Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering af neuromuskulære kryds i mus ved kombineret konfokal og superopløsningsmikroskopi

Published: December 8, 2021 doi: 10.3791/63032
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1,2, *1,3, *1,2
1Genethon, 91000, Evry, France, 2Université Paris-Saclay, Univ Evry, Inserm, Genethon, Integrare research unit UMR_S951, 91000, Evry, France, 3Ecole Pratique des Hautes Etudes, PSL Research University, 75014, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en metode til morfometrisk analyse af neuromuskulære kryds ved kombineret konfokal og STED-mikroskopi, der bruges til at kvantificere patologiske ændringer i musemodeller af SMA og ColQ-relateret CMS.

Abstract

Neuromuskulære kryds (NMJ'er) er højt specialiserede synapser mellem lavere motorneuroner og skeletmuskelfibre, der spiller en væsentlig rolle i transmissionen af molekyler fra nervesystemet til frivillige muskler, hvilket fører til sammentrækning. De er påvirket i mange menneskelige sygdomme, herunder arvelige neuromuskulære lidelser såsom Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Derfor er overvågning af morfologien af neuromuskulære kryds og deres ændringer i sygdomsmusemodeller et værdifuldt værktøj til patologiske undersøgelser og præklinisk vurdering af terapeutiske tilgange. Her beskrives metoder til mærkning og analyse af den tredimensionelle (3D) morfologi af de præ- og postsynaptiske dele af motoriske endeplader fra murine drillede muskelfibre. Procedurerne til fremstilling af prøver og måling af NMJ-volumen, areal, tortuositet og axonterminal morfologi / belægning ved konfokal billeddannelse og afstanden mellem postsynaptiske junctional folder og acetylcholinreceptor (AChR) stribebredde ved superopløsningsstimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi er detaljerede. Ændringer i disse NMJ-parametre er illustreret i mutante mus, der er påvirket af SMA og CMS.

Introduction

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er en kompleks struktur sammensat af en motoraxonterminal, en perisynaptisk Schwann-celle og en skeletmyofiberdel involveret i transmission af kemisk information og kobling af lavere motorneuronaktivitet til muskelkontraktion. Hos pattedyr ændres morfologien af det neuromuskulære kryds under udviklingen og vedtager en typisk kringlelignende form efter modning med forskelle i form og kompleksitet mellem arter og viser en vis grad af plasticitet som reaktion på fysiologiske processer såsom motion eller aldring 1,2,3,4 . Den postsynaptiske motoriske endeplade danner membraninvaginationer kaldet junctional folder, hvor den øverste del indeholdende acetylcholinreceptorer (AChR) er i tæt kontakt med den presynaptiske terminale axongren5.

Morfologiske og funktionelle ændringer i neuromuskulære kryds bidrager til patofysiologien af flere neurodegenerative lidelser såsom spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS), myopatier som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG) og centronukleære myopatier (CNM) og aldringsassocieret sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. I disse sygdomme observeres NMJ strukturelle ændringer såsom endepladefragmentering, reduceret postsynaptisk junctional foldstørrelse og / eller denervation. NMJ'ernes patologi kan være en primær eller tidlig begivenhed under sygdomsprogression eller forekomme mere for nylig som en sekundær begivenhed, der bidrager til de kliniske manifestationer. Under alle omstændigheder udgør overvågning af morfologien af NMJ'er i dyremodeller af disse sygdomme en værdifuld parameter til at studere patologiske ændringer og vurdere effekten af potentielle behandlinger.

Morfologien af neuromuskulære kryds analyseres normalt ved hjælp af teknikker ved hjælp af konfokal mikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16 med deres iboende begrænsninger såsom henholdsvis opløsning eller tekniske vanskeligheder. For nylig blev superopløsningsmikroskopi også brugt til at visualisere bestemte regioner i NMJ, såsom præsynaptiske aktive zoner eller AChR-distribution på den postsynaptiske membran16,17,18, som en alternativ eller komplementær tilgang til ultrastrukturel analyse ved elektronmikroskopi.

Denne protokol har til formål at tilvejebringe en detaljeret og reproducerbar metode til vurdering af NMJ morfologiske parametre ved at kombinere fluorescens konfokal og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Vigtige træk ved de præsynaptiske og postsynaptiske endeplader, såsom volumen, areal, relativ tortuositet, AChR-stribebredde og axonterminalfordeling i innerverede drillede muskelfibre af musegastrocnemius og tibialis anterior blev kvantificeret i forbindelse med normale og syge tilstande. NMJ-defekter blev især eksemplificeret i Smn2B/- musemodellen af spinal muskelatrofi, en neuromuskulær sygdom med motorneurondegeneration forårsaget af mutationer i SMN1-genet11,19 og i en kollagenlignende haleunderenhed af asymmetriske acetylcholinesterase knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) mus, som en model af det medfødte myastheniske syndrom20, 21,22.

Protocol

Pleje og manipulation af mus blev udført i henhold til national og europæisk lovgivning om dyreforsøg og godkendt af det institutionelle etiske udvalg. Hanner og hunner med Smn 2B/- (C57Bl/6J baggrund) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J baggrund) mus ved henholdsvis 3- og 6-ugers alderen blev anvendt i undersøgelsen.

1. Eutanasi af mus og dissektion af muskler: tibialis anterior og gastrocnemius

  1. Fortsæt til musebedøvelse ved intraperitoneal injektion af en ketamin (87,5 mg/kg)/xylazin (12,5 mg/kg) blandet opløsning (0,1 ml/20 g legemsvægt) før eutanasi ved cervikal dislokation.
    BEMÆRK: Da SMA og ColQ-CMS påvirker individer uafhængigt af deres køn, blev han- og hunmus anvendt i den nuværende protokol.
  2. Fjern bagbenshår ved hjælp af en lille elektrisk barbermaskine og skyl benene med 70% ethanol.
    BEMÆRK: Dissektionsproceduren vil variere for hver muskel. Følg trin 1.2.1-1.2.3 for dissektion af tibialis anterior (TA), og følg trin 1.2.4-1.2.6 for gastrocnemius (GA) (mediale og laterale dele). Håndter musklerne forsigtigt for at forhindre vævsskade og knusning eller strækning af dem under dissektion.
    1. Placer musen i liggende stilling.
    2. Lav et hudsnit på 5 mm med skarp-stump saks langs den antero-ydre del af den distale bagben, parallelt med skinnebenet, for at udsætte musklen. Brug ekstra tynd saks til at fjerne fasciaen.
    3. Skær først den distale sene (tæt på poten) og derefter den proksimale sene (tæt på knæet) ved hjælp af ekstra tynd saks og en buet tynd tang. Håndter musklen omhyggeligt for at undgå skader på myofibre og nerver.
      BEMÆRK: Den proksimale sene skal være sektioneret så tæt som muligt på knoglen for at høste hele musklen.
    4. Placer musen i den udsatte position, brug skarp-stump saks til at lave et hudsnit fra den øverste del af det distale bagben bageste rum ned til poten, og fjern huden.
    5. Tag fat i akillessenen med medium savtakket tang, klip den med en ekstra tynd saks og adskil forsigtigt GA fra det omgivende væv tilbage til dets proksimale indsættelse.
    6. På den proksimale side indsættes den medium savtakkede tang i lommen dannet mellem biceps femoris (BF) og GA. Adskil de to muskler for at skære GA-senen så tæt som muligt på knogleindsættelsen med en ekstra tynd saks.
  3. Til vævsfiksering anbringes hver muskel i et 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml 4% w/v paraformaldehyd (PFA) opløsning fortyndet i fosfatbuffersaltvand (PBS uden Ca 2+Mg 2+) og opbevares ved 4 °C i18-24 timer.
    FORSIGTIG: Paraformaldehyd og formaldehyd er giftige og skal håndteres i en kemisk røghætte med tilstrækkeligt beskyttelsesudstyr.
  4. Næste dag vaskes de faste muskler 3x i 5 minutter med PBS i 12-brøndsplader ved at ryste forsigtigt ved stuetemperatur (RT) inde i en kemisk røghætte.
    BEMÆRK: Protokollen kan stoppes på dette trin og fortsættes inden for en måned. I dette tilfælde tilsættes PBS suppleret med 0,01% natriumazid for at opbevare prøver ved 4 °C.
  5. Drille hver muskel i små fiberbundter på ca. 1 mm bred ved hjælp af to fine savtakkede tang.
    BEMÆRK: Det er afgørende at manipulere musklerne meget forsigtigt med tangen uden overdreven kraft for at forhindre vævsskade under drilleri.
    1. Dissocier TA-musklen i 3 eller 4 bundter afhængigt af dens størrelse.
    2. For GA skal du adskille de mediale og laterale dele af musklen og derefter adskille hver del i 4-5 bundter afhængigt af deres størrelse.

2. Immunostaining

  1. Fortsæt med muskelfiberpermeabilisering: Overfør muskelbundter til 24-brøndsplader indeholdende 1% (v / v) Triton X-100 i PBS og hold dem under blid omrøring (50 o / min) i 1 time ved RT eller 5 timer ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Opdel muskelbundterne mellem to plader for at fortsætte med separate immunostainings og for at minimere risikoen for antistofforvirring. Del dem ikke i mere end to brønde (1 brønd / plade); Ellers kan antallet (N) af NMJ'er, der er repræsentative for deres generelle status i den analyserede muskel, være utilstrækkeligt.
  2. Prøverne vaskes 3x i 5 minutter med PBS ved RT, og dem inkuberes med en blokerende opløsning sammensat af 4% bovin serumalbumin (BSA) i PBS/Triton X-100 1% i 4 timer ved 4 °C under blid omrøring (50 o / min).
    BEMÆRK: Brug ikke en aspirationspumpe under vasketrinnene, men opsæt opløsningen manuelt med en 200 μL pipette og små spidser (referencen er angivet i materialetabellen).
  3. Prøverne inkuberes natten over (O/N) ved 4 °C under blid omrøring (50 o/min.) med den blokerende opløsning, der er angivet i trin 2.2, og som indeholder primære monoklonale antistoffer mod enten neurofilament M (NF-M, 2H3, fortynding 1/200) eller synaptisk vesikelglycoprotein 2 (SV2, fortynding 1/200) for at mærke henholdsvis præsynaptiske axonterminaler eller aktive zoner.
  4. Næste dag vaskes muskelbundterne 3x i 5 minutter i PBS under omrøring (50 o / min).
    1. Til konfokal billeddannelse: Inkuber muskelbundterne med sekundære antimuseantistoffer konjugeret med en rød-emitterende fluorophore (F594) (fortynding 1/500) og α-bungarotoxin konjugeret med en grøn-emitterende fluorophore (α-BTX-F488) (fortynding 1/1000) i PBS i 2 timer ved RT under omrøring (50 o / min).
    2. Til STED-billeddannelse: Inkuber muskelbundterne med sekundære antimuseantistoffer konjugeret med en grøn-emitterende fluorophore (F488) (fortynding 1/500) og α-bungarotoxin konjugeret med en langt rød emitterende fluorophore karakteriseret ved høj fotostabilitet (α-BTX-F633) (fortynding 1/1000) i PBS i 2 timer ved RT under omrøring (50 o / min).
      BEMÆRK: Udsæt ikke prøverne for lys under inkubation for at undgå fotoblegning.
  5. Vask de mærkede muskelbundter 3x i 5 minutter med PBS under omrøring (50 o / min) og læg dem på et dias med et monteringsmedium.
    BEMÆRK: Placer maksimalt 4 til 5 muskelbundter pr. Glide for at tillade forsegling.
  6. Tilføj en klasse #1.5 (eller #1.5H) glasdæksel (0,17 mm tykkelse) på toppen, og placer cylindriske magneter på begge sider af diaset for at påføre tryk og flade musklerne.
  7. Hold lysbillederne beskyttet mod lys O/N ved 4 °C. Forsegl diasene permanent med neglelak.

3. Erhvervelse af billeder

  1. Erhvervelser ved hjælp af et konfokalmikroskop
    BEMÆRK: Billeder blev indsamlet med et omvendt laserscanningskonfokalmikroskop ved hjælp af et 63x størrelsesorden olienedsænkningsmål (HCX Plan Apo CS, 1.4 numerisk blænde (NA)).
    1. For blindet analyse, lad en person, der ikke er involveret i analysen, kode hvert dias med et givet nummer. Forbliv blindet for forsøgsgrupperne, indtil kvantificeringen af NMJ-parametre er afsluttet for alle prøver.
    2. Start mikroskopsoftwaren i konfigurationstilstand > machine.xlhw (supplerende figur 1).
    3. Placer diaset på mikroskoptrinnet, og find observationsplanet i prøven ved at se under DAPI-bredfeltfluorescensbelysning med DAPI-filtersættet.
    4. Klik på Åbn projekt > nye projekter , og opret en mappe til lagring af billedanskaffelser (supplerende figur 1).
      BEMÆRK: Opret et nyt projekt for hver NMJ for at begrænse mappestørrelsen og forhindre problemer med computerens hukommelse.
    5. For at administrere anskaffelsesparametre skal du klikke på fanevinduet Anskaffelse og indstille det konfokale pinhole til 1.0 luftig enhed og laserkraft for at optimere forstærknings- og offsetniveauerne for den grønne / F488 (α-BTX) fluorescens ved hjælp af en 488 nm laser ved slutpladen, der skal afbildes (Live-tilstand ON).
    6. Derefter optimeres rød/F594 (NF-M eller SV2) fluorescensoptagelse ved hjælp af en laser tilpasset F594-observation. I denne undersøgelse blev der anvendt en 552 nm laser (Live mode ON). Indstil spektret af farvestofemission med følgende intervaller for hver laser: laser 405 (DAPI) fra 414 til 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) fra 506-531 nm og laser 552 (NF-M/SV2) fra 622-650 nm.
    7. Saml billedstakke af neuromuskulære kryds i hver eksperimentel gruppe med de samme indstillinger: billedstørrelse 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm) ved 400 Hz samplingshastighed, Tovejs X ON, zoomfaktor 2,5, Z-trinstørrelse 0,5 μm i Z-breddetilstand.
      BEMÆRK: For hver NMJ er antallet af skiver indstillet til at erhverve hele krydset. De ovenfor beskrevne erhvervelsesindstillinger opfylder Nyquist-Shanon-prøveudtagningssætningen. Brugeren kan dog klikke på knappen Optimer format , der findes på al nyere konfokal driftssoftware, for at sikre, at pixelstørrelse og Z-trin opfylder den ideelle Nyquist-samplingshastighed. Denne handling vil undgå over- eller undersamplede billeder, hvilket vil medføre tab af nøjagtighed i volumenmålinger.
    8. Gem den oprindelige fil (.lif) eller Z-stack-billeder (.tif) i en mappe med et navn, der indeholder kodenavnet på sliden, farvningstypen og slutpladenummeret.
      BEMÆRK: Saml sekventielt (ikke samtidigt) scanningerne ved hjælp af 488 nm og 552 nm lasere (F488 og F594) for at undgå krydstale af F488-fluorescensen i F594-kanalen og omvendt (blødning). NB: strålestien kan konfigureres med farveassistenten i mikroskopsoftwaren.
    9. Skift til det næste kodede dias, og gentag trin 3.1.3-3.1.8 for hver NMJ.
    10. I slutningen af sessionen skal du klikke på Åbn i 3D-fremviser og vælge en NMJ-repræsentant for en eksperimentel gruppe for at visualisere 3D-mærkningen.
      BEMÆRK: Denne visningstilstand hjælper med at kontrollere, at anskaffelsesparametrene var korrekte.
    11. Luk mikroskopsoftwaren, rengør målene med linsevæv, og sluk derefter for systemet.
  2. Opkøb ved STED-mikroskopi
    BEMÆRK: Billeder blev indsamlet med et omvendt laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med Gated STED ved 775 nm ved hjælp af et 100x olienedsænkningsmål (HC PL APO CS2 1.4 NA).
    1. For blindet analyse, lad en person, der ikke er involveret i analysen, kode hvert dias med et givet nummer. Forbliv blindet for forsøgsgrupperne, indtil kvantificeringen af NMJ-parametre er afsluttet for alle prøver.
    2. Start mikroskopsoftwaren i konfigurationstilstand > machine.xlhw og STED ON (supplerende figur 2).
    3. Klik på Åbn projekt > nye projekter for at oprette en mappe til lagring af billedanskaffelser.
      BEMÆRK: Generer en ny mappe for hvert dias for at begrænse mappestørrelsen og forhindre problemer med computerens hukommelse.
    4. Placer diaset på mikroskoptrinnet, og se det under lysstofbelysning med bredfelt ved hjælp af 488 nm-laseren for at finde observationsplanet i prøven.
    5. Søg efter en NMJ mærket med neurofilament M (NF-M) eller SV2 farvninger ved hjælp af 488 nm laseren med en spektral detektion fra 506-531 nm.
    6. Når en NMJ er blevet identificeret, skal du klikke på Aktivér STED og begynde at hente billeder i et område, der indeholder flere krydsningsfolder (supplerende figur 3) ved hjælp af 635 nm laseren med en spektral detektion fra 640-750 nm.
      BEMÆRK: Vær forsigtig med mætningsopslagstabellen under billedoptagelse, og klik på knappen Hurtig LUT for at undgå overeksponering (grå værdier >255; for 8 bit).
    7. Saml billederne fra hver eksperimentel gruppe med de samme indstillinger: billedstørrelse 2048 x 2048 pixels (38,75 x 38,75 μm) ved en samplingshastighed på 400 Hz.
      BEMÆRK: STED-effekten (Depletion Laser) er indstillet til 65%.
    8. Gem billederne med et filnavn, der indeholder koden til sliden.
      BEMÆRK: Det er muligt at klikke på Optimeret XY-format: Indstil format til for at opnå den bedste anskaffelsesindstilling med STED-billeddannelse.
    9. Skift til det næste kodede dias, og gentag trin 3.2.3-3.2.8. Gentag denne procedure for alle dias.
    10. I slutningen af STED-mikroskopisessionen skal du overføre billedfilerne til en anden computer og gemme de originale filer (. lif) i et eksternt drev eller en ekstern server.
    11. Sluk for mikroskopsoftwaren, rengør målene med linsevæv, og sluk derefter for systemet.

4. Billedanalyse - konfokal mikroskopi

BEMÆRK: Alle billeder blev behandlet med computere ved hjælp af Microsoft Windows 10 professionelt operativsystem.

  1. Start ImageJ og brugerdefineret makro for at beregne postsynaptisk NMJ-slutpladevolumen, PMU-område (Maximum Intensity Projection) og relativ tortuositet.
    1. Behandl NMJ-billedstakke ved hjælp af NIH ImageJ freeware23, iGeodesic-pluginet og den brugerdefinerede makro for at opnå NMJ-parametermålinger. Start ImageJ-software.
      BEMÆRK: Den nyeste version af ImageJ er frit tilgængelig og kan downloades24. For at åbne proprietære filformater skal Bio-Formats Package25-plugin downloades26 . Dette trin er ikke nødvendigt, hvis operatøren bruger Fiji, fordi pluginet allerede er installeret i softwaren. iGeodesic-pluginet27 til beregning af tortuositet er også tilgængeligt online28; kontrollere tilgængeligheden af dette plugin i ImageJ / Fiji-versionen, der vil blive brugt. De specialfremstillede makroer er også tilgængelige online29.
    2. Træk og slip Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (specialfremstillet, supplerende kodningsfil 1) til ImageJ-vinduet; makroen åbnes i et andet vindue. I dette nye vindue skal du klikke på Makroer > Kør makro.
      BEMÆRK: Makroen kan behandle både proprietære filer og TIFF-filer. Filer skal opfylde følgende kriterier: For proprietære filformater skal du kun gemme et kryds (dvs. stakken af billeder) pr. Fil, bestilt i en mappe; for TIFF-billeder skal filer gemmes i en mappe, der indeholder undermapper, hver med navnet JunctionX (X svarer til et NMJ-nummer) med billedstakkene for et givet kryds (RGB TIFF) (supplerende figur 4).
    3. Vælg den oprindelige mappe, der indeholder Junction-undermapperne, der skal analyseres, og klik på Vælg.
    4. I den nye pop op-menu kaldet Gem mappe skal du vælge lagringsmappen og klikke på Vælg.
    5. I den nye pop op-menu kaldet Billedtype skal du vælge formatet for Z-stack-anskaffelserne.
    6. Vælg den RGB-kanal, der svarer til farvningen af interesse, og angiv XY-pixelstørrelse og Z-trin (z). Makroen udfører automatisk analysen.
      BEMÆRK: Hvis der vælges proprietære filformater, læser makroen direkte pixelstørrelse og Z-trin (z). Brugeren skal dog stadig angive den relevante kanal (C1, C2 eller C3). Makroen indeholder et DataSheet (.csv) for hver forbindelsesparameter (slutpladevolumen, MIP-område og tortuositet) i gemmemappen. Makroen genererer også tre . TIF-filer , der svarer til omkredsen af α-BTX-farvnings Drawing_MaxprojX.tif, DrawingJunctionX.tif og MIP MaxprojX.tif. Disse TIFF-filer genereres for at kontrollere kvaliteten af erhvervelserne og for at sikre, at billedbehandling er udført korrekt.
      Postsynaptisk NMJ-volumen (V): Makroen adskiller billeder fra en enkelt NMJ og beholder den α-bungarotoxin F488-kanal svarende til den postsynaptiske slutplade. Stakken er segmenteret ved hjælp af Otsu-tærskel30 på den mellemliggende del af stakken. Det resulterende binære billede er 1 pixel udvidet, og funktionen Analysér partikler bruges til at måle endepladeområdet for hvert detekteret objekt. For at opnå det postsynaptiske NMJ-volumen summerer makroen alle målte endepladeområder i stakken og multiplicerer den med Z-trinsværdi (z) i μm.
      Equation 1
      Slutpladeområde med maksimal intensitetsprojektion (MIP): Når stakken er begrænset, opnås den maksimale intensitetsprojektion (MIP) ved hjælp af Z-projekt ImageJ-funktionen . Funktionen Analysér partikler bruges derefter til at kvantificere MIP-slutpladeområdet.
      NMJ MIP tortuositet (T): NMJ-tortuositeten, som afspejler kompleksitetsgraden af den postsynaptiske motorendeplade inklusive folder og perforeringer31, beregnes ud fra hver MIP ved hjælp af følgende formel, hvor d Obj (AB) er afstanden mellem A og B langs objektets omkreds, og dEuc (AB) er den euklidiske afstand mellem A og B (lige linje).
      Equation 2
    7. Indstil den højeste tortuositetsværdi i vildtypegruppen for hver eksperimentel tilstand til 100%, og normaliser alle de andre værdier af den eksperimentelle tilstand til denne værdi for at opnå den relative NMJ-tortuositet.
  2. Start ImageJ og brugerdefineret makro for at kvantificere præsynaptisk neurofilamentakkumulering og synaptisk vesikelglycoprotein 2-farvning.
    BEMÆRK: Neurofilamentakkumulering (her NF-M) og / eller ændret fordeling af synaptiske vesikler (her SV2) er markører for unormal axonal transport og / eller nedsat vesikelhandel og blev tidligere observeret i NMJ'er af forskellige SMA-musemodeller32,33,34.
    1. Træk og slip Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (specialfremstillet, supplerende kodningsfil 2) til ImageJ-vinduet; makroen åbnes i et andet vindue. I dette nye vindue skal du klikke på Makroer > Kør makro.
      BEMÆRK: Makroen kan behandle både proprietære filformater og TIFF-filer. Filer skal opfylde kriterierne i NOTE nedenfor trin 4.1.2.
    2. Vælg den oprindelige mappe, der indeholder Junction-undermapperne, der skal analyseres, og klik på Vælg.
    3. I den nye pop op-menu kaldet Gem mappe skal du vælge lagringsmappen og klikke på Vælg.
    4. I den nye pop op-menu kaldet Billedtype skal du vælge formatet for Z-stack-anskaffelserne.
    5. I pop op-vinduet Farveoplysninger skal du angive den præsynaptiske og postsynaptiske etiket og farve og klikke på OK. For eksempel Presynaptic label: SV2 eller NF, Presynaptic farve: R, Postsynaptic label: BTX, Postsynaptic farve: G.
      BEMÆRK: For proprietære filformater skal etiketter og tilsvarende kanaler (C1, C2 eller C3) angives.
    6. I pop op-vinduet Pixelstørrelse skal du angive XY-pixelstørrelse 0,072 μm og Z-trin 0,5 μm (z) og klikke på OK. Makroen udfører automatisk analysen.
      BEMÆRK: Denne parameter svarer til billedstørrelsen 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm), der er valgt før konfokale mikroskopanskaffelser, og den er korreleret med objektiv- og zoomindstillingerne. Hvis de proprietære filformater er valgt, læser makroen direkte pixelstørrelse og Z-trin (z). Makroen gemmer i gemmemappen et DataSheet (.csv) af præsynaptiske og postsynaptiske diskenheder, et flersidet TIFF-billede af den aktuelle registrering for hver (præ- og postsynaptisk) mærkning. Som angivet ovenfor genereres disse TIFF-filer for at kontrollere kvaliteten af erhvervelserne og for at sikre, at billedbehandling er udført korrekt.
      Makroen beregner volumenet af axonal neurofilament M-farvning (NF-volumen) fra NF-M-F594-kanalen, der colokaliserer med α-bungarotoxin-F488-mærkning og volumenet af NMJ synaptisk vesikelglycoprotein 2-farvning (SV2-volumen) fra SV2-F594-kanalen, der colocalizes med α-BTX-F488-mærkning. NF-M-akkumuleringen kvantificeres ved at beregne forholdet mellem NF-volumen og postsynaptisk slutpladevolumen (α-BTX) og NMJ-axonterminalbelægning ved forholdet mellem SV2- og α-BTX-volumener som vist nedenfor.
      Equation 3
      Equation 4

5. Billedanalyse - STED-mikroskopi

BEMÆRK: Billedbehandling blev udført med offline-softwaren fra STED-mikroskopproducenten.

  1. Start mikroskopsoftwaren.
  2. Åbn projektet ved at klikke på knappen Åbn projekt . Vælg projektfilen (.lif), og åbn den. Billederne vises på skærmen sammen med deres navne.
  3. I procesvinduet : Klik på Støjreduktion > median. Nederst i det midterste vindue skal du indstille Radius til 5,00 og Iteration til 1,00 og fjerne markeringen af 3D-filtrering.
  4. Vælg derefter Åbn projekter fanen øverst til venstre i vinduet, og vælg et billede.
  5. Klik på Anvend for at validere parametre. Et nyt billede kaldet "nameofimage_median001" oprettes.
    BEMÆRK: Det er muligt at klikke på Preview før Anvend for at overvåge effekten af medianfilteret, hvilket vil forbedre billedkontrasten og udjævne de linjeprofiler, der bruges til kvantificering.
  6. Anvend filteret på alle billeder som angivet i trin 5.4-5.5.
  7. I fanerne Åbn projekter skal du klikke på diskettedrevikonet for at gemme alle projekterne, inklusive de nyoprettede filtrerede billeder.
    BEMÆRK: Det næste trin udføres ved hjælp af det filtrerede billede med navnet "nameofimage_median001".
  8. Beregn afstanden mellem AChR-striber
    BEMÆRK: Ændringer i morfologien af postjunktionelle folder observeres ofte i neuromuskulære lidelser som tegn på NMJ-patologi (umodenhed eller degeneration). Afstanden (d) mellem AChR-striber, som detekteres ved α-bungarotoxinfarvning, beregnes ved at generere intensitetsprofiler og kvantificere afstanden mellem hver maksimal intensitetstop ved at tegne en linjeprofil (supplerende figur 5).
    1. Brug mikroskopsoftwaren til at vælge menuen Kvantificer øverst i det centrale vindue.
    2. Klik på fanen Værktøjer øverst til venstre. Vælg Intensitet i øverste venstre panel, og klik på ikonet Linjeprofil . Indstil Oversampling til 1, og marker Sorter kanaler.
    3. Klik på fanerne Åbn projekter , og vælg det filtrerede billede, der skal analyseres.
      BEMÆRK: Det er muligt at zoome ind på billedet ved at rulle med computermusen. Billedets dynamiske område kan ændres ved hjælp af bjælken på venstre side ved siden af det viste billede, hvilket letter visualiseringen af striberne.
    4. Klik derefter på ikonet Tegn linje i topmenuen i højre vindue og spor en linje, der krydser vinkelret flere striber / krydsningsfolder.
      BEMÆRK: Intensitetsprofilen vises i det centrale vindue.
    5. Klik på toppen af den første top, og flyt musemarkøren, mens du holder venstre museknap nede, indtil den næste maksimale top er nået.
      BEMÆRK: Oplysningerne vises i intensitetsprofilen, mens afstanden mellem de to toppe vises under diagrammet med "dx" -betegnelse.
    6. Klik til højre på musen, mens du er i billedet af det højre vindue, og vælg Gem ROI'er. Åbn de gemte investeringsafkast (interesseområder) ved at klikke på Indlæs investeringsafkast.
    7. Klik på pilikonet øverst til venstre i højre vindue, klik på ROI og slet det ved at klikke på bin-ikonet.
    8. Gentag denne operation så mange gange som nødvendigt fra forskellige intensitetsprofiler for at opnå det forudsagte antal AChR-stribeafstande, der repræsenterer den globale værdi i den analyserede muskel.
      BEMÆRK: Den optimale N-værdi kan beregnes på forhånd baseret på den estimerede forskel mellem grupper, α risiko, effekt og en- eller to-sidet test. I det nuværende eksperimentelle design blev der anvendt en en-tailed Mann-Whitney-test (α risiko = 10%; effekt = 80%), og N-værdien blev anslået til at være mindst fem AChR-stribeafstande pr. NMJ for at sammenligne de to grupper af dyr.
  9. AChR stribe bredde
    BEMÆRK: Stribebredden (w) svarer til intensitetsprofilens halvmaksimum (FWHM) i fuld bredde, hvilket er afstanden mellem de punkter, hvor α-BTX-signalfluorescensværdien er halvdelen af dens maksimale intensitet (supplerende figur 5).
    1. Brug mikroskopsoftwaren til at vælge menuen Kvantificer i det centrale vindue.
    2. Klik på fanen Værktøjer øverst til venstre. Vælg Intensitet i øverste venstre panel, og klik på ikonet Bestem FWHM . Marker Sorter kanaler.
      BEMÆRK: For at optimere softwarens maksimale detektion blev Indstil tærskel og bredde indstillet til henholdsvis 50 og 3. Tilpas disse værdier for hvert eksperiment og bede om råd fra en erfaren billeddanner.
    3. Klik på fanen Åbn projekter , og vælg det filtrerede billede, der skal analyseres.
      BEMÆRK: Det er muligt at zoome ind på det viste billede i højre vindue ved at rulle med computermusen. Som angivet ovenfor (BEMÆRK efter trin 5.8.3) kan billedets dynamiske område ændres for optimal stribevisualisering.
    4. Klik derefter på ikonet Tegn rektangel i topmenuen i højre vindue. Vælg en stribe, der enten er vandret eller lodret, og tegn et rektangel vinkelret på striben. Der vises en profil i det centrale vindue.
    5. Klik på enten lodret eller vandret i menuen Gennemsnitlig projektion i venstre panel, afhængigt af om striberetningen er lodret eller vandret.
    6. Klik på Statistik i det centrale vindue og læs FWHM-værdien.
    7. Foretag et højreklik med computermusen på billedet, der vises i højre vindue, og vælg Gem ROI'er.
      BEMÆRK: Åbn de gemte investeringsafkast ved at klikke på Indlæs investeringsafkast.
    8. Klik på pilikonet øverst til venstre i højre vindue, klik på ROI og slet det ved at klikke på bin-ikonet.
    9. Gentag denne operation så mange gange som nødvendigt fra forskellige rektangel ROI'er, indtil der opnås det forventede antal AChR-stribebredder, som vil være repræsentative for den globale værdi i den analyserede muskel.

6. Eksperimentelt design og statistiske test

  1. Udfør statistiske analyser ved hjælp af specifik software.
    BEMÆRK: Data blev indsamlet fra N ≥ 3 biologiske replikater og mindst 20 NMJ'er pr. genotype til konfokal mikroskopbilleddannelse og N ≥ 5 biologiske replikater og N = 5 NMJ'er pr. genotype for STED-billeddannelse i hver forsøgsgruppe. Signifikans blev vurderet ved uparret Mann-Whitney-test (ikke-parametrisk), og p-værdier er angivet i de tilsvarende figurforklaringer.

Representative Results

For at lette den morfologiske analyse af neuromuskulære kryds på præ- og postsynaptisk niveau på en reproducerbar måde blev der udviklet en arbejdsgang fra muskelhøst til billeddannelse og kvantificering ved hjælp af mikroskopsoftwaren og ImageJ brugerdefinerede makroer (figur 1). For at eksemplificere nytten af denne protokol blev morfologien af NMJ'er i to musemodeller af genetiske lidelser, Smn2B / - og ColQDex2 mus påvirket af henholdsvis spinal muskelatrofi (SMA) og en medfødt myasthenisk syndrom (CMS) form, evalueret, og data blev sammenlignet med aldersmatchede kontrolkuldkammerater.

