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Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen
Summary November 20th, 2021
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Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.
Transcript
Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als Stützschicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation angewendet werden, wie einige integrale Membranproteine. Erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen zur Bestimmung der Waschmittel- und Dialysebedingungen, um die Partitionierung in die Lipidmonoschicht zu fördern.
An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipid-Monoschicht, so dass die polaren Kopfgruppen des Lipids in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben. Und die unpolaren Acylschwänze der Lipidverteilung zur Luft-Wasser-Grenzfläche, die die Oberflächenspannung bricht und die Wasseroberfläche abflacht. Die Ladungsnatur die charakteristischen chemischen Anteile der Lipidkopfgruppen liefern die Affinität für Proteine in Lösung.
Förderung der Bindung und im Prinzip der 2D-Array-Bildung. Alle 2D-Kristalle, die auf einer Lipidmonoschicht gebildet werden, können leicht in das Elektronenmikroskop auf einem kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter übertragen werden, das zum Anheben und Unterstützen des kristallinen Arrays auf der Lipidschicht verwendet wird. Wir haben in diesem Manuskript eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung beschrieben.
Lipid-Monolayer-Vorbereitung. Lipidstockzubereitung, herstellung einer Lipidmischung von 0,01 mg pro ml in 9:1 Volumen zu Volumen Chloroform, Methanol. Unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform und 0,99 ml Methanol und 0,1 ml einer Lipidlösung von 10 mg pro ml.
Zubereitung von Teflonplatten. Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für fünf Minuten. Mit heißem Wasser für 15 Minuten waschen und dann mit destilliertem Wasser abspülen.
Trocknen Sie die Teflonplatte in einer getrockneten 30 Minuten und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch unter Vakuum auf. Bildung von Lipid-Monoschicht auf Pufferreservoir. Die geschätzte Betriebszeit beträgt eineinhalb Stunden.
Legen Sie ein Filterpapier vom Typ eins in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an. Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 Mikrolitern Puffer. Fügen Sie vorsichtig flüssigkeitsmischung auf die Pufferoberfläche Tropfen für Tropfen hinzu.
Idealerweise ein Mikroliter pro Tropfen mit einer Hamilton-Spritze. Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser und halten Sie die Feuchtigkeit in der Petrischale. Bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubieren, das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht aus Lipid auf der Oberfläche der Puffer gebildet werden.
Auftragen eines EM-Gitters auf eine Lipid-Monoschicht. Geschätzte Betriebszeit eineinhalb Stunden. Platzieren Sie vorsichtig ein kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, das Kohlenstoff von der Seite nach unten auf die Oberfläche jedes Pufferbehälters ableitet.
Injizieren Sie vorsichtig Proteine in den seitlichen Injektionsbrunnen, verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um ein Mikromolar. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Injizieren Sie vorsichtig etwa 20 bis 30 Mikroliter Puffer in den Injektionsanschluss der Stelle, um das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks anzuheben.
Auf diese Weise können Sie das Gitter mit einer Pinzette aufnehmen und vertikal vom Tropfen abheben. Repräsentative Ergebnisse. Eine auf einem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter dem Transmissionselektronenmikroskop ohne Kontrastfärbung sichtbar gemacht werden.
Das Vorhandensein von Monoschichten kann an der Kontrastdifferenz zu dem Bereich ohne Probe in diesem Strahlengang erkannt werden. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren Kontrast als Bereiche ohne Abdeckung. Da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist, zeigt er eine hellere Beleuchtung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Lipid-Monolayer-Methode aufgrund ihrer Einfachheit die Möglichkeit bietet, Proteinstrukturen zu untersuchen. Es kann einen alternativen Ansatz bieten, um den Prozess der 2D-Kristallisation zu erleichtern.
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