Summary
Denne protokollen beskriver en metode for morfometrisk analyse av nevromuskulære veikryss ved kombinert konfokal og STED-mikroskopi som brukes til å kvantifisere patologiske endringer i musemodeller av SMA og ColQ-relatert CMS.
Abstract
Nevromuskulære veikryss (NMJs) er høyt spesialiserte synapser mellom lavere motorneuroner og skjelettmuskulaturfibre som spiller en viktig rolle i overføringen av molekyler fra nervesystemet til frivillige muskler, noe som fører til sammentrekning. De påvirkes i mange menneskelige sykdommer, inkludert arvelige nevromuskulære lidelser som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Derfor representerer overvåking av morfologien til nevromuskulære veikryss og deres endringer i sykdomsmusemodeller et verdifullt verktøy for patologiske studier og preklinisk vurdering av terapeutiske tilnærminger. Her beskrives metoder for merking og analyse av den tredimensjonale (3D) morfologien til de pre- og postsynaptiske delene av motoriske endeplater fra murine ertet muskelfibre. Prosedyrene for å klargjøre prøver og måle NMJ-volum, areal, tortuositet og aksonterminalmorfologi/belegg ved konfokal avbildning, og avstanden mellom postsynaptiske kryssfolder og acetylkolinreseptor (AChR) stripebredde ved superoppløsning stimulert emisjonsdeplesjon (STED) mikroskopi er detaljert. Endringer i disse NMJ-parametrene er illustrert hos mutante mus påvirket av SMA og CMS.
Introduction
Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er en kompleks struktur sammensatt av en motorisk aksonterminal, en perisynaptisk Schwann-celle og en skjelettmyofiberdel involvert i overføring av kjemisk informasjon og kobling av lavere motornevronaktivitet til muskelkontraksjon. Hos pattedyr endres morfologien til det nevromuskulære krysset under utvikling, vedtar en typisk pretzel-lignende form etter modning, med forskjeller i form og kompleksitet mellom arter, og viser en viss grad av plastisitet som svar på fysiologiske prosesser som trening eller aldring 1,2,3,4 . Den postsynaptiske motoriske endeplaten danner membraninvaginasjoner kalt junctional folds, hvor den øvre delen som inneholder acetylkolinreseptorer (AChR) er i nær kontakt med den presynaptiske terminale aksongrenen5.
Morfologiske og funksjonelle endringer i nevromuskulære veikryss bidrar til patofysiologien til flere nevrodegenerative lidelser som spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS), myopatier som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG) og sentronukleære myopatier (CNM) og aldringsassosiert sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Ved disse sykdommene observeres NMJ-strukturelle endringer som endplatefragmentering, redusert postsynaptisk kryssfoldestørrelse og/eller denervering. Patologien til NMJ kan være en primær eller tidlig hendelse under sykdomsprogresjon eller vises mer i det siste som en sekundær hendelse som bidrar til de kliniske manifestasjonene. I alle fall representerer overvåking av morfologien til NMJ i dyremodeller av disse sykdommene en verdifull parameter for å studere patologiske endringer og vurdere effekten av potensielle behandlinger.
Morfologien til nevromuskulære veikryss analyseres vanligvis ved teknikker ved bruk av konfokalmikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16, med deres iboende begrensninger som henholdsvis oppløsning eller tekniske vanskeligheter. Mer nylig ble superoppløsningsmikroskopi også brukt til å visualisere bestemte regioner i NMJ, for eksempel presynaptiske aktive soner eller AChR-fordeling på den postsynaptiske membranen16,17,18, som en alternativ eller komplementær tilnærming til ultrastrukturell analyse ved elektronmikroskopi.
Denne protokollen tar sikte på å gi en detaljert og reproduserbar metode for å vurdere NMJ morfologiske parametere ved å kombinere fluorescens konfokal og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Viktige trekk ved presynaptiske og postsynaptiske endeplater, som volum, areal, relativ tortuositet, AChR stripebredde og aksonterminalfordeling i innerverte ertemuskelfibre av mus gastrocnemius og tibialis anterior ble kvantifisert i sammenheng med normale og syke forhold. Spesielt ble NMJ-defekter eksemplifisert i Smn2B/- musemodellen for spinal muskelatrofi, en nevromuskulær sykdom med motornevrondegenerasjon forårsaket av mutasjoner i SMN1-genet11,19, og i en kollagenlignende haleunderenhet av asymmetrisk acetylkolinesterase knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) mus, som en modell av det medfødte myasteniske syndromet20, 21,22.
Protocol
Stell og manipulering av mus ble utført i henhold til nasjonal og europeisk lovgivning om dyreforsøk og godkjent av institusjonens etiske komité. Menn og kvinner av Smn2B/- (C57Bl/6J bakgrunn) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrunn) mus ved henholdsvis 3 og 6 ukers alder ble brukt i studien.
1. Eutanasi av mus og disseksjon av muskler: tibialis anterior og gastrocnemius
- Fortsett til musebedøvelse ved intraperitoneal injeksjon av et ketamin (87,5 mg/kg)/xylazin (12,5 mg/kg) blandet oppløsning (0,1 ml/20 g kroppsvekt) før eutanasi ved cervikal dislokasjon.
MERK: Siden SMA og ColQ-CMS påvirker individer uavhengig av kjønn, ble mannlige og kvinnelige mus brukt i denne protokollen. - Fjern bakbenshår ved hjelp av en liten elektrisk barbermaskin og skyll bena med 70% etanol.
MERK: Disseksjonsprosedyren vil variere for hver muskel. For disseksjon av tibialis anterior (TA), følg trinn 1.2.1-1.2.3, og for gastrocnemius (GA) (mediale og laterale deler), følg trinn 1.2.4-1.2.6. Håndter musklene forsiktig for å forhindre vevskader og knuse eller strekke dem under disseksjon.- Plasser musen i den bakre posisjonen.
- Lag et hudinnsnitt på 5 mm med skarp-stump saks langs den antero-ytre delen av den distale bakbenet, parallelt med tibia, for å eksponere muskelen. Bruk ekstra tynn saks for å fjerne fascia.
- Klipp den distale senen først (nær poten) og deretter den proksimale senen (nær kneet) ved hjelp av ekstra tynn saks og en buet tynn tang. Håndter muskelen forsiktig for å unngå skade på myofibre og nerver.
MERK: Den proksimale senen må seksjoneres så nært som mulig til beinet for å høste hele muskelen. - Plasser musen i utsatt stilling, bruk skarp-stump saks for å lage et hudinnsnitt fra den øvre delen av det distale bakbenet bakre rommet ned til poten, og fjern huden.
- Ta tak i akillessenen med middels taggete tang, klipp den med en ekstra tynn saks og skill ga-en forsiktig fra det omkringliggende vevet tilbake til den proksimale innsettingen.
- På den proksimale siden setter du de middels taggete tangene inn i lommen dannet mellom biceps femoris (BF) og GA. Skill de to musklene for å kutte GA-senen så nært som mulig til beininnsettingen med en ekstra tynn saks.
- For vevsfiksering, plasser hver muskel i et 2 ml mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml 4 % w/v paraformaldehyd (PFA) oppløsning fortynnet i fosfatbuffersaltvann (PBS uten Ca 2+Mg 2+) og hold ved 4 °C i18-24 timer.
FORSIKTIG: Paraformaldehyd og formaldehyd er giftige og må håndteres i en kjemisk avtrekkshette med tilstrekkelig verneutstyr. - Neste dag vasker du de faste musklene 3x i 5 minutter med PBS i 12-brønnsplater ved å riste forsiktig ved romtemperatur (RT) inne i en kjemisk avtrekkshette.
MERK: Protokollen kan stoppes på dette trinnet og fortsettes innen en måned. I dette tilfellet tilsettes PBS supplert med 0,01 % natriumazid for å lagre prøver ved 4 °C. - Ert hver muskel i små fiberbunter på ca. 1 mm brede ved hjelp av to fine taggete tang.
MERK: Det er avgjørende å manipulere musklene veldig forsiktig med tangen, uten overdreven kraft, for å forhindre vevskader under erting.- Dissocier TA-muskelen i 3 eller 4 bunter, avhengig av størrelsen.
- For GA, skille de mediale og laterale delene av muskelen og dissosiere hver del i 4-5 bunter avhengig av størrelsen.
2. Immunostaining
- Fortsett med muskelfiberpermeabilisering: Overfør muskelbunter til 24-brønnsplater som inneholder 1% (v / v) Triton X-100 i PBS og hold dem under forsiktig omrøring (50 o / min) i 1 time ved RT eller 5 timer ved 4 ° C.
MERK: Del muskelbuntene mellom to plater for å fortsette med separate immunostainings og for å minimere risikoen for antistoffforvirring. Ikke del dem i mer enn to brønner (1 brønn/plate); Ellers kan antallet (N) NMJ-er som er representative for deres generelle status i den analyserte muskelen være utilstrekkelig. - Vask prøvene 3x i 5 minutter med PBS ved RT og inkuber dem med en blokkerende løsning sammensatt av 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS / Triton X-100 1% i 4 timer ved 4 ° C, under forsiktig omrøring (50 o / min).
MERK: Ikke bruk en aspirasjonspumpe under vasketrinnene, men aspirer oppløsningen manuelt med en pipette på 200 μL og små spisser (referansen er angitt i materialtabellen). - Inkuber prøvene over natten (O/N) ved 4 °C under skånsom omrøring (50 o/min) med blokkeringsløsningen angitt i trinn 2.2 som inneholder primære monoklonale antistoffer mot enten nevrofilament M (NF-M, 2H3, fortynning 1/200) eller synaptisk vesikkeldlykoprotein 2 (SV2, fortynning 1/200) for å merke henholdsvis presynaptiske aksonterminaler eller aktive soner.
- Neste dag vasker du muskelbuntene 3x i 5 minutter i PBS under omrøring (50 o / min).
- For konfokal avbildning: Inkuber muskelbuntene med sekundære antimuseantistoffer konjugert med en rødemitterende fluorofor (F594) (fortynning 1/500) og α-bungarotoksin konjugert med en grønnemitterende fluorofor (α-BTX-F488) (fortynning 1/1000) i PBS i 2 timer ved RT under agitasjon (50 rpm).
- For STED-avbildning: Inkuber muskelbuntene med sekundære antimuseantistoffer konjugert med en grønnemitterende fluorofor (F488) (fortynning 1/500) og α-bungarotoksin konjugert med en langt rødemitterende fluorofor karakterisert ved høy fotostabilitet (α-BTX-F633) (fortynning 1/1000) i PBS i 2 timer ved RT under omrøring (50 rpm).
MERK: Ikke utsett prøvene for lys under inkubasjon for å unngå fotobleking.
- Vask de merkede muskelbuntene 3x i 5 minutter med PBS under omrøring (50 o / min) og legg dem på et lysbilde med et monteringsmedium.
MERK: Plasser maksimalt 4 til 5 muskelbunter per lysbilde for å tillate forsegling. - Legg til en klasse # 1.5 (eller # 1.5H) glassdeksel (0.17 mm tykkelse) på toppen, og plasser sylindriske magneter på begge sider av lysbildet for å legge press og flate musklene.
- Hold lysbildene beskyttet mot lys O/N ved 4 °C. Forsegl lysbildene permanent med neglelakk.
3. Bilde anskaffelse
- Oppkjøp av et konfokalt mikroskop
MERK: Bilder ble samlet inn med et omvendt laserskanningskonfokalt mikroskop ved hjelp av et 63x størrelsesglass for nedsenking av olje (HCX Plan Apo CS, 1,4 numerisk blenderåpning (NA)).- For blindet analyse, la en person som ikke er involvert i analysen kode hvert lysbilde med et gitt nummer. Forbli blindet for eksperimentelle grupper til kvantifiseringen av NMJ-parametere er fullført for alle prøver.
- Start mikroskopprogramvaren i konfigurasjonsmodus > machine.xlhw (tilleggsfigur 1).
- Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og finn observasjonsplanet i prøven ved å se under DAPI bredfeltfluorescensbelysning med DAPI-filtersettet.
- Klikk på Åpne prosjekt > nye prosjekter og opprett en mappe for å lagre bildeopptak (supplerende figur 1).
MERK: Opprett et nytt prosjekt for hver NMJ for å begrense mappestørrelsen og forhindre problemer med datamaskinens minne. - For å administrere anskaffelsesparametere, klikk på anskaffelsesfanevinduet og sett konfokalhullet til 1.0 Luftig enhet og lasereffekt for å optimalisere forsterknings- og forskyvningsnivåene for grønn / F488 (α-BTX) fluorescens ved hjelp av en 488 nm laser på endeplaten som må avbildes (Live-modus PÅ).
- Deretter optimaliserer du den røde / F594 (NF-M eller SV2) fluorescensinnsamlingen ved hjelp av en laser tilpasset F594-observasjon. I denne studien ble det brukt en 552 nm laser ( Live mode ON). Still inn spekteret av fargestoffutslipp med følgende områder for hver laser: laser 405 (DAPI) fra 414 til 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) fra 506-531 nm og laser 552 (NF-M/SV2) fra 622-650 nm.
- Samle bildestakker med nevromuskulære veikryss i hver eksperimentgruppe med samme innstillinger: bildestørrelse 1024 x 1024 piksler (73,7 x 73,7 μm) ved 400 Hz samplingsfrekvens, toveis X ON, zoomfaktor 2,5, Z-trinnstørrelse 0,5 μm i Z-Wide-modus.
MERK: For hver NMJ er antall skiver satt til å skaffe hele krysset. Anskaffelsesinnstillingene beskrevet ovenfor oppfyller Nyquist-Shanon-prøveteoremet. Brukeren kan imidlertid klikke på Optimaliser format-knappen , som finnes på all nylig konfokal driftsprogramvare, for å sikre at pikselstørrelse og Z-trinn oppfyller den ideelle Nyquist-samplingsfrekvensen. Denne handlingen vil unngå over- eller undersamplede bilder, noe som vil føre til tap av nøyaktighet i volummålinger. - Lagre originalfilen (LIF) eller Z-stack-bilder (.tif) i en mappe med et navn som inneholder kodenavnet på lysbildet, fargetypen og sluttplatenummeret.
MERK: Samle inn skanningene sekvensielt (ikke samtidig) ved hjelp av laserne på 488 nm og 552 nm (F488 og F594) for å unngå krysstale av F488-fluorescensen i F594-kanalen og omvendt (gjennomblødning). NB: strålebanen kan konfigureres med Dye Assistant i mikroskopprogramvaren. - Bytt til neste kodede lysbilde, og gjenta trinn 3.1.3-3.1.8 for hver NMJ.
- På slutten av økten klikker du på Åpne i 3D-visning og velger en NMJ-representant for en eksperimentell gruppe for å visualisere 3D-merkingen .
MERK: Denne visningsmodusen bidrar til å bekrefte at innhentingsparameterne var riktige. - Lukk mikroskopprogramvaren, rengjør målene med linsevev, og slå deretter av systemet.
- Oppkjøp ved STED-mikroskopi
MERK: Bildene ble samlet inn med et invertert konfokalt mikroskop for laserskanning utstyrt med Gated STED ved 775 nm ved hjelp av et 100x oljeinnlevelsesmål (HC PL APO CS2 1.4 NA).- For blindet analyse, la en person som ikke er involvert i analysen kode hvert lysbilde med et gitt nummer. Forbli blindet for eksperimentelle grupper til kvantifiseringen av NMJ-parametere er fullført for alle prøver.
- Start mikroskopprogramvaren i konfigurasjonsmodus > machine.xlhw og STED ON (supplerende figur 2).
- Klikk på Åpne prosjekt > nye prosjekter for å opprette en mappe for å lagre bildeoppkjøp.
MERK: Generer en ny mappe for hvert lysbilde for å begrense mappestørrelsen og forhindre problemer med datamaskinens minne. - Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og se det under bredfeltfluorescensbelysning ved hjelp av 488 nm-laseren for å finne observasjonsplanet i prøven.
- Søk etter en NMJ merket med nevrofilament M (NF-M) eller SV2-flekker ved hjelp av 488 nm-laseren med spektraldeteksjon fra 506-531 nm.
- Når en NMJ er identifisert, klikker du på Aktiver STED og begynner å ta bilder i en region som inneholder flere kryssfolder (tilleggsfigur 3) ved hjelp av 635 nm-laseren med spektraldeteksjon fra 640-750 nm.
MERK: Vær forsiktig med metningsoppslagstabellen under bildeinnhenting, og klikk på Quick LUT-knappen for å unngå overeksponering (grå verdier >255; for 8 bit). - Samle bildene fra hver eksperimentell gruppe med samme innstillinger: bildestørrelse 2048 x 2048 piksler (38,75 x 38,75 μm) med en samplingsfrekvens på 400 Hz.
MERK: Strømmen til uttømmingslaseren (STED) er satt til 65 %. - Lagre bildene med et filnavn som inneholder koden til lysbildet.
MERK: Det er mulig å klikke på Optimalisert XY-format: Angi format for å få den beste anskaffelsesinnstillingen med STED-bildebehandling. - Bytt til neste kodede lysbilde, og gjenta trinn 3.2.3-3.2.8. Gjenta denne fremgangsmåten for alle lysbildene.
- På slutten av STED-mikroskopiøkten overfører du bildefilene til en annen datamaskin og lagrer originalfilene (. LIF) på en ekstern stasjon eller server.
- Slå av mikroskopprogramvaren, rengjør målene med linsevev, og slå deretter av systemet.
4. Bildeanalyse - konfokal mikroskopi
MERK: Alle bilder ble behandlet med datamaskiner som bruker Microsoft Windows 10 profesjonelt operativsystem.
- Start ImageJ og egendefinert makro for å beregne postsynaptisk NMJ-sluttplatevolum, MIP-område (Maximum Intensity Projection) og relativ tortuositet.
- Behandle NMJ-bildestakker ved hjelp av NIH ImageJ freeware23, iGeodesic-plugin og den tilpassede makroen for å oppnå NMJ-parametermålinger. Start ImageJ-programvaren.
MERK: Den nyeste versjonen av ImageJ er fritt tilgjengelig og kan lastes ned24. For å åpne proprietære filformater, må Bio-Formats Package25 plugin lastes ned26 . Dette trinnet er ikke nødvendig i tilfelle operatøren bruker Fiji fordi pluginet allerede er installert i programvaren. Den iGeodesic plugin27 for å beregne tortuosity er også tilgjengelig online28; bekreft tilgjengeligheten av denne plugin-modulen i ImageJ/Fiji-versjonen som skal brukes. De skreddersydde makroene er også tilgjengelige online29. - Dra og slipp Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal.ijm (skreddersydd, Supplementary Coding File 1) til ImageJ-vinduet; Makroen åpnes i et annet vindu. I dette nye vinduet klikker du på Makroer > Kjør makro.
MERK: Makroen kan behandle både proprietære filer og TIFF-filer. Filer må oppfylle følgende kriterier: For proprietære filformater, lagre bare ett veikryss (dvs. stabelen med bilder) per fil, bestilt i en mappe; for TIFF-bilder må filene lagres i en mappe som inneholder undermapper, hver med navnet JunctionX (X tilsvarer et NMJ-nummer) med bildestakkene til et gitt veikryss (RGB TIFF) (supplerende figur 4). - Velg den opprinnelige mappen som inneholder Junction-undermappene som må analyseres, og klikk på Velg.
- I den nye hurtigmenyen kalt Saving Folder, velg lagringsmappen og klikk på Velg.
- I den nye lokalmenyen kalt Image Type velger du formatet for Z-stack-anskaffelsene.
- Velg RGB-kanalen som tilsvarer fargen av interesse, og angi XY-pikselstørrelse og Z-trinn (z). Makroen vil automatisk utføre analysen.
MERK: Hvis proprietære filformater velges, leser makroen direkte pikselstørrelse og Z-trinn (z). Brukeren må imidlertid fortsatt indikere kanalen av interesse (C1, C2 eller C3). Makroen vil gi et dataark (.csv) for hver koblingsparameter (sluttplatevolum, MIP-område og tortuositet) i lagringsmappen. Makroen genererer også tre . TIF-filer , som tilsvarer omkretsen av α-BTX-farging Drawing_MaxprojX.tif, DrawingJunctionX.tif og MIP MaxprojX.tif. Disse TIFF-filer er generert for å verifisere kvaliteten på anskaffelser og for å sikre at bildebehandling har blitt utført riktig.
Postsynaptisk NMJ-volum (V): Makroen vil skille bilder fra en enkelt NMJ og beholde α-bungarotoxin F488-kanalen som tilsvarer den postsynaptiske endeplaten. Stabelen er segmentert ved hjelp av Otsu-terskel30 på mellomstykket i stabelen. Det resulterende binære bildet er utvidet med 1 piksel, og funksjonen Analyser partikler brukes til å måle sluttplateområdet for hvert oppdaget objekt. For å oppnå det postsynaptiske NMJ-volumet summerer makroen alle målte endeplateområder i stakken og multipliserer det med Z-trinnverdi (z) i μm.
Sluttplateområde for maksimal intensitetsprojeksjon (MIP): Når stakken er terskalert, oppnås maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) ved hjelp av Z-prosjekt ImageJ-funksjonen . Funksjonen Analyser partikler brukes deretter til å kvantifisere MIP-endeplateområdet.
NMJ MIP tortuosity (T): NMJ tortuosity, som gjenspeiler graden av kompleksitet av den postsynaptiske motorens endeplate inkludert folder og perforeringer31, beregnes basert på hver MIP ved hjelp av følgende formel, hvor d Obj (AB) er avstanden mellom A og B langs omkretsen av objektet, og dEuc (AB) er den euklidske avstanden mellom A og B (rett linje).
- Sett den høyeste tortuositetsverdien i wild-type-gruppen for hver eksperimentell tilstand til 100%, og normaliser alle de andre verdiene av eksperimentell tilstand til denne verdien for å oppnå den relative NMJ-tortuositeten.
- Behandle NMJ-bildestakker ved hjelp av NIH ImageJ freeware23, iGeodesic-plugin og den tilpassede makroen for å oppnå NMJ-parametermålinger. Start ImageJ-programvaren.
- Start ImageJ og tilpasset makro for å kvantifisere presynaptisk nevrofilamentakkumulering og synaptisk vesikkelglykoprotein 2-farging.
MERK: Nevrofilamentakkumulering (her, NF-M) og/eller endret fordeling av synaptiske vesikler (her, SV2) er markører for unormal aksonal transport og/eller nedsatt vesikkelhandel og ble tidligere observert i NMJ av forskjellige SMA-musemodeller32,33,34.- Dra og slipp Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (skreddersydd, Supplementary Coding File 2) til ImageJ-vinduet; makroen åpnes i et annet vindu. I dette nye vinduet klikker du på Makroer > Kjør makro.
MERK: Makroen kan behandle både proprietære filformater og TIFF-filer. Filer må oppfylle kriteriene som er angitt i MERKNADEN nedenfor trinn 4.1.2. - Velg den opprinnelige mappen som inneholder Junction-undermappene som må analyseres, og klikk på Velg.
- I den nye hurtigmenyen kalt Saving Folder, velg lagringsmappen og klikk på Velg.
- I den nye lokalmenyen kalt Image Type velger du formatet for Z-stack-anskaffelsene.
- I popup-vinduet Staining Infos angir du den presynaptiske og postsynaptiske etiketten og fargen og klikker på OK. For eksempel, Presynaptic etikett: SV2 eller NF, Presynaptic farge: R, Postsynaptic etikett: BTX, Postsynaptic farge: G.
MERK: For proprietære filformater må etiketter og tilsvarende kanaler (C1, C2 eller C3) angis. - I popup-vinduet Pikselstørrelse angir du XY-pikselstørrelse 0.072 μm og Z trinn 0.5 μm (z) og klikker på OK. Makroen vil automatisk utføre analysen.
MERK: Denne parameteren tilsvarer bildestørrelsen 1024 x 1024 piksler (73,7 x 73,7 μm) valgt før konfokale mikroskopoppkjøp, og den er korrelert med objektiv- og zoominnstillingene. Hvis de proprietære filformatene er valgt, leser makroen direkte pikselstørrelse og Z-trinn (z). Makroen lagrer i lagringsmappen et dataark (.csv) med presynaptiske og postsynaptiske volumer, et TIFF-bilde med flere sider av gjeldende gjenkjenning for hver (pre- og postsynaptisk) merking. Som angitt ovenfor, er disse TIFF-filer generert for å kontrollere kvaliteten på oppkjøp og for å sikre at bildebehandling har blitt utført riktig.
Makroen beregner volumet av aksonal nevrofilament M-farging (NF-volum) fra NF-M-F594-kanalen som samlokaliserer med α-bungarotoxin-F488-merking og volumet av NMJ synaptisk vesikkelglykoprotein 2-farging (SV2-volum) fra SV2-F594-kanalen som colocalizes med α-BTX-F488-merking. NF-M-akkumuleringen kvantifiseres ved å beregne forholdet mellom NF-volum og postsynaptisk endeplate (α-BTX) volum og NMJ-aksonterminalbelegg ved forholdet mellom SV2- og α-BTX-volumer, som vist nedenfor.
- Dra og slipp Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.ijm (skreddersydd, Supplementary Coding File 2) til ImageJ-vinduet; makroen åpnes i et annet vindu. I dette nye vinduet klikker du på Makroer > Kjør makro.
5. Bildeanalyse- STED-mikroskopi
MERK: Bildebehandling ble utført med offline-programvaren til STED-mikroskopprodusenten.
- Start mikroskopprogramvaren.
- Åpne prosjektet ved å klikke på Åpne prosjekt-knappen . Velg prosjektfilen (.lif) og åpne den. Bildene vises på skjermen sammen med navnene deres.
- I prosessvinduet : Klikk på Støyreduksjon > Median. Nederst i det midterste vinduet setter du Radius til 5,00 og Iterasjon til 1,00, og fjerner merket for 3D-filtrering.
- Velg deretter Åpne prosjekter fanen øverst til venstre i vinduet og velg et bilde.
- Klikk på Bruk for å validere parametere. Et nytt bilde kalt "nameofimage_median001" opprettes.
MERK: Det er mulig å klikke på Forhåndsvisning før Bruk for å overvåke effekten av medianfilteret, noe som vil forbedre bildekontrasten og jevne ut linjeprofilene som brukes til kvantifisering. - Bruke filteret på alle bilder som angitt i trinn 5.4–5.5.
- I kategoriene Åpne prosjekter klikker du på diskettstasjonsikonet for å lagre alle prosjektene, inkludert de nyopprettede filtrerte bildene.
MERK: Det neste trinnet vil bli gjort ved hjelp av det filtrerte bildet som heter "nameofimage_median001". - Beregn avstanden mellom AChR-striper
MERK: Endringer i morfologien til postjunksjonelle folder observeres ofte i nevromuskulære lidelser som et tegn på NMJ-patologi (umodenhet eller degenerasjon). Avstanden (d) mellom AChR-striper, som oppdages ved α-bungarotoksinfarging, beregnes ved å generere intensitetsprofiler og kvantifisere avstanden mellom hver maksimale intensitetstopp ved å tegne en linjeprofil (supplerende figur 5).- Bruk mikroskopprogramvaren til å velge Kvantifiser-menyen øverst i det sentrale vinduet.
- Klikk på Verktøy-fanen øverst til venstre. Velg Intensitet øverst til venstre og klikk på Linjeprofil-ikonet . Sett Overallampling til 1, og merk av for Sorter kanaler.
- Klikk på Åpne prosjekter-fanene og velg det filtrerte bildet som skal analyseres.
MERK: Det er mulig å zoome inn på bildet ved å rulle med datamusen. Det dynamiske området til bildet kan endres ved hjelp av linjen på venstre side ved siden av det viste bildet, noe som letter visualiseringen av stripene. - Klikk deretter på Tegn linje-ikonet i toppmenyen i høyre vindu og spor en linjekryssing vinkelrett på flere striper / kryssfolder.
MERK: Intensitetsprofilen vises i det sentrale vinduet. - Klikk på toppen av den første toppen og flytt musepekeren mens du holder venstre museknapp nede til neste maksimale topp er nådd.
MERK: Informasjonen vises i intensitetsprofilen, mens avstanden mellom de to toppene vises under diagrammet med "dx" -valør. - Klikk rett på musen mens du er i bildet av høyre vindu og velg Lagre avkastning. Åpne de lagrede ROIene (Regions of Interest) ved å klikke på Last inn avkastning.
- Klikk på pilikonet øverst til venstre i høyre vindu, klikk på avkastningen og slett den ved å klikke på bin-ikonet.
- Gjenta denne operasjonen så mange ganger som nødvendig fra forskjellige intensitetsprofiler for å oppnå det forventede antallet AChR-stripeavstander som vil representere den globale verdien i den analyserte muskelen.
MERK: Den optimale N-verdien kan beregnes på forhånd basert på estimert forskjell mellom grupper, α risiko, kraft og en- eller tosidig test. I det nåværende eksperimentelle designet ble en ensidig Mann-Whitney-test (α risiko = 10%; effekt = 80%) anvendt, og N-verdien ble estimert til å være minst fem AChR-stripeavstander per NMJ for å sammenligne de to dyregruppene.
- AChR stripe bredde
MERK: Stripebredden (w) tilsvarer halvmaksimumet i full bredde (FWHM) for intensitetsprofilen, som er avstanden mellom punktene der α-BTX-signalfluorescensverdien er halvparten av den maksimale intensiteten (tilleggsfigur 5).- Bruk mikroskopprogramvaren til å velge Kvantifiser-menyen i det sentrale vinduet.
- Klikk på Verktøy-fanen øverst til venstre. Velg Intensitet øverst til venstre og klikk på Bestem FWHM-ikonet . Merk av for Sorter kanaler.
MERK: For å optimalisere toppdeteksjonen av programvaren, ble Set Threshold og Width satt til henholdsvis 50 og 3. Tilpass disse verdiene for hvert eksperiment og be om råd fra en erfaren bildeforsker. - Klikk på Åpne prosjekter-fanene og velg det filtrerte bildet som skal analyseres.
MERK: Det er mulig å zoome inn på det viste bildet i høyre vindu ved å rulle med datamusen. Som angitt ovenfor (MERK etter trinn 5.8.3), kan bildets dynamiske område endres for optimal stripevisualisering. - Deretter klikker du på Tegn rektangel ikonet i toppmenyen i høyre vindu. Velg en stripe som er enten horisontal eller vertikal, og tegn et rektangel vinkelrett på stripen. En profil vises i det sentrale vinduet.
- Klikk på enten Vertikal eller Horisontal av Gjennomsnittlig projeksjon menyen i venstre panel, avhengig av om striperetningen er vertikal eller horisontal.
- Klikk på Statistikk i det sentrale vinduet og les FWHM-verdien.
- Høyreklikk med datamusen på bildet som vises i høyre vindu, og velg Lagre avkastning.
MERK: Åpne de lagrede avkastningene ved å klikke på Last inn avkastning. - Klikk på pilikonet øverst til venstre i høyre vindu, klikk på avkastningen og slett den ved å klikke på bin-ikonet.
- Gjenta denne operasjonen så mange ganger som nødvendig fra forskjellige rektangel-ROIer til du oppnår det forventede antallet AChR-stripebredder, som vil være representativt for den globale verdien i den analyserte muskelen.
6. Eksperimentell design og statistiske tester
- Utfør statistiske analyser ved hjelp av spesifikk programvare.
MERK: Data ble samlet inn fra N ≥ 3 biologiske replikasjoner og minst 20 NMJ per genotype for konfokal mikroskopavbildning, og N ≥ 5 biologiske replikasjoner og N = 5 NMJ per genotype for STED-avbildning, i hver eksperimentgruppe. Signifikans ble vurdert ved uparret Mann-Whitney-test (ikke-parametrisk), og p-verdier er angitt i tilsvarende figurforklaringer.
Representative Results
For å lette den morfologiske analysen av nevromuskulære veikryss på pre- og postsynaptisk nivå på en reproduserbar måte, ble det utviklet en arbeidsflyt fra muskelhøsting til avbildning og kvantifisering ved hjelp av mikroskopprogramvaren og ImageJ tilpassede makroer (figur 1). For å eksemplifisere nytten av denne protokollen ble morfologien til NMJ i to musemodeller av genetiske lidelser, henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2-mus påvirket av spinal muskelatrofi (SMA) og en medfødt myastenisk syndrom (CMS) -form, evaluert og data ble sammenlignet med aldersmatchede kontrollkull.
NMJ-strukturen ble vurdert fra tibialis anterior og gastrocnemius muskler av henholdsvis 3- og 6 uker gamle Smn2B/- (C57Bl/6 bakgrunn) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrunn) mus når tegn på sykdommen allerede er tilstede hos disse dyrene. Ved 3 ukers alder viser Smn2B/- mus tegn på forsinket skjelettmuskelutvikling og denervering, som NMJ-atrofi og tap35,36. CMS-mus har en primær patologi hos NMJ og manifesterer en reduksjon i kroppsvekt fra første leveuke og markert muskelsvakhet20 (data ikke vist). Som vist i figur 2A, virket den postsynaptiske motorendeplaten merket med fluorescerende α-bungarotoxin mindre og/eller fragmentert i mutanter av de to muselinjene ved konfokal mikroskopi. Kvantifisering av NMJ Z-stabler ved hjelp av disse tilpassede ImageJ-makroene viste markerte reduksjoner i endeplatevolum, maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) og relativ tortuositet hos både SMA- og CMS-mus sammenlignet med kontroller, som tegn på NMJ-modningsdefekter32 (figur 2B-D). Postsynaptisk endeplatevolum og MIP var redusert hos syke dyr (foldeendring på 2,7 og 2,0 for volum, og 2,5 og 2,0 for MIP, henholdsvis hos Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus). Den relative tortuositeten var også mindre i SMN- og ColQ-mangelfulle muskler enn WT (16,97 % ± 1,33 % i SMA versus 48,84 % ± 5,90 % WT-mus og 13,29 % ± 2,79 % i CMS versus 30,20 % ± 4,44 % kontrollmus). I tillegg viste kvantifiseringen av fordelingen av presynaptiske aksonterminale grener ved hjelp av den tilpassede makroen ImageJ et endret mønster i nevrofilament M-fordeling i de to dyremodellene, med økt immunmerking (84,65 % ± 0,32 % versus 16,57 % ± 2,03 % og 23,64 % ± 2,78 % versus 18,77 % ± 1,73 % i Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2-mus sammenlignet med kontroller) (figur 3A-D ). Ved SV2-farging ble det også observert en 43 % reduksjon i beleggsforholdet, dvs. prosent av AChR-holdige regioner med tilstøtende nerveterminale aktive soner, hos Smn2B/- mus (49,36 % ± 3,76 % i SMA versus 85,69 % ± 2,34 % WT-mus) (figur 3E,F). Denne NMJ-parameteren ble også beregnet i GA for ColQ Dex2/Dex2 mutanter, men det ble ikke funnet noen statistisk signifikant forskjell sammenlignet med kontrollerte kullkamerater (data ikke vist).
Vi analyserte videre postsynaptiske membranegenskaper ved å kvantifisere avstanden mellom koblingsfolder og bredden på AChR-striper, som ligger på toppen av disse brettene, i ColQ-mangelfull muskel ved hjelp av superoppløsning stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Som vist i figur 4, kan aspektet av disse strukturene tydelig visualiseres ved fluorescerende α-bungarotoksinmerking og intensitetsprofilanalyse. Vi evaluerte disse NMJ-parametrene og fant en økning i kryssfoldavstanden (d) og bredden (w) av AChR-striper i gastrocnemiusmuskelen til mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm og 320,8 nm ± 10,90 nm for avstanden, og 216,9 nm ± 10,51 nm og 186,3 nm ± 7,015 nm for bredden, i ColQ Dex2/Dex2 sammenlignet med villtypemus, henholdsvis p < 0,05) (figur 4C,D).
Figur 1: Flytskjema for videoprotokollen for 3D multiscale NMJ-karakterisering ved konfokal og STED-mikroskopi. Tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler ble samlet fra mus, og muskelfibre ble ertet før merking med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primære antistoffer rettet mot nevrofilament M (NF-M) og synaptisk vesikkelglykoprotein 2 (SV2), og fluorofor (F488 eller F594)-konjugerte sekundære antistoffer. Bildestabler ble anskaffet ved konfokal mikroskopi og behandlet for å måle postsynaptisk NMJ-volum, presynaptisk NF-M-akkumulering, NMJ-aksonterminalbelegg, postsynaptisk maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) endeplateområde og tortuositet (d Obj (AB) er avstanden mellom A og B langs omkretsen av objektet (rød linje), mens dEuc (AB) er den euklidske avstanden mellom A og B (grønn linje)). For STED-mikroskopianalyse ble bredden på acetylkolinreseptorstriper (AChR) og avstanden mellom kryssfolder kvantifisert fra intensitetsprofiler av α-BTX-F633-farging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Multiparameter postsynaptisk NMJ-karakterisering i musemodeller av spinal muskelatrofi (SMA) og ColQ-relatert medfødt myastenisk syndrom (CMS). (A) Representative bilder av postsynaptiske motoriske endeplater fra TA- og GA-muskler merket med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantifisering av NMJ postsynaptisk endeplatevolum, (C) maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) areal og (D) relativ tortuositet i TA på 3 uker gammel villtype (WT) og Smn2B/- mus (venstre grafer, N = 3 dyr per genotype, n = 37 og n = 56 NMJs, henholdsvis) og 6 uker gamle WT og ColQ Dex2/Dex2 mus (høyre grafer, N = 5 mus per genotype, n = 89 og n = 97 NMJs, henholdsvis). Data uttrykkes som gjennomsnitt per mus (prikk) ± SEM. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skala bar er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfometrisk analyse av presynaptisk aksonterminalfordeling i muskler hos WT og mutante mus. NMJ innerveringsmønster i tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler av villtype, SMA og ColQ-relaterte CMS-mus. (A, B) Representative nevromuskulære veikryss fra TA av WT og Smn2B/- mus ved 21 dagers alder merket med antistoffer mot nevrofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn) (A), og resultater fra kvantitativ analyse av nevrofilamentakkumulering (B); (C, D) Representative nevromuskulære veikryss fra GA hos 6 uker gamle WT- og ColQ Dex2/Dex2-mus merket med antistoffer mot nevrofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn), som viser fragmenterte og umodne postsynaptiske endeplater (C), og resultater av nevrofilamentakkumulering i de to dyregruppene (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) og N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT dyr, og N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- og N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2 mus ble analysert i forsøkene (B, D). (E, F) Representative bilder av aksonterminalbelegg i NMJ fra TA av 3 uker gamle WT og Smn2B/- mus merket med antistoffer mot synaptisk vesikkelglykoprotein 2 (SV2, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn) (E), og resultater av NMJ-belegg (SV2/AChR volumforhold) (F). Muskler fra N = 3 (n = 50 NMJs) villtype og N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- mus ble analysert. Data uttrykkes som middelverdi per mus (prikk) ± SEM. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Vektstenger er 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: STED-avbildning av NMJ postsynaptiske endeplater. (A) Representativt STED-bilde av en NMJ merket med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) fra gastrocnemius av en 6 uker gammel villtype mus som viser postjunksjonelle AChR-striper (skalalinjen er 5 μm). (B) Høyere forstørrelse av en region med AChR-striper (bunnpanel) som ble brukt til å generere intensitetsprofilen. Bredden (w) på AChR-striper og avstanden mellom to tilstøtende striper (d) i denne regionen ble kvantifisert og presentert i søylediagrammet. Skjematisk fremstilling av den postsynaptiske endeplaten for å illustrere AChR stripebredde (w) og avstand (d). Disse parametrene, (C) AChR stripeavstand og (D) bredde, ble målt i ColQ Dex2/Dex2 mus og kontroll av kullkamerater ved 6 ukers alder. NMJ fra 5 WT (totalt n = 29 NMJs) og 6 ColQ Dex2/Dex2 (totalt n = 43 NMJs) dyr ble analysert blindt. Data uttrykkes som gjennomsnitt per mus (prikk) ± SEM. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-testen (* p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Lansering av LAS X-programvare og parametere for konfokale oppkjøp. De ulike trinnene for å skaffe konfokale bilder er beskrevet i avsnitt 3.1.2 til 3.1.7 i protokollen. For hver NMJ-stakkinnsamling åpnes et prosjekt (trinn 3.1.4), og parametrene for bildestørrelse, innsamlingshastighet, X-, Y- og Z-akser velges (trinn 3.1.7), med hver sekvensiell skanning angitt (Seq.1, laser 405 for DAPI; Seq.2, laser 488 for α-BTX-F488; og Seq.3, laser 552 for F594 konjugerte sekundære antistoffer). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Lansering av LAS X-programvare og parametere for STED-anskaffelser. Fremgangsmåten for å skaffe STED-bilder er beskrevet i avsnittene 3.2.2 til 3.2.8 i protokollen. Mikroskopet startes i konfigurasjonsmodus STED ON (trinn 3.2.2), og et prosjekt åpnes (trinn 3.2.3). Parametrene for bildeinnhenting (trinn 3.2.7) (bildestørrelse, innhentingshastighet, zoomfaktor, X-akse), med hver sekvensiell skanning er angitt (Seq.1 for α-BTX-F633; Seq.2 for F488 konjugerte sekundære antistoffer). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Bilder av α-BTX-fargede kryssfolder oppnådd ved STED-mikroskopi. Bildeeksempler på en postsynaptisk endeplate merket med α-BTX-F633 fra en 6 uker gammel villtypemus som ble anskaffet med enten riktig (venstre) eller feil fokus (høyre). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Popup-vinduer i Windows for å beskrive inndata og utdata innhentet av de egendefinerte ImageJ-makroene. Eksempler på inndata (.tif- og LIF-filer) for NMJ-bilder vises i venstre kolonne. Utdataene fra makroene (høyre kolonne) lagres i mapper (Save_Volume, Save_Accu) som inneholder bilder av krysset (.tif) og dataark som inneholder resultatene (.csv filer). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 5: AChR stripeavstand og breddeanalyse fra et STED-oppkjøp ved hjelp av LAS X-programvaren. Fremgangsmåten for å analysere NMJ STED-bilder er beskrevet i avsnitt 5 i protokollen. A) Bilde av et merket postsynaptisk endeplateområde som inneholder AChR-striper. Interesseområdet for stripeanalyse velges ved å tegne en vinkelrett linje (grønn linje, for stripeavstand) eller et vinkelrett rektangel (lilla rektangel, for stripebredde). (B, C) Intensitetsprofiler for de valgte regionene og målene for å beregne avstanden mellom AChR-striper (B) og AChR-stripebredden (C) vises. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ tilpasset makro for å trekke ut NMJ-parametermålinger (NMJ-volum, MIP-sluttplateområde og NMJ-tortuositet). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ tilpasset makro for å trekke ut NF-M-akkumulering og SV2-farging. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den beskrevne videoprotokollen gir en detaljert metode for å kvantifisere 3D-strukturen av nevromuskulære veikryss ved å kombinere konfokal og STED-mikroskopi som kan brukes til å karakterisere patologiske forandringer på pre- og postsynaptiske nivåer. Den høye oppløsningen til STED-mikroskopi tillater visualisering og morfometrisk analyse av nanostrukturer som ikke kan identifiseres ved konvensjonell konfokal avbildning. Denne prosedyren gjorde det mulig for oss å måle strukturelle endringer av NMJ i to appendikulære muskler, tibialis anterior og gastrocnemius, av SMA- og ColQ-relaterte CMS-mus.
For å oppnå pålitelige resultater med denne teknikken, er det viktig å dissekere og erte muskler riktig, spesielt oppmerksom på fascia som omgir muskelen og den påførte styrken for å skille muskelbunter; Ellers kan innerveringsmønsteret forstyrres og hindre riktig presynaptisk NMJ-vurdering. Selv om detaljert informasjon er gitt for å analysere NMJ fra TA og GA, kan denne protokollen i prinsippet tilpasses andre muskler, inkludert flate muskler, for eksempel membranen eller tverrgående abdominis37, som ikke krever ertende trinn. Vevsfiksering er også avgjørende for å sikre god kvalitet på farging; Derfor anbefales det å bruke PFA av høy kvalitet med et passende volum (15-20 ganger muskelen). I tillegg er eksponeringstiden for fikseringsmiddelet et viktig skritt fordi artefakter, for eksempel krymping og klumping, kan oppstå på grunn av overfiksering og påvirkning av NMJ-funksjoner. Gitt størrelsen på prøvene og penetrasjonshastigheten til paraformaldehydoppløsningen i vev38, anbefales en fikseringstid på 18-24 timer for denne typen muskel. I tilfelle fargingstrinnet er planlagt mer enn en uke etter vevshøsting, anbefales det å holde PFA-faste muskler i PBS supplert med natriumazid ved 4 ° C for å forhindre bakteriell spredning.
Denne protokollen presenterer en tilnærming ved bruk av α-BTX-F488 for konfokal og α-BTX-F633 for STED-avbildning. Disse fluoroforene ble valgt for å passe med det beskrevne eksperimentelle designet, men kan modifiseres i henhold til tilgjengelig utstyr og materialer. For eksempel kan α-BTX F488-merking velges når du bruker en STED CW 592 nm-laser for bildeopptak og kvantifisering. Det ser imidlertid ut til at konfigurasjonen som ble brukt i denne studien (pulserende eksitasjonsgated STED, 775 nm uttømming) viser høyere ytelse og bedre oppløsning enn andre tilnærminger, for eksempel kontinuerlig bølge STED39, noe som gjør den mer egnet for den nåværende applikasjonen. Det er også viktig å velge lasereffektinnstillingene nøye, spesielt for STED (både eksitasjon og uttømming), siden egenskapene til en intensitetsprofil ikke kan måles ved metning, og derfor kan ethvert mettet signal i et NMJ-bilde sette hele analysen i fare.
Denne detaljerte arbeidsflyten, inkludert bildeinnhenting og analyse ved hjelp av mikroskopprogramvare og ImageJ-makroer, ble utviklet for å lette autonom NMJ-morfometrisk analyse ved konfokal og STED-mikroskopi fra en enkelt muskel. Tidligere beskrevne arbeidsflyter for NMJ konfokal analyse, som NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banet vei for design av halvautomatiske metoder som letter morfologisk analyse av NMJ og komparative studier. NMJ-morph (og den oppdaterte versjonen aNMJ-morph15) er en gratis ImageJ-basert plattform som bruker maksimal intensitetsprojeksjon for å måle 21 morfologiske funksjoner, og NMJ-Analyser bruker et skript utviklet i Python som genererer 29 relevante parametere fra hele 3D NMJ-strukturen. Manuell terskelverdi er det eneste trinnet under bildebehandling i disse to metodene som krever brukeranalyse. Denne integrerte protokollen beskriver trinn for vevsforberedelse, 3D-konfokale bildeoppkjøp og ImageJ-basert behandling av NMJ-er fra hele skjelettmuskler og gir en forenklet oversikt over fem viktige parametere for endplatene postsynaptisk (volum, maksimalt projeksjonsområde og tortuositet) og presynaptisk (aksonterminalbelegg og nevrofilamentakkumulering). En tilleggsparameter av biologisk relevans, AChR-organisasjonsmønsteret til de postsynaptiske kryssfoldene, ble innlemmet for morfometrisk analyse på nanoskalanivå ved superoppløsning STED-mikroskopi (oppløsning 20-30 nm) 40. Interessant nok er vevsforberedelse for STED-avbildning enklere enn andre metoder som brukes til NMJ ultrastrukturelle studier, for eksempel konvensjonell transmisjonselektronmikroskopi (TEM)9, som er en ganske kompleks og tidkrevende prosedyre som krever en dyktig manipulator for å oppnå ultratynne seksjoner av riktig muskelregion. I tillegg kan kvantitative data fra flere koblingsfolder hentes automatisk ved hjelp av den STED-tilknyttede programvaren.
Denne protokollen ble brukt for å illustrere tidligere kjente NMJs defekter i SMN og ColQ mangelfulle muskler 20,36,41,42. Vanlige endringer ble funnet i de to musemodellene ved konfokal mikroskopi, som redusert postsynaptisk endeplatevolum, MIP-område og relativ tortuositet, og økt nevrofilamentakkumulering, mens noen mer spesifikke funn (redusert NMJ-belegg), ble observert bare hos SMA-mus, som en indikator på nedsatt vesikler som handler36. Endelig ble det oppdaget en økning i AChR-stripeavstand og bredde i ColQ-KO ved STED-analyse, som er tegn på ultrastrukturelle defekter i de postsynaptiske kryssfoldene, som tidligere observert av TEM20. Det er viktig at denne protokollen kan bidra til en mer grundig morfologisk karakterisering av nevromuskulære veikryss under utvikling, vedlikehold og under ulike patologiske forhold.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Vi takker Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility", samt histologitjenesten, som delvis støttes av utstyrsmidler fra Region Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne og INSERM, Frankrike. Vi er også takknemlige til Dr. Rashmi Kothary for å gi Smn 2B / 2B muselinjen (University of Ottawa, Canada) og Dr. Eric Krejci for ColQDex2 / + muselinjen (upublisert, Universitetet i Paris, Frankrike). Vi takker Guillaume Corre for hans støtte i statistisk analyse. 2H3 (utviklet av Jessel, TM og Dodd, J.) og SV2 (utviklet av Buckley, KM) monoklonale antistoffer ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), opprettet av NICHD av NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA 52242. Dette arbeidet ble støttet av Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM og Universitetet i Evry Val d'Essonne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers and Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488) | Life Technologies, Thermofisher | A-11001 | |
| Alexa Fluor 488 α-bungarotoxin (F488-a-BTX) | Life Technologies, Thermofisher | B13422 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594) | Life Technologies, Thermofisher | A-11032 | |
| ATTO-633 α-bungarotoxin (F633-a-BTX) | Alomone Labs | B-100-FR | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| DAPI Fluoromount-G | Southern Biotech | 00-4959-52 | |
| DPBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| Ethanol Absolute | VWR | 20821.296 | |
| Immersion Oil, n = 1.518 | THORLABS | MOIL-10LF | Low autofluorescence |
| Neurofilament (NF-M) antibody | DSHB | AB_531793 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MERCK | 1.04005 | |
| Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody | DSHB | AB_2315387 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Materials | |||
| Alnico Button cylindrical magnets | Farnell France | E822 | diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg |
| 63x 1.4 NA magnitude oil immersion HCX Plan Apo CS objective | Leica Microsystems | ||
| 100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective | Zeiss | ||
| Curved thin forceps-Moria iris forceps | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Extra thin scissors - Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15-003-08 | |
| Fine serrated forceps | Euronexia | P-95-AA | |
| Gel loading tip round 1-200 µL | COSTAR | 4853 | |
| Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm | Leica Microsystems | ||
| Lens Cleaning Tissue | Whatman (GE Healthcare) | 2105-841 | |
| Medium serrated forceps | Euronexia | P-95-AB | |
| Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170±5 µm | Marienfield | 107222 | High precision |
| Nunclon delta surface (12-well plates) | Thermo Scientific | 150628 | |
| Nunclon delta surface (24-well plates) | Thermo Scientific | 142475 | |
| Safeshield scalpel | Feather | 02.001.40.023 | |
| Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Software | |||
| GraphPad | Prism, San Diego (US) | Release N°6.07 | Statistical software |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Release N° 1.53f | |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | Release N°3.7.2.2283 | Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
References
- Slater, C. R. Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse. Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), (2016).
- Willadt, S., Nash, M., Slater, C. Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions. Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).
- Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy. Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).
- Koneczny, I., Herbst, R. Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture. Cells. 8 (7), 671 (2019).
- Dowling, J. J., et al. Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models. Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).
- Gibbs, E. M., et al. Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy. Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).
- Swoboda, K. J., et al. Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function. Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).
- Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease. Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).
- Minty, G., et al. aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology. Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).
- Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- York, A. L., Zheng, J. Q. Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology. Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).
- Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function. Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).
- Sigoillot, S. M., et al. Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency. The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).
- Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies. Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- ImageJ. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2021).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Bio-Formats. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/ (2021).
- Legland, D., Beaugrand, J. Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables. Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).
- ImageJ documentation. , Available from: http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start (2021).
- GitHUb. , Available from: https://github.com/Genethon/ImCy (2021).
- Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).
- Kong, L., et al. Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice. The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model. Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).
- Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).
- Boyer, J. G., et al. Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).
- Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).
- Vicidomini, G., et al. STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects. PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Thomson, S. R., et al. Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).
- McMacken, G. M., et al. Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome. Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).