NMJ-strukturen blev vurderet ud fra tibialis anterior- og gastrocnemius-muskler i henholdsvis 3- og 6 uger gamle Smn2B/- (C57Bl/6-baggrund) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J-baggrund), når der allerede er tegn på sygdommen hos disse dyr. Ved 3 ugers alderen viser Smn2B/- mus tegn på forsinket skeletmuskeludvikling og denervation, såsom NMJ-atrofi og tab35,36. CMS-mus har en primær patologi i NMJ'er og manifesterer en reduktion i kropsvægt fra den første uge af livet og markant muskelsvaghed20 (data ikke vist). Som vist i figur 2A syntes den postsynaptiske motorendeplade mærket med fluorescerende α-bungarotoxin mindre og/eller fragmenteret i mutanter af de to muselinjer ved konfokal mikroskopi. Kvantificering af NMJ Z-stakke ved hjælp af denne tilpassede ImageJ-makro afslørede markante fald i endepladevolumen, maksimal intensitetsprojektion (MIP) og relativ tortuositet hos både SMA- og CMS-mus sammenlignet med kontroller, som tegn på NMJ-modningsfejl32 (figur 2B-D). Postsynaptisk slutpladevolumen og MIP blev nedsat hos syge dyr (foldændring på 2,7 og 2,0 for volumen og 2,5 og 2,0 for MIP i henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus). Den relative tortuositet var også mindre i SMN- og ColQ-mangelfulde muskler end WT (16,97% ± 1,33% i SMA versus 48,84% ± 5,90% WT-mus og 13,29% ± 2,79% i CMS versus 30,20% ± 4,44% kontrolmus). Derudover afslørede kvantificeringen af fordelingen af præsynaptiske axonterminalgrene ved hjælp af ImageJ brugerdefinerede makro et ændret mønster i neurofilament M-fordeling i de to dyremodeller med øget immunmærkning (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% og 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% i henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus sammenlignet med kontroller) (figur 3A-D ). Ved SV2-farvning blev der også observeret en 43% reduktion i belægningsforholdet, dvs. procent af AChR-holdige regioner med tilstødende nerveterminale aktive zoner, i Smn2B / - mus (49,36% ± 3,76% i SMA versus 85,69% ± 2,34% WT-mus) (figur 3E, F). Denne NMJ-parameter blev også beregnet i GA for ColQ Dex2/Dex2-mutanter, men der blev ikke fundet nogen statistisk signifikant forskel sammenlignet med kontrolkuldkammerater (data ikke vist).

Vi analyserede yderligere postsynaptiske membranegenskaber ved at kvantificere afstanden mellem krydsningsfolder og bredden af AChR-striber, som er placeret ved toppen af disse folder, i ColQ-mangelfuld muskel ved hjælp af superopløsningsstimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Som vist i figur 4 kan aspektet af disse strukturer tydeligt visualiseres ved fluorescerende α-bungarotoxin mærkning og intensitetsprofilanalyse. Vi evaluerede disse NMJ-parametre og fandt en stigning i krydsningsfoldafstanden (d) og bredden (w) af AChR-striber i gastrocnemiusmusklen hos mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm og 320,8 nm ± 10,90 nm for afstanden og 216,9 nm ± 10,51 nm og 186,3 nm ± 7,015 nm for bredden i ColQ Dex2/Dex2 sammenlignet med vildtypemus, henholdsvis p < 0,05) (figur 4C,D).

Figure 1
Figur 1: Flowchart af videoprotokollen til 3D multiscale NMJ-karakterisering ved konfokal og STED-mikroskopi. Tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler blev indsamlet fra mus, og muskelfibre blev drillet før mærkning med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primære antistoffer rettet mod neurofilament M (NF-M) og synaptisk vesikel glycoprotein 2 (SV2) og fluorophore (F488 eller F594) -konjugerede sekundære antistoffer. Billedstakke blev erhvervet ved konfokal mikroskopi og behandlet til måling af postsynaptisk NMJ-volumen, præsynaptisk NF-M-akkumulering, NMJ-axonterminalbelægning, postsynaptisk maksimal intensitetsprojektion (MIP) endepladeområde og tortuositet (d Obj (AB) er afstanden mellem A og B langs objektets omkreds (rød linje), mens dEuc (AB) er den euklidiske afstand mellem A og B (grøn linje)). Til STED-mikroskopianalyse blev bredden af acetylcholinreceptor (AChR) striber og afstanden mellem krydsningsfolder kvantificeret fra intensitetsprofiler af α-BTX-F633-farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Multi-parameter postsynaptisk NMJ-karakterisering i musemodeller af spinal muskelatrofi (SMA) og ColQ-relateret medfødt myasthenisk syndrom (CMS). (A) Repræsentative billeder af postsynaptiske motoriske endeplader fra TA- og GA-muskler mærket med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantificering af NMJ postsynaptisk endepladevolumen, (C) maksimal intensitetsprojektion (MIP) areal og (D) relativ tortuositet i TA af 3 uger gamle vildtype (WT) og Smn2B /- mus (venstre grafer, N = 3 dyr pr. genotype, n = 37 og n = 56 NMJ'er) og 6 uger gamle WT og ColQ Dex2/Dex2 mus (højre grafer, N = 5 mus pr. genotype, henholdsvis n = 89 og n = 97 NMJ'er). Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Morfometrisk analyse af presynaptisk axonterminalfordeling i muskler hos WT og mutante mus. NMJ innerveringsmønster i tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler af vildtype, SMA og ColQ-relaterede CMS-mus. (A, B) Repræsentative neuromuskulære kryds fra TA af WT- og Smn2B/- mus ved 21 dages alderen mærket med antistoffer mod neurofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn) (A) og resultater fra kvantitativ analyse af neurofilamentakkumulering (B); (C, D) Repræsentative neuromuskulære kryds fra GA af 6 uger gamle WT- og ColQDex2/Dex2-mus mærket med antistoffer mod neurofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn), der viser fragmenterede og umodne postsynaptiske endeplader (C) og resultater af neurofilamentakkumulering i de to grupper af dyr (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) og N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT dyr, og N = 3 (n = 36 NMJs) Smn2B / - og N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2 / Dex2 mus blev analyseret i forsøgene (B, D). (E, F) Repræsentative billeder af axonterminalbelægning i NMJ'er fra TA af 3 uger gamle WT- og Smn2B/- mus mærket med antistoffer mod synaptisk vesikelglycoprotein 2 (SV2, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn) (E) og resultater af NMJ-belægning (SV2/AChR-volumenforhold) (F). Muskler fra N = 3 (n = 50 NMJs) vildtype og N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B /- mus blev analyseret. Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalastænger er 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: STED-billeddannelse af NMJ postsynaptiske slutplader. (A) Repræsentativt STED-billede af en NMJ mærket med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) fra gastrocnemius af en 6 uger gammel vildtypemus, der viser postjunctional AChR-striber (skalabjælken er 5 μm). (B) Højere forstørrelse af et område med AChR-striber (bundpanel), der blev brugt til at generere intensitetsprofilen. Bredden (w) af AChR-striber og afstanden mellem to tilstødende striber (d) i denne region blev kvantificeret og præsenteret i søjlediagrammet. Skematisk gengivelse af den postsynaptiske endeplade for at illustrere AChR-stribebredde (w) og afstand (d). Disse parametre, (C) AChR stribeafstand og (D) bredde, blev målt i ColQ Dex2/Dex2 mus og kontrolkuldkammerater ved 6 ugers alderen. NMJ'er fra 5 WT (i alt n = 29 NMJ'er) og 6 ColQ Dex2/Dex2 (i alt n = 43 NMJ'er) dyr blev analyseret blindt. Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Statistiske forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af Mann-Whitney-testen (* p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Lancering af LAS X-software og parametre for confocal acquisitions. De forskellige trin til erhvervelse af konfokale billeder er beskrevet i afsnit 3.1.2 til 3.1.7 i protokollen. For hver NMJ-stakanskaffelse åbnes et projekt (trin 3.1.4), og parametrene billedstørrelse, anskaffelseshastighed, X-, Y- og Z-akser vælges (trin 3.1.7), hvor hver sekventiel scanning er angivet (Seq.1, laser 405 til DAPI; Seq.2, laser 488 til α-BTX-F488; og Seq.3, laser 552 til F594 konjugerede sekundære antistoffer). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Lancering af LAS X-software og parametre for STED-opkøb. Trinene til erhvervelse af STED-billeder er beskrevet i afsnit 3.2.2 til 3.2.8 i protokollen. Mikroskopet startes i konfigurationstilstand STED ON (trin 3.2.2), og et projekt åbnes (trin 3.2.3). Parametrene for billedoptagelse (trin 3.2.7) (billedstørrelse, anskaffelseshastighed, zoomfaktor, X-akse) med hver sekventiel scanning er angivet (Seq.1 for α-BTX-F633; Seq.2 for F488 konjugerede sekundære antistoffer). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Billeder af α-BTX-farvede krydsfolder opnået ved STED-mikroskopi. Billedeksempler på en postsynaptisk slutplade mærket med α-BTX-F633 fra en 6 uger gammel vildtypemus, der blev erhvervet med enten et korrekt (venstre) eller forkert fokus (højre). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Windows-pop op-vinduer til beskrivelse af input- og outputdata, der er opnået af de brugerdefinerede ImageJ-makroer. Inputdataeksempler (.tif- og .lif-filer) på NMJ-billeder vises i venstre kolonne. Outputdataene fra makroerne (højre kolonne) gemmes i mapper (Save_Volume, Save_Accu), der indeholder billeder af krydset (.tif) og datablade, der indeholder resultaterne (.csv filer). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: AChR-stribeafstands- og breddeanalyse fra en STED-anskaffelse ved hjælp af LAS X-softwaren. Trinene til analyse af NMJ STED-billeder er beskrevet i afsnit 5 i protokollen. A) Billede af et mærket postsynaptisk endepladeområde indeholdende AChR-striber. Interesseområdet for stribeanalyse vælges ved at tegne en vinkelret linje (grøn linje, for stribeafstand) eller et vinkelret rektangel (lilla rektangel, for stribebredde). (B, C) Intensitetsprofiler for de valgte regioner og målinger til beregning af afstanden mellem AChR-striber (B) og AChR-stribebredde (C) vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ brugerdefineret makro til at udtrække NMJ-parametermålinger (NMJ-volumen, MIP-endepladeområde og NMJ-tortuositet). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ brugerdefineret makro til udpakning af NF-M-akkumulering og SV2-farvning. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den beskrevne videoprotokol giver en detaljeret metode til at kvantificere 3D-strukturen af neuromuskulære kryds ved at kombinere konfokal og STED-mikroskopi, der kan bruges til at karakterisere patologiske ændringer på præ- og postsynaptiske niveauer. Den høje opløsning af STED-mikroskopi muliggør visualisering og morfometrisk analyse af nanostrukturer, der ikke kan identificeres ved konventionel konfokal billeddannelse. Denne procedure gjorde det muligt for os at måle strukturelle ændringer af NMJ'er i to appendikulære muskler, tibialis anterior og gastrocnemius, af SMA og ColQ-relaterede CMS-mus.

For at opnå pålidelige resultater med denne teknik er det vigtigt at dissekere og drille musklerne ordentligt og være særlig opmærksom på fasciaen omkring musklen og den anvendte styrke til at adskille muskelbundter; Ellers kan innerveringsmønsteret forstyrres, hvilket hindrer korrekt præsynaptisk NMJ-vurdering. Selvom der gives detaljerede oplysninger til at analysere NMJ'er fra TA og GA, kan denne protokol i princippet tilpasses andre muskler, herunder flade muskler, såsom membranen eller tværgående abdominis37, som ikke kræver drilletrinnet. Vævsfiksering er også afgørende for at sikre farvning af god kvalitet; derfor anbefales det at anvende PFA af høj kvalitet i et passende volumen (15-20 gange musklens). Derudover er eksponeringstiden for fikseringsmidlet et vigtigt skridt, fordi artefakter, såsom krympning og klumpning, kan forekomme på grund af overfiksering og indflydelse på NMJ-funktioner. I betragtning af prøvernes størrelse og penetrationshastigheden for paraformaldehydopløsningen i væv38 anbefales en fikseringstid på 18-24 timer til denne type muskel. Hvis farvningstrinnet planlægges mere end en uge efter vævshøst, foreslås det at holde PFA-faste muskler i PBS suppleret med natriumazid ved 4 °C for at forhindre bakteriel spredning.

Denne protokol præsenterer en tilgang, der bruger α-BTX-F488 til konfokal og α-BTX-F633 til STED-billeddannelse. Disse fluorophorer blev valgt til at passe til det beskrevne eksperimentelle design, men kan ændres i henhold til det tilgængelige udstyr og materialer. For eksempel kan α-BTX F488-mærkning vælges, når du bruger en STED CW 592 nm laser til billedoptagelse og kvantificering. Det ser imidlertid ud til, at den konfiguration, der blev anvendt i denne undersøgelse (pulserende excitation gated STED, 775 nm udtømning) udviser højere ydeevne og bedre opløsning end andre tilgange, såsom kontinuerlig bølge STED39, hvilket gør den mere egnet til den aktuelle anvendelse. Det er også vigtigt omhyggeligt at vælge lasereffektindstillingerne, især for STED (både excitation og udtømning), da egenskaberne ved en intensitetsprofil ikke kan måles i tilfælde af mætning, og derfor kan ethvert mættet signal i et NMJ-billede bringe hele analysen i fare.

Denne detaljerede arbejdsgang, herunder billedanskaffelser og analyse ved hjælp af mikroskopsoftware og ImageJ-makroer, blev udviklet til at lette autonom NMJ-morfometrisk analyse ved konfokal og STED-mikroskopi fra en enkelt muskel. Tidligere beskrevne arbejdsgange for NMJ konfokal analyse, såsom NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banede vejen for design af halvautomatiske metoder, der letter morfologisk analyse af NMJ'er og komparative undersøgelser. NMJ-morph (og dens opdaterede version aNMJ-morph15) er en gratis ImageJ-baseret platform, der bruger den maksimale intensitetsprojektion til at måle 21 morfologiske funktioner, og NMJ-Analyser bruger et script udviklet i Python, der genererer 29 relevante parametre fra hele 3D NMJ-strukturen. Manuel tærskel er det eneste trin under billedbehandling i disse to metoder, der kræver brugeranalyse. Denne integrerede protokol beskriver trin til vævsforberedelse, 3D-konfokale billedopkøb og ImageJ-baseret behandling af NMJ'er fra hele skeletmuskler og giver et forenklet overblik over fem vigtige parametre for de postsynaptiske (volumen, maksimalt projektionsområde og tortuositet) og præsynaptiske (axonterminal belægning og neurofilamentakkumulering) endeplader. En yderligere parameter af biologisk relevans, AChR-organisationsmønsteret for de postsynaptiske junctional folds, blev indarbejdet til morfometrisk analyse på nanoskalaniveau ved superopløsning STED-mikroskopi (opløsning 20-30 nm)40. Interessant nok er vævsforberedelse til STED-billeddannelse enklere end andre metoder, der anvendes til NMJ-ultrastrukturelle undersøgelser, såsom konventionel transmissionselektronmikroskopi (TEM)9, hvilket er en ret kompleks og tidskrævende procedure, der kræver en dygtig manipulator for at opnå ultratynde sektioner af den passende muskelregion. Derudover kan kvantitative data fra flere krydsningsfolder opnås automatisk ved hjælp af den STED-tilknyttede software.

Denne protokol blev anvendt til at illustrere tidligere kendte NMJs defekter i SMN og ColQ mangelfulde muskler 20,36,41,42. Almindelige ændringer blev fundet i de to musemodeller ved konfokal mikroskopi, såsom nedsat postsynaptisk endepladevolumen, MIP-område og relativ tortuositet og øget neurofilamentakkumulering, mens nogle mere specifikke fund (nedsat NMJ-belægning) kun blev observeret hos SMA-mus som en indikator for nedsat vesiklerhandel36. Endelig blev en stigning i AChR-stribeafstand og bredde detekteret i ColQ-KO ved STED-analyse, som er tegn på ultrastrukturelle defekter i de postsynaptiske forbindelsesfolder, som tidligere observeret af TEM20. Det er vigtigt, at denne protokol kan hjælpe med en mere dybtgående morfologisk karakterisering af neuromuskulære kryds under udvikling, vedligeholdelse og under forskellige patologiske forhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i forbindelse med dette arbejde.

Acknowledgments

Vi takker Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility" samt histologitjenesten, som delvist støttes af udstyrsmidler fra Region Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne og INSERM, Frankrig. Vi er også taknemmelige for Dr. Rashmi Kothary for at levere Smn 2B / 2B muselinjen (University of Ottawa, Canada) og Dr. Eric Krejci til ColQDex2 / + muselinjen (ikke offentliggjort, University of Paris, Frankrig). Vi takker Guillaume Corre for hans støtte til statistisk analyse. 2H3 (udviklet af Jessel, T.M. og Dodd, J.) og SV2 (udviklet af Buckley, K.M.) monoklonale antistoffer blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), oprettet af NICHD i NIH og vedligeholdt ved University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dette arbejde blev støttet af Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM og University of Evry Val d'Essonne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers and Reagents
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) Life Technologies, Thermofisher A-11001
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) Life Technologies, Thermofisher B13422
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) Life Technologies, Thermofisher A-11032
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) Alomone Labs B-100-FR
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
DAPI Fluoromount-G Southern Biotech 00-4959-52
DPBS Gibco, Invitrogen 14190-169
Ethanol Absolute VWR 20821.296
Immersion Oil, n = 1.518 THORLABS MOIL-10LF  Low autofluorescence
Neurofilament (NF-M) antibody  DSHB AB_531793
Paraformaldehyde (PFA) MERCK 1.04005
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody DSHB AB_2315387
Triton X-100 Sigma T8787
Materials
Alnico Button cylindrical magnets Farnell France E822 diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg
63x 1.4 NA magnitude oil immersion  HCX Plan Apo CS objective Leica Microsystems
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective Zeiss
Curved thin forceps-Moria iris forceps Fine Science Tools 11370-31
Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15-003-08
Fine serrated forceps Euronexia P-95-AA
Gel loading tip round 1-200 µL COSTAR 4853
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Leica Microsystems
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm Leica Microsystems
Lens Cleaning Tissue  Whatman (GE Healthcare) 2105-841
Medium serrated forceps Euronexia P-95-AB
Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm Marienfield 107222 High precision
Nunclon delta surface (12-well plates) Thermo Scientific  150628
Nunclon delta surface (24-well plates) Thermo Scientific  142475
Safeshield scalpel Feather 02.001.40.023
Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11
Superfrost plus slides Thermo Scientific  J1800AMNZ
Software
GraphPad  Prism, San Diego (US) Release N°6.07 Statistical software
ImageJ software National Institutes of Health Release N° 1.53f
Leica Application Suite X software Leica Microsystems Release N°3.7.2.2283 Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
  2. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
  3. Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
  4. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
  5. Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
  6. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
  7. Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).
  8. Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671 (2019).
  9. Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
  10. Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
  11. Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
  12. Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).
  13. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).
  14. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).
  15. Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).
  16. Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
  17. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  18. York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
  19. Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
  20. Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
  21. Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
  22. Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
  25. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  26. Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
  27. Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
  28. ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
  29. GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
  30. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  31. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
  32. Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
  33. Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
  34. Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
  35. Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
  36. Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
  37. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).
  38. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
  39. Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).
  40. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
  41. Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).
  42. McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 178
Karakterisering af neuromuskulære kryds i mus ved kombineret konfokal og superopløsningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marinello, M., Cosette, J., Bogni,… More

Marinello, M., Cosette, J., Bogni, C., Denard, J., Stockholm, D., Buj-Bello, A. Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63032, doi:10.3791/63032 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter