Bu protokol, NSCLC hasta kaynaklı organoid modellerde hedeflenen sinyal inhibitörlerine karşı ilaç duyarlılıklarının standartlaştırılmış bir değerlendirmesini açıklamaktadır.
Klinik hasta örneklerinden türetilen yeni 3D kanser organoid kültürleri, kanserde intratümör heterojenitesini ve hedeflenen inhibitörlere tedavi yanıtını değerlendirmek için önemli bir model sistemi temsil etmektedir. Gastrointestinal ve pankreas kanserlerinde öncü çalışmalar, hasta kaynaklı organoidlerin (PDO’lar) hastaya yakın bir kültür sistemi olarak vaat edildiğini ve artan sayıda modelin ortaya çıktığını vurgulamıştır. Benzer şekilde, diğer kanser türlerindeki çalışmalar organoid modeller oluşturmaya ve kültür protokollerini optimize etmeye odaklanmıştır. Özellikle, 3D kanser organoid modelleri, orijinal tümör örneklerinin genetik karmaşıklığını korur ve böylece tümör kaynaklı dizileme verilerini, deneysel bir ortamda genetik olarak bilgilendirilmiş hedefli tedavilerle tedaviye dönüştürür. Ayrıca, PDO’lar gelecekte tümörlerin dirençle ilişkili adaptasyonunun üstesinden gelmek için rasyonel kombinasyon tedavilerinin değerlendirilmesini teşvik edebilir. İkincisi, küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde (NSCLC) yoğun araştırma çabalarına odaklanmaktadır, çünkü direnç gelişimi sonuçta hedeflenen inhibitörlerin tedavi başarısını sınırlamaktadır. NSCLC PDO’ları kullanılarak terapötik olarak hedeflenebilir mekanizmaların erken bir değerlendirmesi, rasyonel kombinasyon tedavilerini bilgilendirmeye yardımcı olabilir. Bu yazıda, NSCLC türevi 3D PDO’larda hedeflenen inhibitörlere karşı ilaç duyarlılıklarının hücre kültürü plakasına dayalı değerlendirilmesi için, kombinasyonel tedavilere ve diğer tedavi modalitelerine potansiyel adaptasyon ile standartlaştırılmış bir protokol açıklanmaktadır.
Onkojenik faktörlere karşı kişiselleştirilmiş tedaviler kanser tedavisinde devrim yaratmış, hastanın sağkalımını iyileştirmiş ve tedavi aracılı yan etkileri azaltmıştır1. Moleküler tanılama ve dizileme teknolojilerindeki son gelişmeler, insan tümörlerinin karmaşıklığını, mekansal ve zamansal heterojenliğin tedavi yanıtını etkilediğini vurgulamıştır2. Hücre kültürü modellerindeki bu subklonal farklılıkları özetlemek, uzun zamandır aksi takdirde tekdüze hücre hatlarındaki seçilmiş değişiklikleri araştırmakla sınırlı kalmıştır. Tümör biyopsilerinden veya cerrahi tümör rezeksiyonlarından üretilen yeni geliştirilen 3D PDO modelleri, hasta kaynaklı tümör dokusunda hücresel karmaşıklığın ve sinyal çapraz konuşmasının daha iyi temsil edilmesini sağlar3. Bu nedenle, gastrointestinal ve pankreas kanserinden türetilen tümör organoidleri başarıyla üretilmiş ve genetik çeşitliliği ve tedavi yanıtının belirleyicilerini özetlemektedir4,5,6. Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (KHDAK), organoid gelişim ve kuruluş zorlukları kabul edilmekte ve gelecekte KHDAK PDO’larının daha geniş ve sistematik kullanımını sağlamak için kültür tekniklerinin ve seçici medya faktörlerinin optimizasyonuna ihtiyaç duyulmaktadır7,8.
İlk ilaç tedavisine dayanan rezidüel tümör hücrelerini hedef alan kombinatoryal tedavilerin geliştirilmesi, direnç gelişimini inhibe etmek ve nihayetinde hastanın sağkalımını iyileştirmek için esastır9. Organoid kültürlerin mimari karmaşıklığı göz önüne alındığında, klasik ilaç yanıt parametrelerinin, ilaç hassasiyetlerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde test edilmesini sağlamak için optimize edilmesi gerekir. Görüntüleme tabanlı okumalar10,11 ve hücresel ATP bolluğunu ölçen klasik hücre canlılığı testleri6,12, diğer tekniklerin yanı sıra, PDO kültürlerinde ilaç yanıtlarının profilini çıkarmak için mevcuttur. Burada, NSCLC PDO modellerinde bilinen klinik sürücülere karşı hedefe yönelik tedaviye yönelik ilaç duyarlılıklarını değerlendirmek için standartlaştırılmış bir protokol geliştiriyor ve açıklıyoruz.
Bu makale, NSCLC türevi 3D PDO modellerinde ilaç duyarlılığını değerlendirmek için standartlaştırılmış bir protokol geliştirmekte ve açıklamaktadır. İlaç duyarlılığı çalışmalarına ek olarak, ilaç duyarlılığındaki farklılıkların altında yatan nedenleri belirlemek için mevcut organoid modellerin daha fazla karakterizasyonuna ihtiyaç vardır. Bu, organoidlerin ve hasta örneklerinin genetik profillemesini ve farklılaşma belirteçleri için immünohistokimya boyama ve genel hücresel sinyal biyobelirteçleri ve fizyolojisi gibi organoidler için mevcut diğer analizleri içerebilir13,29.
Protokoldeki kritik adımlar
Burada özetlenen protokol, dikkatle takip edildiğinde doğru ve tekrarlanabilir ilaç duyarlılığı analizlerine izin veren standartlaştırılmış bir iş akışı sağlar. Aşağıdaki adımlarda özel dikkat gösterilmelidir: Tek hücreli süspansiyonların oluşturulması sırasında TripLE ve DNAse I sindirimi, BME2’de tek hücreli süspansiyonların tohumlanması, tedaviye kadar organoid büyümenin izlenmesi, ortam değişiklikleri ve lüminesans bazlı hücre sağkalım okuması sırasında BME2 gömülü organoidlerin bozulması ve lizisi. (1) Organoidlerin Triple bazlı ayrışmasından sonra ek DNAse I sindirimi, düzenli kültür bakımı sırasında organoid modellerinin genişletilmesi için gerekli olmasa da, DNAse I sindirimi, organoid kümelerin tek hücreli süspansiyonlara daha iyi ayrılmasını ve doğru hücre sayımını sağladığı için ilaç yükseltme deneyleri için tohumlama yaparken ihmal edilmemelidir. (2) BME2’de tek hücreli süspansiyonun tohumlanması, BME2’nin oda sıcaklığında katılaşması göz önüne alındığında kritik bir adımı temsil eder. Bu nedenle, bir kerede en fazla 1-2 sıra tohumlanmalı ve ek sıralar tohumlanmadan önce örnekler buz üzerine yerleştirilmelidir. Not olarak, homojen bir hücre süspansiyonuna izin vermek için tohumlamaya devam edildiğinde hücrelerin yukarı ve aşağı pipetlenmesi gerekir. (3) Tohumlamadan tedaviye kadar 7 günlük genişleme sırasında organoid büyümenin dikkatle izlenmesi gerekir. Beklenen gelişime bir örnek Şekil 1B ve Ek Tablo 1’de verilmiştir. Not olarak, Şekil 1B’de gösterildiği gibi parlak alan mikroskobu ve görüntü analizi ile organoid boyutundaki değişikliklerin değerlendirilmesi, organoid büyümesindeki farklılıkların ve iki katına çıkma sürelerinin kesin bir şekilde değerlendirilmesine izin verebilir. İki katına çıkma süreleri, literatürde yakın zamanda tartışıldığı gibi, ilaç yanıtları üzerinde etkili olabilir30. Organoid büyüme hızı sunulan örneği önemli ölçüde aşarsa, tedavinin başlamasına kadar daha kısa bir genişleme süresi ve daha kısa tedavi süresi düşünülebilir. (4) Ek olarak, aspire edici organoidleri önlemek için ortam değiştirirken özel dikkat gösterilmelidir. BME2 gömülü organoidlerin saat 6 pozisyonundaki tohumlama konumu, plakalar saat yönünde 180 ° döndürüldüğünde ve ortam organoidlerin zıt konumunda aspire edildiğinde ortamın güvenli bir şekilde aspire edilmesini sağlar. (5) Son olarak, sağkalım okuması sırasında BME2 gömülü organoidlerin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesi, doğru sonuçların kaydedilmesi için esastır. Üreticinin talimatlarına göre, uygun lizizi sağlamak için numuneler tekrar tekrar, ideal olarak filtrelenmemiş uçlar kullanılarak yukarı ve aşağı pipetlenmelidir. Kuluçka süreleri tarif edildiği gibi takip edilmelidir. Ayrıca, bir ELISA plaka okuyucu kullanarak son okuma için lizatın% 75’inin (toplam hacim yerine) beyaz, opak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya aktarılması, her bir kuyuda aynı hacmi ve kuvvetli pipetleme ile ortaya çıkabilecek hava kabarcıklarının bulunmamasını sağladığından, uygun bir değerlendirmeye izin verir.
BME2-gömülü organoid kültürlerde ilaç yanıtlarının profillenmesi, normal hücre hattı kültürlerinde gözlenenden daha yüksek bir standart sapma gösterebilir (Şekil 2, Şekil 3A). Daha yüksek standart sapma, BME2 ile çalışırken tohumlamada küçük değişikliklerin artma olasılığının artması ve ilk 7 günlük büyüme süresi boyunca kuyular arasında bireysel organoid büyüme oranlarındaki farklılıklar da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere dayanmaktadır. Bu nedenle, ilaç konsantrasyonu başına eşit veya dörtten fazla teknik kopya tohumlanmalıdır.
En önemlisi, onkojenik sürücü mutasyonu taşıyan malign hücrelerin varlığı ve normal hava yolu epitel hücreleri tarafından sınırlı kontaminasyon dikkatle değerlendirilmelidir. NSCLC oluşumundaki zorluklar normal hava yolu epitel hücrelerinin büyümesini destekleyebilir7. Onkojenik sürücü mutasyonlarının varlığını doğrulamak için kopya numarası profilleme veya PCR ve dizileme tabanlı yaklaşımlar, NSCLC organoid kültürlerinin kalitesini sağlamak için tercih edilen yöntemlerdir.
Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
Temel medya çözümlerine eklenen medya ve ilgili büyüme faktörleri, hedeflenen inhibitörlere ilaç yanıtını önemli ölçüde etkileyebilir. İlaç yanıtını etkileyen ve sınırlayan bypass reseptörlerini ve sinyal yollarını aktive ederler (örneğin, FGF, HGF, EGF)26. Büyüme faktörü açısından zengin ve uyarlanmış bir ortam, organoid kültürünün genişletilmesi için en uygun olsa da, yukarıda belirtildiği gibi, ilaç tırmanışı ve duyarlılık değerlendirmeleri, azaltılmış bir büyüme faktörü ortamında yapılmalıdır. Bu, farklı ortam formülasyonlarını ve ilaç yanıt verilerini karşılaştıran dahili deneyime dayanmaktadır (Şekil 3C). Medya çözeltileri belirli ilaç tedavisine duyarlılık derecesini etkileyebilir ve IC50 değerlerini değiştirebilirken, ortam formülasyonundan bağımsız olarak sağlam duyarlılık veya direnç fenotipleri belirgindir (Şekil 3C, D). Ek olarak, organoid kültürler arasında medya formülasyonunda ve ilaç yanıtlarının profillenmesinde genel tutarlılık önerilir ve konsantrasyon başına eşit veya dörtten fazla teknik kopyanın tohumlanması gerekir. Bu , özellikle hassasiyet aralıklarını karşılaştırmak için önemlidir. İlgilenilen İnhibitör için direnç.
Yöntemin sınırlamaları
Burada sunulan protokol, hasta kaynaklı kanser hücreleri kültürlendiğinde NSCLC 3D kanser organoid modellerinin hedeflenen inhibitörlere duyarlılığını açıklamaktadır. İlaç direnci ve duyarlılığının ayrıntılı bir karakterizasyonu için yol inhibisyonu ve sürücü onkogen ve sekonder mutasyonların varlığı için sekanslama analizi ile ilgili farmakodinamik analiz de dahil olmak üzere ek deneylere ihtiyaç vardır. Ayrıca, etkileşimlerden türetilen mikroçevresel uyaranlar veya tümör mikro ortamındaki kanser dışı seyirci hücreler tarafından salgılanan faktörler gibi seyirci faktörler hesaba katılmaz ve immün veya stromal hücrelere sahip ko-kültür organoid modelleri denendiğinde yeni protokollere ihtiyaç duyulur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, tümör mikroçevre etkileşimlerini özetlemek ve anti-PD-L1 tedavisi gibi immün kontrol noktası inhibitörlerine verilen yanıtları profillemek için organoid modellerin kullanımını vurgulamıştır13,31.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemler açısından önemi
3D kanser organoid modelleri, orijinal tümörde mevcut olan genetik çeşitliliği ve tedavi yanıtının belirleyicilerini özetlemektedir4,5,6. Özellikle, mekansal ve zamansal heterojenite tümör evrimini destekleyebilir ve tümör alt klonlarının paralel ortaya çıkışı ve sıralı gelişimi meydana gelebilir32,33. İntratümör heterojenite, terapötik basınç altında daha dirençli tümör hücrelerinin seçimi için önemlidir9,34,35. Burada sağlanan protokol, hastaya yakın örneklerde hedefe yönelik inhibitörlerle tedaviye duyarlılıkların hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nedenle, organoid modeller, genetik çeşitliliğe sahip olmayan daha geleneksel homojen hücre hattı modellerine veya hücre hatları veya hasta kaynaklı ksenograftları kullanan uzun süreli çalışmalara göre avantajlara sahiptir. Ayrıca, mevcut protokol, maliyet ve analitik kapasite ile ilgili birkaç sınırlama ile tedavinin ve kombinasyonel tedavi yaklaşımlarının çoklu kollarına ölçeklendirilmesine izin vermektedir. Bu nedenle, birincil olarak hedeflenen İnhibitörün tırmandırılmasında sabit bir dozda ikinci bir ilgi çekici ilacın eklenmesi ve yalnızca birincil olarak hedeflenen İnhibitörün tırmandırılmasıyla karşılaştırılması, potansiyel kombinatoryal etkilerin verimli bir şekilde değerlendirilmesine ve minimum ek biyokütle gereksinimine izin verir (Ek Şekil 3). Organoid gelişimini ve ilaç yanıtını izlemek için kullanılan görüntüleme tabanlı değerlendirmelerle karşılaştırıldığında, burada açıklanan lüminesans bazlı hücre sağkalım testi, gerekli minimum ekipman ve eğitim ile benzer duyarlılığa sahiptir.
Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Hasta örneklerinden kanser organoid modellerinin oluşturulmasına izin veren standartlaştırılmış bir boru hattının geliştirilmesi ve ardından ilaç duyarlılıkları profillemesi önemli klinik uygulanabilirlik potansiyeline sahiptir. Ex vivo farmakolojik profilleme, tümörlerdeki kırılganlıkların ve dirençli ilişkili özelliklerin saptanmasında tanınmış, hastalarda tedaviye yanıtla korelasyon kazanmıştır36,37. İlaç duyarlılıklarının ex vivo profillenmesi, klinikte tedavi seçiminde ve direnç mekanizmalarını ele alan rasyonel kombinasyonel tedavilerin tasarımında önemli ölçüde yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yaklaşım moleküler terapi veya kombinatoryal tedavi rejimleri için geliştirilmiş kişiselleştirilmiş stratejilerin sağlanmasına yardımcı olabilir. İkincisi, ilaç toleransını ve direnç mekanizmalarını erken hedeflemeye yardımcı olabilir ve gelecekte hasta sonuçlarını iyileştirmek için klinik yanıtı derinleştirebilir.
The authors have nothing to disclose.
Jeroen P Roose (UCSF) ve Calvin J Kuo (Stanford) laboratuvarlarına organoid kültürü ve protokol geliştirme konusundaki katkıları için teşekkür ederiz. Ayrıca protokoller ve örnek kuruluş girdileri için Oghenekevwe M. Gbenedio’ya (Roose laboratuvarı, UCSF) teşekkür ederiz. Bu araştırma projesi NIH’nin [U54CA224081] desteğiyle yürütülmüştür. F. Haderk, Alman Kanser Yardımı’ndan Mildred Scheel doktora sonrası bursu tarafından desteklendi.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |