Summary
दशकों से संरचनात्मक अध्ययनों के लिए दो आयामी (2डी) प्रोटीन क्रिस्टल बनाने के लिए लिपिड मोनोलेयर का उपयोग एक नींव के रूप में किया गया है। वे एयर-वॉटर इंटरफेस पर स्थिर हैं और इलेक्ट्रॉन इमेजिंग के लिए एक पतली सहायक सामग्री के रूप में काम कर सकते हैं। यहां हम जैविक अध्ययन के लिए लिपिड मोनोलेयर तैयार करने पर सिद्ध कदम प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। घुलनशील या झिल्ली प्रोटीन जैसे मैक्रोमॉलिक्यूल्स को अनुकूल परिस्थितियों में अत्यधिक आदेशित दो-आयामी (2डी) क्रिस्टल में उगाया जा सकता है। उगाए गए 2डी क्रिस्टल की गुणवत्ता 2डी इमेज प्रोसेसिंग के माध्यम से अंतिम पुनर्निर्माण के समाधान के लिए महत्वपूर्ण है। इन वर्षों में, लिपिड मोनोलेयर का उपयोग परिधीय झिल्ली प्रोटीन के साथ-साथ घुलनशील प्रोटीन के 2डी क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक परत के रूप में किया गया है। इस विधि को अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के 2डी क्रिस्टलीकरण पर भी लागू किया जा सकता है लेकिन मोनोलेयर को विभाजन को बढ़ावा देने के लिए डिटर्जेंट और डायलिसिस की स्थिति निर्धारित करने के लिए अधिक व्यापक अनुभवजन्य जांच की आवश्यकता होती है। हवा-पानी इंटरफेस पर एक लिपिड मोनोलेयर रूपों जैसे कि ध्रुवीय लिपिड सिर समूह जलीय चरण में हाइड्रेटेड रहते हैं और गैर-ध्रुवीय, एसील चेन, हवा में पूंछ विभाजन, सतह तनाव को तोड़ते हैं और पानी की सतह को सपाट करते हैं। हेड ग्रुप्स की आवेशित प्रकृति या विशिष्ट रासायनिक मोइटीज समाधान में प्रोटीन के लिए आत्मीयता प्रदान करते हैं, 2डी सरणी गठन के लिए बाध्यकारी को बढ़ावा देते हैं। 2डी सरणी के साथ एक नवगठित मोनोलेयर को क्रिस्टलीय सरणी को उठाने और समर्थन देने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है। इस काम में, हम क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक (क्रायो-ईएम) इमेजिंग के लिए एक लिपिड मोनोलेयर पद्धति का वर्णन करते हैं।
Introduction
प्रोटीन के 2डी क्रिस्टल या पेचिक सरणी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन विवर्तन अनुकूल मामलों में उप-नैनोमीटर संकल्प प्राप्त कर सकता है1,2,3. विशेष रुचि के अपने निकट देशी वातावरण में 2डी झिल्ली प्रोटीन सरणी या क्रिस्टल का पुनर्गठन कर रहे हैं1. क्योंकि एक क्रिस्टल विशिष्ट स्थानिक आवृत्तियों पर संरचनात्मक कारकों की तीव्रता को बढ़ाने के संकेत एम्पलीफायर के रूप में कार्य करता है, इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी एकल कण क्रायो-ईएम के लिए उन लोगों की तुलना में उच्च संकल्पों, जैसे छोटे अणुओं पर एक छोटे आकार के साथ एक लक्ष्य की जांच करने की अनुमति देता है। इलेक्ट्रॉन बीम को प्रोटीन की एक आदेशित 2डी सरणी द्वारा डिफ्रैक्ट किया जा सकता है, जो डिटेक्टर4पर छवि विमान के आधार पर एक विवर्तन पैटर्न या जाली छवि उत्पन्न करता है। इसके बाद डिफ्रेक्ट की गई तीव्रता को निकाला जा सकता है और क्रिस्टल की 2डी प्रक्षेपण संरचना को पुनर्निर्मित करने के लिए संसाधित किया जा सकता है। इलेक्ट्रॉनों में एक्स-रे की तुलना में एक बड़ा बिखरने वाला क्रॉस-सेक्शन होता है और इसका बिखराव ज्यादातर अणु5में इलेक्ट्रॉनों और आवेशित परमाणुओं के बीच कूलोम इंटरैक्शन के आधार पर रदरफोर्ड मॉडल का अनुसरण करता है । 2डी झिल्ली क्रिस्टल की मोटाई आमतौर पर 100 एनएम से कम होती है, जो नमूना6के भीतर होने वाले गतिशील बिखरने के बिना इलेक्ट्रॉन संचरण के लिए उपयुक्त होती है। इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलीय अध्ययनों को झिल्ली प्रोटीन और लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन 7 ,8,9,10, 11, 12, 13, 14,15,16,17की उच्च-संकल्प संरचनात्मक जानकारी की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में दिखाया गया है।
एक लिपिड मोनोलेयर एक एकल लिपिड परत है जो एयर-वॉटर इंटरफेस6पर घने पैक किए गए फॉस्फोलिपिड से बना होता है, जो घुलनशील प्रोटीन या परिधीय झिल्ली प्रोटीन18के लिए 2D सरणी गठन में सहायता कर सकता है। लिपिड के घनत्व और उनके पार्श्व दबाव के आधार पर, लिपिड अणु हवा-पानी के इंटरफ़ेस पर एक आदेशित 2डी सरणी बना सकते हैं, जिसमें उनकी एसील चेन हवा में फैली हुई और जलीयसमाधान1,6,19में उजागर हाइड्रोफिलिक हेडग्रुप्स हो सकते हैं। लिपिड हेडग्रुप इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकता है या एक विशिष्ट प्रोटीन डोमेन को बांधने के लिए एक आत्मीयता टैग प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कुत्तों-एनटीए-नी (1,2-डाइलियोल-एसएन-ग्लिसेरो-3-[(एन-(5-अमीनो-1-कार्बोक्सीपेन्टाइल) इमिनो डायेमेटिक एसिड) succinyl]2-Ni 2 +)का उपयोग अक्सर एक लिपिड मोनोलेयर बनाने में किया जाता है ताकि प्रोटीन को पॉली-हिस्टिडीन टैग20,21,222के साथ बांधा जा सके । इसके अलावा, हैजा टॉक्सिन बी23, 24के लिए लिपिड मोनोलेयर में गैंगलियोसाइड जीएम1 के एक विशेष पेंटासैचराइड को बांध सकता है। लिपिड हेडग्रुप पर प्रोटीन को एंकर करके, लिपिड मोनोलेयर 2डी सरणी के गठन में सहायता कर सकता है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलीय अध्ययनों के लिए पतले हैं। प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी में लिपिड मोनोलेयर तकनीक का उपयोग किया गया है, जैसे स्ट्रेप्टाविडिन2,25,एनेक्सिन वी26,हैजा टॉक्सिन27, ई कोलाई जायरास बी सबयूनिट28, ई कोलाई आरएनए पॉलीमरेज25,29,30,कार्क्सीसोम शेल प्रोटीन31 और एचआईवी-132 और मोलोनी मुरीन ल्यूकेमिया वायरस के कैप्सिड प्रोटीन 33लिपिड मोनोलेयर की स्थिरता और रासायनिक संपत्ति के कारण, क्रायो-ईएम इमेजिंग34के लिए नमूना तैयार करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों का पता लगाया गया है। हालांकि, प्रोटीन सरणी गठन के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी।
यहां, हम क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए लिपिड मोनोलेयर की सामान्य तैयारी और कुछ विचारों का व्यापक विवरण प्रदान करते हैं जो गठित मोनोलेयर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं।
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Protocol
1. टेफ्लॉन ब्लॉक तैयारी
- रासायनिक प्रतिरोधी पीटीएफई (पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन) राल से टेफ्लॉन ब्लॉक तैयार करें। एक सामान्य ड्रिल का उपयोग करके ब्लॉक पर छेद करें जिसके बाद चित्र 1में लेबल किए गए आयाम हैं।
2. मोनोलेयर लिपिड तैयारी
नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 30-45 मिनट
- लिपिड स्टॉक तैयारी
- 9:1 (v/v) क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल में 0.01 मिलीग्राम/एमएल लिपिड मिश्रण तैयार करें जिसमें क्लोरोफॉर्म का 8.91 एमएल, मेथनॉल का 0.99 एमएल और 10 मिलीग्राम/एमएल लिपिड का 0.01 एमएल का उपयोग करके।
- टेफ्लॉन प्लेट तैयार करना
- 5 मिनट के लिए मेथनॉल स्नान में एक टेफ्लॉन प्लेट को सोनिकेट करें।
- गर्म पानी से 15 मिनट तक धोएं।
- आसुत पानी से कुल्ला।
- टेफ्लॉन प्लेट को 30 मिनट के लिए एक डेसीकेटर में सुखा लें और उपयोग में न आने पर इसे वैक्यूम के नीचे रखें(चित्रा 1)।
3. बफर जलाशय पर लिपिड मोनोलेयर का गठन
नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 1.5 घंटे
- प्रयोग के दिन क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल के 9:1 मिश्रण में 0.01 मिलीग्राम/एमएल का लिपिड मिश्रण ताजा तैयार करें।
- पेट्री डिश में टाइप-1 फिल्टर पेपर रखें और फिल्टर पेपर के ऊपर टेफ्लॉन ब्लॉक की व्यवस्था करें।
- बफर के 60 माइक्रोन के साथ टेफ्लॉन प्लेट के कुओं को भरें।
- ध्यान से एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर ड्रॉप द्वारा ड्रॉप (आदर्श 1 μL प्रति बूंद) द्वारा बफर सतह ड्रॉप के शीर्ष पर लिपिड मिश्रण जोड़ें ।
- पेट्री डिश में आर्द्रता रखने के लिए डिस्टल्ड पानी के साथ फिल्टर पेपर गीला करें।
- 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। क्लोरोफॉर्म वाष्पित होना चाहिए, और बफर की सतह पर लिपिड का एक मोनोलेयर बनाया जाना चाहिए।
4. लिपिड मोनोलेयर पर ईएम ग्रिड का आवेदन
नोट: अनुमानित ऑपरेटिंग समय: 1.5 घंटे
- धीरे-धीरे प्रत्येक बफर जलाशय के शीर्ष पर चमक-निर्वहन, कार्बन साइड डाउन के बिना एक होले कार्बन-लेपित ईएम ग्रिड रखें।
- ध्यान से साइड इंजेक्शन में प्रोटीन अच्छी तरह से इंजेक्ट करें। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रोटीन के 1 माइक्रोन के आसपास अच्छी तरह से अंतिम प्रोटीन सांद्रता का प्रयोग करें। प्रयोग से पहले प्रोटीन एकाग्रता को पूर्व-अनुकूलित करें।
- कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- धीरे-धीरे साइड इंजेक्शन पोर्ट में बफर के लगभग 20-30 माइक्रोन इंजेक्ट करें। यह ग्रिड को टेफ्लॉन ब्लॉक की सतह से ऊपर उठ जाएगा।
- तुरंत एक चिमटी के साथ ग्रिड उठाओ और यह बूंद से खड़ी उठा ।
- नकारात्मक धुंधला या क्रायो-टेम इमेजिंग(चित्रा 2)के लिए मोनोलेयर नमूने तैयार करें। यदि प्रोटीन 2D सरणी बनाते हैं, तो छवि शक्ति स्पेक्ट्रम या फोरियर पीरियोग्राम क्रिस्टल समरूपता के आधार पर स्थानिक आवृत्तियों पर विवर्तन तीव्रता दिखाएगा। यदि पावर स्पेक्ट्रम में कोई विवर्तन स्पॉट नहीं दिखाया जाता है, तो प्रोटीन 2डी क्रिस्टल बनाने की संभावना नहीं है।
- ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEM) का उपयोग करके ईएम ग्रिड पर लिपिड मोनोलेयर के कवरेज की जांच करें। एक कम-बढ़ाया इलेक्ट्रॉन छवि कवर मोनोलेयर की आकृति विज्ञान की पहचान करने में सहायक है। आमतौर पर, मोनोलेयर-कवर क्षेत्र की छवि विपरीत खुले क्षेत्रों की तुलना में थोड़ी कम होगी। इसके अलावा, गणना 2डी इमेज पावर स्पेक्ट्रम 2डी क्रिस्टलीय के स्थान की पहचान करने में मदद करेगा।
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Representative Results
ईएम ग्रिड पर जमा एक लिपिड मोनोलेयर को बिना धुंधला किए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) के तहत कल्पना की जा सकती है। मोनोलेयर उपस्थिति बीम पथ में किसी भी नमूने के बिना क्षेत्र से विपरीत अंतर से पहचाना जा सकता है। जिन क्षेत्रों में लिपिड मोनोलेयर कवरेज होता है, उनमें कोई कवरेज नहीं होता है, क्योंकि खाली छेदों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन बीम में कोई बिखराव नहीं होता है और एक उज्जवल रोशनी(चित्रा 3)दिखाता है।
2डी मोनोलेयर क्रिस्टलीकरण के लिए शर्तों को स्क्रीन करने के लिए, नकारात्मक दाग ईएम या क्रायो-ईएम इमेजिंग का उपयोग करके नमूने की छवि की जांच करें। क्या मोनोलेयर छेद को कवर करता है जब मंच झुका होता है तो एक मजबूत किनारे के विपरीत द्वारा देखा जा सकता है। यदि एक क्रिस्टल बनता है, तो छवि शक्ति स्पेक्ट्रम या पीरियोटोग्राम फोरियर या विवर्तन स्पॉट दिखाएगा। छोटे आकारों (< 200 एनएम) में क्रिस्टल और बेतरतीब ढंग से उन्मुख बिजली स्पेक्ट्रम में उच्च तीव्रता के छल्ले दिखा सकते हैं। यदि क्रिस्टल नहीं उगाए गए हैं, तो पावर स्पेक्ट्रम फोरियर स्पॉट नहीं दिखाएगा।
चित्रा 1। लिपिड मोनोलेयर गठन के लिए टेफ्लॉन ब्लॉक का उपयोग किया जाता है। एक टेफ्लॉन ब्लॉक शीर्ष (ऊपर) और क्रॉस-सेक्शन (नीचे) दृश्यों में दिखाया गया है। इसमें छह पंक्तियों और दो स्तंभों में व्यवस्थित 12 कुएं हैं । मुख्य बफर अच्छी तरह से लेबल ए, गहरे नीले रंग में दिखाया गया है, बीच में व्यास में 4 मिमी और 60 माइक्रोन नमूना मात्रा के साथ 5 मिमी गहरा है। मोनोलेयर मुख्य कुएं में बफर जलाशय के शीर्ष पर बनता है और प्रोटीन को हल्के नीले रंग में दिखाए गए साइड पोर्ट लेबल बी के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। लिपिड मोनोलेयर पर 2डी क्रिस्टल के विकास की योजनाबद्ध प्रस्तुति। बफर जलाशय पहले बफर से भरा होता है, इसके बाद कुएं के ऊपर जमा लिपिड होता है। एक ईएम ग्रिड का कार्बन साइड लिपिड मोनोलेयर पर रखा गया है, जो हाइड्रोफोबिक पूंछ के साथ बातचीत करेगा। सबसे पहले, प्रोटीन साइड इंजेक्शन अच्छी तरह से बी (चरण 1) के माध्यम से इंजेक्शन रहे हैं । समय के साथ, प्रोटीन को 2D क्रिस्टल जाली में व्यवस्थित किया जाता है और लिपिड हेड समूहों (चरण 2) के साथ बातचीत की जाती है। आगे के विश्लेषण के लिए ईएम ग्रिड लेने के लिए, एक चिमटी का उपयोग बफर जलाशय से ग्रिड को उठाने के लिए किया जाता है (चरण 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3। ईएम ग्रिड पर लिपिड मोनोलेयर कवरेज का उदाहरण। एक मोनोलेयर-और होले कार्बन-लेपित ईएम ग्रिड को बिना धुंधला किए कमरे के तापमान पर फिलिप्स सीएम12 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। नारंगी तीर उस क्षेत्र को इंगित करता है जिसमें कोई लिपिड मोनोलेयर कवरेज नहीं है, और नीले तीर ग्रिड छेद में लिपिड मोनोलेयर की पूरी कवरेज का संकेत देते हैं। स्केल बार 0.5 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक लिपिड मोनोलेयर एक शक्तिशाली उपकरण है जो जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के संरचनात्मक अध्ययन के लिए बड़े 2डी क्रिस्टल के विकास की सुविधा प्रदान करता है। वायु-जल इंटरफ़ेस पर एक बरकरार लिपिड मोनोलेयर को सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए, यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि प्रयोग के दिन लिपिड को ताजा तैयार किया जाता है, क्योंकि लिपिड एसील चेन के ऑक्सीकरण से मोनोलेयर में पैकिंग व्यवधान हो सकता है और परिणामस्वरूप क्रिस्टल गठन पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। पाउडर रूप में खरीदे गए लिपिड को क्लोरोफॉर्म के मिश्रण का उपयोग करके भंग किया जाना चाहिए: मेथनॉल सॉल्वेंट, जिसका उपयोग आमतौर पर फॉस्फोलिपिड्स35को भंग करने के लिए किया जाता है। क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल सॉल्वेंट को प्रीमेड और सीलबंद ग्लास शीशी में संग्रहित किया जा सकता है। जबकि घुलित लिपिड हवा-पानी इंटरफेस पर लागू होते हैं, क्लोरोफॉर्म तक प्रतीक्षा करें: मेथनॉल सॉल्वेंट पूरी तरह से बफर से वाष्पित हो जाता है। लिपिड मोनोलेयर के गठन और इस प्रयोग में 2डी क्रिस्टल का गठन के लिए उचित प्रतीक्षा समय आवश्यक है। आमतौर पर, लिपिड मोनोलेयर और 2डी सरणी का गठन लगभग 30 से 60 मिनट के भीतर इनक्यूबेशन समय18के भीतर हो सकता है।
जब लिपिड मोनोलेयर ठीक से बनता है, तो सुनिश्चित करें कि लिपिड द्वारा प्रभावी रूप से 2डी क्रिस्टल सरणी गठन को बढ़ावा दिया जा सकता है। बफर संरचना को 2डी सरणी की स्थापना को स्थिर करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, खासकर जब कुत्तों-एनटीए-नी लिपिड का उपयोग18,36किया जाता है। इस लिपिड के लिए लिपिड मोनोलेयर क्रिस्टलीकरण की सफलता प्रभावित हो सकती है यदि ईडीटीए (एथिलेंडियामाइमेटेट), डीटीटी (1,4-डिइयोथरेइटोल), या बफर में विभिन्न आयनों की उच्च सांद्रता है। घुलनशील चेलेटर ईडीटीए लिपिड-मेटल आयन-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स36को बाधित कर सकता है। इसका एक उदाहरण इम्मोडायसेटेट-सीयू (II) लिपिड के साथ स्ट्रेप्टाविडिन प्रोटीन इंटरैक्शन है; EDTA के अलावा Cu (II) को हटा देता है और लिपिड-मेटल आयन-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स20को बाधित करता है । इसलिए, नमूने को ईडीटीए को हटाने के लिए पतला या बफर की आवश्यकता हो सकती है, जिससे प्रोटीन की मजबूत बाध्यकारी और क्रिस्टल गठन को बढ़ावा मिल सकता है। टेफ्लॉन ब्लॉक में बफर जलाशय में जोड़ने से पहले बफर का अनुकूलन किया जाना चाहिए।
2डी क्रिस्टल के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक विस्तार को संरक्षित करने के लिए, नमूना फ्लैटनेस को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। हालांकि, सतह तनाव, नमूना और समर्थन या मानव हस्तक्षेप के बीच अंतर गर्मी क्षमताओं के कारण, नमूना हस्तांतरण के दौरान 2डी क्रिस्टल की सपाटता को बनाए रखना तुच्छ नहीं है। जब ईएम ग्रिड को बफर जलाशय से हटा दिया जाता है, तो मोनोलेयर इंटरफेस को बरकरार रखने के लिए इसे यथासंभव कम अशांति के साथ संचालित करना चाहिए। ग्रिड के किसी भी कठोर रोटेशन या आंदोलन मोनोलेयर इंटरफेस को फ्रैक्चर कर सकते हैं। यह नमूना ठंड चरणों के लिए भी लागू होता है, जहां क्रिस्टल के साथ ग्रिड को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और बर्फ क्रिस्टल से बचने के लिए तेजी से जमे हुए हैं, जो नवगठित 2D प्रोटीन क्रिस्टल को नुकसान पहुंचा सकते हैं।
लेसी कार्बन फिल्म पर छेद आकार के आधार पर, विभिन्न आकारों में मोनोलेयर का समर्थन करने के लिए लेसी कार्बन-लेपित ग्रिड का उपयोग कर सकते हैं। मोनोलेयर इंटरफ़ेस की फ्लैटनेस लेसी कार्बन फिल्म पर विभिन्न छेद आकारों से प्रभावित हो सकती है, जो आइसोट्रोपिक दिशाओं में विवर्तन तीव्रता के साथ एक फ्लैट मोनोलेयर को स्क्रीन करने में मदद कर सकती है।
डायलिसिस, कमजोर पड़ने, हाइड्रोफोबिक सोखने और लिपिड मोनोलेयर37,38, 39:संरचनात्मक अध्ययनों के लिए 2डी क्रिस्टल विकसित करने और विकसित करने के लिए चार सामान्य तरीके उपयोग किए जाते हैं। डायलिसिस विधि शुद्धि के शुरुआती चरण में झिल्ली प्रोटीन को घुलनशील करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिटर्जेंट को हटा देती है। 2डी क्रिस्टल अनुकूल परिस्थितियों35के तहत लिपिड बिलेयर में डिटर्जेंट-घुलनीय झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करके उगाए जाते हैं। पुनर्गठन के लिए, डिटर्जेंट को डायलिसिस द्वारा हटाने की आवश्यकता है। इसलिए, डायलिसिस विधि 2डी क्रिस्टल40के गठन को चलाने में मदद करती है। हालांकि, डायलिसिस विधि आमतौर पर समय लेने वाली होती है, खासकर एक छोटे से महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) के साथ डिटर्जेंट के लिए। नियंत्रित कमजोर पड़ने के माध्यम से 2डी सरणी का गठन भी प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि प्रोटीन-लिपिड-डिटर्जेंट मिश्रण के लिए एक सेट अनुपात प्रदान करती है ताकि क्रिस्टल गठन को प्रेरित किया जा सके यदि डिटर्जेंट एकाग्रता अपने सीएमसी से नीचे गिरती है। इसमें एक विशिष्ट कमजोर पड़ने वाली मशीन द्वारा उच्च आरंभिक प्रोटीन एकाग्रता41से शुरू होने वाले कार्य को पूरा करने में सुविधा हो सकती है । इसके अलावा, हाइड्रोफोबिक सोखने कम सीएमसी डिटर्जेंट 42 को हटाने के लिए पॉलीस्टीरिन मोतियों (जैसे, जैव-मोती) का उपयोग करके2डीक्रिस्टल के विकास का संकेत देता है। यदि उच्च सीएमसी डिटर्जेंट के साथ ब्याज का प्रोटीन घुलनशील है, तो यह विधि आदर्श नहीं है। इसके विपरीत, लिपिड मोनोलेयर विधि बहुमुखी है और 2डी क्रिस्टलीकरण43के लिए गैर-जटिल कदम प्रदान करती है। जैसा कि यहां चर्चा की गई है, प्रयोगों को संचालित करने के लिए एक सरल उपकरण और कुछ सामग्रियों की आवश्यकता होती है। हमारी विधि के साथ, प्रयोग के लिए आवश्यक कुल समय को 4 घंटे17तक छोटा किया जा सकता है। हालांकि प्रोटीन एकाग्रता और बफर घटकों जैसे कुछ मापदंडों का पूर्व-अनुकूलन अभी भी पहले से आवश्यक हो सकता है, लेकिन नियमित प्रयोगशाला कार्य में किसी की दक्षता को अधिकतम करना संभव है।
लिपिड मोनोलेयर का उपयोग करके अभिन्न झिल्ली प्रोटीन को क्रिस्टलाइज करने के लिए, किसी को यह परीक्षण करना चाहिए कि क्या घुलनशील प्रोटीन और लिपिड के लिए डिटर्जेंट एकाग्रता मोनोलेयर इंटरफेस को परेशान करती है। आम तौर पर, सीएमसी 44की तुलना में डिटर्जेंट एकाग्रता का कम उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है। ऐसे मामलों में कि मोनोलेयर इंटरफ़ेस डिटर्जेंट अस्तित्व के प्रति संवेदनशील है, फ्लोरो-लिपिड का उपयोग करके लिपिड मोनोलेयर बनाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है, जो शायद ही डिटर्जेंट द्वारा घुलनशील हो और मोनोलेयर विधि45का उपयोग करके अभिन्न झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की प्रयोज्यता का विस्तार करे।
यद्यपि लिपिड मोनोलेयर विधि सरल और कम महंगी है, मोनोलेयर तैयारी की प्रजनन क्षमता विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है, जैसे परिवेश आर्द्रता और तापमान। क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए नमूना हस्तांतरण की सफलता सावधानीपूर्वक नमूना हैंडलिंग पर निर्भर करती है। कुछ मामलों में, नौसिखिए द्वारा या एक नई अनुसंधान परियोजना के शुरुआती चरण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन परिणाम प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
अंत में, लिपिड मोनोलेयर विधि अपनी सादगी के कारण प्रोटीन संरचनाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती है। यह 2डी क्रिस्टल गठन की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस पांडुलिपि की तैयारी आंशिक रूप से अमेरिकी सेना अनुसंधान कार्यालय (W911NF2010321) और एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड द्वारा पी-एल.C के लिए समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
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