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Neuroscience

संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहों में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का लक्षण वर्णन

Published: December 8, 2021 doi: 10.3791/63032
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1,2, *1,3, *1,2
1Genethon, 91000, Evry, France, 2Université Paris-Saclay, Univ Evry, Inserm, Genethon, Integrare research unit UMR_S951, 91000, Evry, France, 3Ecole Pratique des Hautes Etudes, PSL Research University, 75014, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल संयुक्त कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस के माउस मॉडल में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

Abstract

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) निचले मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बीच अत्यधिक विशिष्ट सिनैप्स हैं जो तंत्रिका तंत्र से स्वैच्छिक मांसपेशियों तक अणुओं के संचरण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे संकुचन होता है। वे कई मानव रोगों में प्रभावित होते हैं, जिनमें विरासत में मिले न्यूरोमस्कुलर विकार जैसे ड्यूचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए), और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) शामिल हैं। इसलिए, न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान की निगरानी और रोग माउस मॉडल में उनके परिवर्तन पैथोलॉजिकल अध्ययन और चिकित्सीय दृष्टिकोण के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, म्यूरिन टीज्ड मांसपेशी फाइबर से मोटर एंडप्लेट के पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक भागों के त्रि-आयामी (3 डी) आकृति विज्ञान को लेबल करने और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। नमूने तैयार करने और कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा एनएमजे की मात्रा, क्षेत्र, टोर्टुओसिटी और एक्सॉन टर्मिनल आकृति विज्ञान / अधिभोग को मापने की प्रक्रियाएं, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी द्वारा पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों और एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (एसीएचआर) पट्टी चौड़ाई के बीच की दूरी विस्तृत है। इन एनएमजे मापदंडों में परिवर्तन एसएमए और सीएमएस से प्रभावित उत्परिवर्ती चूहों में चित्रित किए गए हैं।

Introduction

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक जटिल संरचना है जो मोटर एक्सॉन टर्मिनल, एक पेरिसिनेप्टिक श्वान सेल और एक कंकाल मायोफिबर भाग से बना है जो रासायनिक जानकारी के संचरण और मांसपेशियों के संकुचन के लिए कम मोटर न्यूरॉन गतिविधि के युग्मन में शामिल है। स्तनधारियों में, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की आकृति विज्ञान विकास के दौरान बदल जाता है, परिपक्वता के बाद एक विशिष्ट प्रेट्ज़ेल जैसे आकार को अपनाता है, प्रजातियों के बीच आकार और जटिलता में अंतर के साथ, और व्यायाम या उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक प्रक्रियाओं के जवाब में कुछ हद तक प्लास्टिसिटी दिखाता है 1,2,3,4 . पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट जंक्शनल सिलवटनामक झिल्ली इनवेजाइनेशन बनाता है, जहां एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) युक्त ऊपरी हिस्सा प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल एक्सॉन शाखा5 के साथ निकट संपर्क में होता है।

न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों में रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए) और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), मायोपैथी जैसे ड्यूशेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), मायास्थेनिया ग्रेविस (एमजी) और सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथिस (सीएनएम), और उम्र बढ़ने से जुड़े सरकोपेनिया 3,6,7,8,9, 10,11,12. इन रोगों में, एनएमजे संरचनात्मक परिवर्तन जैसे एंडप्लेट विखंडन, कम पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल फोल्ड आकार और / या डीनेरवेशन देखा जाता है। एनएमजे की विकृति रोग की प्रगति के दौरान एक प्राथमिक या प्रारंभिक घटना हो सकती है या नैदानिक अभिव्यक्तियों में योगदान देने वाली द्वितीयक घटना के रूप में अधिक हाल ही में दिखाई देती है। किसी भी मामले में, इन रोगों के पशु मॉडल में एनएमजे की आकृति विज्ञान की निगरानी पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करती है।

न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान का विश्लेषण आमतौर पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 2,13,14,15 या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,16 का उपयोग करके तकनीकों द्वारा किया जाता है, जिसमें क्रमशः संकल्प या तकनीकी कठिनाइयों जैसी उनकी अंतर्निहित सीमाएं होती हैं। हाल ही में, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग एनएमजे के विशेष क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए भी किया गया था, जैसे कि प्रीसिनेप्टिक सक्रिय क्षेत्र या पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली 16,17,18 पर एसीएचआर वितरण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक या पूरक दृष्टिकोण के रूप में।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी के संयोजन से एनएमजे रूपात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करना है। प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट की महत्वपूर्ण विशेषताएं, जैसे वॉल्यूम, क्षेत्र, सापेक्ष टॉर्टुओसिटी, एसीएचआर पट्टी चौड़ाई, और माउस गैस्ट्रोकेनेमस और टिबियलिस एंटीरियर के आंतरिक टेड टीज मांसपेशी फाइबर में एक्सॉन टर्मिनल वितरण को सामान्य और रोगग्रस्त स्थितियों के संदर्भ में निर्धारित किया गया था। विशेष रूप से, एनएमजे दोषों को स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी के एसएमएन2 बी / - माउस मॉडल में उदाहरण दिया गया था, जो एसएमएन 1 जीन 11,19 में उत्परिवर्तन के कारण मोटर न्यूरॉन अपघटन के साथ एक न्यूरोमस्कुलर बीमारी है, और एसिमेट्रिक एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ नॉकआउट (कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 या कोलक्यू-केओ) चूहों के कोलेजन जैसी पूंछ सबयूनिट में, जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम20 के मॉडल के रूप में। 21,22.

Protocol

चूहों की देखभाल और हेरफेर पशु प्रयोग पर राष्ट्रीय और यूरोपीय कानून के अनुसार किया गया था और संस्थागत नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अध्ययन में क्रमशः 3 और 6 सप्ताह की उम्र में एसएमएन2 बी / - (सी 57 बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि) और कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 (बी 6 डी 2 एफ 1 / जे पृष्ठभूमि) चूहों के पुरुषों और महिलाओं का उपयोग किया गया था।

1. चूहों की इच्छामृत्यु और मांसपेशियों का विच्छेदन: टिबियलिस पूर्ववर्ती और गैस्ट्रोकेनेमस

  1. सर्वाइकल डिस्लोकेशन द्वारा इच्छामृत्यु से पहले केटामाइन (87.5 मिलीग्राम / किग्रा)/ ज़ाइलज़िन (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रित घोल (0.1 एमएल / 20 ग्राम शरीर के वजन) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस एनेस्थीसिया के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: चूंकि एसएमए और कोलक्यू-सीएमएस व्यक्तियों को उनके लिंग से स्वतंत्र रूप से प्रभावित करते हैं, इसलिए वर्तमान प्रोटोकॉल में नर और मादा चूहों का उपयोग किया गया था।
  2. एक छोटे इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके पिछले बालों को हटा दें और 70% इथेनॉल के साथ पैरों को कुल्ला करें।
    नोट: विच्छेदन प्रक्रिया प्रत्येक मांसपेशी के लिए भिन्न होगी। टिबियलिस पूर्ववर्ती (टीए) के विच्छेदन के लिए, चरण 1.2.1-1.2.3 का पालन करें, और गैस्ट्रोकेनेमस (जीए) (औसत दर्जे और पार्श्व भागों) के लिए, चरण 1.2.4-1.2.6 का पालन करें। ऊतक क्षति को रोकने और विच्छेदन के दौरान उन्हें कुचलने या खींचने के लिए मांसपेशियों को धीरे से संभालें।
    1. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें।
    2. मांसपेशियों को उजागर करने के लिए, टिबिया के समानांतर, डिस्टल हिंदलिम्ब के एंटेरो-बाहरी हिस्से के साथ तेज-कुंद कैंची के साथ 5 मिमी का त्वचा चीरा लगाएं। प्रावरणी को हटाने के लिए अतिरिक्त पतली कैंची का उपयोग करें।
    3. अतिरिक्त-पतली कैंची और घुमावदार पतली धार का उपयोग करके डिस्टल कण्डरा को पहले (पंजे के करीब) और फिर समीपस्थ कण्डरा (घुटने के करीब) काटें। मायोफाइबर और नसों को नुकसान से बचने के लिए मांसपेशियों को सावधानी से संभालें।
      नोट: समीपस्थ कण्डरा को पूरी मांसपेशियों की कटाई के लिए हड्डी के जितना संभव हो उतना करीब विभाजित किया जाना चाहिए।
    4. माउस को प्रवण स्थिति में रखें, डिस्टल हिंदलिम्ब पश्चवर्ती डिब्बे के ऊपरी हिस्से से पंजे तक त्वचा चीरा लगाने के लिए तेज-कुंद कैंची का उपयोग करें, और त्वचा को हटा दें।
    5. अकिलिस कण्डरा को मध्यम सेरेटेड बल के साथ पकड़ें, इसे एक अतिरिक्त-पतली कैंची से काटें और धीरे से जीए को आसपास के ऊतक से वापस इसके समीपस्थ सम्मिलन तक अलग करें।
    6. समीपस्थ पक्ष पर, बाइसेप्स फेमोरिस (बीएफ) और जीए के बीच बनी जेब में मध्यम सेरेटेड फोर्सेस डालें। अतिरिक्त-पतली कैंची के साथ हड्डी सम्मिलन के जितना संभव हो जीए कण्डरा को काटने के लिए दो मांसपेशियों को अलग करें।
  3. ऊतक निर्धारण के लिए, प्रत्येक मांसपेशी को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें फॉस्फेट बफर खारा (सीए2 + एमजी 2 +) के बिना पीबीएस) में पतला 4% डब्ल्यू / वी पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान का 1 एमएल होता है और 18-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड और फॉर्मलाडेहाइड विषाक्त हैं और उन्हें पर्याप्त सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ रासायनिक फ्यूम हुड में संभाला जाना चाहिए।
  4. अगले दिन, एक रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर कमरे के तापमान (आरटी) पर धीरे से हिलाकर 12-वेल प्लेटों में पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए निश्चित मांसपेशियों को 3 गुना धो लें।
    नोट: प्रोटोकॉल को इस चरण में रोका जा सकता है और एक महीने के भीतर जारी रखा जा सकता है। इस मामले में, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करने के लिए 0.01% सोडियम एज़ाइड के साथ पूरक पीबीएस जोड़ें।
  5. प्रत्येक मांसपेशी को लगभग 1 मिमी चौड़े छोटे फाइबर बंडलों में दो महीन सेरेटेड फोर्सप्स का उपयोग करके चिढ़ाएं।
    नोट: चिढ़ाने के दौरान ऊतक क्षति को रोकने के लिए, अत्यधिक बल के बिना, बल के साथ मांसपेशियों को बहुत धीरे से हेरफेर करना महत्वपूर्ण है।
    1. टीए मांसपेशी को इसके आकार के आधार पर 3 या 4 बंडलों में अलग करें।
    2. जीए के लिए, मांसपेशियों के मध्यवर्ती और पार्श्व भागों को अलग करें और फिर प्रत्येक भाग को उनके आकार के आधार पर 4-5 बंडलों में अलग करें।

2. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. मांसपेशी फाइबर परमेबिलाइजेशन के साथ आगे बढ़ें: पीबीएस में 1% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 युक्त 24-वेल प्लेटों में मांसपेशियों के बंडलों को स्थानांतरित करें और उन्हें आरटी पर 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए कोमल आंदोलन (50 आरपीएम) के तहत रखें।
    नोट: अलग-अलग इम्यूनोस्टेनिंग के साथ आगे बढ़ने और एंटीबॉडी भ्रम के जोखिम को कम करने के लिए मांसपेशियों के बंडलों को दो प्लेटों के बीच विभाजित करें। उन्हें दो से अधिक कुओं (1 कुआं / प्लेट) में विभाजित न करें; अन्यथा, एनएमजे की संख्या (एन) जो विश्लेषण की गई मांसपेशियों में उनकी सामान्य स्थिति का प्रतिनिधि है, अपर्याप्त हो सकती है।
  2. नमूनों को आरटी पर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3 गुना धोएं और उन्हें पीबीएस / ट्राइटन एक्स -100 में 4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) से बना ब्लॉकिंग समाधान के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए सौम्य आंदोलन (50 आरपीएम) के तहत इनक्यूबेट करें।
    नोट: धोने के चरणों के दौरान एक आकांक्षा पंप का उपयोग न करें, बल्कि समाधान को मैन्युअल रूप से 200 μL पिपेट और छोटे आकार के सुझावों के साथ एस्पिरेट करें (संदर्भ सामग्री की तालिका में इंगित किया गया है)।
  3. चरण 2.2 में इंगित ब्लॉकिंग समाधान के साथ कोमल आंदोलन (50 आरपीएम) के तहत रात भर (ओ / एन) नमूनों को रात भर (ओ / एन) इनक्यूबेट करें, जिसमें न्यूरोफिलामेंट एम (एनएफ-एम, 2 एच 3, कमजोर पड़ने 1/200) या सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 (एसवी 2, कमजोर पड़ने 1/200) के खिलाफ प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी होते हैं।
  4. अगले दिन, आंदोलन (50 आरपीएम) के तहत पीबीएस में 5 मिनट के लिए मांसपेशियों के बंडलों को 3 गुना धो लें।
    1. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए: लाल उत्सर्जक फ्लोरोफोरे (एफ 594) (कमजोर पड़ने 1/500) और α-बंगारोटॉक्सिन के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटी-माउस एंटीबॉडी के साथ मांसपेशियों के बंडलों को इनक्यूबेट करें, जो पीबीएस में हरे-उत्सर्जक फ्लोरोफोरे (α-बीटीएक्स-एफ 488) (कमजोर पड़ने वाले 1/1000) के साथ संयुग्मित होते हैं।
    2. एसटीईडी इमेजिंग के लिए: हरे रंग के उत्सर्जक फ्लोरोफोरे (एफ 488) (कमजोर पड़ने 1/500) और α-बंगारोटॉक्सिन के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटी-माउस एंटीबॉडी के साथ मांसपेशियों के बंडलों को इनक्यूबेट करें, जो उच्च फोटोस्टेबिलिटी (α-बीटीएक्स-एफ 633) (कमजोर पड़ने 1/1000) के साथ संयुग्मित होता है।
      नोट: फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए इनक्यूबेशन के दौरान नमूने को प्रकाश में उजागर न करें।
  5. लेबल किए गए मांसपेशी बंडलों को आंदोलन (50 आरपीएम) के तहत पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं और उन्हें बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड पर रखें।
    नोट: सीलिंग की अनुमति देने के लिए प्रति स्लाइड अधिकतम 4 से 5 मांसपेशी बंडल रखें।
  6. शीर्ष पर एक ग्रेड # 1.5 (या # 1.5 एच) ग्लास कवरस्लिप (0.17 मिमी मोटाई) जोड़ें, और दबाव लागू करने और मांसपेशियों को समतल करने के लिए स्लाइड के दोनों किनारों पर बेलनाकार मैग्नेट रखें।
  7. स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्के ओ/एन से सुरक्षित रखें। नेल पॉलिश के साथ स्लाइड्स को स्थायी रूप से सील करें।

3. छवि अधिग्रहण

  1. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहण
    नोट: छवियों को 63x परिमाण तेल विसर्जन उद्देश्य (HCX Plan Apo CS, 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (NA)) का उपयोग करके एक उल्टे लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एकत्र किया गया था।
    1. अंधे विश्लेषण के लिए, किसी व्यक्ति को विश्लेषण कोड में शामिल नहीं होने दें, प्रत्येक स्लाइड को किसी दिए गए नंबर के साथ। सभी नमूनों के लिए एनएमजे मापदंडों की मात्रा का निर्धारण पूरा होने तक प्रयोगात्मक समूहों से अंधे रहें।
    2. कॉन्फ़िगरेशन मोड > मशीन.xlhw (पूरक चित्रा 1) में माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    3. माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड रखें और डीएपीआई फिल्टर सेट के साथ डीएपीआई वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस रोशनी के तहत देखकर नमूने के भीतर अवलोकन विमान ढूंढें।
    4. ओपन प्रोजेक्ट > नई परियोजनाओं पर क्लिक करें और छवि अधिग्रहण (पूरक चित्रा 1) को संग्रहीत करने के लिए एक फ़ोल्डर बनाएं।
      नोट: फ़ोल्डर आकार को सीमित करने और कंप्यूटर मेमोरी समस्याओं को रोकने के लिए प्रत्येक NMJ के लिए एक नया प्रोजेक्ट बनाएँ।
    5. अधिग्रहण मापदंडों को प्रबंधित करने के लिए, अधिग्रहण टैब विंडो पर क्लिक करें और कॉन्फोकल पिनहोल को 1.0 एयरी यूनिट और लेजर पावर पर सेट करें ताकि एंडप्लेट पर 488 एनएम लेजर का उपयोग करके ग्रीन / एफ 488 (α-बीटीएक्स) फ्लोरेसेंस के लिए लाभ और ऑफसेट स्तरों को अनुकूलित किया जा सके।
    6. इसके बाद, एफ 594 अवलोकन के लिए अनुकूलित लेजर का उपयोग करके लाल / एफ 594 (एनएफ-एम या एसवी 2) प्रतिदीप्ति अधिग्रहण को अनुकूलित करें। इस अध्ययन में, एक 552 एनएम लेजर (लाइव मोड ऑन) का उपयोग किया गया था। प्रत्येक लेजर के लिए निम्नलिखित श्रेणियों के साथ डाई उत्सर्जन के स्पेक्ट्रम को सेट करें: लेजर 405 (DAPI) 414 से 483 nm तक, लेजर 488 (F488-α-BTX) 506-531 nm से, और लेजर 552 (NF-M/SV2) 622-650 nm से।
    7. प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में समान सेटिंग्स के साथ न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के छवि ढेर एकत्र करें: 400 हर्ट्ज नमूना दर पर छवि आकार 1024 x 1024 पिक्सेल (73.7 x 73.7 μm), द्विदिश X ON, ज़ूम फैक्टर 2.5, Z-चरण आकार 0.5 μm Z-Wide मोड में।
      नोट: प्रत्येक एनएमजे के लिए, स्लाइस की संख्या पूरे जंक्शन को प्राप्त करने के लिए निर्धारित की गई है। ऊपर वर्णित अधिग्रहण सेटिंग्स Nyquist-Shanon नमूना प्रमेय को पूरा करती हैं। हालांकि, उपयोगकर्ता पिक्सेल आकार और जेड-स्टेप को आदर्श नायक्विस्ट नमूना दर को पूरा करने के लिए, हाल के सभी कॉन्फोकल ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर पर मौजूद ऑप्टिमाइज़ प्रारूप बटन पर क्लिक कर सकता है। यह क्रिया अधिक या कम नमूने वाली छवियों से बचेगी, जिससे मात्रा माप में सटीकता का नुकसान होगा।
    8. मूल फ़ाइल (.lif) या Z-स्टैक छवियों (.tif) को किसी ऐसे नाम के साथ फ़ोल्डर में सहेजें जिसमें स्लाइड का कोड नाम, धुंधला प्रकार और अंतप्लेट संख्या शामिल हो.
      नोट: एफ 488 फ्लोरेसेंस को एफ 594 चैनल में और इसके विपरीत (ब्लीड-थ्रू) में एफ 488 फ्लोरेसेंस के क्रॉसस्टॉक से बचने के लिए 488 एनएम और 552 एनएम लेजर (एफ 488 और एफ 594) का उपयोग करके स्कैन को क्रमिक रूप से (एक साथ नहीं) एकत्र करें। एनबी: बीम पथ माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में डाई सहायक के साथ कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।
    9. अगली कोडित स्लाइड में बदलें और प्रत्येक NMJ के लिए चरण 3.1.3-3.1.8 दोहराएँ।
    10. सत्र के अंत में, ओपन इन 3 डी व्यूअर पर क्लिक करें और 3 डी लेबलिंग की कल्पना करने के लिए एक प्रयोगात्मक समूह का एनएमजे प्रतिनिधि चुनें।
      नोट: यह दृश्य मोड यह सत्यापित करने में मदद करेगा कि अधिग्रहण पैरामीटर सही थे।
    11. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को बंद करें, लेंस ऊतकों के साथ उद्देश्यों को साफ करें, और फिर सिस्टम को बंद करें।
  2. एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहण
    नोट: छवियों को 100x तेल विसर्जन उद्देश्य (HC PL APO CS2 1.4 NA) का उपयोग करके 775 nm पर गेटेड STED से लैस एक उल्टे लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एकत्र किया गया था।
    1. अंधे विश्लेषण के लिए, किसी व्यक्ति को विश्लेषण कोड में शामिल नहीं होने दें, प्रत्येक स्लाइड को किसी दिए गए नंबर के साथ। सभी नमूनों के लिए एनएमजे मापदंडों की मात्रा का निर्धारण पूरा होने तक प्रयोगात्मक समूहों से अंधे रहें।
    2. कॉन्फ़िगरेशन मोड में माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर लॉन्च करें > machine.xlhw और STED ON (पूरक चित्रा 2)।
    3. छवि अधिग्रहण को संग्रहीत करने के लिए फ़ोल्डर बनाने के लिए ओपन प्रोजेक्ट > नई परियोजनाओं पर क्लिक करें।
      नोट: फ़ोल्डर आकार को सीमित करने और कंप्यूटर स्मृति समस्याओं को रोकने के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए एक नया फ़ोल्डर जनरेट करें।
    4. माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड रखें और नमूने के भीतर अवलोकन विमान खोजने के लिए 488 एनएम लेजर का उपयोग करके इसे वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस रोशनी के तहत देखें।
    5. 506-531 एनएम से वर्णक्रमीय पहचान के साथ 488 एनएम लेजर का उपयोग करके न्यूरोफिलामेंट एम (एनएफ-एम) या एसवी 2 धुंधला के साथ लेबल किए गए एनएमजे की खोज करें।
    6. जब एक एनएमजे की पहचान की गई है, तो एसटीईडी को सक्रिय करें पर क्लिक करें और एक ऐसे क्षेत्र में छवियां प्राप्त करना शुरू करें जिसमें 640-750 एनएम से वर्णक्रमीय पहचान के साथ 635 एनएम लेजर का उपयोग करके कई जंक्शन सिलवटें (पूरक चित्रा 3) शामिल हैं।
      नोट: छवि अधिग्रहण के दौरान संतृप्ति लुक-अप तालिका से सावधान रहें और ओवरएक्सपोजर (ग्रे मान >255; 8 बिट के लिए) से बचने के लिए क्विक एलयूटी बटन पर क्लिक करें।
    7. प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह की छवियों को समान सेटिंग्स के साथ एकत्र करें: छवि आकार 2048 x 2048 पिक्सेल (38.75 x 38.75 μm) 400 हर्ट्ज नमूना दर पर।
      नोट: अवक्षय लेजर (एसटीईडी) शक्ति 65% पर सेट है।
    8. छवियों को फ़ाइल नाम के साथ सहेजें जिसमें स्लाइड का कोड शामिल है।
      नोट: एसटीईडी इमेजिंग के साथ सर्वोत्तम अधिग्रहण सेटिंग प्राप्त करने के लिए अनुकूलित एक्सवाई प्रारूप: सेट प्रारूप पर क्लिक करना संभव है।
    9. अगली कोडित स्लाइड में बदलें और चरण 3.2.3-3.2.8 दोहराएँ। सभी स्लाइड्स के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
    10. एसटीईडी माइक्रोस्कोपी सत्र के अंत में, छवि फ़ाइलों को किसी अन्य कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और मूल फ़ाइलों को सहेजें (। lif) एक बाहरी ड्राइव या सर्वर में।
    11. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को बंद करें, लेंस ऊतकों के साथ उद्देश्यों को साफ करें, और फिर सिस्टम को बंद करें।

4. छवि विश्लेषण- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

नोट: सभी छवियों को Microsoft Windows 10 पेशेवर ऑपरेटिंग सिस्टम का उपयोग कर कंप्यूटर के साथ संसाधित किया गया था।

  1. पोस्टसिनेप्टिक एनएमजे एंडप्लेट वॉल्यूम, अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) क्षेत्र और सापेक्ष कठोरता की गणना करने के लिए इमेजजे और कस्टम मैक्रो लॉन्च करें।
    1. एनएमजे पैरामीटर माप प्राप्त करने के लिए एनआईएच इमेजजे फ्रीवेयर23, आईजियोडेसिक प्लगइन और कस्टम मैक्रो का उपयोग करके एनएमजे छवि स्टैक को संसाधित करें। ImageJ सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
      नोट: ImageJ का नवीनतम संस्करण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है और डाउनलोड किया जा सकताहै 24. मालिकाना फ़ाइल प्रारूपों को खोलने के लिए, बायो-फॉर्मेट पैकेज25 प्लगइन डाउनलोड करनाहोगा। यदि ऑपरेटर फिजी का उपयोग करता है तो यह चरण आवश्यक नहीं है क्योंकि प्लगइन पहले से ही सॉफ्टवेयर में स्थापित है। टोर्टुओसिटी की गणना करने के लिए iGeodesic प्लगइन27 भी ऑनलाइन उपलब्धहै28; फिजी संस्करण में इस प्लगइन की उपलब्धता को सत्यापित करें जिसका उपयोग किया जाएगा। कस्टम-निर्मित मैक्रोज़ऑनलाइन भी उपलब्ध हैं।
    2. Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (कस्टम निर्मित, पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) को ImageJ विंडो पर खींचें और छोड़ दें; मैक्रो एक दूसरी विंडो में खुला होगा। इस नई विंडो में, मैक्रोज़ पर क्लिक करें > मैक्रो चलाएँ.
      नोट: मैक्रो मालिकाना और TIFF दोनों फ़ाइलों को संसाधित कर सकते हैं। फ़ाइलों को निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना होगा: मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों के लिए, फ़ोल्डर में आदेशित प्रति फ़ाइल केवल एक जंक्शन (यानी, छवियों का ढेर) सहेजें; टीआईएफएफ छवियों के लिए, फ़ाइलों को सबफ़ोल्डर्स वाले फ़ोल्डर में सहेजा जाना चाहिए, प्रत्येक नाम जंक्शनएक्स (एक्स एक एनएमजे नंबर से मेल खाता है) किसी दिए गए जंक्शन (आरजीबी टीआईएफएफ) (पूरक चित्रा 4) के छवि ढेर के साथ।
    3. जंक्शन सबफ़ोल्डर्स वाले मूल फ़ोल्डर का चयन करें जिसका विश्लेषण किया जाना है और चयन पर क्लिक करें।
    4. सहेजने फ़ोल्डर नामक नए पॉप-अप मेनू में, संग्रहण फ़ोल्डर का चयन करें और चयन करें पर क्लिक करें.
    5. छवि प्रकार नामक नए पॉप-अप मेनू में, जेड-स्टैक अधिग्रहण के प्रारूप का चयन करें।
    6. रुचि के धुंधला होने के अनुरूप आरजीबी चैनल का चयन करें और एक्सवाई पिक्सेल आकार और जेड-चरण (जेड) इंगित करें। मैक्रो स्वचालित रूप से विश्लेषण करेगा।
      नोट: यदि मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों का चयन किया जाता है, तो मैक्रो सीधे पिक्सेल आकार और Z-चरण (z) पढ़ता है। हालांकि, उपयोगकर्ता को अभी भी रुचि के चैनल (सी 1, सी 2, या सी 3) को इंगित करना होगा। मैक्रो सहेजने वाले फ़ोल्डर में प्रत्येक जंक्शन पैरामीटर (एंडप्लेट वॉल्यूम, एमआईपी क्षेत्र, और टॉर्टुओसिटी) के लिए एक डेटाशीट (.csv) प्रदान करेगा। मैक्रो भी तीन उत्पन्न करता है। टीआईएफ फाइलें, जो α-बीटीएक्स स्टेनिंग Drawing_MaxprojX.tif, ड्राइंगजंक्शनएक्स.tif और एमआईपी मैक्सप्रोजएक्स.tif की परिधि के अनुरूप हैं। ये टीआईएफएफ फाइलें अधिग्रहण की गुणवत्ता को सत्यापित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए उत्पन्न होती हैं कि छवि प्रसंस्करण सही ढंग से किया गया है।
      पोस्टसिनेप्टिक एनएमजे वॉल्यूम (वी): मैक्रो एक एकल एनएमजे से छवियों को अलग करेगा और पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट के अनुरूप α-बंगारोटॉक्सिन एफ 488 चैनल रखेगा। स्टैक को स्टैक के मध्यवर्ती स्लाइस पर ओत्सु थ्रेशोल्ड30 का उपयोग करके खंडित किया गया है। परिणामस्वरूप द्विआधारी छवि 1-पिक्सेल फैली हुई है, और विश्लेषण कण सुविधा का उपयोग प्रत्येक पता लगाए गए ऑब्जेक्ट के एंडप्लेट क्षेत्र को मापने के लिए किया जाता है। पोस्टसिनेप्टिक एनएमजे वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए, मैक्रो स्टैक के सभी मापा एंडप्लेट क्षेत्रों को जोड़ता है और इसे जेड-स्टेप मान (जेड) से गुणा करता है।
      Equation 1
      अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) एंडप्लेट क्षेत्र: स्टैक को दहलीज पर रखने के बाद, जेड-प्रोजेक्ट इमेजजे सुविधा का उपयोग करके अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) प्राप्त किया जाता है। विश्लेषण कण सुविधा का उपयोग तब एमआईपी एंडप्लेट क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
      एनएमजे एमआईपी टॉर्टुओसिटी (टी): एनएमजे टॉर्टुओसिटी, जो सिलवटों औरछिद्रों सहित पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट की जटिलता की डिग्री को दर्शाता है, की गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक एमआईपी के आधार पर की जाती है, जहां डीओबीजे (एबी) वस्तु की परिधि के साथ ए और बी के बीच की दूरी है, और डीयूक (एबी) ए और बी (सीधी रेखा) के बीच यूक्लिडियन दूरी है।
      Equation 2
    7. प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के जंगली-प्रकार के समूह में उच्चतम टॉर्टुओसिटी मान को 100% तक सेट करें, और सापेक्ष एनएमजे टॉर्टुओसिटी प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक स्थिति के अन्य सभी मूल्यों को इस मान में सामान्य करें।
  2. प्रीसिनेप्टिक न्यूरोफिलामेंट संचय और सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 धुंधला करने की मात्रा निर्धारित करने के लिए इमेजजे और कस्टम मैक्रो लॉन्च करें।
    नोट: न्यूरोफिलामेंट संचय (यहां, एनएफ-एम) और / या सिनैप्टिक पुटिकाओं का परिवर्तित वितरण (यहां, एसवी 2) असामान्य अक्षीय परिवहन और / या बिगड़ा हुआ पुटिका तस्करी के मार्कर हैं और पहले विभिन्न एसएमए माउस मॉडल32,33,34 के एनएमजे में देखा गया था।
    1. Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (कस्टम निर्मित, पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) को ImageJ विंडो में खींचें और छोड़ दें; मैक्रो एक दूसरी विंडो में खुल जाएगा। इस नई विंडो में, मैक्रोज़ पर क्लिक करें > मैक्रो चलाएँ.
      नोट: मैक्रो मालिकाना फ़ाइल स्वरूप और TIFF फ़ाइलों दोनों को संसाधित कर सकते हैं। फ़ाइलों को चरण 4.1.2 के नीचे नोट में इंगित मानदंडों को पूरा करना होगा।
    2. जंक्शन सबफ़ोल्डर्स वाले मूल फ़ोल्डर का चयन करें जिसका विश्लेषण किया जाना है और चयन पर क्लिक करें।
    3. सहेजने फ़ोल्डर नामक नए पॉप-अप मेनू में, संग्रहण फ़ोल्डर का चयन करें और चयन करें पर क्लिक करें.
    4. छवि प्रकार नामक नए पॉप-अप मेनू में, जेड-स्टैक अधिग्रहण के प्रारूप का चयन करें।
    5. स्टेनिंग इन्फोस पॉप-अप में, प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक लेबल और रंग इंगित करें और ओके पर क्लिक करें। उदाहरण के लिए, प्रीसिनेप्टिक लेबल: एसवी 2 या एनएफ, प्रीसिनेप्टिक रंग: आर, पोस्टसिनेप्टिक लेबल: बीटीएक्स, पोस्टसिनेप्टिक रंग: जी।
      नोट: मालिकाना फ़ाइल प्रारूपों के लिए, लेबल और संबंधित चैनल (C1, C2, या C3) को इंगित किया जाना चाहिए।
    6. पिक्सेल आकार पॉप-अप में, XY पिक्सेल आकार 0.072 μm और Z step 0.5 μm (z) इंगित करें और OK पर क्लिक करें। मैक्रो स्वचालित रूप से विश्लेषण करेगा।
      नोट: यह पैरामीटर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप अधिग्रहण से पहले चयनित छवि आकार 1024 x 1024 पिक्सेल (73.7 x 73.7 μm) से मेल खाता है, और यह उद्देश्य और ज़ूम सेटिंग्स से संबंधित है। यदि मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों का चयन किया जाता है, तो मैक्रो सीधे पिक्सेल आकार और Z-चरण (z) पढ़ता है। मैक्रो, बचत फ़ोल्डर में, प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक वॉल्यूम का एक डेटाशीट (.csv), प्रत्येक (प्री- और पोस्टसिनेप्टिक) लेबलिंग के लिए वर्तमान डिटेक्शन की एक मल्टीपेज टीआईएफएफ छवि संग्रहीत करेगा। जैसा कि ऊपर बताया गया है, ये टीआईएफएफ फाइलें अधिग्रहण की गुणवत्ता की जांच करने और यह सुनिश्चित करने के लिए उत्पन्न होती हैं कि छवि प्रसंस्करण सही ढंग से किया गया है।
      मैक्रो एनएफ-एम-एफ 594 चैनल से अक्षीय न्यूरोफिलामेंट एम स्टेनिंग (एनएफ वॉल्यूम) की मात्रा की गणना करता है जो α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 लेबलिंग और एसवी 2-एफ 594 चैनल से एनएमजे सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 स्टेनिंग (एसवी 2 वॉल्यूम) की मात्रा के साथ मिलकर बनता है जो α-बीटीएक्स-एफ 488 लेबलिंग के साथ मिलकर बनता है। एनएफ-एम संचय को एनएफ वॉल्यूम और पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट (α-बीटीएक्स) वॉल्यूम और एनएमजे एक्सॉन टर्मिनल ऑक्युपेंसी के बीच अनुपात की गणना करके एसवी 2 और α-बीटीएक्स वॉल्यूम के अनुपात से निर्धारित किया जाता है, जैसा कि नीचे दिखाया गया है।
      Equation 3
      Equation 4

5. छवि विश्लेषण- एसटीईडी माइक्रोस्कोपी

नोट: छवि प्रसंस्करण एसटीईडी माइक्रोस्कोप निर्माता के ऑफ़लाइन सॉफ्टवेयर के साथ किया गया था।

  1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
  2. ओपन प्रोजेक्ट बटन पर क्लिक करके प्रोजेक्ट खोलें । प्रोजेक्ट फ़ाइल (.lif) का चयन करें और इसे खोलें। छवियों को उनके नाम के साथ स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाता है।
  3. प्रक्रिया विंडो में: शोर न्यूनीकरण > माध्य पर क्लिक करें। मध्य विंडो के निचले भाग में, त्रिज्या को 5.00 और पुनरावृत्ति को 1.00 पर सेट करें, और 3 डी फ़िल्टरिंग को अनटिक करें।
  4. फिर विंडो के शीर्ष बाईं ओर ओपन प्रोजेक्ट टैब का चयन करें और एक छवि चुनें।
  5. पैरामीटर को मान्य करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें। "nameofimage_median001" नामक एक नई छवि बनाई गई है।
    नोट: औसत फ़िल्टर के प्रभाव की निगरानी के लिए लागू करने से पहले पूर्वावलोकन पर क्लिक करना संभव है, जो छवि कंट्रास्ट को बढ़ाएगा और परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले लाइन प्रोफाइल को चिकना करेगा।
  6. चरण 5.4-5.5 में दर्शाए अनुसार फ़िल्टर को सभी छवियों पर लागू करें।
  7. ओपन प्रोजेक्ट टैब में, सभी प्रोजेक्ट्स को सहेजने के लिए फ्लॉपी ड्राइव आइकन पर क्लिक करें, जिसमें नई बनाई गई फ़िल्टर की गई छवियां भी शामिल हैं।
    नोट: अगला चरण "nameofimage_median001" नामक फ़िल्टर की गई छवि का उपयोग करके किया जाएगा।
  8. एसीएचआर धारियों के बीच की दूरी की गणना करें
    नोट: पोस्टजंक्शनल सिलवटों की आकृति विज्ञान में परिवर्तन अक्सर एनएमजे पैथोलॉजी (अपरिपक्वता या अध: पतन) के संकेत के रूप में न्यूरोमस्कुलर विकारों में देखा जाता है। एसीएचआर धारियों के बीच की दूरी (डी), जो α-बंगारोटॉक्सिन धुंधला होने से पता चलती है, की गणना तीव्रता प्रोफाइल उत्पन्न करके और एक रेखा प्रोफ़ाइल (पूरक चित्रा 5) खींचकर प्रत्येक अधिकतम तीव्रता शिखर के बीच की दूरी को निर्धारित करके की जाती है।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, केंद्रीय विंडो के शीर्ष पर मात्रा मेनू का चयन करें।
    2. ऊपर बाईं ओर उपकरण टैब पर क्लिक करें। शीर्ष बाएं पैनल में तीव्रता का चयन करें और लाइन प्रोफ़ाइल आइकन पर क्लिक करें। ओवरसैंपलिंग को 1 पर सेट करें, और टिक सॉर्ट चैनल।
    3. ओपन प्रोजेक्ट टैब पर क्लिक करें और विश्लेषण की जाने वाली फ़िल्टर की गई छवि का चयन करें।
      नोट: कंप्यूटर माउस के साथ स्क्रॉल करके छवि पर ज़ूम इन करना संभव है। छवि की गतिशील सीमा को प्रदर्शित छवि के बगल में बाईं ओर बार का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है, जो धारियों के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है।
    4. फिर, दाईं खिड़की के शीर्ष मेनू में ड्रॉ लाइन आइकन पर क्लिक करें और कई धारियों / जंक्शन सिलवटों के लंबवत एक लाइन क्रॉसिंग का पता लगाएं।
      नोट: तीव्रता प्रोफ़ाइल केंद्रीय विंडो में प्रदर्शित किया जाता है।
    5. पहले शिखर के शीर्ष पर क्लिक करें और बाएं माउस बटन को दबाते हुए माउस पॉइंटर को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि अगली अधिकतम चोटी तक नहीं पहुंच जाता।
      नोट: जानकारी तीव्रता प्रोफ़ाइल में दिखाई गई है, जबकि दो चोटियों के बीच की दूरी "डीएक्स" संप्रदाय के साथ चार्ट के तहत प्रदर्शित की जाती है।
    6. दाईं विंडो की छवि में रहते हुए माउस पर राइट क्लिक करें और ROIs सहेजें का चयन करें। लोड ROIs पर क्लिक करके सहेजे गए ROIs (रुचि के क्षेत्र) खोलें।
    7. दाईं विंडो के ऊपरी बाईं ओर तीर आइकन पर क्लिक करें, आरओआई पर क्लिक करें और बिन आइकन पर क्लिक करके इसे हटा दें।
    8. एसीएचआर पट्टी दूरी की अनुमानित संख्या प्राप्त करने के लिए विभिन्न तीव्रता प्रोफाइल से जितनी बार आवश्यक हो उतनी बार इस ऑपरेशन को दोहराएं जो विश्लेषण की गई मांसपेशियों में वैश्विक मूल्य का प्रतिनिधित्व करेगा।
      नोट: इष्टतम एन मान की गणना समूहों, α जोखिम, शक्ति और एक या दो पूंछ वाले परीक्षण के बीच अनुमानित अंतर के आधार पर पहले से की जा सकती है। वर्तमान प्रयोगात्मक डिजाइन में, एक पूंछ वाला मान-व्हिटनी परीक्षण (α जोखिम = 10%; शक्ति = 80%) लागू किया गया था, और जानवरों के दो समूहों की तुलना करने के लिए एन मान प्रति एनएमजे कम से कम पांच एसीएचआर पट्टी दूरी होने का अनुमान लगाया गया था।
  9. एसीएचआर पट्टी चौड़ाई
    नोट: पट्टी चौड़ाई (डब्ल्यू) तीव्रता प्रोफ़ाइल के पूर्ण-चौड़ाई आधे-अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) से मेल खाती है, जो उन बिंदुओं के बीच की दूरी है जहां α-बीटीएक्स सिग्नल फ्लोरेसेंस मान इसकी अधिकतम तीव्रता का आधा है (पूरक चित्रा 5)।
    1. माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, केंद्रीय विंडो में मात्रा मेनू का चयन करें।
    2. शीर्ष बाईं ओर उपकरण टैब पर क्लिक करें। शीर्ष बाएं पैनल में तीव्रता का चयन करें और FWHM निर्धारित करें आइकन पर क्लिक करें। टिक सॉर्ट चैनल.
      नोट: सॉफ्टवेयर द्वारा पीक डिटेक्शन को अनुकूलित करने के लिए, सेट थ्रेशोल्ड और चौड़ाई क्रमशः 50 और 3 पर सेट की गई थी। प्रत्येक प्रयोग के लिए इन मूल्यों को अनुकूलित करें और एक अनुभवी इमेजिंग वैज्ञानिक से सलाह लें।
    3. ओपन प्रोजेक्ट टैब पर क्लिक करें और विश्लेषण किए जाने वाले फ़िल्टर किए गए छवि का चयन करें।
      नोट: कंप्यूटर माउस के साथ स्क्रॉल करके दाईं विंडो में प्रदर्शित छवि पर ज़ूम इन करना संभव है। जैसा कि ऊपर बताया गया है (चरण 5.8.3 के बाद नोट), छवि की गतिशील सीमा को इष्टतम पट्टी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए संशोधित किया जा सकता है।
    4. इसके बाद, दाईं विंडो के शीर्ष मेनू में ड्रॉ आयत आइकन पर क्लिक करें। एक पट्टी का चयन करें जो या तो क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर है और पट्टी के लंबवत एक आयत खींचें। केंद्रीय विंडो में एक प्रोफ़ाइल प्रकट होती है।
    5. बाएं पैनल में स्थित औसत प्रक्षेपण मेनू के ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज पर क्लिक करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि पट्टी अभिविन्यास ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज है या नहीं।
    6. केंद्रीय विंडो में सांख्यिकी पर क्लिक करें और FWHM मान पढ़ें।
    7. दाईं विंडो में प्रदर्शित छवि पर कंप्यूटर माउस के साथ राइट-क्लिक करें और ROIs सहेजें का चयन करें।
      नोट: लोड ROIs पर क्लिक करके सहेजे गए ROIs खोलें।
    8. दाईं विंडो के ऊपरी बाईं ओर तीर आइकन पर क्लिक करें, आरओआई पर क्लिक करें और बिन आइकन पर क्लिक करके इसे हटा दें।
    9. एसीएचआर पट्टी चौड़ाई की अनुमानित संख्या प्राप्त करने तक विभिन्न आयताकार आरओआई से आवश्यकतानुसार इस ऑपरेशन को कई बार दोहराएं, जो विश्लेषण की गई मांसपेशियों में वैश्विक मूल्य का प्रतिनिधि होगा।

6. प्रायोगिक डिजाइन और सांख्यिकीय परीक्षण

  1. विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    नोट: डेटा को एन ≥ 3 जैविक प्रतिकृतियों और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए प्रति जीनोटाइप कम से कम 20 एनएमजे से एकत्र किया गया था, और प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में एसटीईडी इमेजिंग के लिए एन ≥ 5 जैविक प्रतिकृति और एन = 5 एनएमजे प्रति जीनोटाइप। महत्व का मूल्यांकन अप्रकाशित मैन-व्हिटनी परीक्षण (गैर-पैरामीट्रिक) द्वारा किया गया था, और पी-मानों को संबंधित आंकड़ा किंवदंतियों में इंगित किया गया है।

Representative Results

प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक स्तर पर न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के रूपात्मक विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और इमेजजे कस्टम मैक्रोज़ (चित्रा 1) का उपयोग करके मांसपेशियों की कटाई से इमेजिंग और परिमाणीकरण तक एक वर्कफ़्लो विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का उदाहरण देने के लिए, आनुवंशिक विकारों के दो माउस मॉडल, एसएमएन2 बी / - और कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 चूहों में एनएमजे की आकृति विज्ञान क्रमशः रीढ़ की हड्डी की मांसपेशियों के शोष (एसएमए) और एक जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस) रूप से प्रभावित था, का मूल्यांकन किया गया था और डेटा की तुलना उम्र से मेल खाने वाले नियंत्रण साहित्यकारों से की गई थी।

एनएमजे संरचना का मूल्यांकन क्रमशः 3- और 6 सप्ताह के एसएमएन2 बी / - (सी 57 बीएल / 6 पृष्ठभूमि) और कोलक्यू डेक्स 2 / डेक्स 2 (बी 6 डी 2 एफ 1 / जे पृष्ठभूमि) चूहों की टिबियलिस पूर्ववर्ती और गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों से किया गया था, जब इन जानवरों में बीमारी के संकेत पहले से ही मौजूद हैं। 3 सप्ताह की उम्र में, एसएमएन2 बी / - चूहों में कंकाल की मांसपेशियों के विकास में देरी और निर्जलीकरण के लक्षण दिखाई देते हैं, जैसे कि एनएमजे शोष और हानि35,36। सीएमएस चूहों में एनएमजे में एक प्राथमिक विकृति होती है और जीवन के पहले सप्ताह से शरीर के वजन में कमी आती है और मांसपेशियों की कमजोरी20 (डेटा नहीं दिखाया गया है) को चिह्नित किया जाता है। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, फ्लोरोसेंट α-बंगारोटॉक्सिन के साथ लेबल किया गया पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा दो माउस लाइनों के उत्परिवर्ती में छोटा और / या खंडित दिखाई दिया। इस अनुकूलित इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके एनएमजे जेड-स्टैक्स की मात्रा का परिमाणीकरण करने से पता चला है कि नियंत्रण की तुलना में एसएमए और सीएमएस चूहों दोनों में एंडप्लेट वॉल्यूम, अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी), और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी में उल्लेखनीय कमी आई है, जैसा कि एनएमजे परिपक्वता दोष32 (चित्रा 2 बी-डी) के संकेत हैं। रोगग्रस्त जानवरों में पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट वॉल्यूम और एमआईपी में कमी आई थी (मात्रा के लिए 2.7 और 2.0 का गुना परिवर्तन, और एमआईपी के लिए 2.5 और 2.0, क्रमशः एसएमएन2 बी / - और कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 चूहों में)। डब्ल्यूटी की तुलना में एसएमएन और कोलक्यू की कमी वाली मांसपेशियों में सापेक्ष टॉर्टुओसिटी भी कम थी (एसएमए में 16.97% ± 1.33% बनाम 5.90% डब्ल्यूटी चूहों ± 48.84% और सीएमएस में 2.79% ± 13.29% बनाम 4.44% नियंत्रण चूहों ± 30.20%)। इसके अलावा, इमेजजे कस्टम मैक्रो का उपयोग करके प्रीसिनेप्टिक एक्सॉन टर्मिनल शाखाओं के वितरण की मात्रा ने दो पशु मॉडलों में न्यूरोफिलामेंट एम वितरण में एक परिवर्तित पैटर्न का खुलासा किया, जिसमें इम्यूनोलेबलिंग (84.65% ± 0.32% बनाम 16.57% ± 2.03% और 23.64% ± क्रमशः 2.78% बनाम 18.77% बनाम 18.77% ± 1.73% नियंत्रण की तुलना में 1.73% थी। ). एसवी 2 धुंधला होने से, अधिभोग अनुपात में 43% की कमी, यानी, आसन्न तंत्रिका टर्मिनल सक्रिय क्षेत्रों के साथ एसीएचआर युक्त क्षेत्रों का प्रतिशत, एसएमएन2 बी / - चूहों में भी देखा गया (एसएमए में 49.36% ± 3.76% बनाम 2.34% डब्ल्यूटी चूहों ± 85.69% (चित्रा 3 ई, एफ)। इस एनएमजे पैरामीटर की गणना कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 उत्परिवर्ती के जीए में भी की गई थी, लेकिन नियंत्रण लिटरमेट्स (डेटा नहीं दिखाया गया) की तुलना में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था।

हमने सुपर-रिज़ॉल्यूशन उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोलक्यू-कमी वाली मांसपेशियों में जंक्शन सिलवटों और एसीएचआर धारियों की चौड़ाई के बीच की दूरी को निर्धारित करके पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली विशेषताओं का विश्लेषण किया, जो इन सिलवटों के शिखर पर स्थित हैं। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, इन संरचनाओं के पहलू को फ्लोरोसेंट α-बंगारोटॉक्सिन लेबलिंग और तीव्रता प्रोफ़ाइल विश्लेषण द्वारा स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। हमने इन एनएमजे मापदंडों का मूल्यांकन किया और म्यूटेंट की गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी में एसीएचआर धारियों की जंक्शन फोल्ड दूरी (डी) और चौड़ाई (डब्ल्यू) में वृद्धि पाई (दूरी के लिए 358.3 एनएम ± 11.97 एनएम और 320.8 एनएम ± दूरी के लिए 10.±90 एनएम, और 10.51 एनएम और 186.3 एनएम ± 7.015 एनएम की तुलना में चौड़ाई के लिए 216.9 एनएम, 10.51 एनएम और 186.3 एनएम ± चौड़ाई की तुलना में 7.015 एनएम। क्रमशः, पी < 0.05) (चित्रा 4 सी, डी)।

Figure 1
चित्रा 1: कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी मल्टीस्केल एनएमजे लक्षण वर्णन के लिए वीडियो प्रोटोकॉल का फ़्लोचार्ट। टिबियलिस एंटीरियर (टीए) और गैस्ट्रोकेनेमस (जीए) मांसपेशियों को चूहों से एकत्र किया गया था, और मांसपेशियों के तंतुओं को α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 या α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 633, डीएपीआई, न्यूरोफिलामेंट एम (एनएफ-एम) और सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 (एसवी 2) और फ्लोरोफोरे (एफ 488 या एफ 5 9 4) -संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल करने से पहले छेड़ा गया था। छवि स्टैक्स को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया गया था और पोस्टसिनेप्टिक एनएमजे वॉल्यूम, प्रीसिनेप्टिक एनएफ-एम संचय, एनएमजे एक्सॉन टर्मिनल अधिभोग, पोस्टसिनेप्टिक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) एंडप्लेट क्षेत्र को मापने के लिए संसाधित किया गया था, और टॉर्टुसिटी (डीओबीजे (एबी) ऑब्जेक्ट (लाल रेखा) की परिधि के साथ ए और बी के बीच की दूरी है, जबकि डीयूक (एबी) ए और बी (हरी रेखा)) के बीच यूक्लिडियन दूरी है। एसटीईडी माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (एसीएचआर) धारियों की चौड़ाई और जंक्शन सिलवटों के बीच की दूरी को α-बीटीएक्स-एफ 633 धुंधला होने की तीव्रता प्रोफाइल से निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए) और कोलक्यू से संबंधित जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस) के माउस मॉडल में मल्टी-पैरामीटर पोस्टसिनेप्टिक एनएमजे लक्षण वर्णन। (ए) टीए और जीए मांसपेशियों से पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट की प्रतिनिधि छवियां α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 (α-बीटीएक्स) के साथ लेबल की गई हैं। (बी) एनएमजे पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट वॉल्यूम का परिमाणीकरण, (सी) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) क्षेत्र और (डी) 3 सप्ताह के जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और एसएमएन2 बी / - चूहों (बाएं ग्राफ, एन = 3 जानवर प्रति जीनोटाइप, एन = 37 और एन = 56 एनएमजे, क्रमशः) और 6 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 के टीए में सापेक्ष कठोरता चूहे (दाएं ग्राफ, एन = 5 चूहे प्रति जीनोटाइप, एन = 89 और एन = 97 एनएमजे, क्रमशः)। डेटा को एसईएम के ± प्रति माउस (डॉट) के औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण मैन-व्हिटनी परीक्षण (* पी < 0.05) द्वारा किया गया था। स्केल पट्टी 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती चूहों की मांसपेशियों में प्रीसिनेप्टिक एक्सॉन टर्मिनल वितरण का मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण। जंगली प्रकार, एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस चूहों की टिबियलिस एंटीरियर (टीए) और गैस्ट्रोकेनेमस (जीए) मांसपेशियों में एनएमजे संक्रमण पैटर्न। (ए, बी) 21 दिनों की उम्र में डब्ल्यूटी और एसएमएन2 बी / - चूहों के टीए से प्रतिनिधि न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों को न्यूरोफिलामेंट एम (एनएफ-एम, लाल) और α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 (α-बीटीएक्स, ग्रीन) (ए) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है, और न्यूरोफिलामेंट संचय (बी) के मात्रात्मक विश्लेषण के परिणाम; (C, D) 6 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 चूहों के जीए से प्रतिनिधि न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों को न्यूरोफिलामेंट एम (एनएफ-एम, लाल) और α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 (α-बीटीएक्स, हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है, जो खंडित और अपरिपक्व पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट (सी) दिखाते हैं, और जानवरों के दो समूहों (डी) में न्यूरोफिलामेंट संचय के परिणाम दिखाते हैं। N = 4 (n = 34 NMJ) (B) और N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT जानवर, और N = 3 (n = 36 NMJ) Smn2B/- और N = 3 (n = 55 NMJ) ColQDex2/Dex2 चूहों का प्रयोगों (B, D) में विश्लेषण किया गया था। (E, F) 3 सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और एसएमएन2 बी / - चूहों के टीए से एनएमजे में एक्सॉन टर्मिनल अधिभोग की प्रतिनिधि छवियां सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 (एसवी 2, लाल) और α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 488 (α-बीटीएक्स, ग्रीन) (ई) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल की गईं, और एनएमजे अधिभोग (एसवी 2 / एसीएचआर वॉल्यूम अनुपात) (एफ) के परिणाम। एन = 3 (एन = 50 एनएमजे) जंगली प्रकार और एन = 4 (एन = 62 एनएमजे) एसएमएन2 बी / - चूहों की मांसपेशियों का विश्लेषण किया गया था। डेटा को एसईएम ± प्रति माउस (डॉट) के औसत मान के रूप में व्यक्त किया जाता है। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण मैन-व्हिटनी परीक्षण (* पी < 0.05) द्वारा किया गया था। स्केल पट्टियाँ 20 μm हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
(ए) 6 सप्ताह के जंगली प्रकार के माउस के गैस्ट्रोकेनेमस से α-बंगारोटॉक्सिन-एफ 633 (α-बीटीएक्स) के साथ लेबल किए गए एनएमजे की प्रतिनिधि एसटीईडी छवि पोस्टजंक्शनल एसीएचआर स्ट्रिप्स दिखाती है (स्केल बार 5 μm है)। (बी) एसीएचआर धारियों (निचले पैनल) के साथ एक क्षेत्र का उच्च आवर्धन जिसका उपयोग तीव्रता प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए किया गया था। एसीएचआर धारियों की चौड़ाई (डब्ल्यू) और इस क्षेत्र की दो आसन्न धारियों (डी) के बीच की दूरी को परिमाणित किया गया और बार ग्राफ में प्रस्तुत किया गया। एसीएचआर पट्टी चौड़ाई (डब्ल्यू) और दूरी (डी) को चित्रित करने के लिए पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इन मापदंडों, (सी) एसीएचआर पट्टी दूरी और (डी) चौड़ाई, कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 चूहों में मापा गया था और 6 सप्ताह की उम्र में कूड़े को नियंत्रित किया गया था। 5 WT (कुल n = 29 NMJ) और 6 ColQDex2/Dex2 (कुल n = 43 NMJ) जानवरों के NMJ का आँख बंद करके विश्लेषण किया गया। डेटा को एसईएम के ± प्रति माउस (डॉट) के औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है। मान-व्हिटनी परीक्षण (* पी < 0.05) का उपयोग करके समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर का विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एलएएस एक्स सॉफ्टवेयर का शुभारंभ और कॉन्फोकल अधिग्रहण के लिए पैरामीटर। कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न चरणों को प्रोटोकॉल के अनुभाग 3.1.2 से 3.1.7 में वर्णित किया गया है। प्रत्येक एनएमजे स्टैक अधिग्रहण के लिए, एक परियोजना खोली जाती है (चरण 3.1.4) और छवि आकार, अधिग्रहण गति, एक्स, वाई और जेड अक्षों के मापदंडों का चयन किया जाता है (चरण 3.1.7), प्रत्येक अनुक्रमिक स्कैन इंगित किया जाता है (डीएपीआई के लिए एसईक्यू.1, लेजर 405; seq.2, α-BTX-F488 के लिए लेजर 488; और Seq.3, F594 संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए लेजर 552)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: एसटीईडी अधिग्रहण के लिए एलएएस एक्स सॉफ्टवेयर और मापदंडों का शुभारंभ। एसटीईडी छवियों को प्राप्त करने के चरणों को प्रोटोकॉल के अनुभाग 3.2.2 से 3.2.8 में वर्णित किया गया है। माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन मोड STED ON (चरण 3.2.2) में लॉन्च किया गया है, और एक परियोजना खोली जाती है (चरण 3.2.3)। प्रत्येक अनुक्रमिक स्कैन के साथ छवि अधिग्रहण (चरण 3.2.7) (छवि आकार, अधिग्रहण गति, ज़ूम फैक्टर, एक्स अक्ष) के लिए पैरामीटर इंगित किए गए हैं (α-बीटीएक्स-एफ 633 के लिए Seq.1; एफ 488 संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए Seq.2)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त α-बीटीएक्स-सना हुआ जंक्शन सिलवटों की छवियां। 6 सप्ताह के जंगली प्रकार के माउस से α-बीटीएक्स-एफ 633 के साथ लेबल किए गए पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट के छवि उदाहरण जो या तो सही (बाएं) या गलत फोकस (दाएं) के साथ हासिल किए गए थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: कस्टम इमेजजे मैक्रोज़ द्वारा प्राप्त इनपुट और आउटपुट डेटा का वर्णन करने के लिए विंडोज पॉप-अप। एनएमजे छवियों के इनपुट डेटा उदाहरण (.tif और .lif फ़ाइलें) बाएं कॉलम पर दिखाए गए हैं। मैक्रोज़ (दाएँ स्तंभ) से आउटपुट डेटा फ़ोल्डरों (Save_Volume, Save_Accu) में सहेजा जाता है जिसमें जंक्शन (.tif) की छवियाँ और परिणामों (.csv फ़ाइलों) वाले डेटापत्रक होते हैं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 5: एलएएस एक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एसटीईडी अधिग्रहण से एसीएचआर पट्टी दूरी और चौड़ाई विश्लेषण। एनएमजे एसटीईडी छवियों का विश्लेषण करने के चरण प्रोटोकॉल के खंड 5 में वर्णित हैं। ए) एसीएचआर धारियों वाले एक लेबल पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट क्षेत्र की छवि। पट्टी विश्लेषण के लिए रुचि का क्षेत्र एक लंबवत रेखा (पट्टी की दूरी के लिए हरी रेखा), या लंबवत आयत (पट्टी चौड़ाई के लिए बैंगनी आयत) खींचकर चुना जाता है। (B, C) चयनित क्षेत्रों की तीव्रता प्रोफाइल और एसीएचआर धारियों (बी) और एसीएचआर पट्टी चौड़ाई (सी) के बीच की दूरी की गणना करने के लिए माप दिखाए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. एनएमजे पैरामीटर माप (एनएमजे वॉल्यूम, एमआईपी एंडप्लेट क्षेत्र, और एनएमजे टॉर्टुओसिटी) निकालने के लिए इमेजजे कस्टम मैक्रो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. एनएफ-एम संचय और एसवी 2 धुंधला निकालने के लिए इमेजजे कस्टम मैक्रो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्णित वीडियो प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के संयोजन से न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की 3 डी संरचना को निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक स्तरों पर पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। एसटीईडी माइक्रोस्कोपी का उच्च रिज़ॉल्यूशन नैनोस्ट्रक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है जो पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा पहचाने जाने योग्य नहीं हैं। इस प्रक्रिया ने हमें एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस चूहों के दो एपेंडिसुलर मांसपेशियों, टिबियलिस एंटीरियर और गैस्ट्रोकेनेमस में एनएमजे के संरचनात्मक परिवर्तनों को मापने में सक्षम बनाया।

इस तकनीक के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों को ठीक से विच्छेदित और चिढ़ाना महत्वपूर्ण है, मांसपेशियों के आसपास के प्रावरणी पर विशेष ध्यान देना और मांसपेशियों के बंडलों को अलग करने के लिए लागू ताकत; अन्यथा, संक्रमण पैटर्न को उचित प्रीसिनेप्टिक एनएमजे मूल्यांकन में बाधा डालने के लिए बाधित किया जा सकता है। यद्यपि टीए और जीए से एनएमजे का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है, सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल को अन्य मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें फ्लैट मांसपेशियां शामिल हैं, जैसे कि डायाफ्राम या ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस37, जिन्हें चिढ़ाने के कदम की आवश्यकता नहीं होती है। अच्छी गुणवत्ता वाले धुंधलापन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक निर्धारण भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, उचित मात्रा (मांसपेशियों के 15-20 गुना) पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएफए का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फिक्सेटिव के लिए एक्सपोजर समय एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि कलाकृतियां, जैसे संकोचन और झुरमुट, अति-निर्धारण के कारण दिखाई दे सकती हैं और एनएमजे सुविधाओं को प्रभावित कर सकती हैं। नमूनों के आकार औरऊतकों 38 में पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान की प्रवेश दर को देखते हुए, इस प्रकार की मांसपेशियों के लिए 18-24 घंटे के निर्धारण समय की सिफारिश की जाती है। यदि ऊतक कटाई के एक सप्ताह से अधिक समय बाद धुंधला कदम की योजना बनाई जाती है, तो बैक्टीरिया के प्रसार को रोकने के लिए पीबीएस में पीएफए-निश्चित मांसपेशियों को सोडियम एज़ाइड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरक रखने का सुझाव दिया जाता है।

यह प्रोटोकॉल कॉन्फोकल के लिए α-बीटीएक्स-एफ 488 और एसटीईडी इमेजिंग के लिए α-बीटीएक्स-एफ 633 का उपयोग करके एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इन फ्लोरोफोरे को वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ फिट करने के लिए चुना गया था, लेकिन उपलब्ध उपकरणों और सामग्रियों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण और परिमाणीकरण के लिए एसटीईडी सीडब्ल्यू 592 एनएम लेजर का उपयोग करते समय α-बीटीएक्स एफ 488 लेबलिंग का चयन किया जा सकता है। हालांकि, ऐसा प्रतीत होता है कि वर्तमान अध्ययन (स्पंदित उत्तेजना गेटेड एसटीईडी, 775 एनएम कमी) में लागू किया गया विन्यास अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में उच्च प्रदर्शन और बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करता है, जैसे कि निरंतर तरंग एसटीईडी39, जिससे यह वर्तमान आवेदन के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है। लेजर पावर सेटिंग्स को ध्यान से चुनना भी महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से एसटीईडी (उत्तेजना और कमी दोनों) के लिए, क्योंकि संतृप्ति के मामले में तीव्रता प्रोफ़ाइल की विशेषताओं को मापा नहीं जा सकता है, और इसलिए एनएमजे छवि में कोई भी संतृप्त संकेत पूरे विश्लेषण को खतरे में डाल सकता है।

माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सहित यह विस्तृत वर्कफ़्लो, एक मांसपेशी से कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा स्वायत्त एनएमजे मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की सुविधा के लिए विकसित किया गया था। एनएमजे कॉनफोकल विश्लेषण के लिए पहले वर्णित वर्कफ़्लो, जैसे एनएमजे-मॉर्फ2 या एनएमजे-एनालाइजर14, ने अर्ध-स्वचालित तरीकों के डिजाइन के लिए मार्ग प्रशस्त किया जो एनएमजे के रूपात्मक विश्लेषण और तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। एनएमजे-मॉर्फ (और इसका अद्यतन संस्करण एएनएमजे-मॉर्फ15) एक मुफ्त इमेजजे-आधारित मंच है जो 21 रूपात्मक विशेषताओं को मापने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करता है, और एनएमजे-एनालाइजर पायथन में विकसित एक स्क्रिप्ट का उपयोग करता है जो पूरे 3 डी एनएमजे संरचना से 29 प्रासंगिक पैरामीटर उत्पन्न करता है। मैन्युअल थ्रेशोल्डिंग इन दो विधियों में छवि प्रसंस्करण के दौरान एकमात्र चरण है जिसके लिए उपयोगकर्ता विश्लेषण की आवश्यकता होती है। यह एकीकृत प्रोटोकॉल ऊतक तैयार करने, 3 डी कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण, और पूरे कंकाल की मांसपेशियों से एनएमजे के इमेजजे-आधारित प्रसंस्करण के लिए चरणों का विवरण देता है और पोस्टसिनेप्टिक (वॉल्यूम, अधिकतम प्रक्षेपण क्षेत्र, और टॉर्टुओसिटी) और प्रीसिनेप्टिक (एक्सॉन टर्मिनल अधिभोग और न्यूरोफिलामेंट संचय) एंडप्लेट के पांच महत्वपूर्ण मापदंडों का सरलीकृत अवलोकन प्रदान करता है। जैविक प्रासंगिकता का एक अतिरिक्त पैरामीटर, पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों का एसीएचआर संगठन पैटर्न, सुपर-रिज़ॉल्यूशन एसटीईडी माइक्रोस्कोपी (रिज़ॉल्यूशन 20-30 एनएम) 40 द्वारा नैनोस्केल स्तर पर मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए शामिल किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि एसटीईडी इमेजिंग के लिए ऊतक तैयारी एनएमजे अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में सरल है, जैसे कि पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 9, जो एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है जिसे उपयुक्त मांसपेशी क्षेत्र के अल्ट्राथिन वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक कुशल मैनिपुलेटर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एसटीईडी से जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कई जंक्शन सिलवटों से मात्रात्मक डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल एसएमएन और कोलक्यू की कमी वाली मांसपेशियों 20,36,41,42 में पहले से ज्ञात एनएमजे दोषों को चित्रित करने के लिए लागू किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा दो माउस मॉडल में सामान्य परिवर्तन पाए गए, जैसे कि पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट वॉल्यूम, एमआईपी क्षेत्र, और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी में कमी, और न्यूरोफिलामेंट संचय में वृद्धि, जबकि कुछ और विशिष्ट निष्कर्ष (एनएमजे अधिभोग में कमी), केवल एसएमए चूहों में देखे गए थे, बिगड़ा हुआ पुटिका तस्करी36 के संकेतक के रूप में। अंत में, एसटीईडी विश्लेषण द्वारा कोलक्यू-केओ में एसीएचआर पट्टी दूरी और चौड़ाई में वृद्धि का पता लगाया गया था, जो पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों में अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोषों के संकेत हैं, जैसा कि पहले टीईएम20 द्वारा देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रोटोकॉल विकास, रखरखाव और विभिन्न रोग स्थितियों के तहत न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के अधिक गहन रूपात्मक लक्षण वर्णन में मदद कर सकता है।

Disclosures

लेखक इस काम से संबंधित हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम जेनेथन की "इमेजिंग और साइटोमेट्री कोर सुविधा" के साथ-साथ हिस्टोलॉजी सेवा को धन्यवाद देते हैं, जो क्षेत्र इले-डी-फ्रांस, कंसिल जनरल डी एल'एसोने, जेनोपोल रेचरचे ऑफ एवरी, यूनिवर्सिटी ऑफ एवरी वैल डी'एससोन और आईएनएसईआरएम, फ्रांस से उपकरण निधि द्वारा समर्थित हैं। हम एसएमएन2 बी / 2 बी माउस लाइन (ओटावा विश्वविद्यालय, कनाडा) और डॉ एरिक क्रेजी को कोलक्यूडेक्स 2 / + माउस लाइन (अप्रकाशित, पेरिस विश्वविद्यालय, फ्रांस) प्रदान करने के लिए डॉ रश्मि कोथारी के भी आभारी हैं। हम सांख्यिकीय विश्लेषण में उनके समर्थन के लिए गिलाउम कोरे को धन्यवाद देते हैं। 2एच3 (जेसेल, टीएम और डोड, जे द्वारा विकसित) और एसवी 2 (बकले, केएम द्वारा विकसित) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाए गए डेवलपमेंटल स्टडीज हाइब्रिडोमा बैंक (डीएसएचबी) से प्राप्त किए गए थे और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242 में बनाए गए थे। इस काम को एसोसिएशन फ्रैंकाइज़ कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस (एएफएम-टेलीथॉन), आईएनएसईआरएम और इवरी वैल डी'एससोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers and Reagents
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) Life Technologies, Thermofisher A-11001
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) Life Technologies, Thermofisher B13422
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) Life Technologies, Thermofisher A-11032
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) Alomone Labs B-100-FR
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
DAPI Fluoromount-G Southern Biotech 00-4959-52
DPBS Gibco, Invitrogen 14190-169
Ethanol Absolute VWR 20821.296
Immersion Oil, n = 1.518 THORLABS MOIL-10LF  Low autofluorescence
Neurofilament (NF-M) antibody  DSHB AB_531793
Paraformaldehyde (PFA) MERCK 1.04005
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody DSHB AB_2315387
Triton X-100 Sigma T8787
Materials
Alnico Button cylindrical magnets Farnell France E822 diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg
63x 1.4 NA magnitude oil immersion  HCX Plan Apo CS objective Leica Microsystems
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective Zeiss
Curved thin forceps-Moria iris forceps Fine Science Tools 11370-31
Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15-003-08
Fine serrated forceps Euronexia P-95-AA
Gel loading tip round 1-200 µL COSTAR 4853
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Leica Microsystems
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm Leica Microsystems
Lens Cleaning Tissue  Whatman (GE Healthcare) 2105-841
Medium serrated forceps Euronexia P-95-AB
Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm Marienfield 107222 High precision
Nunclon delta surface (12-well plates) Thermo Scientific  150628
Nunclon delta surface (24-well plates) Thermo Scientific  142475
Safeshield scalpel Feather 02.001.40.023
Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11
Superfrost plus slides Thermo Scientific  J1800AMNZ
Software
GraphPad  Prism, San Diego (US) Release N°6.07 Statistical software
ImageJ software National Institutes of Health Release N° 1.53f
Leica Application Suite X software Leica Microsystems Release N°3.7.2.2283 Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 178
संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहों में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का लक्षण वर्णन
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Marinello, M., Cosette, J., Bogni,… More

Marinello, M., Cosette, J., Bogni, C., Denard, J., Stockholm, D., Buj-Bello, A. Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63032, doi:10.3791/63032 (2021).

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