Summary
Dieses Protokoll demonstriert, wie der pflanzliche Wirt verwendet werden kann, um Speichelproteine von Zikaden und pflanzliche virale Proteine zu detektieren, die von Zikadenvektoren freigesetzt werden.
Abstract
Insektenvektoren übertragen horizontal viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von hemipterischen Insekten übertragen, die stechend-saugende Mundwerkzeuge haben. Während der Virusübertragung überbrückt der Insektenspeichel den Virus-Vektor-Wirt, da der Speichel Viren vektoriert und die Insektenproteine die Immunantwort von Pflanzen von Insekten in pflanzliche Wirte auslösen oder unterdrücken. Die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelproteinen wird zu einem neuen Schwerpunkt im Forschungsfeld der Arbovirus-Wirt-Interaktionen. Dieses Protokoll bietet ein System zum Nachweis von Proteinen im Speichel von Zikaden mit Hilfe des pflanzlichen Wirts. Als Beispiel dient der mit dem Reiszwergvirus (RDV) infizierte Zikadenvektor Nephotettix cincticeps. Das Vitellogenin und das Hauptprotein P8 des äußeren Kapsids P8 von RDV, das durch den Speichel von N. cincticeps vektorisiert wird, können gleichzeitig in der Reispflanze nachgewiesen werden, von der sich N. cincticeps ernährt. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Speichelproteine, die nach dem Fressen von Insekten vorübergehend im pflanzlichen Wirt zurückgehalten werden. Es wird angenommen, dass dieses Nachweissystem der Untersuchung von Interaktionen zwischen Hemipteran-Virus-Pflanze oder Hemipteran-Pflanze zugute kommen wird.
Introduction
Der Vektor-Wirt-Übertragungsmodus von Arboviren, ein grundlegendes Problem, steht an der Grenze der biologischen Wissenschaft. Viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung werden horizontal durch Insektenvektoren übertragen1. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von Hemiptera-Insekten übertragen, darunter Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse. Diese Insekten verfügen über besondere Merkmale, die es ihnen ermöglichen, Pflanzenviren effizient zu übertragen1. Sie besitzen stechend-saugende Mundwerkzeuge und ernähren sich vom Saft von Phloem und Xylem und scheiden ihren Speichelaus 1,2,3,4. Mit der Entwicklung und Verbesserung von Techniken wird die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelkomponenten zu einem neuen Schwerpunkt intensiver Forschung. Zu den bekannten Speichelproteinen im Speichel gehören zahlreiche Enzyme, wie Pektinesterase, Cellulase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Polyphenoloxidase und Saccharase, unter anderem 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den Proteinen im Speichel gehören auch Auslöser, die die Abwehrreaktion des Wirts auslösen und dadurch die Leistung von Insekten verändern, sowie Effektoren, die die Abwehr des Wirts unterdrücken, was die Fitness der Insekten verbessert, und Komponenten, die pathologische Reaktionen des Wirts hervorrufen14,15,16,17. Daher sind Speichelproteine wichtige Materialien für die Kommunikation zwischen Insekten und Wirten. Bei der Übertragung von Viren enthält der Speichel, der von den Speicheldrüsen stechend-saugender viruliferer Insekten abgesondert wird, auch virale Proteine. Virale Bestandteile nutzen den Speichelfluss, um sie vom Insekt an den Pflanzenwirt freizusetzen. Daher überbrückt der Speichel der Insekten die tritrophe Virus-Vektor-Wirt-Interaktion. Die Untersuchung der biologischen Funktion von Speichelproteinen, die von viruliferen Insekten sezerniert werden, hilft, die Beziehung zwischen Virus, Vektor und Wirt zu verstehen.
Für tierische Viren wird berichtet, dass der Speichel von Stechmücken die Übertragung und Pathogenität des West-Nil-Virus (WNV) und des Dengue-Virus (DENV) vermittelt. Das Speichelprotein AaSG34 fördert die Replikation und Übertragung des Dengue-2-Virus, während das Speichelprotein AaVA-1 die Übertragung von DENV und dem Zika-Virus (ZIKV) fördert, indem es die Autophagie aktiviert18,19. Das Speichelprotein D7 von Stechmücken kann die DENV-Infektion in vitro und in vivo durch direkte Interaktion mit den DENV-Virionen und dem rekombinanten DENV-Hüllprotein20 hemmen. In Pflanzenviren induziert das Begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) das Speichelprotein Bsp9 der Weißen Fliege, das die WRKY33-vermittelte Immunität des pflanzlichen Wirts unterdrückt, um die Präferenz und Leistung der Weißen Fliege zu erhöhen und schließlich die Übertragung von Viren zu erhöhen21. Da die Studien zur Rolle von Speichelproteinen von Insekten in pflanzlichen Wirten hinter denen tierischer Wirte zurückgeblieben sind, ist ein stabiles und zuverlässiges System zum Nachweis der Speichelproteine in pflanzlichen Wirten dringend erforderlich.
Das als Reiszwergvirus (RDV) bekannte Pflanzenvirus wird von der Zikade Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) mit hoher Effizienz und persistent vermehrend übertragen22,23. Zuerst wurde berichtet, dass RDV durch einen Insektenvektor übertragen wird und in Asien eine schwere Erkrankung von Reis verursacht24,25. Das Virion ist ikosaedrisch und doppellagig kugelförmig, und die äußere Schicht enthält das äußere KapsidproteinP8 22. Die zirkulative Übertragungszeit von RDV in N. cincticeps beträgt 14 Tage 26,27,28,29,30. Wenn das RDV in den Speicheldrüsen ankommt, werden Virionen über einen Exozytose-ähnlichen Mechanismus in die im Speichel gespeicherten Hohlräume in den Speicheldrüsen freigesetzt23. Das Vitellogenin (Vg) ist die Vorstufe des Dotterproteins, die für die Entwicklung der Eizellen bei weiblichen Insekten unerlässlichist 31,32,33. Die meisten Insektenarten haben mindestens ein Vg-Transkript von 6-7 kb, das für ein Vorläuferprotein von etwa 220 kDa kodiert. Die Proteinvorstufen von Vg können in der Regel in große (140 bis 190 kDa) und kleine (<50 kDa) Fragmente gespalten werden, bevor sie in den Eierstock gelangen18,19. Frühere proteomische Analysen zeigten das Vorhandensein der von Vg abgeleiteten Peptide im sezernierten Speichel der Zikade Recilia dorsalis, obwohl ihre Funktion unbekannt ist (unveröffentlichte Daten). Es wird neu berichtet, dass Vg, das oral von Zikaden abgesondert wird, als Effektor fungiert, um die Abwehrkräfte von Pflanzen zu schädigen34. Es ist nicht bekannt, ob das Vg von N. cincticeps auch mit Speichelfluss an den Pflanzenwirt abgegeben werden kann und dann in der Pflanze eine Rolle spielen könnte, um die pflanzliche Abwehr zu stören. Um herauszufinden, ob N. cincticeps Speichelproteine wie Vg nutzt, um die pflanzliche Abwehr zu hemmen oder zu aktivieren, besteht der erste Schritt darin, Proteine zu identifizieren, die während der Fütterung an die Pflanze abgegeben werden. Das Verständnis der Methode zur Identifizierung der in der Pflanze vorhandenen Speichelproteine ist möglicherweise unerlässlich, um die Funktion von Speichelproteinen und die Wechselwirkungen zwischen Hemiptera und Pflanzen zu erklären.
In dem hier vorgestellten Protokoll wird N. cincticeps als Beispiel verwendet, um eine Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von Speichelproteinen im pflanzlichen Wirt bereitzustellen, die durch Insektenfraß eingeführt werden. Das Protokoll beschreibt in erster Linie die Sammlung und den Nachweis von Speichelproteinen und ist hilfreich für weitere Untersuchungen an den meisten Hemipteren.
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Protocol
Die nicht-viruliferen adulten Zikaden wurden im Vector-borne Virus Research Center der Fujian Agriculture and Forestry University, China, vermehrt.
1. Aufzucht nichtviruliferer Insekten
- Ziehen Sie die erwachsenen Tiere auf Reissetzlingen in einem Würfelkäfig auf, der 40 cm x 35 cm x 20 cm (Länge x Breite x Höhe) groß ist. Halten Sie eine Seite des Käfigs zur Belüftung mit einem insektensicheren Netz bedeckt.
- Halten Sie die Käfige mit Zikaden in einem Inkubator mit eingebautem Feuchtigkeitsregler bei 26 °C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75 % unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel.
- Verwenden Sie einen Sauger, um alle erwachsenen Tiere vorsichtig aus ihrem Käfig in einen neuen Käfig zu bringen, der jede Woche frische Reissetzlinge enthält.
- Lassen Sie mehr als 200 Erwachsene sich paaren und Eier in den Reis legen.
- Bewahren Sie die alten Reissetzlinge auf, damit die Nymphen schlüpfen können. Diese neuen nichtviruliferen Nymphen werden in das 2-Instar-Stadium gebracht.
2. Viruserwerb und Sammlung viruliferer Insekten
- Übertragen Sie die nichtviruliferen Nymphen im 2-Instar vorsichtig für 1-2 h in ein Glaskulturröhrchen (2,5 cm Durchmesser und 15 cm Höhe), um sie mit dem Absauger zu verhungern.
- Lassen Sie die Nymphen in einem Käfig frei, in dem sich eine RDV-infizierte Reispflanze befindet, die in einem Topf gewachsen ist.
- Lassen Sie die Nymphen 2 Tage lang von der infizierten Reispflanze fressen.
Anmerkungen: Gießen Sie die Reispflanze vorsichtig und vermeiden Sie es, die Nymphen wegzuwaschen. Die Nymphen im 2-Instadium sind etwa 1,6-2 mm lang.
- Setzen Sie diese Nymphen vorsichtig in einen neuen Käfig um, der frische virenfreie Reissämlinge mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75% unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel enthält. Lassen Sie die Nymphen 12 Tage lang von der infizierten Reispflanze ernähren, um die zirkulative Übertragungszeit von RDV abzuschließen.
3. Entnahme von Speichelproteinen mit Hilfe eines Futterkäfigs
- Bereiten Sie fünf kleine rohrartige Futterkäfige (2,5 cm Durchmesser und 4 cm Höhe) vor, in denen ein Ende mit insektensicheren Netzen bedeckt ist.
- Sperren Sie 15-20 Zikaden in jeden Futterkäfig und decken Sie dann das andere Ende des Käfigs mit einer dünnen Schaumstoffmatte ab.
- Befestigen Sie einen Reiskeimling (5-6 cm hoch) mit Klebebändern zwischen dem Ende des Käfigs und einer Schaumstoffmatte. Stellen Sie sicher, dass sich die Zikaden im Futterkäfig von den Reissetzlingen ernähren können, die dem Inneren des Käfigs ausgesetzt sind.
- Tauchen Sie die Wurzeln des Sämlings in Wasser, damit die Reispflanze am Leben bleibt. Lassen Sie die Zikaden 2 Tage lang davon ernähren.
- Nehmen Sie die Zikaden aus ihren Futterkäfigen und sammeln Sie die Reissetzlinge, von denen sie sich ernährt haben. Schneiden Sie die Teile der Sämlinge außerhalb des Käfigs ab und stellen Sie die Fraßregionen der Sämlinge wieder her.
HINWEIS: Diese Probe kann maximal 3 Monate bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort zum Nachweis verwendet wird.
4. Vorbereitung der Reagenzien
- Lösen Sie 15,1 g Tris-Base, 94 g Glycin und 5 g SDS in 1 l sterilem Wasser auf, um 5xTris-Glycin-Puffer herzustellen. Verdünnen Sie 200 ml 5xTris-Glycin-Puffer mit 800 ml sterilem Wasser, um 1xTris-Glycin-Puffer herzustellen (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung).
- Lösen Sie 80 g NaCl, 30 g Tris-Base und 2 g KCl in 1 l sterilem Wasser auf, um 10xTris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) herzustellen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 15 min.
- Lösen Sie 8 g SDS, 4 ml ß-Mercaptoethanol, 0,02 g Bromphenolblau und 40 ml Glycerin in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) auf, um 4x Proteinprobenpuffer herzustellen.
- Mischen Sie 800 ml Tris-Glycin-Puffer mit 200 ml Methanol, um den Transferpuffer herzustellen.
- Fügen Sie 100 ml 10xTBS-Lösung und 3 ml Tween 20 bis 900 ml steriles Wasser hinzu, um den TBS-Puffer mit Tween 20 (TBST)-Lösung herzustellen.
5. Western Blot zum Nachweis des Speichels und der viralen Proteine
- Mahlen Sie 0,1 g der Reisproben mit flüssigem Stickstoff, bis das Gewebe zu einem Pulver wird. Geben Sie 200 μL 4x Proteinprobenpuffer in die Probe und kochen Sie sie 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und legen Sie ihn in eine neue Durchstechflasche. Laden Sie 10 μl der Probe in ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45-60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 V laufen.
Anmerkungen: Die Rückstände nach der Zentrifugation können verworfen werden.
- Entfernen Sie den Überstand und legen Sie ihn in eine neue Durchstechflasche. Laden Sie 10 μl der Probe in ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45-60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 V laufen.
- Eine 0,45 μm Nitrozellulosemembran und andere Sandwichmaterialien für 30 min in den Transferpuffer geben.
Anmerkungen: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, bevor das Gel seinen Lauf beendet hat. - Legen Sie das Gel ein und übertragen Sie es 90-120 Minuten lang bei 100 V in den Transferpuffer.
- Nehmen Sie die Membran und legen Sie sie 20 Minuten lang in eine 7%ige fettfreie Trockenmilchblockierlösung in TBST-Lösung. Den spezifischen Antikörper gegen RDV P8 oder Vg in eine 7%ige Lösung fettfreier Trockenmilch in TBST geben. Inkubieren Sie mit dem Antikörper zur Färbung der Membran für 2 h oder über Nacht.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Lösung, wobei Sie jedes Mal 5 Minuten waschen müssen.
- Fügen Sie das Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper zu 7% fettfreier Trockenmilch mit TBST hinzu. Mit dem Antikörper 60-90 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST-Lösung.
- Verwenden Sie das ECL-Western-Kit für die Chemilumineszenzmethode. Mischen Sie die Detektionsreagenzien 1 und 2 im Kit im Verhältnis 1:1 in einem Röhrchen. Geben Sie das gemischte Reagenz auf die Membran und inkubieren Sie den Blot 5 Minuten lang.
- Lassen Sie das überschüssige Reagenz ab und machen Sie ein kolorimetrisches Bild des Chemilumineszenzbildes. Kombinieren Sie sie, um die Leiter mit den Proteinbändern zu sehen.
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Representative Results
Abbildung 1 veranschaulicht alle Schritte dieses Protokolls: die Aufzucht von Insekten, den Viruserwerb, die Sammlung von Speichelproteinen über die Reisfütterung und den Western-Blot. Die Ergebnisse der Western Blots zeigten, dass in den Proben von Futterreis und Speicheldrüsen von Insekten auf der Membran, die mit Antikörpern gegen Vg inkubiert wurden, spezifische und erwartete Banden von etwa 220 kDa beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurde in der nicht fütternden Reisprobe keine Bande beobachtet. Das Ergebnis in Abbildung 2 deutet darauf hin, dass Vg als Speichelprotein an den pflanzlichen Wirt freigesetzt wurde. Auf der Membran, die mit Antikörpern gegen RDV P8 inkubiert wurde, wurde auch in den Proben von Reis, der gefüttert worden war, und den Körpern viruliferer Insektenkörper eine spezifische und erwartete Bande von etwa 46 kDa beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in der nicht fressenden Reisprobe und den nicht-viruliferen Zikadenkörpern keine Bande beobachtet, wie in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Ergebnis bewies, dass die viralen Proteine auch in den Futterpflanzen nachgewiesen werden konnten.
Abbildung 1: Übersicht über die Schritte beim Nachweis von Speichelproteinen. Zu den Schritten gehören die Aufzucht von Insekten, der Viruserwerb, die Sammlung von Speichelproteinen über die Pflanzenfütterung und das Western Blotting. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Western-Blot-Assay von Vg in Pflanzen- und Insektenproben. Bahn 1, nicht fressende Pflanzen; Bahn 2, virulifere Zikadenfresser; Bahn 3, virulifere Zikadenspeicheldrüsen; Spur M, Markierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Western-Blot-Assay von P8 in Pflanzen- und Insektenproben. Bahn 1, nicht fressende Pflanzen; Bahn 2, virulifere Zikadenfresser; Bahn 3, virulifere Zikadenkörper; Bahn 4, nichtvirulifere Zikadenkörper; M, Markierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Puffer | Zusammensetzung | Kommentare/Beschreibung |
| 5x Tris-Glycin-Puffer | 15,1 g Tris-Basis 94 g Glycin 5 g Sicherheitsdatenblatt in 1 l sterilem Wasser |
Lösung aus dem Bestand |
| 1x Tris-Glycin-Puffer | 200 mL 5x Tris-Glycin-Puffer 800 ml steriles Wasser |
Arbeitslösung, für SDS-PAGE |
| 10x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) Puffer | 80 g NaCl 30 g Tris-Basis 2 g KCl in 1 L sterilem Wasser |
Lösung aus dem Bestand |
| TBS mit Tween 20 (TBST)-Lösung | 100 ml 10x TBS-Lösung 3 ml Tween 20 900 ml steriles Wasser |
Arbeitslösung |
| 4x Proteinprobenpuffer | 8 g Sicherheitsdatenblätter 4 ml β-Mercaptoethanol 0,02 g Bromphenol blau 40 ml Glycerin in 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) |
Zur Proteinextraktion |
| Transfer-Puffer | 800 ml Tris-Glycin-Puffer 200 mL Methanol |
Für den Proteintransfer |
Tabelle 1: Puffer, Lösungen und Reagenzien, die in der Studie verwendet wurden. Die Zusammensetzung der Puffer und der Lösungen sowie deren Verwendung werden aufgelistet.
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Discussion
Der Speichel, der direkt von den Speicheldrüsen der stechend-saugenden Insekten abgesondert wird, spielt eine entscheidende Rolle, da er das Wirtsgewebe vorverdaut und entgiftet und die lebensreichsübergreifenden biologischen Faktoren der Vektoren in den Wirt einbringt 1,3,4. Die weltverbandsübergreifenden biologischen Faktoren, einschließlich Elicitoren, Effektoren und kleiner RNA, sind entscheidend für die Kommunikation zwischen Insekt und Wirt14,15,16. Daher wird die Entdeckung weiterer Arten und Funktionen von Speichelkomponenten das Verständnis der Beziehung zwischen Insekten und Wirten fördern. Hier wurde ein System zum Nachweis von Speichelproteinen im pflanzlichen Wirt bereitgestellt, das weitere Untersuchungen zur Funktion von Speichelproteinen in pflanzlichen Wirten ermöglicht.
Dieses Protokoll bietet Techniken zum Nachweis der Speichelproteine von Zikaden mit stechend-saugenden Mundwerkzeugen durch Sammeln der fressenden Pflanzen. Einige bemerkenswerte Punkte sollten beachtet werden, um die besten und zuverlässigsten Ergebnisse zu erzielen. (1) Die Virusbelastung in den infizierten Reispflanzen ist kritisch. Die Virustiter in Reispflanzen wirken sich direkt auf die Aufnahme von Insekten aus. Wenn die Insektenkolonie hochvirulifer ist, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass virale Proteine in vitro im Speichel gesammelt werden. Daher sind die viralen Proteine, die aus dem Speichel an den pflanzlichen Wirt abgegeben werden, viel einfacher zu erkennen. Es wird empfohlen, infizierte Pflanzen zu wählen, die signifikante Symptome aufweisen, um als Quelle für Viren zu dienen. (2) Zeitpunkt der Erkennung. Es wird angenommen, dass einige der Speichelproteine im pflanzlichen Wirt vorübergehend sind, weil sie vom pflanzlichen Wirt abgebaut oder in der Pflanze verdünnt werden. Eine sofortige Erkennung der Fütterungspflanzen nach der 2-tägigen Fütterung wird empfohlen. Es wird auch die Hypothese aufgestellt, dass eine längere Retentionszeit für einige spezifische Speichelproteine in der Pflanze besser wäre. Daher konnte der Nachweiszeitpunkt einiger Speichelproteine in weiteren Studien bestimmt werden. (3) Stellen Sie sicher, dass genügend Replikate vorhanden sind. Die Anzahl der Insekten, die überleben, nimmt ab, da die eingesperrten Insekten im Futterkäfig nur eine begrenzte Aktivität und Nahrungsfähigkeit haben. Die Verwendung ausreichender Replikate hilft, die Speichelproteine anzureichern. Drei bis fünf Wiederholungen sind in der Regel ausreichend. Wenn es nur ein Replikat gibt, wäre es besser, 15-20 Zikaden einzusperren, um sich von einem Reissämling zu ernähren.
Diese repräsentativen Ergebnisse zeigten das Vorhandensein des viralen Proteins P8 in der Fraßpflanze von viruliferen Zikaden. Es zeigte sich, dass das Virus, das mit dem Speichelfluss vermischt ist, aus den Speicheldrüsen freigesetzt wird. Es wurde dann vom Insekt auf den pflanzlichen Wirt freigesetzt und beendete schließlich die horizontale Virusübertragung. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob Vg die Rolle des Auslösers oder Effektors bei der Nahrungsaufnahme von Insekten spielt und ob es die Immunantwort des pflanzlichen Wirts auslöst oder unterdrückt. Bisher wurde der Speichel von mehr als 10.000 R. dorsalis mittels Membranfütterung gesammelt und mittels LC-MS/MS (unveröffentlichte Daten) analysiert. Das Vorhandensein von Vg im Speichel wurde nachgewiesen, obwohl seine Funktion unbekannt ist. Hier konnte nachgewiesen werden, dass Vg auch im Speichel von N. cincticeps vorkommt und sogar an die Pflanze abgegeben wird. In Kombination mit den Studien an Zikaden16 wird angenommen, dass das Vorkommen von Vg im Speichel der Hemiptera universell ist. Eine neue Entdeckung berichtet, dass das Vg des Zikadenspeichels ein Effektor ist, der das pflanzliche Abwehrsystem schädigt34. Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, ob das Vg in den meisten hemipterischen Speicheln als Effektor fungiert. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine stabile und zuverlässige Methode bietet, um das Vorhandensein von Speichelproteinen, die von Zikaden in Pflanzen abgesondert werden, zu untersuchen. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für den Nachweis von Speichelproteinen der meisten Hemipteren anwendbar ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31772124 und 31972239) und der Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
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