Этот протокол описывает стандартизированную оценку чувствительности лекарственного средства к целевым сигнальным ингибиторам в органоидных моделях, полученных от пациентов с НМРЛ.
Новые 3D-культуры органоидов рака, полученные из клинических образцов пациентов, представляют собой важную модельную систему для оценки внутриопухолевой гетерогенности и реакции лечения на целевые ингибиторы при раке. Новаторская работа в области рака желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы подчеркнула перспективность органоидов, полученных от пациента (PDO), в качестве системы культуры, близкой к пациенту, с появлением все большего числа моделей. Аналогичным образом, работа в других типах рака была сосредоточена на создании органоидных моделей и оптимизации протоколов культивирования. Примечательно, что 3D-модели органоидов рака поддерживают генетическую сложность оригинальных образцов опухолей и, таким образом, переводят данные секвенирования опухоли в лечение генетически информированными целевыми методами лечения в экспериментальных условиях. Кроме того, PDO могут способствовать оценке рациональных комбинированных методов лечения для преодоления резистентной адаптации опухолей в будущем. Последний фокусируется на интенсивных исследовательских усилиях при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), поскольку развитие резистентности в конечном итоге ограничивает успех лечения целевыми ингибиторами. Ранняя оценка терапевтически целенаправленных механизмов с использованием ФДО НМРЛ может помочь в рациональном комбинированном лечении. В этой рукописи описывается стандартизированный протокол оценки чувствительности препарата к целевым ингибиторам в 3D-PDO, полученных из НМРЛ, с потенциальной адаптивностью к комбинированному лечению и другим методам лечения.
Персонализированные методы лечения онкогенных факторов произвели революцию в лечении рака, улучшив выживаемость пациентов и уменьшив побочные эффекты, опосредованные лечением1. Последние достижения в области молекулярной диагностики и технологий секвенирования подчеркнули сложность опухолей человека, причем пространственная и временная гетерогенность влияет на реакцию на лечение2. Повторение этих субклональных различий в моделях клеточных культур уже давно ограничивается исследованием отдельных изменений, представляющих интерес в однородных клеточных линиях. Недавно разработанные 3D-модели PDO, полученные из биопсии опухоли или хирургических резекций опухоли, позволяют улучшить представление клеточной сложности и передачу перекрестных помех в опухолевой ткани, полученной от пациента3. Таким образом, опухолевые органоиды, полученные из рака желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы, были успешно сгенерированы и повторяют генетическое разнообразие и детерминанты ответа на лечение4,5,6. При немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) признаются проблемы развития и становления органоидов, а также оптимизация методов культивирования и селективных медиа-факторов для обеспечения более широкого и систематического использования ПДО НМРЛ в будущем7,8.
Разработка комбинаторной терапии, нацеленной на остаточные опухолевые клетки, которые выдерживают первоначальное медикаментозное лечение, имеет важное значение для ингибирования развития резистентности и, в конечном счете, для улучшения выживаемости пациентов9. Учитывая архитектурную сложность органоидных культур, классические параметры лекарственного ответа должны быть оптимизированы, чтобы обеспечить точное и воспроизводимое тестирование чувствительности к лекарственным средствам. Показания на основе визуализации10,11 и классические анализы жизнеспособности клеток, измеряющие содержание клеточного АТФ6,12, среди других методов, доступны для профилирования реакций на лекарства в культурах PDO. Здесь мы разрабатываем и описываем стандартизированный протокол для оценки чувствительности лекарств к таргетной терапии против известных клинических факторов в моделях НМРЛ PDO.
Эта рукопись разрабатывает и описывает стандартизированный протокол оценки чувствительности к лекарственным средствам в 3D-моделях PDO, полученных из НМРЛ. В дополнение к исследованиям чувствительности к лекарственным средствам необходима дальнейшая характеристика доступных органоидных моделей для определения основных причин различий в чувствительности к лекарственным средствам. Это может включать генетическое профилирование органоидов и образцов пациентов и другие анализы, доступные для органоидов, такие как иммуногистохимическое окрашивание для маркеров дифференцировки и общих клеточных сигнальных биомаркеров и физиологии13,29.
Критические шаги в протоколе
Протокол, описанный в настоящем документе, обеспечивает стандартизированный рабочий процесс, который позволяет проводить точный и воспроизводимый анализ чувствительности к лекарственным средствам при тщательном соблюдении. Особую осторожность следует проявлять на следующих этапах: пищеварение TrypLE и DNAse I во время генерации одноклеточных суспензий, посев одноклеточных суспензий в BME2, мониторинг роста органоидов до лечения, изменения среды, а также нарушение и лизис встроенных органоидов BME2 во время считывания выживаемости клеток на основе люминесценции. (1) В то время как дополнительное переваривание DNAse I после диссоциации органоидов на основе TrypLE не является необходимым для расширения моделей органоидов во время регулярного поддержания культуры, пищеварение DNAse I не следует пропускать при посеве для экспериментов по эскалации лекарств, поскольку оно обеспечивает лучшее разделение кластеров органоидов на одноклеточные суспензии и точный подсчет клеток. (2) Посев одноэлементной суспензии в BME2 представляет собой критический этап с учетом затвердевания BME2 при комнатной температуре. Таким образом, необходимо сразу посеять максимум 1-2 ряда, а образцы поместить на лед перед посевом дополнительных рядов. Следует отметить, что клетки должны быть пипетированы вверх и вниз, когда посев продолжается, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. (3) Рост органоидов необходимо тщательно контролировать в течение 7-дневного расширения от посева до обработки. Пример ожидаемого развития приведен на рисунке 1В и в дополнительной таблице 1. Следует отметить, что оценка изменений в размерах органоидов с помощью микроскопии с ярким полем и анализа изображений, как представлено на рисунке 1B , может позволить точно оценить различия в росте органоидов и удвоении времени. Удвоение времени может повлиять на реакцию на наркотики, как недавно обсуждалось в литературе30. Если скорость роста органоидов значительно превышает представленный пример, можно рассмотреть возможность более короткого времени расширения до начала лечения и более короткой продолжительности лечения. (4) Кроме того, при смене среды следует проявлять особую осторожность, чтобы избежать аспирации органоидов. Посевное положение встроенных органоидов BME2 в положении «6 часов» обеспечивает безопасное аспирирование среды, когда пластины поворачиваются по часовой стрелке на 180°, а среда аспирируется в противоположном положении органоидов. (5) Наконец, тщательный лизис встроенных органоидов BME2 во время считывания выживаемости имеет важное значение для записи точных результатов. В соответствии с инструкциями производителя, образцы должны быть несколько раз пипетированы вверх и вниз, в идеале с использованием нефильтрованных наконечников, чтобы обеспечить надлежащий лизис. Время инкубации должно соблюдаться, как описано. Кроме того, перенос 75% лизата (вместо общего объема) на белую, непрозрачную нижнюю 96-луночную пластину для окончательного считывания с использованием считывателя пластин ИФА позволяет провести соответствующую оценку, поскольку это обеспечивает одинаковый объем в каждой скважине и отсутствие пузырьков воздуха, которые могут быть введены путем энергичного пипетирования.
Следует отметить, что профилирование реакций на лекарственные средства в органоидных культурах, встроенных в BME2, может показать более высокое стандартное отклонение, чем наблюдаемое в обычных культурах клеточных линий (рисунок 2, рисунок 3A). Более высокое стандартное отклонение основано на нескольких факторах, включая повышенную вероятность незначительных изменений в посеве при работе с BME2 и различия в отдельных темпах роста органоидов в скважинах в течение начального 7-дневного периода роста. Таким образом, должно быть посеяно равное или более четырех технических реплик на концентрацию лекарственного средства.
Самое главное, наличие злокачественных клеток, несущих онкогенную мутацию драйвера и ограниченное загрязнение нормальными эпителиальными клетками дыхательных путей, должно быть тщательно оценено. Проблемы в установлении НМРЛ могут способствовать росту нормальных эпителиальных клеток дыхательных путей7. Профилирование номеров копий или подходы на основе ПЦР и секвенирования для подтверждения наличия онкогенных мутаций драйвера являются методами выбора для обеспечения качества органоидных культур НМРЛ.
Модификации и устранение неполадок метода
Среды и соответствующие факторы роста, добавляемые к базовым медиа-решениям, могут значительно влиять на реакцию препарата на целевые ингибиторы. Они активируют байпасные рецепторы и сигнальные пути, которые влияют и ограничивают реакцию на препарат (например, FGF, HGF, EGF)26. В то время как богатая и адаптированная среда с фактором роста может быть оптимальной для расширения органоидной культуры, оценки эскалации и чувствительности к лекарственным средствам должны проводиться в средах с пониженным фактором роста, как описано выше. Это основано на внутреннем опыте сравнения различных составов сред и данных о реакции на лекарства (рисунок 3C). В то время как медиа-растворы могут влиять на степень чувствительности к определенному лекарственному лечению и могут смещать значения IC50 , устойчивые фенотипы чувствительности или резистентности очевидны независимо от состава среды (рисунок 3C, D). Кроме того, рекомендуется общая согласованность в составе среды и профилировании реакций на лекарства в органоидных культурах, и необходимо посеять равную или более четырех технических реплик на концентрацию. Это особенно важно для контрольных диапазонов чувствительности и чувствительности. резистентность к интересующему ингибитору.
Ограничения метода
Протокол, представленный здесь, описывает чувствительность 3D-моделей органоидов рака НМРЛ к целевым ингибиторам при культивировании раковых клеток, полученных от пациента. Дополнительные эксперименты, включая фармакодинамический анализ в отношении ингибирования путей и анализа секвенирования на наличие онкогена драйвера и вторичных мутаций, необходимы для детальной характеристики лекарственной устойчивости и чувствительности. Кроме того, побочные факторы, такие как стимулы микроокружения, полученные в результате взаимодействий или секретируемые нераковыми клетками-сторонними клетками в микроокружении опухоли, не учитываются, и необходимы новые протоколы, когда предпринимаются попытки кокультурных органоидных моделей с иммунными или стромальными клетками. Недавняя работа подчеркнула использование органоидных моделей для рекапитуляции взаимодействий микроокружения опухоли и профилирования ответов на ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как лечение анти-PD-L1113,31.
Значимость метода по отношению к существующим/альтернативным методам
3D раковые органоидные модели рекапитулируют генетическое разнообразие и детерминанты ответа на лечение, присутствующие в исходной опухоли4,5,6. Примечательно, что пространственная и временная гетерогенность может способствовать эволюции опухоли, а параллельное возникновение и последовательное развитие субклонов опухоли может происходить32,33. Внутриопухолевая гетерогенность значительна для отбора более устойчивых опухолевых клеток под терапевтическим давлением9,34,35. Протокол, представленный здесь, позволяет быстро оценить чувствительность к лечению таргетными ингибиторами в образцах, близких к пациенту. Таким образом, органоидные модели имеют преимущества перед более традиционными гомогенными моделями клеточных линий, лишенными генетического разнообразия, или долгосрочными исследованиями с использованием клеточных линий или ксенотрансплантатов, полученных от пациента. Кроме того, настоящий протокол позволяет расширить масштаб до нескольких направлений лечения и комбинированных подходов к лечению с небольшими ограничениями в отношении стоимости и аналитического потенциала. Таким образом, добавление второго лекарственного средства, представляющего интерес, в фиксированной дозе при одновременном увеличении в первую очередь целевого ингибитора и сравнение его с эскалацией только основного целевого ингибитора позволяет эффективно оценивать потенциальные комбинаторные эффекты и с минимальной дополнительной биомассой, требуемой (дополнительный рисунок 3). По сравнению с оценками на основе визуализации, используемыми для мониторинга развития органоидов и реакции на лекарства, анализ выживаемости клеток на основе люминесценции, описанный здесь, имеет аналогичную чувствительность с минимальным оборудованием и требуемой подготовкой.
Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Разработка стандартизированного конвейера, который позволяет устанавливать модели органоидов рака из образцов пациентов и последующее профилирование чувствительности к лекарственным средствам, обладает значительным потенциалом клинической применимости. Фармакологическое профилирование ex vivo получило признание при обнаружении уязвимостей и резистентных признаков в опухолях, коррелирующих с ответом на лечение у пациентов36,37. Примечательно, что профилирование чувствительности к лекарственным средствам ex vivo может помочь в выборе лечения в клинике и разработке рациональных комбинированных методов лечения, направленных на механизмы резистентности. В целом, этот подход может помочь обеспечить улучшенные персонализированные стратегии для молекулярной терапии или комбинаторных схем лечения. Последнее может помочь на раннем этапе нацелиться на механизмы лекарственной толерантности и резистентности и углубить клинический ответ для улучшения результатов лечения пациентов в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим лаборатории Jeroen P Roose (UCSF) и Calvin J Kuo (Стэнфорд) за их вклад в развитие органоидной культуры и протокола. Мы также благодарим Огенекевве М. Гбендио (Лаборатория Руза, UCSF) за протоколы и ввод образцов. Этот исследовательский проект был проведен при поддержке NIH [U54CA224081]. Ф. Хадерк был поддержан постдокторской стипендией Милдред Шеель от Немецкой онкологической помощи.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |