Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Bewertung von Arzneimittelsensitivitäten gegenüber zielgerichteten Signalinhibitoren in NSCLC-patientenabgeleiteten Organoidmodellen.
Neuartige 3D-Krebsorganoidkulturen, die aus klinischen Patientenproben gewonnen werden, stellen ein wichtiges Modellsystem zur Bewertung der Intratumorheterogenität und des Ansprechens auf gezielte Inhibitoren bei Krebs dar. Pionierarbeit bei Magen-Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs hat das Versprechen von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) als patientennahes Kultursystem hervorgehoben, wobei immer mehr Modelle entstehen. In ähnlicher Weise hat sich die Arbeit in anderen Krebsarten auf die Etablierung von Organoidmodellen und die Optimierung von Kulturprotokollen konzentriert. Insbesondere 3D-Krebsorganoid-Modelle behalten die genetische Komplexität ursprünglicher Tumorproben bei und übersetzen so tumorabgeleitete Sequenzierungsdaten in die Behandlung mit genetisch informierten zielgerichteten Therapien in einem experimentellen Umfeld. Darüber hinaus könnten PDOs die Bewertung rationaler Kombinationsbehandlungen fördern, um die resistenzassoziierte Anpassung von Tumoren in der Zukunft zu überwinden. Letzteres konzentriert sich auf intensive Forschungsanstrengungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), da die Resistenzentwicklung letztendlich den Behandlungserfolg gezielter Inhibitoren einschränkt. Eine frühzeitige Bewertung therapeutisch zielgerichteter Mechanismen unter Verwendung von NSCLC-PDOs könnte dazu beitragen, rationale Kombinationsbehandlungen zu informieren. Dieses Manuskript beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die zellkulturplattenbasierte Bewertung von Arzneimittelempfindlichkeiten gegenüber zielgerichteten Inhibitoren in NSCLC-abgeleiteten 3D-PDOs mit potenzieller Anpassungsfähigkeit an Kombinationsbehandlungen und andere Behandlungsmodalitäten.
Personalisierte Therapien gegen onkogene Treiber haben die Krebsbehandlung revolutioniert, das Überleben der Patienten verbessert und behandlungsvermittelte Nebenwirkungen reduziert1. Jüngste Fortschritte in der molekularen Diagnostik und Sequenzierungstechnologie haben die Komplexität menschlicher Tumore deutlich gemacht, wobei sich die räumliche und zeitliche Heterogenität auf das Ansprechen auf die Behandlung auswirkt2. Die Rekapitulation dieser subklonalen Unterschiede in Zellkulturmodellen beschränkte sich lange Zeit auf die Untersuchung ausgewählter Veränderungen des Interesses in ansonsten einheitlichen Zelllinien. Neu entwickelte 3D-PDO-Modelle, die aus Tumorbiopsien oder chirurgischen Tumorresektionen generiert werden, ermöglichen eine verbesserte Darstellung der zellulären Komplexität und Signalübersprechen innerhalb von patientenabgeleitetem Tumorgewebe3. So wurden Tumororganoide aus Magen-Darm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs erfolgreich erzeugt und rekapitulieren die genetische Vielfalt und Determinanten des Behandlungsansprechens4,5,6. Bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) werden Herausforderungen bei der Entwicklung und Etablierung von Organoiden anerkannt, und es ist eine Optimierung von Kulturtechniken und selektiven Medienfaktoren erforderlich, um in Zukunft eine breitere und systematischere Verwendung von NSCLC-PDOs zu ermöglichen7,8.
Die Entwicklung kombinatorischer Therapien, die auf Resttumorzellen abzielen, die einer medikamentösen Erstbehandlung standhalten, ist unerlässlich, um die Resistenzentwicklung zu hemmen und letztendlich das Überleben der Patienten zu verbessern9. Angesichts der architektonischen Komplexität von Organoidkulturen müssen klassische Arzneimittelreaktionsparameter optimiert werden, um genaue und reproduzierbare Tests von Arzneimittelempfindlichkeiten zu ermöglichen. Bildgebende Auslesungen10,11 und klassische Zelllebensfähigkeitsassays zur Messung der zellulären ATP-Abundanz6,12 stehen neben anderen Techniken zur Profilierung von Arzneimittelreaktionen in PDO-Kulturen zur Verfügung. Hier entwickeln und beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll zur Bewertung von Arzneimittelempfindlichkeiten gegenüber einer zielgerichteten Therapie gegen bekannte klinische Treiber in NSCLC-PDO-Modellen.
Dieses Manuskript entwickelt und beschreibt ein standardisiertes Protokoll zur Bewertung der Arzneimittelsensitivität in NSCLC-abgeleiteten 3D-PDO-Modellen. Zusätzlich zu Arzneimittelsensitivitätsstudien ist eine weitere Charakterisierung verfügbarer Organoidmodelle erforderlich, um die zugrunde liegenden Ursachen für Unterschiede in der Arzneimittelsensitivität zu bestimmen. Dies kann die genetische Profilerstellung von Organoiden und Patientenproben und andere Analysen umfassen, die für Organoide verfügbar sind, wie z. B. die immunhistochemische Färbung für Differenzierungsmarker und allgemeine zelluläre Signalbiomarker und Physiologie13,29.
Kritische Schritte im Protokoll
Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen standardisierten Workflow, der bei sorgfältiger Befolgung genaue und reproduzierbare Analysen der Arzneimittelsensitivität ermöglicht. Besondere Vorsicht ist bei den folgenden Schritten geboten: TrypLE- und DNAse-I-Verdauung während der Erzeugung von Einzelzellsuspensionen, Aussaat von Einzelzellsuspensionen in BME2, Überwachung des Organoidwachstums bis zur Behandlung, Medienveränderungen sowie Unterbrechung und Lyse von eingebetteten BME2-Organoiden während des lumineszenzbasierten Zellüberlebens-Readouts. (1) Während eine zusätzliche DNAse-I-Verdauung nach der TrypLE-basierten Dissoziation von Organoiden für die Erweiterung von Organoidmodellen während der regelmäßigen Kulturpflege nicht wesentlich ist, sollte die DNAse-I-Verdauung bei der Aussaat für Arzneimitteleskalationsexperimente nicht ausgelassen werden, da sie eine bessere Trennung von Organoidclustern in Einzelzellsuspensionen und eine genaue Zellzählung gewährleistet. (2) Die Aussaat von Einzelzellsuspension in BME2 stellt angesichts der Erstarrung von BME2 bei Raumtemperatur einen kritischen Schritt dar. Daher müssen maximal 1-2 Reihen gleichzeitig ausgesät werden, und Proben sollten auf Eis gelegt werden, bevor zusätzliche Reihen ausgesät werden. Bemerkenswert ist, dass Zellen nach oben und unten pipettiert werden müssen, wenn die Aussaat fortgesetzt wird, um eine homogene Zellsuspension zu ermöglichen. (3) Das Organoidwachstum muss während der 7-tägigen Expansion von der Aussaat bis zur Behandlung sorgfältig überwacht werden. Ein Beispiel für die erwartete Entwicklung ist in Abbildung 1B und der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt. Bemerkenswert ist, dass die Beurteilung von Änderungen der Organoidgröße durch Hellfeldmikroskopie und Bildanalyse, wie in Abbildung 1B dargestellt, eine genaue Bewertung der Unterschiede im Organoidwachstum und in den Verdopplungszeiten ermöglichen kann. Verdoppelungszeiten können sich auf das Ansprechen von Medikamenten auswirken, wie kürzlich in der Literatur diskutiert wurde30. Übersteigt die Organoid-Wachstumsrate das vorgestellte Beispiel deutlich, kann eine kürzere Expansionszeit bis zum Behandlungsbeginn und eine kürzere Behandlungsdauer in Betracht gezogen werden. (4) Darüber hinaus ist beim Medienwechsel besonders darauf zu achten, dass Organoide abgesaugt werden. Die Seeding-Position der eingebetteten BME2-Organoide in der 6-Uhr-Position ermöglicht eine sichere Ansaugung von Medien, wenn die Platten um 180° im Uhrzeigersinn gedreht und die Medien an der entgegengesetzten Position der Organoide abgesaugt werden. (5) Schließlich ist eine gründliche Lyse der in BME2 eingebetteten Organoide während der Überlebensanzeige unerlässlich, um genaue Ergebnisse aufzuzeichnen. Gemäß den Anweisungen des Herstellers sollten die Proben wiederholt auf und ab pipettiert werden, idealerweise mit ungefilterten Spitzen, um eine ordnungsgemäße Lyse zu gewährleisten. Die Inkubationszeiten sollten wie beschrieben eingehalten werden. Darüber hinaus ermöglicht die Übertragung von 75% des Lysats (anstelle des Gesamtvolumens) auf eine weiße, undurchsichtige 96-Well-Platte für die endgültige Anzeige mit einem ELISA-Plattenleser eine angemessene Bewertung, da dies das gleiche Volumen in jedem Bohrloch und das Fehlen von Luftblasen gewährleistet, die durch kräftiges Pipettieren eingeführt werden können.
Bemerkenswert ist, dass die Profilierung von Arzneimittelreaktionen in BME2-eingebetteten Organoidkulturen eine höhere Standardabweichung aufweisen kann als in regulären Zelllinienkulturen beobachtet (Abbildung 2, Abbildung 3A). Die höhere Standardabweichung basiert auf mehreren Faktoren, einschließlich einer erhöhten Wahrscheinlichkeit geringfügiger Schwankungen bei der Aussaat bei der Arbeit mit BME2 und Unterschieden in den einzelnen Organoid-Wachstumsraten zwischen Bohrlöchern während der anfänglichen 7-tägigen Wachstumsperiode. Daher sollten gleich oder mehr als vier technische Replikate pro Arzneimittelkonzentration ausgesät werden.
Am wichtigsten ist, dass das Vorhandensein von bösartigen Zellen, die die onkogene Treibermutation tragen, und die begrenzte Kontamination durch normale Atemwegsepithelzellen sorgfältig bewertet werden müssen. Herausforderungen bei der NSCLC-Etablierung können das Auswachsen normaler Atemwegsepithelzellen begünstigen7. Copy Number Profiling oder PCR- und Sequencing-basierte Ansätze zur Bestätigung des Vorhandenseins der onkogenen Treibermutationen sind die Methoden der Wahl, um die Qualität von NSCLC-Organoidkulturen sicherzustellen.
Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode
Medien und entsprechende Wachstumsfaktoren, die zu grundlegenden Medienlösungen hinzugefügt werden, können die Arzneimittelreaktion auf gezielte Inhibitoren erheblich beeinflussen. Sie aktivieren Bypass-Rezeptoren und Signalwege, die die Arzneimittelreaktion beeinflussen und begrenzen (z. B. FGF, HGF, EGF)26. Während ein wachstumsfaktorreiches und maßgeschneidertes Medium optimal für die Erweiterung der Organoidkultur sein kann, sollten Arzneimitteleskalations- und Sensitivitätsbewertungen in einem Medien mit reduziertem Wachstumsfaktor durchgeführt werden, wie oben beschrieben. Dies basiert auf internen Erfahrungen beim Vergleich verschiedener Medienformulierungen und Arzneimittelreaktionsdaten (Abbildung 3C). Während Medienlösungen den Grad der Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Arzneimittelbehandlungen beeinflussen und die IC50-Werte verschieben können, sind robuste Phänotypen der Empfindlichkeit oder Resistenz unabhängig von der Medienformulierung erkennbar (Abbildung 3C, D). Darüber hinaus wird eine allgemeine Konsistenz in der Medienformulierung und Profilierung der Arzneimittelreaktionen über Organoidkulturen hinweg empfohlen, und es müssen gleiche oder mehr als vier technische Replikate pro Konzentration ausgesät werden. Dies ist besonders wichtig, um Bereiche in Sensitivität vs. Resistenz für den Inhibitor von Interesse.
Einschränkungen der Methode
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Empfindlichkeit von NSCLC 3D-Krebsorganoidmodellen gegenüber gezielten Inhibitoren, wenn von Patienten stammende Krebszellen kultiviert werden. Für eine detaillierte Charakterisierung der Arzneimittelresistenz und -sensitivität sind zusätzliche Experimente erforderlich, einschließlich pharmakodynamischer Analysen zur Signalwegshemmung und Sequenzierungsanalyse auf das Vorhandensein des Treiberonkogens und sekundärer Mutationen. Darüber hinaus werden Bystander-Faktoren wie Mikroumweltreize, die aus Interaktionen abgeleitet werden, oder sezernierte Faktoren von Nicht-Krebs-Bystander-Zellen in der Tumormikroumgebung nicht berücksichtigt, und neue Protokolle werden benötigt, wenn Co-Kultur-Organoid-Modelle mit Immun- oder Stromazellen versucht werden. Jüngste Arbeiten haben die Verwendung von Organoidmodellen zur Rekapitulation von Tumor-Mikroumgebungsinteraktionen und Profilreaktionen auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren, wie z.B. Anti-PD-L1-Behandlung13,31, hervorgehoben.
Die Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden
3D-Krebsorganoidmodelle rekapitulieren die genetische Vielfalt und die Determinanten des Behandlungsansprechens im ursprünglichen Tumor4,5,6. Insbesondere kann räumliche und zeitliche Heterogenität die Tumorevolution fördern, und parallele Entstehung und die sequentielle Entwicklung von Tumorsubklonen können auftreten32,33. Die intratumorale Heterogenität ist signifikant für die Auswahl widerstandsfähigerer Tumorzellen unter therapeutischem Druck9,34,35. Das hier bereitgestellte Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit gezielten Inhibitoren in patientennahen Proben. Daher haben Organoidmodelle Vorteile gegenüber konventionelleren homogenen Zelllinienmodellen, denen die genetische Vielfalt fehlt, oder Langzeitstudien mit Zelllinien oder von Patienten abgeleiteten Xenotransplantaten. Darüber hinaus ermöglicht das vorliegende Protokoll die Skalierung auf mehrere Behandlungsarme und Kombinationsbehandlungsansätze mit wenigen Einschränkungen in Bezug auf Kosten und analytische Kapazität. Daher ermöglicht die Zugabe eines zweiten Medikaments von Interesse bei einer festen Dosis bei gleichzeitiger Eskalation des primär zielgerichteten Inhibitors und der Vergleich mit der Eskalation des primär zielgerichteten Inhibitors allein, die potenziellen kombinatorischen Effekte effizient zu bewerten und mit minimaler zusätzlicher Biomasse erforderlich (Ergänzende Abbildung 3). Im Vergleich zu bildgebenden Bewertungen, die zur Überwachung der Organoidentwicklung und des Arzneimittelansprechens verwendet werden, weist der hier beschriebene lumineszenzbasierte Zellüberlebensassay eine ähnliche Empfindlichkeit mit minimaler Ausrüstung und minimalem Schulungsaufwand auf.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Die Entwicklung einer standardisierten Pipeline, die die Etablierung von Krebsorganoidmodellen aus Patientenproben und die anschließende Erstellung von Arzneimittelsensitivitätsprofilen ermöglicht, birgt ein erhebliches klinisches Anwendbarkeitspotenzial. Die pharmakologische Ex-vivo-Profilerstellung hat bei der Erkennung von Schwachstellen und resistentenassoziierten Merkmalen in Tumoren, die mit dem Ansprechen auf die Behandlung bei Patienten korrelieren, Anerkennung gefunden36,37. Bezeichnenderweise kann die Ex-vivo-Profilierung von Arzneimittelsensitivitäten bei der Behandlungsauswahl in der Klinik und bei der Gestaltung rationaler Kombinationsbehandlungen helfen, die sich mit Resistenzmechanismen befassen. Insgesamt könnte dieser Ansatz dazu beitragen, verbesserte personalisierte Strategien für die molekulare Therapie oder kombinatorische Behandlungsschemata zu ermöglichen. Letzteres kann dazu beitragen, Arzneimitteltoleranz- und Resistenzmechanismen frühzeitig ins Visier zu nehmen und die klinische Reaktion zu vertiefen, um die Patientenergebnisse in Zukunft zu verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Labors von Jeroen P Roose (UCSF) und Calvin J Kuo (Stanford) für ihren Beitrag zur Organoidkultur und Protokollentwicklung. Wir danken außerdem Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) für Protokolle und Input zur Probeneinrichtung. Dieses Forschungsprojekt wurde mit Unterstützung des NIH [U54CA224081] durchgeführt. F. Haderk wurde durch das Mildred Scheel Postdoc-Stipendium der Deutschen Krebshilfe gefördert.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |