Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

Published: December 8, 2021 doi: 10.3791/63032
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1,2, *1,3, *1,2
1Genethon, 91000, Evry, France, 2Université Paris-Saclay, Univ Evry, Inserm, Genethon, Integrare research unit UMR_S951, 91000, Evry, France, 3Ecole Pratique des Hautes Etudes, PSL Research University, 75014, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מורפומטרי של צמתים עצביים-שריריים על ידי מיקרוסקופיה משולבת של קונפוקל ו-STED המשמשת לכימות שינויים פתולוגיים במודלים של עכברים של SMA ו-CMS הקשורים ל-ColQ.

Abstract

צמתים עצביים-שריריים (NMJs) הם סינפסות מיוחדות מאוד בין נוירונים מוטוריים נמוכים וסיבי שרירי שלד הממלאים תפקיד חיוני בהעברת מולקולות ממערכת העצבים לשרירים רצוניים, מה שמוביל להתכווצות. הם מושפעים ממחלות אנושיות רבות, כולל הפרעות נוירומוסקולריות תורשתיות כגון ניוון שרירים דושן (DMD), תסמונות מיאסטניות מולדות (CMS), ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS). לכן, ניטור המורפולוגיה של צמתים עצביים-שריריים והשינויים שלהם במודלים של עכברי מחלה מהווה כלי רב ערך למחקרים פתולוגיים ולהערכה פרה-קלינית של גישות טיפוליות. כאן מתוארות שיטות לתיוג וניתוח המורפולוגיה התלת-ממדית (3D) של החלקים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים של לוחות קצה מוטוריים מסיבי שריר ממוריניים. ההליכים להכנת דגימות ולמדידת נפח NMJ, שטח, טורטואוזיות ומורפולוגיה/תפוסה של מסוף אקסון על ידי הדמיה קונפוקלית, והמרחק בין קפלי צומת פוסט-סינפטיים לבין קולטן אצטילכולין (AChR) רוחב פס על ידי מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה ברזולוציה גבוהה במיוחד (STED) מפורטים. שינויים בפרמטרים אלה של NMJ מודגמים בעכברים מוטנטיים המושפעים מ-SMA ו-CMS.

Introduction

הצומת הנוירומוסקולרי (באנגלית: Neuromuscular junction, בראשי תיבות: NMJ) הוא מבנה מורכב המורכב ממסוף אקסון מוטורי, תא שוואן פריסינפטי וחלק מיופייבר שלדי המעורב בהעברת מידע כימי וצימוד של פעילות נוירונים מוטוריים נמוכים יותר להתכווצות שרירים. ביונקים, המורפולוגיה של הצומת העצבי-שרירי משתנה במהלך ההתפתחות, מאמצת צורה טיפוסית דמוית בייגלה לאחר ההתבגרות, עם הבדלים בצורה ובמורכבות בין המינים, ומראה מידה מסוימת של פלסטיות בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים כגון פעילות גופנית או הזדקנות 1,2,3,4 . לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית יוצרת אינווגינציות ממברנה הנקראות קפלים צומתיים, כאשר החלק העליון המכיל קולטני אצטילכולין (AChR) נמצא במגע הדוק עם ענף האקסון הטרמינלי הקדם-סינפטי5.

שינויים מורפולוגיים ותפקודיים בצמתים עצביים-שריריים תורמים לפתופיזיולוגיה של מספר הפרעות נוירודגנרטיביות כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מיופתיות כמו ניוון שרירים דושן (DMD), תסמונות מיאסטניות מולדות (CMS), מיאסטניה גרביס (MG) ומיופתיות צנטרו-גרעיניות (CNM), וסרקופניה הקשורה להזדקנות 3,6,7,8,9, 10,11,12. במחלות אלה נצפים שינויים מבניים NMJ כגון פיצול לוחית קצה, גודל קיפול צומתי פוסט-סינפטי מופחת ו/או ניתוק עצבים. הפתולוגיה של NMJs יכולה להיות אירוע ראשוני או מוקדם במהלך התקדמות המחלה או להופיע לאחרונה כאירוע משני התורם לביטויים הקליניים. בכל מקרה, ניטור המורפולוגיה של NMJs במודלים של בעלי חיים של מחלות אלה מייצג פרמטר רב ערך לחקר שינויים פתולוגיים והערכת היעילות של טיפולים פוטנציאליים.

המורפולוגיה של צמתים עצביים-שריריים מנותחת בדרך כלל על ידי טכניקות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית 2,13,14,15 או מיקרוסקופיית אלקטרונים 5,16, עם המגבלות המובנות שלהם כגון רזולוציה או קשיים טכניים, בהתאמה. לאחרונה, מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה שימשה גם כדי לדמיין אזורים מסוימים של NMJ, כגון אזורים פעילים presynaptic או התפלגות AChR על הממברנה הפוסט-סינפטית16,17,18, כגישה חלופית או משלימה לאנליזה אולטרה-סטרוקטורלית על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים.

פרוטוקול זה נועד לספק שיטה מפורטת וניתנת לשחזור להערכת פרמטרים מורפולוגיים של NMJ על ידי שילוב מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית ודלדול פליטה מגורה (STED). תכונות חשובות של לוחות הקצה הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, כגון נפח, שטח, פיתול יחסי, רוחב פס AChR והתפלגות מסוף האקסון בסיבי שריר פנימיים של גסטרוקנמיוס עכבר וטיביאליס קדמי כומתו בהקשר של תנאים נורמליים וחולים. בפרט, פגמים NMJ הודגמו במודל העכבר Smn 2B/- של ניוון שרירים בעמוד השדרה, מחלה נוירומוסקולרית עם ניוון נוירונים מוטוריים הנגרמת על ידי מוטציות בגן SMN1 11,19, ובתת-יחידת זנב דמוית קולגן של נוקאאוט אצטילכולין אסטראז אסימטרי (ColQ Dex2/Dex2 או ColQ-KO), כמודל של תסמונת מיאסטנית מולדת 20, 21,22.

Protocol

טיפול ומניפולציה בעכברים בוצעו על פי חקיקה לאומית ואירופאית בנושא ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית. זכרים ונקבות של עכברי Smn 2B/- (רקע C57Bl/6J) ועכברי ColQ Dex2/Dex2 (רקע B6D2F1/J) בגיל 3 ו-6 שבועות, בהתאמה, שימשו במחקר.

1. המתת חסד של עכברים וכריתת שרירים: טיביאליס קדמי וגסטרוקנמיוס

  1. המשך להרדמה בעכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (12.5 מ"ג/ק"ג) תמיסה מעורבת (0.1 מ"ל/20 גרם משקל גוף) לפני המתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם.
    הערה: מכיוון ש-SMA ו-ColQ-CMS משפיעים על אנשים ללא תלות במין שלהם, נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בפרוטוקול הנוכחי.
  2. הסירו את השיער האחורי באמצעות מכונת גילוח חשמלית קטנה ושטפו את הרגליים ב-70% אתנול.
    הערה: הליך הדיסקציה יהיה שונה עבור כל שריר. עבור דיסקציה של tibialis קדמי (TA), בצע את השלבים 1.2.1-1.2.3, ועבור gastrocnemius (GA) (חלקים מדיאליים ורוחביים), בצע את השלבים 1.2.4-1.2.6. טפל בשרירים בעדינות כדי למנוע נזק לרקמות וריסוק או מתיחה שלהם במהלך דיסקציה.
    1. הנח את העכבר במצב שכיבה.
    2. בצע חתך בעור של 5 מ"מ עם מספריים קהים חדים לאורך החלק האנטרו-חיצוני של החלק האחורי הדיסטלי, במקביל לטיביה, כדי לחשוף את השריר. השתמש במספריים דקים במיוחד כדי להסיר את החיתולית.
    3. חותכים תחילה את הגיד הדיסטלי (קרוב לכף) ולאחר מכן את הגיד הפרוקסימלי (קרוב לברך) באמצעות מספריים דקים במיוחד ומלקחיים דקים מעוקלים. טפלו בשריר בזהירות כדי למנוע נזק למיופייבר ולעצבים.
      הערה: יש לחתוך את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לעצם כדי לקצור את השריר כולו.
    4. הניחו את העכבר במצב נוטה, השתמשו במספריים קהים חדים כדי לבצע חתך בעור מהחלק העליון של התא האחורי הדיסטלי עד לכפה, והסירו את העור.
    5. תפסו את גיד אכילס במלקחיים משוננים בינוניים, חתכו אותו במספריים דקים במיוחד והפרידו בעדינות את ה-GA מהרקמה הסובבת אותו בחזרה להחדרתו הפרוקסימלית.
    6. בצד הפרוקסימלי, הכנס את המלקחיים המשוננים הבינוניים לכיס שנוצר בין שרירי הזרוע femoris (BF) לבין ה- GA. הפרד את שני השרירים כדי לחתוך את גיד ה- GA קרוב ככל האפשר להחדרת העצם באמצעות מספריים דקים במיוחד.
  3. לקיבוע רקמות, יש להכניס כל שריר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) המדוללת במלח מאגר פוספט (PBS ללא Ca 2+Mg 2+) ולשמור על טמפרטורה של 4°C למשך18-24 שעות.
    אזהרה: פרפורמלדהיד ופורמלדהיד הם רעילים ויש לטפל בהם במכסה אדים כימי עם ציוד מגן מתאים.
  4. למחרת, שטפו את השרירים הקבועים 3x למשך 5 דקות עם PBS בצלחות של 12 בארות על ידי ניעור עדין בטמפרטורת החדר (RT) בתוך מכסה אדים כימי.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולהמשיך אותו תוך חודש. במקרה זה, להוסיף PBS בתוספת 0.01% נתרן אזיד כדי לאחסן דגימות ב 4 °C (64 °F).
  5. הקניטו כל שריר בצרורות סיבים קטנים ברוחב של כ-1 מ"מ באמצעות שני מלקחיים משוננים עדינים.
    הערה: חשוב מאוד לתמרן את השרירים בעדינות רבה עם המלקחיים, ללא כוח מוגזם, כדי למנוע נזק לרקמות במהלך ההקנטה.
    1. נתקו את שריר ה-TA ל-3 או 4 צרורות בהתאם לגודלו.
    2. עבור GA, להפריד את החלקים המדיאליים והרוחביים של השריר ולאחר מכן לנתק כל חלק לתוך 4-5 צרורות בהתאם לגודלם.

2. אימונוסטינינג

  1. המשך עם חדירת סיבי שריר: העבר את צרורות השרירים ל-24 צלחות המכילות 1% (v/v) Triton X-100 ב-PBS ושמור אותם תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד) למשך שעה אחת ב-RT או 5 שעות ב-4°C.
    הערה: פצלו את צרורות השרירים בין שתי צלחות כדי להמשיך עם תופעות חיסון נפרדות וכדי למזער את הסיכון לבלבול נוגדנים. אין לפצל אותם ליותר משתי בארות (באר אחת / צלחת); אחרת, המספר (N) של NMJs המייצגים את מעמדם הכללי בשריר המנותח עשוי להיות לא מספיק.
  2. שטפו את הדגימות 3x במשך 5 דקות עם PBS ב-RT ודגרו אותן עם תמיסת חסימה המורכבת מ-4% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS/Triton X-100 1% למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס, תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד).
    הערה: אין להשתמש במשאבת שאיפה במהלך שלבי הכביסה, אלא לשאוף את התמיסה באופן ידני עם פיפטה של 200 μL וטיפים בגודל קטן (ההפניה מצוינת בטבלת החומרים).
  3. דגירה של הדגימות למשך הלילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה (50 סל"ד) כאשר תמיסת החסימה מסומנת בשלב 2.2 המכילה נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים נגד נוירופילמנט M (NF-M, 2H3, דילול 1/200) או גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2, דילול 1/200) כדי לסמן מסופי אקסון קדם-סינפטיים או אזורים פעילים, בהתאמה.
  4. למחרת, לשטוף את צרורות השרירים 3x במשך 5 דקות PBS תחת תסיסה (50 סל"ד).
    1. להדמיה קונפוקלית: דגירה של צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים המצומדים עם פלואורופור פולט אדום (F594) (דילול 1/500) ו-α-בונגארוטוקסין מצומד עם פלואורופור פולט ירוק (α-BTX-F488) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל"ד).
    2. להדמיית STED: דגירה על צרורות השרירים עם נוגדנים משניים נגד עכברים המצומדים עם פלואורופור פולט ירוק (F488) (דילול 1/500) ו-α-בונגארוטוקסין מצומד עם פלואורופור פולט אדום רחוק המאופיין ביציבות פוטו-יציבה גבוהה (α-BTX-F633) (דילול 1/1000) ב-PBS למשך שעתיים ב-RT תחת תסיסה (50 סל"ד).
      הערה: אין לחשוף את הדגימות לאור במהלך הדגירה כדי למנוע הלבנת תמונות.
  5. שטפו את צרורות השרירים המסומנים 3x למשך 5 דקות עם PBS תחת תסיסה (50 סל"ד) והניחו אותם על מגלשה עם מדיום הרכבה.
    הערה: יש להניח לכל היותר 4 עד 5 חבילות שרירים בכל שקופית כדי לאפשר איטום.
  6. הוסף כיסוי זכוכית דרגה #1.5 (או #1.5H) (עובי 0.17 מ"מ) בחלק העליון, והנח מגנטים גליליים משני צידי המגלשה כדי להפעיל לחץ ולשטח את השרירים.
  7. שמור על המגלשות מוגנות מפני O/N קל בטמפרטורה של 4°C. אטמו את השקופיות לצמיתות בעזרת לק.

3. רכישת תמונה

  1. רכישות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי
    הערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר באמצעות מטרת טבילת שמן בעוצמה של פי 63 (HCX Plan Apo CS, צמצם מספרי 1.4 (NA)).
    1. לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד לכימות הפרמטרים של NMJ עבור כל הדגימות.
    2. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > machine.xlhw (איור משלים 1).
    3. מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ ומצא את מישור התצפית בתוך הדגימה על ידי הסתכלות תחת תאורת פלואורסצנציה בשדה רחב של DAPI עם ערכת מסנן DAPI.
    4. לחץ על פתח פרוייקט > פרוייקטים חדשים וצור תיקיה לאחסון רכישות תמונות (איור משלים 1).
      הערה: צור פרוייקט חדש עבור כל NMJ כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב.
    5. כדי לנהל פרמטרים של רכישה, לחץ על חלון הכרטיסייה רכישה והגדר את חור הסיכה הקונפוקלי ליחידה אוורירית 1.0 וכוח לייזר כדי למטב את רמות הרווח וההיסט עבור הפלואורסצנציה הירוקה/F488 (α-BTX) באמצעות לייזר של 488 ננומטר בלוח הקצה שיש לדמות (מצב Live ON).
    6. לאחר מכן, מטב את רכישת הפלואורסצנציה האדומה/F594 (NF-M או SV2) באמצעות לייזר המותאם לתצפית F594. במחקר זה נעשה שימוש בלייזר של 552 ננומטר ( מצב Live Mode ON). הגדר את ספקטרום פליטת הצבעים עם הטווחים הבאים עבור כל לייזר: לייזר 405 (DAPI) מ- 414 עד 483 ננומטר, לייזר 488 (F488-α-BTX) בין 506-531 ננומטר ולייזר 552 (NF-M/SV2) בין 622-650 ננומטר.
    7. אסוף ערימות תמונות של צמתים עצביים-שריריים בכל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 1024 x 1024 פיקסלים (73.7 x 73.7 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ, X מופעל דו-כיווני, גורם זום 2.5, גודל Z-step 0.5 מיקרומטר במצב Z-Wide.
      הערה: עבור כל NMJ, מספר הפרוסות מוגדר לרכישת הצומת כולו. הגדרות הרכישה שתוארו לעיל ממלאות את משפט הדגימה של ניקוויסט-שנון. עם זאת, המשתמש יכול ללחוץ על כפתור מיטוב פורמט , הקיים בכל תוכנות ההפעלה הקונפוקליות האחרונות, כדי להבטיח שגודל הפיקסל ושלב Z יעמדו בקצב הדגימה האידיאלי של Nyquist. פעולה זו תימנע מתמונות שנדגמו מעל או מתחת לנדגימה, מה שיגרום לאובדן דיוק במדידות עוצמת הקול.
    8. שמור את הקובץ המקורי ( .lif) או תמונות Z-stack (.tif) בתיקייה עם שם הכולל את שם הקוד של השקופית, סוג הצביעה ומספר לוחית הקצה.
      הערה: אסוף ברצף (לא בו-זמנית) את הסריקות באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-552 ננומטר (F488 ו-F594) כדי להימנע מהצלבה של פלואורסצנציה של F488 לערוץ F594 ולהיפך (גלישה). NB: ניתן להגדיר את נתיב הקרן באמצעות עוזר הצבע בתוכנת המיקרוסקופ.
    9. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.1.3-3.1.8 עבור כל NMJ.
    10. בסוף ההפעלה, לחץ על פתח במציג 3D ובחר נציג NMJ של קבוצת ניסוי כדי לדמיין את התיוג התלת-ממדי.
      הערה: מצב תצוגה זה יעזור לוודא שפרמטרי הרכישה היו נכונים.
    11. סגור את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות העדשה ולאחר מכן כבה את המערכת.
  2. רכישות על ידי מיקרוסקופיית STED
    הערה: התמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר המצויד ב-STED מגודר בגודל 775 ננומטר באמצעות מטרת טבילת שמן פי 100 (HC PL APO CS2 1.4 NA).
    1. לניתוח עיוור, תן לאדם שאינו מעורב בניתוח לקודד כל שקופית עם מספר נתון. הישארו עיוורים לקבוצות הניסוי עד לכימות הפרמטרים של NMJ עבור כל הדגימות.
    2. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ במצב תצורה > machine.xlhw ו- STED ON (איור משלים 2).
    3. לחץ על פתח פרוייקט > פרויקטים חדשים כדי ליצור תיקיה לאחסון רכישות תמונות.
      הערה: צור תיקיה חדשה עבור כל שקופית כדי להגביל את גודל התיקיה ולמנוע בעיות בזיכרון המחשב.
    4. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ וצפה בה תחת תאורת פלואורסצנציה בשדה רחב באמצעות לייזר 488 ננומטר כדי למצוא את מישור התצפית בתוך הדגימה.
    5. חפש NMJ המסומן בכתמי נוירופילמנט M (NF-M) או SV2 באמצעות לייזר 488 ננומטר עם גילוי ספקטרלי מ-506-531 ננומטר.
    6. כאשר זוהה NMJ, לחץ על הפעל STED והתחל לרכוש תמונות באזור המכיל מספר קיפולים צמתים (איור משלים 3) באמצעות לייזר 635 ננומטר עם גילוי ספקטרלי בין 640-750 ננומטר.
      הערה: הקפד על טבלת בדיקת הרוויה במהלך רכישת תמונה ולחץ על הלחצן Quick LUT כדי למנוע חשיפת יתר (ערכים אפורים >255; עבור 8 סיביות).
    7. אסוף את התמונות של כל קבוצת ניסוי עם אותן הגדרות: גודל תמונה 2048 x 2048 פיקסלים (38.75 x 38.75 מיקרומטר) בקצב דגימה של 400 הרץ.
      הערה: עוצמת הלייזר המתרוקנת (STED) מוגדרת ל-65%.
    8. שמור את התמונות בשם קובץ הכולל את הקוד של השקופית.
      הערה: ניתן ללחוץ על פורמט XY ממוטב: הגדר פורמט כדי להשיג את הגדרת הרכישה הטובה ביותר עם הדמיית STED.
    9. עבור לשקופית המקודדת הבאה וחזור על שלבים 3.2.3-3.2.8. חזור על הליך זה עבור כל השקופיות.
    10. בתום המיקרוסקופיה של STED, העבר את קבצי התמונה למחשב אחר ושמור את הקבצים המקוריים (. lif) בכונן חיצוני או בשרת.
    11. כבה את תוכנת המיקרוסקופ, נקה את המטרות עם רקמות העדשה ולאחר מכן כבה את המערכת.

4. ניתוח תמונה - מיקרוסקופיה קונפוקלית

הערה: כל התמונות עובדו עם מחשבים המשתמשים במערכת ההפעלה המקצועית Microsoft Windows 10.

  1. הפעל את ImageJ ומאקרו מותאם אישית כדי לחשב נפח לוחית קצה NMJ פוסט-סינפטית, אזור הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) וטורטואוזיות יחסית.
    1. עיבוד ערימות תמונות NMJ באמצעות NIH ImageJ תוכנה חופשית23, תוסף iGeodesic והמאקרו המותאם אישית לקבלת מדידות פרמטרים NMJ. הפעל את תוכנת ImageJ.
      הערה: הגרסה העדכנית ביותר של ImageJ זמינה בחינם וניתן להורידאותה 24. על מנת לפתוח פורמטים של קבצים קנייניים, יש להוריד את התוסף Bio-Formats Package25 26 . שלב זה אינו הכרחי במקרה שהמפעיל משתמש בפיג'י מכיוון שהתוסף כבר מותקן בתוכנה. תוסף iGeodesic27 למחשוב טורטואוזיות זמין גם באינטרנט28; ודא את הזמינות של תוסף זה בגרסת ImageJ/Fiji שבה ייעשה שימוש. פקודות המאקרו המותאמות אישית זמינות גם באינטרנט29.
    2. גרור ושחרר את Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (מותאם אישית, קובץ קידוד משלים 1) לחלון ImageJ; המאקרו יהיה פתוח בחלון שני. בחלון חדש זה, לחץ על פקודות מאקרו > הפעל מאקרו.
      הערה: המאקרו יכול לעבד הן קבצים קנייניים והן קבצי TIFF. קבצים חייבים לעמוד בקריטריונים הבאים: לתבניות קובץ קנייניות, שמור רק צומת אחד (כלומר, אוסף התמונות) לכל קובץ, מסודר בתיקייה; בתמונות TIFF, יש לשמור קבצים בתיקייה המכילה תיקיות משנה, שכל אחת מהן נקראת JunctionX (X מתאים למספר NMJ) עם אוספי התמונות של צומת נתון (RGB TIFF) (איור משלים 4).
    3. בחר את התיקיה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של Junction שיש לנתח ולחץ על בחר.
    4. בתפריט המוקפץ החדש שנקרא שמירת תיקיה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר.
    5. בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר את התבנית של רכישות Z-stack.
    6. בחר בערוץ RGB המתאים לצביעת העניין וציין גודל פיקסלים XY ושלב Z (z). המאקרו יבצע את הניתוח באופן אוטומטי.
      הערה: אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו קורא ישירות את גודל הפיקסלים ואת Z-step (z). עם זאת, המשתמש עדיין צריך לציין את ערוץ העניין (C1, C2 או C3). המאקרו יספק גליון נתונים (.csv) עבור כל פרמטר צומת (אמצעי אחסון של לוחית קצה, אזור MIP וטורטואוזיות) בתיקיית השמירה. המאקרו גם יוצר שלושה . קבצי TIF , התואמים את ההיקף של Drawing_MaxprojX.tif צביעת α-BTX, DrawingJunctionX.tif ו- MIP MaxprojX.tif. קובצי TIFF אלה נוצרים כדי לאמת את איכות הרכישות וכדי להבטיח שעיבוד התמונה בוצע כהלכה.
      אמצעי אחסון NMJ פוסט-סינפטי (V): המאקרו יפריד תמונות מ- NMJ יחיד וישמור על ערוץ α-bungarotoxin F488 המתאים ללוחית הקצה הפוסט-סינפטית. המחסנית מפולחת באמצעות סף Otsu30 על פרוסת הביניים של הערימה. התמונה הבינארית המתקבלת מורחבת בפיקסל אחד, והתכונה 'ניתוח חלקיקים ' משמשת למדידת אזור לוחית הקצה של כל עצם שזוהה. כדי לקבל את נפח NMJ הפוסט-סינפטי, המאקרו מסכם את כל אזורי לוחית הקצה הנמדדים של הערימה ומכפיל אותה בערך Z-step (z) ב- μm.
      Equation 1
      אזור לוחית קצה של הקרנה בעוצמה מרבית (MIP): לאחר סף הערימה, ההקרנה בעוצמה מרבית (MIP) מתקבלת באמצעות התכונה ImageJ של Z-project . התכונה 'נתח חלקיקים ' משמשת לאחר מכן לכימות אזור לוחית הקצה של MIP.
      טורטואוזיות NMJ MIP (T): טורטואוזיות NMJ, המשקפת את מידת המורכבות של לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית כולל קפלים ונקבים31, מחושבת על סמך כל MIP באמצעות הנוסחה הבאה, כאשר d Obj(AB) הוא המרחק בין A ל-B לאורך היקף האובייקט, ו-dEuc(AB) הוא המרחק האוקלידי בין A ל-B (קו ישר).
      Equation 2
    7. הגדר את ערך הטורטואוזיות הגבוה ביותר בקבוצת הסוג הפראי של כל תנאי ניסוי ל- 100%, ונרמל את כל הערכים האחרים של תנאי הניסוי לערך זה על מנת לקבל את הטורטואוזיות היחסית של NMJ.
  2. הפעל את ImageJ ומאקרו מותאם אישית כדי לכמת הצטברות נוירופילמנט קדם-סינפטי וכתם גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2.
    הערה: הצטברות נוירופילמנט (כאן, NF-M) ו/או התפלגות שונה של שלפוחיות סינפטיות (כאן, SV2) הם סמנים של הובלה אקסונאלית חריגה ו / או סחר שלפוחית לקוי ונצפו בעבר ב- NMJs של מודלים שונים של עכברי SMA32,33,34.
    1. גרור ושחרר את Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (מותאם אישית, קובץ קידוד משלים 2) לחלון ImageJ; המאקרו ייפתח בחלון שני. בחלון חדש זה, לחץ על פקודות מאקרו > הפעל מאקרו.
      הערה: המאקרו יכול לעבד הן תבניות קובץ קנייניות והן קבצי TIFF. הקבצים חייבים לעמוד בקריטריונים המצוינים בהערה שלהלן שלב 4.1.2.
    2. בחר את התיקיה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של Junction שיש לנתח ולחץ על בחר.
    3. בתפריט המוקפץ החדש שנקרא שמירת תיקיה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר.
    4. בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר את התבנית של רכישות Z-stack.
    5. בחלון המוקפץ Staining Infos , ציין את התווית והצבע הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים ולחץ על אישור. לדוגמה, תווית קדם-סינפטית: SV2 או NF, צבע קדם-סינפטי: R, תווית פוסט-סינפטית: BTX, צבע פוסט-סינפטי: G.
      הערה: עבור תבניות קובץ קנייניות, יש לציין תוויות וערוצים מתאימים (C1, C2 או C3).
    6. בחלון המוקפץ גודל פיקסל , ציין גודל פיקסל XY 0.072 מיקרומטר ו- Z שלב 0.5 מיקרומטר (z) ולחץ על אישור. המאקרו יבצע את הניתוח באופן אוטומטי.
      הערה: פרמטר זה מתאים לגודל התמונה 1024 x 1024 פיקסלים (73.7 x 73.7 מיקרומטר) שנבחר לפני רכישת מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מתואם להגדרות המטרה והזום. אם נבחרו תבניות הקובץ הקנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת Z-step (z). המאקרו יאחסן, בתיקיית השמירה, גליון נתונים (.csv) של אמצעי אחסון קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, תמונת TIFF מרובת עמודים של הזיהוי הנוכחי עבור כל תיוג (טרום ופוסט-סינפטי). כפי שצוין לעיל, קבצי TIFF אלה נוצרים כדי לבדוק את איכות הרכישות וכדי להבטיח שעיבוד התמונה בוצע כראוי.
      המאקרו מחשב את הנפח של צביעת נוירופילמנט M אקסונאלית (נפח NF) מערוץ NF-M-F594 המתמזג עם תיוג α-bungarotoxin-F488 ואת הנפח של צביעת גליקופרוטאין 2 שלפוחית סינפטית NMJ (נפח SV2) מערוץ SV2-F594 המתמזג עם תיוג α-BTX-F488. הצטברות NF-M מכמתת על ידי חישוב היחס בין נפח NF לנפח לוחית קצה פוסט-סינפטית (α-BTX) ותפוסת מסוף האקסון NMJ לפי היחס בין נפחי SV2 ו- α-BTX, כפי שמוצג להלן.
      Equation 3
      Equation 4

5. ניתוח תמונה - מיקרוסקופיית STED

הערה: עיבוד התמונה בוצע באמצעות תוכנה לא מקוונת של יצרן מיקרוסקופ STED.

  1. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ.
  2. פתח את הפרויקט על ידי לחיצה על פתח פרויקט לחצן. בחר את קובץ הפרוייקט ( .lif) ופתח אותו. התמונות מוצגות על המסך יחד עם שמותיהן.
  3. בחלון תהליך : לחץ על הפחתת רעש > חציון. בתחתית החלון האמצעי, הגדר את רדיוס ל- 5.00 ואת איטרציה ל- 1.00, ובטל את הסימון של סינון תלת-ממדי.
  4. לאחר מכן בחר את פרויקטים פתוחים הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה של החלון ובחר תמונה.
  5. לחץ על החל כדי לאמת פרמטרים. תמונה חדשה בשם "nameofimage_median001" נוצרת.
    הערה: ניתן ללחוץ על תצוגה מקדימה לפני החל כדי לפקח על ההשפעה של המסנן החציוני, אשר ישפר את ניגודיות התמונה ויחליק את פרופילי הקו המשמשים לכימות.
  6. החל את המסנן על כל התמונות כפי שמצוין בשלבים 5.4-5.5.
  7. בכרטיסיות פרויקטים פתוחים , לחץ על סמל כונן התקליטונים כדי לשמור את כל הפרויקטים, כולל התמונות המסוננות החדשות שנוצרו.
    הערה: השלב הבא ייעשה באמצעות התמונה המסוננת בשם "nameofimage_median001".
  8. חישוב המרחק בין פסי AChR
    הערה: שינויים במורפולוגיה של קפלים פוסט-ג'נטוריים נצפים לעתים קרובות בהפרעות נוירומוסקולריות כסימן לפתולוגיה של NMJ (חוסר בגרות או ניוון). המרחק (d) בין פסי AChR, המזוהים על ידי צביעת α-בונגארוטוקסין, מחושב על ידי יצירת פרופילי עוצמה וכימות המרחק בין כל שיא עוצמה מקסימלית על ידי ציור פרופיל קו (איור משלים 5).
    1. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר בתפריט כימות בחלק העליון של החלון המרכזי.
    2. לחץ על כלים הכרטיסייה בפינה הימנית העליונה. בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה ולחץ על סמל פרופיל קו . הגדר דגימת יתר ל- 1, וסמן את מיין ערוצים.
    3. לחץ על הכרטיסיות פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח.
      הערה: ניתן להגדיל את התצוגה של התמונה על-ידי גלילה באמצעות עכבר המחשב. ניתן לשנות את הטווח הדינמי של התמונה באמצעות הסרגל בצד שמאל ליד התמונה המוצגת, מה שמקל על ההדמיה של הפסים.
    4. לאחר מכן, לחץ על לצייר קו סמל בתפריט העליון של החלון הימני ולעקוב אחר קו חוצה בניצב כמה פסים / קיפולים צומתיים.
      הערה: פרופיל העוצמה מוצג בחלון המרכזי.
    5. לחץ על החלק העליון של השיא הראשון והזז את מצביע העכבר תוך שמירה על לחצן העכבר השמאלי לחוץ עד להגעה לשיא המרבי הבא.
      הערה: המידע מוצג בפרופיל העוצמה, בעוד שהמרחק בין שתי הפסגות מוצג מתחת לתרשים עם המלים "dx".
    6. לחץ ימינה על העכבר בזמן שאתה בתמונה של החלון הימני ובחר שמור ROIs. פתח את ה- ROIs שנשמרו (אזורי עניין) על ידי לחיצה על טען ROIs.
    7. לחץ על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של החלון הימני, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח.
    8. חזור על פעולה זו כמה פעמים שנדרש מפרופילי עוצמה שונים כדי לקבל את המספר החזוי של מרחקי פס AChR שייצגו את הערך הגלובלי בשריר המנותח.
      הערה: ניתן לחשב מראש את ערך N האופטימלי בהתבסס על ההפרש המשוער בין קבוצות, סיכון α, הספק ומבחן זנב אחד או שניים. בתכנון הניסוי הנוכחי, הוחל מבחן מאן-וויטני חד-זנב (סיכון α = 10%; הספק = 80%), וערך ה-N הוערך כחמישה מרחקי פס AChR לפחות לכל NMJ על מנת להשוות בין שתי קבוצות בעלי החיים.
  9. רוחב פס AChR
    הערה: רוחב הפס (w) מתאים לחצי הרוחב המלא המרבי (FWHM) של פרופיל העוצמה, שהוא המרחק בין הנקודות שבהן ערך הפלואורסצנציה של האות α-BTX הוא מחצית מעוצמתו המרבית (איור משלים 5).
    1. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר בתפריט כימות בחלון המרכזי.
    2. לחץ על כלים הכרטיסייה בצד שמאל למעלה. בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה ולחץ על הסמל קבע FWHM . סמן ערוצי מיון.
      הערה: כדי למטב את זיהוי השיא על-ידי התוכנה, הגדר סף ורוחב הוגדרו ל- 50 ו- 3, בהתאמה. התאימו את הערכים הללו לכל ניסוי ובקשו עצה ממדען הדמיה מנוסה.
    3. לחץ על הכרטיסיות פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח.
      הערה: ניתן להגדיל את התצוגה של התמונה המוצגת בחלון הימני על-ידי גלילה באמצעות עכבר המחשב. כפי שצוין לעיל (הערה לאחר שלב 5.8.3), ניתן לשנות את הטווח הדינמי של התמונה להדמיית פס אופטימלית.
    4. לאחר מכן, לחץ על צייר סמל מלבן בתפריט העליון של החלון הימני. בחר פס אופקי או אנכי וצייר מלבן בניצב לפס. פרופיל מופיע בחלון המרכזי.
    5. לחץ על אנכי או אופקי בתפריט הקרנה ממוצעת הממוקם בחלונית השמאלית, בהתאם לכיוון הפס האנכי או האופקי.
    6. לחץ על סטטיסטיקה בחלון המרכזי וקרא את הערך FWHM.
    7. בצע לחיצה ימנית עם עכבר המחשב על התמונה המוצגת בחלון הימני ובחר שמור ROIs.
      הערה: פתח את ה- ROIs שנשמרו על ידי לחיצה על טען ROIs.
    8. לחץ על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של החלון הימני, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח.
    9. חזור על פעולה זו כמה פעמים שנדרש מ- ROIs מלבניים שונים עד לקבלת המספר החזוי של רוחב פס AChR, אשר ייצג את הערך הגלובלי בשריר המנותח.

6. תכנון ניסויים ובדיקות סטטיסטיות

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנה ספציפית.
    הערה: הנתונים נאספו מ-N ≥ 3 שכפולים ביולוגיים ולפחות 20 NMJs לכל גנוטיפ להדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי, ו-N ≥ 5 שכפולים ביולוגיים ו-N = 5 NMJs לכל גנוטיפ להדמיית STED, בכל קבוצת ניסוי. המובהקות הוערכה על ידי מבחן מאן-וויטני הלא מזווג (לא-פאראמטרי), וערכי p מצוינים במקרא האיורים המתאים.

Representative Results

על מנת להקל על הניתוח המורפולוגי של צמתים עצביים-שריריים ברמה הקדם-סינפטית והפוסט-סינפטית באופן הניתן לשחזור, פותחה זרימת עבודה מקצירת שרירים ועד הדמיה וכימות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ ופקודות מאקרו מותאמות אישית של ImageJ (איור 1). כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול זה, הוערכו המורפולוגיה של NMJs בשני מודלים של עכברים של הפרעות גנטיות, עכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2 המושפעים מאטרופיה שרירית בעמוד השדרה (SMA) וצורה של תסמונת מיאסטנית מולדת (CMS), בהתאמה, והנתונים הושוו לחברי פסולת בקרה תואמי גיל.

מבנה ה-NMJ הוערך משרירי טיביאליס קדמיים וגסטרוקנמיוס של עכברי Smn2B/- (רקע C57Bl/6) ו-ColQ Dex2/Dex2 (רקע B6D2F1/J), בהתאמה, כאשר סימנים למחלה כבר נמצאים בבעלי חיים אלה. בגיל 3 שבועות, עכברי Smn2B/- מראים סימנים של עיכוב בהתפתחות שרירי השלד וניתוק עצבים, כגון ניוון NMJ ואובדן35,36. לעכברי CMS יש פתולוגיה ראשונית ב- NMJs והם מפגינים ירידה במשקל הגוף מהשבוע הראשון לחיים וחולשת שרירים מסומנת20 (נתונים לא מוצגים). כפי שניתן לראות באיור 2A, לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית המסומנת בפלואורסצנט α-בונגארוטוקסין נראתה קטנה יותר ו/או מקוטעת במוטציות של שני קווי העכבר על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כימות של ערימות NMJ Z באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית אלה של ImageJ גילה ירידות ניכרות בנפח לוחית הקצה, בהקרנה בעוצמה מרבית (MIP) ובטורטואוזיות יחסית בעכברי SMA ו-CMS בהשוואה לפקדים, כסימנים לפגמים בהבשלת NMJ32 (איור 2B-D). נפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית ו-MIP ירדו בבעלי חיים חולים (שינוי קיפול של 2.7 ו-2.0 עבור נפח, ו-2.5 ו-2.0 עבור MIP, בעכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2, בהתאמה). הטורטואוזיות היחסית הייתה גם קטנה יותר בשרירים עם מחסור ב-SMN וב-ColQ בהשוואה ל-WT (16.97% ±-1.33% ב-SMA לעומת 48.84% ±-5.90% בעכברי WT, ו-13.29% ±-2.79% ב-CMS לעומת 30.20% ±-4.44% עכברי בקרה). בנוסף, כימות ההתפלגות של ענפי מסוף האקסון הקדם-סינפטי באמצעות המאקרו המותאם אישית ImageJ חשף דפוס שונה בהתפלגות הנוירופילמנט M בשני המודלים החייתיים, עם עלייה באימונו-לייבלינג (84.65% ± 0.32% לעומת 16.57% ± 2.03% ו-23.64% ±-2.78% לעומת 18.77% ±-1.73% בעכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2 בהשוואה לבקרים, בהתאמה) (איור 3A-D ). על ידי צביעת SV2, נצפתה ירידה של 43% ביחס התפוסה, כלומר אחוז מהאזורים המכילים AChR עם אזורים פעילים של מסוף העצבים הסמוך, גם בעכברי Smn2B/- (49.36% ± 3.76% בעכברי SMA לעומת 85.69% ± 2.34% עכברי WT) (איור 3E,F). פרמטר NMJ זה חושב גם ב-GA של מוטנטים מסוג ColQ Dex2/Dex2, אך לא נמצא הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לחברי פסולת בקרה (הנתונים לא הוצגו).

בהמשך ניתחנו את מאפייני הממברנה הפוסט-סינפטית על ידי כימות המרחק בין קפלי צומת לרוחב פסי AChR, הממוקמים בפסגת הקפלים הללו, בשרירים חסרי ColQ באמצעות מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה ברזולוציה גבוהה (STED). כפי שניתן לראות באיור 4, ניתן לדמיין בבירור את ההיבט של המבנים האלה על-ידי תיוג פלואורסצנטי של α-בונגארוטוקסין וניתוח פרופיל עוצמה. הערכנו את הפרמטרים האלה של NMJ ומצאנו עלייה במרחק הקיפול הצמתי (d) וברוחב (w) של פסי AChR בשריר הגסטרוקנמיוס של מוטנטים (358.3 ננומטר ± 11.97 ננומטר ו-320.8 ננומטר ± 10.90 ננומטר למרחק, ו-216.9 ננומטר ± 10.51 ננומטר ו-186.3 ננומטר ± 7.015 ננומטר לרוחב, ב-ColQ Dex2/Dex2 בהשוואה לעכברים מסוג פראי, בהתאמה, p < 0.05) (איור 4C,D).

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול הווידאו לאפיון NMJ רב-ממדי תלת-ממדי על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED. שרירי טיביאליס קדמיים (TA) וגסטרוקנמיוס (GA) נאספו מעכברים, וסיבי שריר הוקניטו לפני הסימון עם α-בונגארוטוקסין-F488 או α-בונגארוטוקסין-F633, DAPI, נוגדנים ראשוניים המכוונים נגד נוירופילמנט M (NF-M) וגליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2), ונוגדנים משניים מצומדים לפלואורופור (F488 או F594). ערימות תמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ועובדו למדידת נפח NMJ פוסט-סינפטי, הצטברות NF-M קדם-סינפטית, תפוסת מסוף אקסון NMJ, אזור לוחית קצה של הקרנה בעוצמה מרבית פוסט-סינפטית (MIP) וטורטואוזיות (d Obj(AB) הוא המרחק בין A ל-B לאורך היקף האובייקט (קו אדום), בעוד ש-dEuc(AB) הוא המרחק האוקלידי בין A ל-B (הקו הירוק)). עבור ניתוח מיקרוסקופיה STED, רוחב פסי קולטן אצטילכולין (AChR) והמרחק בין קפלי צומת כומתו מפרופילי עוצמה של מכתים α-BTX-F633. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אפיון NMJ פוסט-סינפטי מרובה פרמטרים במודלים של עכברים של ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) ותסמונת מיאסטנית מולדת הקשורה ל-ColQ (CMS ). (A) תמונות מייצגות של לוחות קצה מוטוריים פוסט-סינפטיים משרירי TA ו-GA המסומנים ב-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B ) כימות של נפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית של NMJ, (C) אזור היטל העוצמה המרבית (MIP) ו-(D) הטורטואוזיות היחסית בת"א של עכברים מסוג בר בן 3 שבועות (WT) ו-Smn2B /- עכברים (גרפים שמאליים, N = 3 בעלי חיים לכל גנוטיפ, n = 37 ו-n = 56 NMJs, בהתאמה) ו-WT ו-ColQDex2/Dex2 בני 6 שבועות עכברים (גרפים ימניים, N = 5 עכברים לכל גנוטיפ, n = 89 ו- n = 97 NMJs, בהתאמה). הנתונים מבוטאים כממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח מורפומטרי של התפלגות מסוף האקסון הקדם-סינפטי בשרירי WT ועכברים מוטאנטים. תבנית העצבנות של NMJ בשרירים הקדמיים של טיביאליס (TA) וגסטרוקנמיוס (GA) של עכברי CMS מסוג פראי, SMA ו-ColQ. (א, ב) צמתים עצביים-שריריים מייצגים מ-TA של עכברי WT ו-Smn2B/- בגיל 21 יום המסומנים בנוגדנים נגד נוירופילמנט M (NF-M, אדום) ו-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, ירוק) (A), ותוצאות מניתוח כמותי של הצטברות נוירופילמנט (B); (ג, ד) צמתים עצביים-שריריים מייצגים מ-GA של עכברי WT ו-ColQ Dex2/Dex2 בני 6 שבועות המסומנים בנוגדנים נגד נוירופילמנט M (NF-M, אדום) ו-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, ירוק), המציגים לוחות קצה פוסט-סינפטיים מקוטעים ולא בשלים (C), ותוצאות של הצטברות נוירופילמנט בשתי קבוצות בעלי החיים (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) ו- N = 3 (n = 54 NMJs) (D) חיות WT, ו- N = 3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- ו- N = 3 (n = 55 NMJs) עכברי ColQ Dex2/Dex2 נותחו בניסויים (B, D). (ה, ו) תמונות מייצגות של תפוסת מסוף האקסון ב-NMJs מ-TA של עכברי WT ו-Smn 2B/- בני 3 שבועות המסומנים בנוגדנים נגד גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2, אדום) ו-α-בונגארוטוקסין-F488 (α-BTX, ירוק) (E), ותוצאות תפוסת NMJ (יחס נפח SV2/AChR) (F). נותחו שרירים מ-N = 3 (n = 50 NMJs) מסוג פראי ו-N = 4 (n = 62 NMJs) עכברי Smn2B/- . הנתונים מבוטאים כערך הממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). סרגלי קנה המידה הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הדמיית STED של לוחות קצה פוסט-סינפטיים של NMJ. (A) תמונת STED מייצגת של NMJ המסומנת ב-α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) מגסטרוקנמיוס של עכבר פראי בן 6 שבועות המציג פסי AChR פוסט-ג'ונטאליים (סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר). (B) הגדלה גבוהה יותר של אזור עם פסי AChR (פאנל תחתון) ששימש ליצירת פרופיל העוצמה. הרוחב (w) של פסי AChR והמרחק בין שני פסים סמוכים (d) של אזור זה כומתו והוצגו בגרף העמודות. ייצוג סכמטי של לוחית הקצה הפוסט-סינפטית להמחשת רוחב פס AChR (w) ומרחק (d). פרמטרים אלה, (C) מרחק פס AChR ורוחב (D), נמדדו בעכברי ColQ Dex2/Dex2 ובחברי פסולת בקרה בגיל 6 שבועות. NMJs מ-5 WT (סה"כ n = 29 NMJs) ו-6 ColQ Dex2/Dex2 (סה"כ n = 43 NMJs) בעלי חיים נותחו באופן עיוור. הנתונים מבוטאים כממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות נותחו באמצעות מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: השקת תוכנת LAS X ופרמטרים לרכישות קונפוקליות. השלבים השונים לרכישת תמונות קונפוקליות מתוארים בסעיפים 3.1.2 עד 3.1.7 של הפרוטוקול. עבור כל רכישה של מחסנית NMJ, נפתח פרויקט (שלב 3.1.4) ונבחרים הפרמטרים של גודל תמונה, מהירות רכישה, צירי X, Y ו- Z (שלב 3.1.7), כאשר כל סריקה רציפה מסומנת (Seq.1, לייזר 405 עבור DAPI; Seq.2, לייזר 488 עבור α-BTX-F488; ו- Seq.3, לייזר 552 עבור נוגדנים משניים מצומדים F594). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: השקת תוכנת LAS X ופרמטרים לרכישות STED. השלבים לרכישת תמונות STED מתוארים בסעיפים 3.2.2 עד 3.2.8 של הפרוטוקול. המיקרוסקופ משוגר במצב תצורה STED ON (שלב 3.2.2), ופרויקט נפתח (שלב 3.2.3). הפרמטרים לרכישת תמונה (שלב 3.2.7) (גודל תמונה, מהירות רכישה, גורם זום, ציר X), עם כל סריקה רציפה מסומנים (Seq.1 עבור α-BTX-F633; Seq.2 עבור F488 נוגדנים משניים מצומדים). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: תמונות של קפלים צומתיים מוכתמים ב-α-BTX שהתקבלו על-ידי מיקרוסקופיית STED. דוגמאות תמונה של לוחית קצה פוסט-סינפטית המסומנת ב- α-BTX-F633 מעכבר מסוג פראי בן 6 שבועות שנרכשו עם מיקוד נכון (משמאל) או שגוי (מימין). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: חלונות מוקפצים של Windows לתיאור נתוני הקלט והפלט המתקבלים על-ידי פקודות המאקרו המותאמות אישית של ImageJ. דוגמאות נתוני קלט (קבצי .tif ו- .lif) של תמונות NMJ מוצגות בעמודה השמאלית. נתוני הפלט מפקודות המאקרו (עמודה ימנית) נשמרים בתיקיות (Save_Volume, Save_Accu) המכילות תמונות של הצומת (.tif) וגליונות נתונים המכילים את התוצאות (.csv קבצים). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: ניתוח מרחק ורוחב פס AChR מרכישת STED באמצעות תוכנת LAS X. השלבים לניתוח תמונות NMJ STED מתוארים בסעיף 5 של הפרוטוקול. A) תמונה של אזור לוחית קצה פוסט-סינפטי עם תווית המכיל פסי AChR. אזור העניין לניתוח פסים נבחר על ידי ציור קו מאונך (קו ירוק, למרחק פס), או מלבן מאונך (מלבן סגול, לרוחב פס). (ב, ג) פרופילי עוצמה של האזורים שנבחרו ומדידות לחישוב המרחק בין פסי AChR (B) לרוחב פס AChR (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. מאקרו מותאם אישית של ImageJ לחילוץ מדידות פרמטרים של NMJ (אמצעי אחסון NMJ, אזור לוחית קצה MIP וטורטואוזיות NMJ). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. מאקרו מותאם אישית של ImageJ לחילוץ הצטברות NF-M וצביעת SV2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

פרוטוקול הווידאו המתואר מספק שיטה מפורטת לכימות המבנה התלת-ממדי של צמתים עצביים-שריריים על ידי שילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED שניתן להשתמש בה כדי לאפיין שינויים פתולוגיים ברמות הטרום-סינפטיות והפוסט-סינפטיות. הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופיית STED מאפשרת הדמיה וניתוח מורפומטרי של ננו-מבנים שאינם ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית קונבנציונלית. הליך זה אפשר לנו למדוד שינויים מבניים של NMJs בשני שרירים תוספניים, טיביאליס קדמי וגסטרוקנמיוס, של עכברי CMS הקשורים ל-SMA ו-ColQ.

כדי להשיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו, זה קריטי לנתח ולהקניט את השרירים כראוי, תוך מתן תשומת לב מיוחדת fascia סביב השריר ואת הכוח המופעל כדי להפריד צרורות שרירים; אחרת, דפוס העצבנות עלול להיות משובש ולפגוע בהערכת NMJ קדם-סינפטית נכונה. למרות מידע מפורט מסופק כדי לנתח NMJs מ TA ו GA, באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשרירים אחרים, כולל שרירים שטוחים, כגון הסרעפת או abdominis רוחבי37, אשר אינם דורשים את הצעד מתגרה. קיבוע רקמות הוא גם חיוני כדי להבטיח צביעה באיכות טובה; לכן, מומלץ להשתמש ב- PFA באיכות גבוהה בנפח מתאים (פי 15-20 מזה של השריר). בנוסף, זמן החשיפה לקיבוע הוא צעד חשוב מכיוון שחפצים, כגון התכווצות וגושים, עשויים להופיע עקב קיבוע יתר והשפעה על תכונות NMJ. בהתחשב בגודל הדגימות ובקצב החדירה של תמיסת paraformaldehyde ברקמות38, זמן קיבוע של 18-24 שעות מומלץ עבור סוג זה של שריר. במקרה ששלב ההכתמה מתוכנן יותר משבוע לאחר קצירת הרקמות, מומלץ לשמור על שרירים קבועים ב-PFA ב-PBS בתוספת נתרן אזיד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע התפשטות חיידקים.

פרוטוקול זה מציג גישה המשתמשת ב- α-BTX-F488 עבור קונפוקל ו- α-BTX-F633 להדמיית STED. פלואורופורים אלה נבחרו כך שיתאימו לתכנון הניסויי המתואר, אך ניתן לשנותם בהתאם לציוד ולחומרים הזמינים. לדוגמה, ניתן לבחור תיוג α-BTX F488 בעת שימוש בלייזר STED CW 592 ננומטר לרכישת תמונה וכימות. עם זאת, נראה כי התצורה שיושמה במחקר הנוכחי (עירור פועם מגודר STED, דלדול 775 ננומטר) מציגה ביצועים גבוהים יותר ורזולוציה טובה יותר מאשר גישות אחרות, כגון גל רציף STED39, מה שהופך אותו מתאים יותר עבור היישום הנוכחי. חשוב גם לבחור בקפידה את הגדרות כוח הלייזר, במיוחד עבור STED (הן עירור והן דלדול), שכן המאפיינים של פרופיל עוצמה לא ניתן למדוד במקרה של רוויה, ולכן כל אות רווי בתמונה NMJ יכול לסכן את הניתוח כולו.

