Summary
Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.
Abstract
Die Elektronenkristallographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur hochauflösenden Strukturbestimmung. Makromoleküle wie lösliche oder Membranproteine können unter günstigen Bedingungen zu hochgeordneten zweidimensionalen (2D) Kristallen gezüchtet werden. Die Qualität der gezüchteten 2D-Kristalle ist entscheidend für die Auflösung der finalen Rekonstruktion mittels 2D-Bildverarbeitung. Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als unterstützende Schicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation integraler Membranproteine angewendet werden, erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen, um Waschmittel- und Dialysebedingungen zu bestimmen, um die Aufteilung auf die Monoschicht zu fördern. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipidmonoschicht, so dass die polaren Lipidkopfgruppen in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben und die unpolaren Acylketten, Schwänze sich in die Luft aufteilen, die Oberflächenspannung brechen und die Wasseroberfläche abflachen. Die geladene Natur oder die charakteristischen chemischen Bestandteile der Kopfgruppen bieten eine Affinität für Proteine in Lösung und fördern die Bindung für die Bildung von 2D-Arrays. Eine neu gebildete Monoschicht mit dem 2D-Array kann leicht in ein Elektronenmikroskop (EM) auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter übertragen werden, das zum Heben und Unterstützen des kristallinen Arrays verwendet wird. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Bildgebung.
Introduction
Elektronenbeugung durch 2D-Kristalle oder spiralförmige Arrays von Proteinen können in günstigen Fällen Sub-Nanometer-Auflösungen erreichen1,2,3. Von besonderem Interesse sind rekonstituierte 2D-Membranproteinarrays oder Kristalle in ihren nahezu nativen Umgebungen1. Da ein Kristall als Signalverstärker fungiert, der die Dichte der strukturellen Faktoren bei bestimmten räumlichen Frequenzen erhöht, ermöglicht die Elektronenkristallographie die Sondierung eines Ziels mit einer kleineren Größe bei hohen Auflösungen, z. B. kleinen Molekülen, als bei Einzelpartikel-Kryo-EM. Der Elektronenstrahl kann durch ein geordnetes 2D-Array von Proteinen gebeugt werden, wodurch ein Beugungsmuster oder ein Gitterbild erzeugt wird, je nachdem, wo die Bildebene auf demDetektor aufgezeichnetwird 4 . Die gebeugten Intensitäten können dann extrahiert und verarbeitet werden, um eine 2D-Projektionsstruktur des Kristalls zu rekonstruieren. Elektronen haben einen größeren Streuquerschnitt als Röntgenstrahlen und ihre Streuung folgt größtenteils dem Rutherford-Modell, das auf der Coulomb-Wechselwirkung zwischen den Elektronen und den geladenen Atomen imMolekül basiert 5. Die Dicken von 2D-Membrankristallen betragen in der Regel weniger als 100 nm, geeignet für die Elektronenübertragung ohne dynamische Streuung innerhalb der Probe6. Elektronenkristallographische Studien haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um hochauflösende Strukturinformationen von Membranproteinen und Lipid-Protein-Interaktionen zu untersuchen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Eine Lipidmonoschicht ist eine einzelne Lipidschicht, die aus Phospholipiden besteht, die dicht an einer Luft-Wasser-Grenzfläche6gepackt sind und die 2D-Array-Bildung für lösliche Proteine oder periphere Membranproteine unterstützen können18. Abhängig von der Dichte der Lipide und ihrem lateralen Druck können die Lipidmoleküle ein geordnetes 2D-Array an der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, wobei ihre acylketten auf die Luft ausgedehnt sind und hydrophile Kopfgruppen in der wässrigen Lösung1,6,19freigelegt werden . Die Lipidkopfgruppe kann über elektrostatische Interaktion mit Proteinen interagieren oder modifiziert werden, um ein Affinitäts-Tag bereitzustellen, um eine bestimmte Proteindomäne zu binden. Zum Beispiel wird das DOGS-NTA-Ni (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2-Ni2+ ) häufig bei der Bildung einer Lipidmonoschicht verwendet, um die Proteine mit einem Poly-Histidin-Tag20,21,22zu binden . Auch das Choleratoxin B kann ein bestimmtes Pentasaccharid von Gangliosid GM1 in einer Lipidmonoschicht für Strukturstudienbinden 23,24. Durch die Verankerung der Proteine auf den Lipidkopfgruppen kann die Lipidmonoschicht die Bildung der dünnen 2D-Arrays für hochauflösende elektronenkristallographische Studien unterstützen. Die Lipid-Monolayer-Technik wurde in der Elektronenkristallographie für Strukturstudien von Proteinen wie Streptavidin2,25, Annexin V26, Choleratoxin27, E. coli gyrase B Untereinheit28, E. coli RNA Polymerase25,29,30, Carboxysomenschalenproteine31 und die Kapsidproteine des HIV-132 und Moloney murinen Leukämievirus verwendet 33. Aufgrund der Stabilität und chemischen Eigenschaften der Lipidmonoschicht wurden verschiedene Anwendungen für die Probenvorbereitung für die Kryo-EM-Bildgebung untersucht34. Für die Bildung von Protein-Arrays ist jedoch eine Optimierung erforderlich.
Hier geben wir ausführliche Details zur allgemeinen Herstellung von Lipidmonoschichten für die Kryo-EM-Bildgebung und einige Überlegungen, die die Qualität der gebildeten Monoschichten beeinflussen könnten.
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Protocol
1. Teflonblock-Zubereitung
- Bereiten Sie den Teflonblock aus chemikalienbeständigem PTFE-Harz (Polytetrafluorethylen) vor. Machen Sie Löcher auf dem Block mit einem allgemeinen Bohrer, gefolgt von den in Abbildung 1beschrifteten Abmessungen.
2. Monolayer-Lipidpräparation
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 30- 45 Minuten
- Lipid-Stoffaufbereitung
- Ein 0,01 mg/ml Lipidgemisch in 9:1 (v/v) Chloroform/Methanol wird unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform, 0,99 ml Methanol und 0,01 ml 10 mg/ml Lipiden vorbereitet.
- Teflonplattenzubereitung
- Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für 5 Minuten.
- 15 Minuten mit heißem Wasser waschen.
- Mit destilliertem Wasser abspülen.
- Trocknen Sie die Teflonplatte 30 Minuten lang in einem Trockener und halten Sie sie bei Nichtgebrauch unter Vakuum (Abbildung 1).
3. Bildung von Lipidmonoschichten auf Pufferreservoir
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden
- Bereiten Sie am Tag des Experiments eine Lipidmischung von 0,01 mg/ ml in einer 9:1-Mischung aus Chloroform/Methanol frisch vor.
- Legen Sie ein Typ-1-Filterpapier in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an.
- Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 μL des Puffers.
- Fügen Sie vorsichtig lipidische Mischung Tropfen für Tropfen (idealerweise 1 μL pro Tropfen) mit einer Hamilton-Spritze auf die Pufferoberfläche hinzu.
- Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser, um die Feuchtigkeit in der Petrischale zu halten.
- 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht Lipid auf der Oberfläche des Puffers sollte gebildet werden.
4. Aufbringung eines EM-Gitters auf einer Lipid-Monoschicht
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden
- Legen Sie vorsichtig ein löchriges, kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, Kohlenstoffseite nach unten, auf die Oberseite jedes Pufferreservoirs.
- Injizieren Sie Proteine vorsichtig in die seitliche Injektionsbrunnen. Verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um 1 μM Protein als Ausgangspunkt. Optimieren Sie die Proteinkonzentration vor dem Experiment.
- 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Vorsichtig ca. 20-30 μL Puffer in den seitlichen Injektionsanschluss injizieren. Dadurch wird das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks erhöht.
- Nehmen Sie das Gitter sofort mit einer Pinzette auf und heben Sie es vertikal vom Tröpfchen ab.
- Vorbereitung von Monolayer-Proben für negative Färbung oder Kryo-TEM-Bildgebung (Abbildung 2). Wenn die Proteine ein 2D-Array bilden, zeigt das Bildleistungsspektrum oder Das Fourier-Periodogramm Beugungsdichten bei den räumlichen Frequenzen basierend auf der Kristallsymmetrie. Wenn im Leistungsspektrum keine Beugungsflecken gezeigt werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Proteine einen 2D-Kristall bilden.
- Überprüfen Sie die Abdeckung der Lipidmonoschicht auf dem EM-Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Ein tiefer vergrößertes Elektronenbild ist hilfreich, um die Morphologie der bedeckten Monoschicht zu identifizieren. Normalerweise ist der Bildkontrast des mit einer Einschicht bedeckten Bereichs etwas geringer als der der unbedeckten Bereiche. Darüber hinaus hilft das berechnete 2D-Bildleistungsspektrum, den Standort des 2D-Kristallins zu identifizieren.
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Representative Results
Eine auf dem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ohne Färbung visualisiert werden. Die Monoschichtpräsenz ist an der Kontrastdifferenz zur Fläche ohne Probe im Strahlengang zu erkennen. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren lokalen Kontrast als solche ohne Abdeckung, da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist und eine hellere Beleuchtung zeigt (Abbildung 3).
Um die Bedingungen für die 2D-Monoschichtkristallisation zu überprüfen, untersuchen Sie das Bild der Probe mit negativer EM- oder Kryo-EM-Bildgebung. Ob die Monoschicht die Löcher bedeckt, konnte durch einen stärkeren Kantenkontrast beim Kippen der Bühne beobachtet werden. Wenn ein Kristall gebildet wird, zeigt das Bildleistungsspektrum oder Periodogramm die Fourier- oder Beugungspunkte. Kristalle in kleinen Größen (< 200 nm) und zufällig ausgerichtet können hochintensive Ringe im Leistungsspektrum aufweisen. Wenn die Kristalle nicht gezüchtet werden, zeigt das Leistungsspektrum keine Fourier-Flecken.
Abbildung 1. Teflonblock zur Bildung von Lipid-Monolayern. Ein Teflonblock wird in den Ansichten oben (oben) und im Querschnitt (unten) angezeigt. Es enthält 12 Brunnen, die in sechs Reihen und zwei Spalten angeordnet sind. Der Hauptpuffer mit der Bezeichnung A, in dunklerem Blau dargestellt, in der Mitte ist 4 mm im Durchmesser und 5 mm tief mit 60 μL Probenvolumen. Die Monoschicht wird auf dem Pufferreservoir in der Hauptbohrung gebildet und Proteine werden durch den seitenseitigen Port mit der Markierung B in hellblau injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Entwicklung von 2D-Kristall auf Lipid-Monoschicht. Das Pufferreservoir wird zuerst mit dem Puffer gefüllt, gefolgt von dem Lipid, das sich auf dem Bohrwasser ablagert. Die Kohlenstoffseite eines EM-Gitters wird auf die Lipidmonoschicht gelegt, die mit den hydrophoben Schwänzen interagiert. Zuerst werden Proteine durch die seitliche Injektionsbohrung B injiziert (Schritt 1). Im Laufe der Zeit werden die Proteine zu einem 2D-Kristallgitter angeordnet und interagieren mit den Lipidkopfgruppen (Schritt 2). Um das EM-Gitter zur weiteren Analyse aufzunehmen, wird eine Pinzette verwendet, um das Gitter vertikal vom Pufferreservoir abzuheben (Schritt 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Beispiel für die Lipid-Monolayer-Abdeckung auf einem EM-Gitter. Ein einschichtiges und löchriges kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Flecken wurde mit einem Philips CM12 Transmissionselektronenmikroskop bei Raumtemperatur abgebildet. Der orangefarbene Pfeil zeigt den Bereich an, der keine Lipid-Monolayer-Abdeckung aufzeichnet, und die blauen Pfeile zeigen die vollständige Abdeckung der Lipid-Monoschicht im Gitterloch an. Der Maßstabsbalken beträgt 0,5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine Lipidmonoschicht ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Wachstum großer 2D-Kristalle für Strukturstudien biologischer Makromoleküle erleichtert. Um eine intakte Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche erfolgreich vorzubereiten, wird dringend empfohlen, die Lipide am Tag des Experiments frisch aufzubereiten, da eine Oxidation der Lipid-Acylkette zu einer Packungsstörung in der Monoschicht führen und die resultierende Kristallbildung beeinträchtigen könnte. Gekaufte Lipide in Pulverform sollten mit einer Mischung aus Chloroform:Methanol-Lösungsmittel gelöst werden, das üblicherweise zum Auflösen von Phospholipiden verwendet wird35. Das Chloroform:Methanol-Lösungsmittel kann vorgefertigt und in einer versiegelten Glasfläschchen gelagert werden. Während die gelösten Lipide an der Luft-Wasser-Grenzfläche aufgetragen werden, warten Sie, bis das Chloroform:Methanol-Lösungsmittel vollständig aus dem Puffer verdampft ist. Die richtige Wartezeit für die Bildung von Lipidmonoschichten und die Bildung von 2D-Kristallen ist in diesem Experiment unerlässlich. Typischerweise kann die Bildung einer Lipidmonoschicht und 2D-Arrays innerhalb von etwa 30 bis 60 Minuten nach Inkubationszeiterfolgen 18.
Wenn eine Lipidmonoschicht richtig gebildet ist, stellen Sie sicher, dass die Bildung des 2D-Kristallarrays durch das Lipid effektiv gefördert werden kann. Die Pufferzusammensetzung sollte optimiert werden, um die Etablierung von 2D-Arrays zu stabilisieren, insbesondere wenn DOGS-NTA-Ni-Lipid verwendet wird18,36. Der Erfolg der Lipid-Monolayer-Kristallisation für dieses Lipid kann beeinträchtigt werden, wenn hohe Konzentrationen von EDTA (Ethylendiamintetraacetat), DTT (1,4-Dithiothreitol) oder verschiedenen Ionen im Puffer vorhanden sind. Der lösliche Chelator EDTA kann den Lipid-Metall-Ionen-Protein-Komplexstören 36. Ein Beispiel dafür ist die Streptavidin-Protein-Interaktion mit Iminodiacetat-Cu(II)-Lipid; die Zugabe von EDTA entfernt Cu (II) und unterbricht den Lipid-Metall-Ionen-Protein-Komplex20. Daher muss die Probe möglicherweise verdünnt oder puffergetauscht werden, um EDTA zu entfernen, was eine stärkere Bindung von Protein ermöglicht und die Kristallbildung fördert. Die Optimierung des Puffers muss durchgeführt werden, bevor er dem Pufferreservoir im Teflonblock hinzugefügt wird.
Um die hochauflösenden strukturellen Details des 2D-Kristalls zu erhalten, ist die Aufrechterhaltung der Probenflachheit von entscheidender Bedeutung. Aufgrund der Oberflächenspannung, der unterschiedlichen Wärmekapazitäten zwischen Probe und Träger oder des menschlichen Eingriffs ist es jedoch nicht trivial, die Ebenheit des 2D-Kristalls während des Probentransfers aufrechtzuerhalten. Wenn das EM-Gitter aus dem Pufferreservoir gehoben wird, muss man es mit so wenig Störung wie möglich betreiben, um die Monolayer-Schnittstelle intakt zu lassen. Jede drastische Drehung oder Bewegung des Gitters kann die Monoschichtschnittstelle brechen. Dies gilt auch für Probengefrierschritte, bei denen das Gitter mit Kristallen vorsichtig gehandhabt und schnell eingefroren werden muss, um Eiskristalle zu vermeiden, die die neu gebildeten 2D-Proteinkristalle beschädigen können.
Man kann ein spitzes kohlenstoffbeschichtetes Gitter verwenden, um Monoschichten in verschiedenen Größen zu unterstützen, abhängig von den Lochgrößen auf dem Spitzenkohlenstofffilm. Die Ebenheit der Monoschicht-Grenzfläche kann durch verschiedene Lochgrößen auf dem spitzen Kohlenstofffilm beeinflusst werden, was dazu beitragen kann, eine flache Monoschicht mit den Beugungsintensitäten in isotroper Richtung abzuschirmen.
Es gibt vier gängige Methoden, um 2D-Kristalle für Strukturstudien zu züchten und zu entwickeln: Dialyse, Verdünnung, hydrophobe Adsorption und Lipidmonoschicht37,38,39. Die Dialysemethode entfernt die Reinigungsmittel, die zur Lösung von Membranproteinen verwendet werden, im frühen Schritt der Reinigung. Die 2D-Kristalle werden durch Rekonstituierung von waschmittellöslichen Membranproteinen zu Lipiddoppelschichten unter günstigen Bedingungen gezüchtet35. Damit die Rekonstitution stattfinden kann, müssen Reinigungsmittel durch Dialyse entfernt werden. Daher hilft die Dialysemethode, die Bildung von 2D-Kristallenvoranzutreiben 40. Die Dialysemethode ist jedoch in der Regel zeitaufwendig, insbesondere bei Reinigungsmitteln mit einer kleinen kritischen Mizellenkonzentration (CMC). Die Bildung von 2D-Arrays kann auch über eine kontrollierte Verdünnung erreicht werden. Diese Methode bietet ein festgelegtes Verhältnis für das Protein-Lipid-Waschmittel-Gemisch, um kristallisierend zu sein, wenn die Waschmittelkonzentration unter seinen CMC fällt. Dies könnte durch eine spezielle Verdünnungsmaschine erleichtert werden, um die Arbeit ab einer höheren anfänglichen Proteinkonzentration durchzuführen41. Darüber hinaus veranlasst die hydrophobe Adsorption das Wachstum von 2D-Kristallen durch die Verwendung von Polystyrolperlen (z. B. Bioperlen), um die CMC-niedrigen Reinigungsmittel zu entfernen42. Wenn das interessierende Protein mit Hoch-CMC-Waschmitteln solubilisiert wird, ist diese Methode nicht ideal. Im Gegensatz dazu ist die Lipid-Monolayer-Methode vielseitig und bietet nicht gewundene Schritte für die 2D-Kristallisation43. Wie hier besprochen, erfordert es eine einfache Vorrichtung und einige Materialien, um die Experimente durchzuführen. Mit unserer Methode kann die für das Experiment benötigte Gesamtzeit auf 4 Stunden17verkürzt werden. Auch wenn im Vorfeld noch eine Voroptimierung bestimmter Parameter wie Proteinkonzentration und Pufferkomponenten erforderlich sein kann, ist es möglich, die Effizienz in der routinemäßigen Laborarbeit zu maximieren.
Für die Kristallisation integraler Membranproteine mit einer Lipidmonoschicht sollte getestet werden, ob die Waschmittelkonzentration für lösliche Proteine und Lipide die Monolayer-Grenzfläche stört. Im Allgemeinen wird empfohlen, die Waschmittelkonzentration niedriger als cmC 44zu verwenden. In Fällen, in denen die Monolayer-Grenzfläche empfindlich auf das Waschmittelexistenz reagiert, kann ein alternativer Ansatz darin bestehen, die Lipid-Monoschicht unter Verwendung von Fluor-Lipiden zu bilden, die durch Waschmittel kaum solubilisiert werden und die Anwendbarkeit der integralen Membranproteinkristallisation mit der Monolayer-Methodeerweitern 45.
Obwohl das Lipid-Monolayer-Verfahren einfach und kostengünstiger ist, hängt die Reproduzierbarkeit der Monolayer-Zubereitung von verschiedenen Faktoren wie Umgebungsfeuchtigkeit und Temperatur ab. Der Erfolg des Probentransfers für die Kryo-EM-Bildgebung hängt von einem sorgfältigen Probenhandling ab. In einigen Fällen kann es schwierig sein, hochauflösende Ergebnisse von einem Anfänger oder in der Anfangsphase eines neuen Forschungsprojekts zu erhalten.
Zusammenfassend bietet die Lipid-Monolayer-Methode aufgrund ihrer Einfachheit die Möglichkeit, Proteinstrukturen zu untersuchen. Es könnte einen alternativen Ansatz bieten, um den Prozess der 2D-Kristallbildung zu erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde teilweise vom US Army Research Office (W911NF2010321) und den Startfonds der Arizona State University für P.-L.C unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
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