilsættes 0,8 ml frisk DMEM med serum.
- Opløsning I forberedes ved at tilsætte 0,2 μg Dup51- eller Dup51p-reporterplasmid, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 eller pNS6U1-5a-plasmid og 100 μL transfektionsmedium i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der fremstilles en masterblanding af opløsning II for alle prøver, der skal transfekteres, ved tilsætning af 100 μL transfektionsmedium og 4,0 μL transfektionsreagens pr. prøve.
- Transfektionsblandingen forberedes ved at tilsætte 100 μL opløsning II i hvert mikrocentrifugerør indeholdende opløsning I.
- Vortex transfektionen blandes i 15 s, centrifuge i en bordplade mikrocentrifuge ved 3.000 x g i 10 s ved RT og inkuberer derefter ved RT i 5 minutter.
- Tilsæt alle 200 μL af transfektionsblandingen i en brønd af HeLa-cellepladen med 12 brønde for at opnå et endeligt volumen på 1,0 ml pr. brønd og inkubere pladen ved 37 °C i 48 timer.
- Efter inkubation ekstraheres RNA fra de transfekterede HeLa-celler med kommercielt tilgængelig guanidinthiocyanat og phenolopløsning.
BEMÆRK: Dette reagens indeholder phenol, og dette trin skal udføres i en stinkhætte. Anvendelsen af DEPC-behandlet vand anbefales til resuspension af ekstraheret RNA.- Aspirer det brugte medium og tilsæt 500 μL af reagenset i hver brønd. Inkuber ved RT i 5 min.
- Homogeniser ved at pipettere op og ned. Overfør derefter opløsningen til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 100 μL chloroform og hvirvel i 15 s.
- Centrifuge ved 12.000 x g i 15 min ved RT.
- Overfør 200 μL af det RNA-holdige, øverste vandige lag til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 2 μg glykogen og 200 μL isopropanol til hver RNA-prøve. Bland ved at vende rørene.
- Opsaml RNA-bundfaldet ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre RNA-pelleten.
- Pelleten vaskes to gange ved at tilsætte 1,0 ml 70% ethanol, vende rørene og centrifugere som beskrevet i trin 2.13.7.
- Lufttør pillen i ~ 10-20 minutter ved RT og resuspend RNA i 10-20 μL RNase-frit vand.
- Bestem RNA-koncentration ved at måle absorbans ved 260 nm som beskrevet af Desjardins og Conklin9.
- Fortsæt med primerforlængelse eller opbevar RNA-prøver i -20 °C. Isoleret RNA kan opbevares ved -20 °C i 6-12 måneder.
3. 32P-mærkning af oligonukleotider
BEMÆRK: Trin, der involverer brug af 32P-ATP og 32P-mærkede oligonukleotider, skal udføres bag et akrylskjold af uddannede personer med godkendelse fra autoriserede institutionelle enheder. Protokollen beskrevet nedenfor kan bruges til mærkning af oligonukleotider, Dup3r og U17-26-R og markører til urinstof-PAGE. Brug af DEPC-behandlet vand anbefales til resuspension af oligonukleotider og størrelsesudelukkelsesperler.
- Til et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes oligonukleotid, T4 polynukleotidkinase (T4 PNK), T4 PNK-buffer og 32P-ATP som beskrevet i tabel 1. Tilsæt 32P-ATP sidst til blandingen; dette er vigtigt.
BEMÆRK: Til tilsætning af radioaktive opløsninger anbefales brug af filterspidser. - Inkuber i et vandbad ved 37 °C i 30 min.
- Mens mærkningsreaktionerne inkuberer, skal du suspendere størrelsesudelukkelsesperlerne med en 25 kDa molekylvægt afskåret ved forsigtigt hvirvel i ~ 10 s.
BEMÆRK: Størrelsesudelukkelsesperlerne skal fremstilles i henhold til producentens anvisninger og opbevares som en 50% suspension i 25% ethanol ved 4 ° C. - Forbered søjler ved at overføre 600 μL af de resuspenderede perler til en engangs minisøjle anbragt i et 1,5 ml opsamlingsrør og returnere perlebeholdningen til 4 °C.
- Centrifugering ved 2.000 x g i 1 min ved RT og kassér gennemstrømningen.
- Vask perlerne ved at tilsætte 300 μL RNase-frit vand til søjlen.
- Gentag trin 3.5. og 3.6. to gange og overfør miniskolonnen til et nyt 1,5 ml centrifugerør.
- Tilsæt kinasereaktionsblandingen til perlekolonnen med størrelsesudelukkelse og centrifugen ved 5000 x g i 1 min ved RT.
- Saml og gem strømmen igennem, som har det 32P-mærkede oligonukleotid, og kassér alle spidser og rør i en akrylaffaldskasse.
- Der tilsættes 20 μL RNase-frit vand for at fortynde 32P-mærket oligonukleotid til en endelig koncentration på 2,5 μM.
BEMÆRK: Fortynd de mærkede markører efter behov for at lægge på urinstof-PAGE geler. - Opbevar det mærkede oligonukleotid i en akrylmikrorørskasse ved -20 °C, eller fortsæt med primerforlængelsesanalysen.
4. Analyse af de splejsede reporterudskrifter ved primerudvidelse
BEMÆRK: Det anbefales at rengøre overflader og udstyr med et RNase-inaktiverende reagens inden brug.
- Tilsæt 2,0 μg RNA ekstraheret fra Hela-cellerne i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsæt RNase-frit vand for at udgøre volumenet til 6,55 μL.
- Master Mix I forberedes med de fortyndede 32P-Dup3r og dNTP'er som vist i tabel 2, og der tilsættes 0,9 μL af blandingen til hvert PCR-rør, der indeholder RNA-prøver.
- Inkuber rørene, først ved 65 °C i 5 minutter og derefter på is i 1 min.
- Forbered Master Mix II med 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase inhibitor og reverse transkriptase som vist i tabel 2.
- Tilsæt 2,55 μL af blandingen til hvert rør indeholdende RNA og Master Mix 1; det samlede volumen af reaktionen skal være 10 μL. Hold rørene ved RT i 10 minutter.
- Overfør rørene til et tørt bad eller en termisk cykturer og inkuber, først ved 50 °C i 60 minutter og derefter ved 70 °C i 15 minutter.
- Efter inkubation tilsættes 10 μL 2x formamid RNA-ilægningsfarvestof til hver prøve og opbevares i en akrylkasse ved -20 °C eller fortsættes med adskillelsen af fragmenter ved hjælp af urinstof-PAGE ved hjælp af en 14 cm lang gel og visualisering af gelbillede som beskrevet nedenfor i trin 8.
- Udfør densitometrisk scanning af gelbilledet med en billedanalysesoftware, og brug båndintensiteterne for inkluderede og sprungede produkter til at beregne procentdelen af exon 2-inklusion som vist nedenfor.
5. Analyse af de splejsede reportertranskripter ved hjælp af fluorescerende RT-PCR
BEMÆRK: RT-PCR-analysen beskrevet nedenfor bruger tilfældige hexamere til cDNA-syntese og en kombination af umærkede Dup8f- og Cy5-mærkede Dup3r-oligonukleotider til PCR-forstærkning af de splejsede produkter.
- Til cDNA-syntese tilsættes 2,0 μg RNA ekstraheret fra de transfekterede Hela-celler i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsættes RNase-frit vand for at udgøre volumenet til 11,0 μL.
- Master Mix I, der indeholder tilfældige hexamere og dNTP som vist i tabel 3 , forberedes, og der tilsættes 2,0 μL af blandingen til hver prøve. Inkuber, først ved 65 °C i 5 minutter og derefter på is i 1 min.
- Forbered Master Mix II, der indeholder First Streng Buffer, RNase-hæmmer, DTT og omvendt transkriptase som vist i tabel 3 , og tilsæt 7,0 μL af blandingen til hvert rør, der indeholder RNA og Master Mix I.
- Hold rørene ved RT i 10 minutter, og inkuber derefter ved 50 °C i 60 min og 70 °C i 15 min.
BEMÆRK: Afsluttede cDNA-reaktioner kan opbevares ved -20 °C. - For PCR overføres 1,0 μL (100 ng/μL) af hver cDNA-prøve til nye PCR-rør.
- Der fremstilles en masterblanding bestående af Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTP'er, Taq-buffer, Taq-polymerase og vand som beskrevet i tabel 4 , og der tilsættes 11,5 μL af blandingen til hvert rør, der indeholder cDNA.
- Udfør PCR ved hjælp af en termisk cyktur med et indledende denatureringstrin ved 94 ° C i 3 minutter; efterfulgt af 20 cyklusser med denaturering (94 °C i 30 s), udglødning (65 °C i 30 s) og forlængelse (72 °C i 15 s) og et afslutningstrin ved 72 °C i 5 minutter.
- Tilsæt 12,5 μL 2x formamid DNA-lastningsfarvestof til hvert rør og opvarm ved 95 °C i 5 minutter.
- PCR-reaktionen opbevares ved -20 °C, eller fortsæt med urinstof-PAGE som beskrevet nedenfor i trin 8.1-8.4.
- Efter elektroforese skal du fjerne glaspladerne fra elektroforeseapparatet og scanne ved hjælp af et fluorescensbillede for at visualisere gelen.
- Udfør densitometrisk scanning af gelbilledet, og brug båndintensiteten af de medfølgende og de oversprungne produkter til at beregne procentdelen af exon 2-inklusion som beskrevet i trin 4.8.
6. Analyse af variant U1 snRNA-ekspression ved primerudvidelse
- Tilsæt 2,0 μg RNA ekstraheret fra Hela-cellerne i separate 200 μL mikrocentrifugerør og tilsæt RNase-frit vand for at udgøre volumenet til 4,325 μL og tilsæt derefter dATP, som vist i tabel 5.
- Tilsæt 10.000 CPM af 32P-U17-26-R oligonukleotid til hvert rør.
BEMÆRK: For at fremstille en 10.000 cpm/μL opløsning af 32P-U17-26-R (fra trin 3) fortyndes det mærkede oligonukleotid (1:20 fortynding), bestemmes cpm i 1,0 μL ved hjælp af en scintillationstæller, og fortyndes yderligere med deioniseret vand for at fremstille en opløsning på 10.000 cpm/μL i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Inkuber ved 65 °C i 5 min, og derefter på is i 1 min.
- Der fremstilles en masterblanding med 5x First Strand Buffer, RNase-hæmmer, DTT og reverse transcriptase som vist i tabel 5 , og der tilsættes 1,8 μL af blandingen til hver prøve.
- Inkuber, først ved RT i 10 minutter og derefter ved 42 °C i 10 minutter.
- Efter inkubation tilsættes 10 μL 2x formamid-RNA, der lægger farvestof i hver prøve og opbevares i en akrylkasse ved -20 °C, eller fortsættes med adskillelse af fragmenter med urinstof-PAGE ved hjælp af en 38 cm lang gel (se trin 8).
7. Analyse af variant U1 snRNA-ekspression ved RT-qPCR
- CDNA-stamen, der er fremstillet som beskrevet ovenfor i trin 5.1-5.4, fortyndes til en koncentration på 0,2 ng/μL.
- Pipette 5,0 μL fortyndet cDNA i individuelle brønde af en 96-brønds qPCR-plade i tre eksemplarer. Tilsæt deioniseret vand i stedet for cDNA til NTC (no-template control).
- Der forberedes to separate primerblandinger bestående af de fremadrettede og omvendte primere til U1- og U2-snRNA'er og vand som vist i tabel 6.
BEMÆRK: Sekvenser for U1- og U2-snRNA-specifikke primere er angivet i tabel 7. - Tilsæt 5,0 μL af U1- og U2-snRNA-grundblandingen til prøve- og NTC-brøndene.
- Tilsæt 10,0 μL PCR-blanding i realtid til hver brønd.
- Forsegl pladerne med en optisk film, og centrifuger derefter ved 1.000 x g i 2 minutter ved RT for at opsamle reaktionerne på bunden af brøndene.
- Udfør qPCR med et indledende denatureringstrin ved 95 °C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser af en 2-trins protokol bestående af denaturering (95 °C i 15 s) og udglødning/forlængelse (62 °C i 60 s), mens tærskelkvantificeringscyklusværdierne (Cq) for målampliconer indsamles.
- Afslut qPCR-reaktionen ved at kontrollere for en enkelt top i dissociationskurven for U1- og U2-snRNA-reaktioner.
- Fra Cq-værdierne beregnes delta Cq (ΔCq) for U1- og U2-snRNA'er sammenlignet med pcDNA-kontrollen.
- Bestem variant U1 snRNA-ekspression som relativ mængde (RQ) af U1 sammenlignet med U2 ved hjælp af ΔΔCq-værdien som vist nedenfor for alle prøver.
8. Opsætning og kørsel af Urea-PAGE geler
BEMÆRK: Samling af glasplader og gelløbeapparatet skal udføres i henhold til producentens anvisninger. Støbningen af 10% urinstof-PAGE gelen kan udføres i henhold til en tidligere beskrevet protokol af Summer et al.10. Trin, der involverer fremstilling af markører og prøver og af løb og visualisering af geler, er beskrevet nedenfor. For at forhindre, at gelen klæber til glasplader, kan den indre overflade eventuelt overtrækkes med silikoneopløsning ved at tilsætte 1 ml af opløsningen på overfladen og jævnt sprede sig over hele overfladen med væv. Når de er tørre, skal pladerne vaskes med deioniseret vand og tørres igen.
FORSIGTIG: Ikke-polymeriseret acrylamid er neurotoksisk og skal håndteres med beskyttelse, der anbefales i materialesikkerhedsdatabladet.
- Primerforlængelsesprøverne og markørerne forberedes ved opvarmning ved 95 °C i 5 minutter og derefter centrifugeres i en bordmikrocentrifuge ved 3.000 x g i 5 s ved RT.
- Inden du lægger markørerne og prøverne i, skylles brøndene ud med 1x TBE-buffer for at fjerne det bundfældede urinstof.
- Læg 10 μL/prøve/brønd, og kør gelen ved 300-500V i 2-3 timer, eller indtil xylencyanolen når bunden.
BEMÆRK: Ca. 1.000 cpm af den 32P-mærkede markør kan indlæses. - Efter elektroforese skal du fjerne glaspladerne fra elektroforeseapparatet.
- Adskil forsigtigt de to plader, så gelen ligger fladt på begge glasoverflader, og overfør gelen til et filterpapir og dæk den med plastfolie.
- Vakuumtør gelen på filterpapiret ved 80 °C i 30 minutter ved hjælp af en geltørrer.
- Læg den tørrede gel i en fosforbilledkassette og opbevar den ved RT natten over.
BEMÆRK: Fosforskærmen skal slettes ved hjælp af en lysboks inden brug. - For at visualisere gelbilledet skal du fjerne skærmen og scanne ved hjælp af et fosforbillede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Splejsningsreporteren Dup51, et tre exon-to intron minigen, blev afledt af det humane β-globin-gen og er tidligere beskrevet (figur 1A) 11,12 . Vi skabte en mutant reporter, Dup51p, ved at introducere Usher syndrom associerede 5'-splejsningssted mutationer, der forekommer i exon 3 af protocadherin 15 (PCDH15) genet13. 5'-splejsningsstedssekvensen ved exon 2-intron 2-krydset blev ændret fra CAG/GUUGGUAUC til AUG/GUGUGUAUC (/ er exon-intron-grænsen) (figur 1B)14. Disse sekvensændringer ændrer det forudsagte mønster af 5'-splejsningssted baseparring med det endogene U1 snRNA og resulterer også i springning af exon 2 i det modne transkript (figur 2). Effekten af disse mutationer kunne undertrykkes ved en kompenserende ændring i 5'-regionen af U1-snRNA'et. Substitution af uracil med adenin i 5. position af U1-snRNA (U1-5a) vendte effekten af 5'-splejsningsstedsmutationer i Dup51p (figur 1B).
Splejsningen af Dup51- og Dup51p-transkripterne kan overvåges ved primerudvidelse ved hjælp af 32P-Dup3r eller ved semikvantitær RT-PCR ved anvendelse af Dup8f- og Dup3r-oligonukleotider (figur 1); sekvenser er angivet i tabel 7. Når det udtrykkes i HeLa-celler, udtrykker Dup51-minigenet det modne transkript i fuld længde, hvor exon 2 splejses effektivt ind (figur 2A, B, bane 1). 5'-splejsningsstedsmutationerne i Dup51p reducerer exon 2-inklusion fra ~ 95% til ~ 30%, hvilket fører til dannelsen af det kortere transkript (bane 5). Coexpression af Dup51p med U1-5a snRNA redder exon 2 splejsning og genopretter dannelsen af transkript i fuld længde (bane 8). Coexpression med vildtype U1 (U1-WT) eller U1-5g variant har ikke en lignende effekt på Dup51p splejsning (bane 6 og 7). U1-WT, U1-5g eller U1-5a coexpression ændrer heller ikke Dup51-reporterens splejsningsmønster (bane 2-4). Samlet set indikerer disse resultater, at redningen af exon 2-splejsning i Dup51p-transkripter specifikt skyldes U>A-mutationen i U1-5a-snRNA'et.
For at overvåge ekspressionen af transfekterede U1 snRNA'er kan primerudvidelse eller RT-qPCR anvendes. Påvisning af U1-5a-varianttranskripter ved primerudvidelse bruger U17-26-oligonukleotid, som er 20 nukleotider lange og basepar nær adeninen i 5. position af U1-snRNA (figur 3A). I nærvær af dATP alene tillader U17-26 inkorporering af 2-3 nukleotider til det endogene vildtype U1-snRNA, der giver 22 eller 23 nukleotider langt produkt (figur 3B, bane 1, 2, 5 og 6). For U1-5a- og U1-5g-varianterne ophører forlængelsen efter tilsætning af et enkelt adenosin, der producerer et 21 nukleotider langt produkt (bane 3, 4, 7 og 8). Analyse ved RT-qPCR muliggør estimering af foldforøgelse i ekspression af varianten U1 over det endogene vildtype snRNA. Her er U1-specifikke primerpar designet således, at der ikke er nogen overlapning med de mutationer, der indføres i varianten snRNAs (figur 3A). Efter normalisering til U2 snRNA-ekspression viste det sig, at den transfekterede U1-WT og U1-5g- og U1-5a-varianterne blev udtrykt ved 3-5 gange over det endogene snRNA (figur 3C). Endogen U1 anslås at være til stede ved 106 kopier pr. celle i HeLa-celler15. Således udtrykkes den eksogene variant snRNA'er ved ~3-5 fold over den endogene U1. U1-5a snRNA's evne til at redde exon 2-inklusion til ~ 95% viser, at niveauerne af den eksogene variant snRNA'er er tilstrækkelige til splejsning af de spirende reportertranskripter.
| Ingredienser | Beløb for én reaktion |
| PNK-buffer (10x) | 2,0 μL |
| T4 Polynukleotidkinase (T4 PNK) (10.000 U/ml) | 1,0 μL |
| Oligonukleotid* (10 μM) | 10,0 μL |
| 32 P-ATP (10 mM) | 1,0 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 6,0 μL |
| *Til mærkningsmarkører anvendes 0,5 μL af pBR322 DNA-MspI Digest eller Low Molecular Weight Marker. | |
Tabel 1: 32P-mærkning af oligonukleotider. Reaktion til fremstilling af en 5′-32P-mærket primer under anvendelse af 32P-ATP.
| Ingredienser - Master Mix I | Beløb for én reaktion |
| RNA og H2O (DEPC behandlet) | 6,55 μL |
| 32 P-Dup3r (2,5 μM) | 0,4 μL |
| dNTP (10 mM) | 0,5 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Beløb for én reaktion |
| First-Streng Buffer (5x) | 2,00 μL |
| RNasehæmmer (40 U/μL) | 0,25 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,05 μL |
| Omvendt transkriptase (RT) (200U/μL) | 0,25 μL |
Tabel 2: 32P-Dup3r primer udvidelse. Reaktion til analyse af splejsede reporterudskrifter ved primerudvidelse.
| Ingredienser - Master Mix I | Beløb for én reaktion |
| RNA og ddH2O (DEPC behandlet) | 11,0 μL |
| Tilfældig hexamer (50 ng / μL) | 1,0 μL |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL |
| Ingredienser – Master Mix II | Beløb for én reaktion |
| First-Streng Buffer (5x) | 4,0 μL |
| RNasehæmmer (40 U/μL) | 1,0 μL |
| DTT (0,1 M) | 1,0 μL |
| Omvendt transkriptase (RT) (200U/μL) | 1,0 μL |
Tabel 3: cDNA-syntese. Reaktion til syntese af cDNA fra total RNA.
| Ingredienser | Beløb for én reaktion |
| cDNA-skabelon (100 ng/μL) | 1,00 μL |
| Fremadrettet primer (Dup8f) (10 μM) | 0,25 μL |
| Cy5 omvendt primer (Cy5-Dup3r) (10 μM) | 0,25 μL |
| dNTP (10 μM) | 0,25 μL |
| Taq Buffer (10x) | 1,25 μL |
| Taq DNA-polymerase (5000 U/ml) | 0,25 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 9,25 μL |
Tabel 4: Fluorescerende RT-PCR. Reaktion til analyse af de splejsede reportertranskripter af RT-PCR ved hjælp af Cy5-mærket primer.
| Ingredienser | Beløb for én reaktion |
| RNA og H2O (DEPC behandlet) | 4.325 μL |
| dATP (10 mM) | 0,375 μL |
| 32 P-U17-26-R oligonukleotid* | 1.000 μL |
| Ingredienser – Master Mix | Beløb for én reaktion |
| First-Streng Buffer (5x) | 1,5 μL |
| RNasehæmmer (40 U/μL) | 0,1 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,1 μL |
| Omvendt transkriptase (RT) (200U/μL) | 0,1 μL |
| *10.000 CPM af 32P-U17-26-R oligonukleotid bør tilsættes til det fortyndede RNA (trin 6.2.). | |
Tabel 5: 32P-U1-snRNA primer udvidelse. Reaktion til analyse af variant U1 snRNA-ekspression ved primerudvidelse.
| Ingredienser | Beløb for én reaktion |
| PCR-blanding i realtid | 10,0 μL |
| cDNA (0,2 ng/μL) | 5,0 μL |
| Fremadrettet primer (10 μM) | 0,2 μL |
| Omvendt primer (10 μM) | 0,2 μL |
| H2O (DEPC behandlet) | 4,6 μL |
Tabel 6: Kvantitativ RT-qPCR. Reaktioner til kvantitativ analyse af variant U1 snRNA-ekspression ved RT-qPCR.
| Oligo navn | Sekvens (5′ til 3′) | Teknik |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | Fluorescerende RT-PCR |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Fluorescerende RT-PCR |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Primer udvidelse |
| U17-26R | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Primer udvidelse |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80R | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84R | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
Tabel 7: Sekvens af oligonukleotider primere. Liste over grundnavne, sekvenser og den teknik, primerne blev brugt til.
Figur 1: Dup51 og Dup51p Minigene Reporters. (A) Skematisk repræsentation af de tre-exon/to-intron minigene journalister, Dup51 og Dup51p. Placeringer af Dup8f og Dup3r i henholdsvis exons 1 og 3 er angivet. (B) Forudsagt baseparring af vildtype U1-snRNA'et og U1-5a-varianten med 5'-splejsningsstedssekvenserne af Dup51- og Dup51p-reportertranskripterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af splejsede reporterudskrifter. HeLa-celler blev cotransfekterede med Dup51- eller Dup51p-minigenplasmiderne og pcDNA-kontrol eller pNS6U1-plasmider for U1-WT, U1-5g eller U1-5a snRNA'er. (A) Primerudvidelsesanalyse med 32P-mærket Dup3r-primer, der demonstrerer splejsning af Minigen-transkripterne Dup51 og Dup51p. MRNA-produkterne er angivet til venstre for gelbilledet. Procentdelen af produktet i fuld længde (± s.d., n = 3) blev beregnet ud fra båndintensiteter af de to mRNA-isoformer og er repræsenteret i graferne nedenfor. (B) RT-PCR-analyse med Dup8f- og Cy5-Dup3r-primere på cDNA fremstillet ud fra totalt RNA ekstraheret fra HeLa-celler, der demonstrerer splejsning af Dup51- eller Dup51p-minigentranskripterne. MRNA-produkterne er angivet til venstre for gelbilledet. Procentdelen af produktet i fuld længde (± s.d., n = 3) blev beregnet ud fra båndintensiteter af de to mRNA-isoformer og er repræsenteret i graferne nedenfor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse af varianten U1-5a snRNA. HeLa-celler blev cotransfekterede med Dup51- eller Dup51p-minigenplasmiderne og pcDNA-kontrol eller pNS6U1-plasmider for U1-WT, U1-5g eller U1-5a snRNA'er. (A) En todimensionel repræsentation af U1-snRNA-sekvensen. Positionen af U17-26R-primeren, der anvendes til primerforlængelsesanalyse af U1-snRNA, er angivet med den røde linje. Positionen af U1/17-39F og U1/58-80R primere, der anvendes til RT-qPCR af U1 snRNA, er angivet med de blå linjer. (B) Primerudvidelsesanalyse med 32P-mærket U17-26 til påvisning af ekspressionen af vildtype U1-snRNA'et og U1-5g- og U1-5a-varianterne. Positioner af produkterne dannet af U1-WT og varianterne snRNA'er er angivet. (C) RT-qPCR-analyse af niveauerne af U1-snRNA-ekspression i Hela-celler. Foldændringen i U1-snRNA-ekspression blev beregnet i forhold til den pcDNA-negative kontrol og normaliseret til U2-snRNA, foldændring (± s.d.; n = 3) i U1 er graferet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assayet kan tilpasses til splejsningsanalyse i andre cellelinjer end HeLa, men faktorer, der påvirker transfektionseffektiviteten, såsom cellesammenløb og mængde DNA, skal muligvis optimeres. Forholdet mellem reporter og U1-konstruktion er en anden kritisk parameter, der muligvis skal bestemmes afhængigt af de ekspressionsniveauer, der observeres i andre celletyper. Kvaliteten af ekstraheret RNA er kritisk for splejsningsanalyse; Derfor anbefales det stærkt at anvende RNase-frit vand og dekontaminering af overflader med RNase-inaktiverende midler.
Analyse af reportertranskripter ved enten primerudvidelse eller fluorescerende RT-PCR giver lignende resultater, hvorfor begge teknikker kan anvendes til overvågning af ændringer i inkluderingen af exon 2 i det modne transkript. Den fluorescerende PCR-reaktion skal stoppes og kvantificeres i den eksponentielle fase af amplifikation, som er afhængig af den indledende RNA-koncentration. Det kan således være en god betingelse for antallet af forstærkningscyklusser, at der skal bestemmes for assays med andre transfektionsbetingelser end dem, der er beskrevet her. Brugervenligheden på grund af den ikke-radioaktive natur er en fordel ved RT-PCR-analysen. Selvom primerforlængelse med radioaktivt mærket primer kræver ekstra sikkerhedsforanstaltninger, kan den detektere signaler fra en lav mængde RNA. Den lave gennemstrømning af primerforlængelse og RT-PCR er en begrænsning af dette assay.
U1 snRNP-komplementeringsassayet er blevet anvendt til flere formål. Ud over at vende virkningerne af 5'-splejsningsstedsmutationer er U1-snRA'er, der bærer ændringer i 5'-regionen, blevet anvendt til genhæmning og til undersøgelse af splejsningsmekanismer. Fortes et al. viste, at målretning af U1-snRNA'er til terminale exons af endogene transkripter effektivt kan hæmme genekspression16. Roca et al. brugte U1-komplementeringen til at studere de ikke-kanoniske mekanismer for 5'-splejsningsstedsgenkendelse og viste, at U1-snRNA'et kan baseparre til 5'-splejsningssteder i et alternativt register, hvor baseparring forskydes af et nukleotid og også i "bulgeregistre", hvor udbulede nukleotider er til stede i enten præ-mRNA eller snRNA17, 18. Dette reportersystem kan potentielt bruges til at studere U1 snRNP's rolle i splejsning af modulering af små molekyler og splejsning af regulatoriske proteiner. Ved at erstatte exon 2 af Dup51p med et målekson kan assayet anvendes til at undersøge virkningsmekanismen for små molekyler, der vides at forbedre eller undertrykke splejsning af specifikke exoner, som i tilfælde af splejsningskoblingsforbindelser19. Ved at indarbejde reguleringssekvenser for alternative splejsningsfaktorer i exons eller introner bør det være muligt at undersøge U1-afhængigheden i splejsningsreguleringen. Dette koncept blev anvendt af Hamid et al. for at demonstrere inddragelsen af stamme-loop 4 af U1-snRNA'et i splejsningsregulering af polypyrimidinkanalbindende protein 120. Vi har brugt dette assay til at studere funktionerne af stamme-loops 3 og 4 af U1 snRNA. Ved at inkorporere mutationer i stamme-loopet af suppressoren U1-5a snRNA, der aktiverer et mutant 5'splice-sted i Dup51p splejsningsreporteren, har vi identificeret deres kritiske roller i dannelsen af cross intron-kontakter med det U2 snRNP-specifikke protein SF3A1 i de tidlige trin af splejsningssamling14,21. Således fungerer den tre-exon to-intron Dup51-reporter som et adaptivt værktøj til overvågning af splejsningseffektivitet i undersøgelser af mekanismer, der ligger til grund for splejsningssamling og splejsningsrelateret sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler til SS fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) og til SS og W.M. fra Valley Research Partnership Program (P1-4009 og VRP77). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