תהליך עבודה מפורט זה, הכולל רכישות וניתוח תמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ ופקודות מאקרו של ImageJ, פותח כדי להקל על ניתוח מורפומטרי אוטונומי של NMJ על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED משריר יחיד. זרימות עבודה שתוארו בעבר עבור ניתוח קונפוקלי NMJ, כגון NMJ-morph2 או NMJ-Analyser14, סללו את הדרך לתכנון שיטות חצי אוטומטיות המאפשרות ניתוח מורפולוגי של NMJs ומחקרים השוואתיים. NMJ-morph (וגרסתו המעודכנת aNMJ-morph15) היא פלטפורמה חינמית מבוססת ImageJ המשתמשת בהיטל העוצמה המקסימלית כדי למדוד 21 תכונות מורפולוגיות, ו- NMJ-Analyser משתמשת בסקריפט שפותח בפייתון שמייצר 29 פרמטרים רלוונטיים מכל מבנה NMJ התלת-ממדי. סף ידני הוא השלב היחיד במהלך עיבוד תמונה בשתי שיטות אלה הדורשות ניתוח משתמש. פרוטוקול משולב זה מפרט שלבים להכנת רקמות, רכישת תמונה קונפוקלית תלת-ממדית ועיבוד מבוסס ImageJ של NMJs מכל שרירי השלד ומספק סקירה פשוטה של חמישה פרמטרים חשובים של לוחות הקצה הפוסט-סינפטיים (נפח, שטח הקרנה מרבי וטורטואוזיות) והקדם-סינפטיים (תפוסת מסוף האקסון והצטברות נוירופילמנט). פרמטר נוסף בעל רלוונטיות ביולוגית, תבנית ארגון AChR של הקפלים הצמתים הפוסט-סינפטיים, שולב לניתוח מורפומטרי ברמה הננומטרית על ידי מיקרוסקופיית STED ברזולוציה גבוהה במיוחד (רזולוציה 20-30 ננומטר)40. באופן מעניין, הכנת רקמות להדמיית STED פשוטה יותר משיטות אחרות המשמשות למחקרים אולטרה-סטרוקטורליים של NMJ, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים קונבנציונלית (TEM)9, שהיא הליך מורכב למדי וגוזל זמן הדורש מניפולטור מיומן על מנת להשיג חלקים אולטרה-דקים של אזור השריר המתאים. בנוסף, ניתן לקבל נתונים כמותיים ממספר קיפולים צומתיים באופן אוטומטי באמצעות התוכנה המשויכת ל-STED.

פרוטוקול זה יושם כדי להמחיש פגמים ידועים בעבר NMJs בשרירים חסרים SMN ו- ColQ 20,36,41,42. שינויים נפוצים נמצאו בשני המודלים של העכברים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, כגון ירידה בנפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית, שטח MIP וטורטואוזיות יחסית, והצטברות מוגברת של נוירופילמנט, בעוד שכמה ממצאים ספציפיים יותר (ירידה בתפוסת NMJ), נצפו רק בעכברי SMA, כאינדיקטור לפגיעה בשלפוחית36. לבסוף, עלייה במרחק וברוחב פס AChR זוהו ב- ColQ-KO על ידי ניתוח STED, שהם סימנים לפגמים אולטרה-סטרוקטורליים בקפלים הצמתים הפוסט-סינפטיים, כפי שנצפה בעבר על ידי TEM20. חשוב לציין כי פרוטוקול זה עשוי לסייע באפיון מורפולוגי מעמיק יותר של צמתים עצביים-שריריים במהלך הפיתוח, התחזוקה ובתנאים פתולוגיים שונים.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

Acknowledgments

אנו מודים ל"מתקן הליבה להדמיה וציטומטריה " של Genethon, כמו גם לשירות ההיסטולוגיה, הנתמכים בחלקם על ידי קרנות ציוד מאזור איל-דה-פראנס, הקונסיל גנרל דה ל'אסון, הגנופול רקרש של אוורי, אוניברסיטת Evry Val d'Essonne וה- INSERM, צרפת. אנו מודים גם לד"ר רשמי קותרי על אספקת קו העכבר Smn 2B/2B (אוניברסיטת אוטווה, קנדה) ולד"ר אריק קרייצ'י עבור קו העכבר ColQDex2/+ (לא פורסם, אוניברסיטת פריז, צרפת). אנו מודים לגיום קורה על תמיכתו בניתוח סטטיסטי. הנוגדנים החד-שבטיים 2H3 (שפותחו על ידי ג'סל, ט.מ. ודוד, ג'יי) ו-SV2 (שפותחו על ידי באקלי, ק.מ.) התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים (DSHB), שנוצר על ידי NICHD של ה-NIH ונשמר באוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Telethon), ה- INSERM ואוניברסיטת Evry Val d'Essonne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers and Reagents
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) Life Technologies, Thermofisher A-11001
Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) Life Technologies, Thermofisher B13422
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) Life Technologies, Thermofisher A-11032
ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) Alomone Labs B-100-FR
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
DAPI Fluoromount-G Southern Biotech 00-4959-52
DPBS Gibco, Invitrogen 14190-169
Ethanol Absolute VWR 20821.296
Immersion Oil, n = 1.518 THORLABS MOIL-10LF  Low autofluorescence
Neurofilament (NF-M) antibody  DSHB AB_531793
Paraformaldehyde (PFA) MERCK 1.04005
Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody DSHB AB_2315387
Triton X-100 Sigma T8787
Materials
Alnico Button cylindrical magnets Farnell France E822 diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg
63x 1.4 NA magnitude oil immersion  HCX Plan Apo CS objective Leica Microsystems
100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective Zeiss
Curved thin forceps-Moria iris forceps Fine Science Tools 11370-31
Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15-003-08
Fine serrated forceps Euronexia P-95-AA
Gel loading tip round 1-200 µL COSTAR 4853
Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Leica Microsystems
Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm Leica Microsystems
Lens Cleaning Tissue  Whatman (GE Healthcare) 2105-841
Medium serrated forceps Euronexia P-95-AB
Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm Marienfield 107222 High precision
Nunclon delta surface (12-well plates) Thermo Scientific  150628
Nunclon delta surface (24-well plates) Thermo Scientific  142475
Safeshield scalpel Feather 02.001.40.023
Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11
Superfrost plus slides Thermo Scientific  J1800AMNZ
Software
GraphPad  Prism, San Diego (US) Release N°6.07 Statistical software
ImageJ software National Institutes of Health Release N° 1.53f
Leica Application Suite X software Leica Microsystems Release N°3.7.2.2283 Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
  2. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
  3. Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
  4. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
  5. Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
  6. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
  7. Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).
  8. Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671 (2019).
  9. Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
  10. Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
  11. Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
  12. Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).
  13. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).
  14. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).
  15. Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).
  16. Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
  17. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  18. York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
  19. Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
  20. Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
  21. Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
  22. Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
  25. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  26. Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
  27. Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
  28. ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
  29. GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
  30. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  31. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
  32. Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
  33. Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
  34. Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
  35. Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
  36. Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
  37. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).
  38. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
  39. Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).
  40. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
  41. Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).
  42. McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 178
אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marinello, M., Cosette, J., Bogni,… More

Marinello, M., Cosette, J., Bogni, C., Denard, J., Stockholm, D., Buj-Bello, A. Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63032, doi:10.3791/63032 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter