Detta protokoll beskriver en standardiserad utvärdering av läkemedelskänslighet till riktade signaleringshämmare i NSCLC patient-härledda organoid modeller.
Nya 3D cancer organoid kulturer härrör från kliniska patient exemplar representerar ett viktigt modellsystem för att utvärdera intratumor heterogenitet och behandling svar på riktade hämmare i cancer. Banbrytande arbete inom mag- och bukspottkörtelcancer har belyst löftet om patient-härledda organoider (PDU) som ett patientproximat kultursystem, med ett ökande antal modeller som dyker upp. På samma sätt har arbetet i andra cancertyper fokuserat på att etablera organoida modeller och optimera kulturprotokoll. I synnerhet upprätthåller 3D-cancerorganoidmodeller den genetiska komplexiteten hos ursprungliga tumörprover och översätter därmed tumör-härledda sekvenseringsdata till behandling med genetiskt informerade riktade terapier i en experimentell miljö. Vidare kan PDO främja utvärderingen av rationella kombinationsbehandlingar för att övervinna resistens-associerade anpassning av tumörer i framtiden. Det senare fokuserar på intensiva forskningsinsatser inom icke-småcellig lungcancer (NSCLC), eftersom resistensutveckling i slutändan begränsar behandlingsframgången för riktade hämmare. En tidig bedömning av terapeutiskt målbara mekanismer med hjälp av NSCLC PDU kan bidra till att informera rationella kombinationsbehandlingar. Detta manuskript beskriver ett standardiserat protokoll för cell kultur platt-baserade bedömning av läkemedelskänslighet till riktade hämmare i NSCLC-härledda 3D PDO, med potentiell anpassningsförmåga till kombinationsbehandlingar och andra behandlingsmetoder.
Personliga terapier mot onkogena förare har revolutionerat cancerbehandling, förbättrat patientens överlevnad och minskat behandlingsmedierade biverkningar1. De senaste framstegen inom molekylär diagnostik och sekvensering teknik har belyst komplexiteten i mänskliga tumörer, med rumsliga och tidsmässiga heterogenitet påverkar behandling svar2. Rekapitulering av dessa subklonala skillnader i cellodlingsmodeller har länge begränsats till att undersöka utvalda förändringar av intresse för annars enhetliga cellinjer. Nyutvecklade 3D PDO modeller genereras från tumör tarmbiopsier eller kirurgiska tumör samband möjliggör förbättrad representation av cellulära komplexitet och signalering crosstalk inom patienten-härledda tumör vävnad3. Som sådan har tumör organoider härrör från mag-tarm- och bukspottkörtelcancer framgångsrikt genererats och rekapitulera den genetiska mångfalden och bestämningsfaktorerna för behandlingssvar4,5,6. Vid icke-småcellig lungcancer (NSCLC) erkänns organoidutvecklings- och etableringsutmaningar, och optimering av kulturtekniker och selektiva mediefaktorer behövs för att möjliggöra bredare och mer systematisk användning av NSCLC-PTO i framtiden7,8.
Att utveckla kombinatoriska terapier riktade mot kvarvarande tumörceller som tål initial läkemedelsbehandling är avgörande för att hämma resistensutveckling och i slutändan förbättra patientens överlevnad9. Med tanke på den arkitektoniska komplexiteten i organoida kulturer måste parametrar för klassiska läkemedelssvar optimeras för att möjliggöra noggrann och reproducerbar testning av läkemedelskänsligheter. Bildbaserade avläsningar10,11 och klassiska cellviabilitetsanalyser som mäter cellulär ATP-överflöd6,12, bland andra tekniker, finns tillgängliga för att profilera läkemedelssvar i subdokulturer. Här utvecklar och beskriver vi ett standardiserat protokoll för att utvärdera läkemedelskänslighet till riktad terapi mot kända kliniska förare i NSCLC PDO-modeller.
Detta manuskript utvecklar och beskriver ett standardiserat protokoll för bedömning av läkemedelskänslighet i NSCLC-härledda 3D-PDO-modeller. Förutom läkemedelskänslighetsstudier behövs ytterligare karakterisering av tillgängliga organoidmodeller för att bestämma de underliggande orsakerna till skillnader i läkemedelskänslighet. Detta kan inkludera genetisk profilering av organoider och patientprover och annan analys tillgänglig för organoider, såsom immunohistokemi färgning för differentieringsmarkörer och allmänna cellulära signaleringsbiomarkörer och fysiologi13,29.
Kritiska steg i protokollet
Protokollet som beskrivs häri ger ett standardiserat arbetsflöde som möjliggör exakta och reproducerbara läkemedelskänslighetsanalyser när de följs noggrant. Särskild försiktighet bör iakttas i följande steg: TrypLE och DNAse I matsmältning under generering av encelliga suspensioner, sådd av encellsuppskov i BME2, övervakning av organoidtillväxt tills behandling, mediaförändringar och störningar och lys av BME2 inbäddade organoider under luminiscensbaserad cellöverlevnadsavläsning. (1) Medan ytterligare DNAse I-matsmältning efter TrypLE-baserad dissociation av organoider inte är nödvändig för att expandera organoida modeller under regelbundet kulturunderhåll, bör DNAse I-matsmältningen inte utelämnas vid sådd för läkemedelsupptrappningsexperiment eftersom det säkerställer bättre separation av organoidkluster till encellsupphängningar och korrekt cellräkning. (2) Sådd av encellsfjädring i BME2 är ett kritiskt steg med tanke på stelningen av BME2 vid rumstemperatur. Således måste högst 1-2 rader sås på en gång, och prover bör placeras på is innan ytterligare rader sås. Observera att celler måste pipetteras upp och ner när sådd fortsätter för att möjliggöra en homogen cell suspension. (3) Organoidtillväxten måste övervakas noggrant under den 7 dagar långa expansionen från sådd till behandling. Ett exempel på den förväntade utvecklingen ges i figur 1B och tilläggstabell 1. Observera att bedömning av förändringar i organoidstorlek genom brightfieldmikroskopi och bildanalys enligt figur 1B kan möjliggöra en exakt utvärdering av skillnader i organoid tillväxt och fördubblingstider. Fördubblingstider kan påverka läkemedelssvaren, vilket nyligen diskuterades i litteraturen30. Om den organoida tillväxthastigheten överstiger det presenterade exemplet avsevärt, kan en kortare expansionstid tills behandlingsstart och kortare behandlingstid övervägas. (4) Dessutom bör särskild försiktighet iakttas vid byte av media för att undvika att man aspirerar organoider. Såddpositionen för BME2 inbäddade organoider vid 6-tidens läge möjliggör en säker aspiration av media när plattorna vrids medurs med 180° och media aspireras i motsatt position av organoiderna. (5) Slutligen är grundlig lys av BME2 inbäddade organoider under överlevnadsavläsningen avgörande för att registrera exakta resultat. Enligt tillverkarens instruktioner ska proverna pipettas upp och ner upprepade gånger, helst med hjälp av ofiltrerade spetsar, för att säkerställa korrekt lys. Inkubationstider ska följas enligt beskrivningen. Dessutom möjliggör överföring av 75% av lysat (istället för den totala volymen) till en vit, ogenomskinlig botten 96-brunnsplatta för den slutliga avläsningen med hjälp av en ELISA-plattläsare en lämplig bedömning, eftersom detta säkerställer samma volym i varje brunn och frånvaron av luftbubblor som kan införas genom kraftig pipettering.
Observera att profilering av läkemedelssvar i BME2-inbäddade organoidkulturer kan visa en högre standardavvikelse än vad som observerats i vanliga cellinjekulturer (figur 2, figur 3A). Den högre standardavvikelsen baseras på flera faktorer, inklusive en ökad sannolikhet för mindre variationer i sådd vid arbete med BME2 och skillnader i individuella organoidtillväxthastigheter över brunnar under den inledande 7-dagars tillväxtperioden. Således bör lika eller mer än fyra tekniska replikat per läkemedelskoncentration sås.
Viktigast av allt, förekomsten av maligna celler som bär på den onkogena föraren mutationen och begränsad förorening av normala luftvägarna epitelial celler måste noggrant utvärderas. Utmaningar i NSCLC etablering kan gynna utväxten av normala luftvägarna epitelial celler7. Kopieringsnummer profilering eller PCR- och sekvensering-baserade metoder för att bekräfta förekomsten av de onkogena drivrutin mutationer är de metoder som väljs för att säkerställa kvaliteten på NSCLC organoid kulturer.
Ändringar och felsökning av metoden
Media och respektive tillväxtfaktorer som läggs till grundläggande medielösningar kan ha en betydande inverkan på läkemedelssvaret på riktade hämmare. De aktiverar bypassreceptorer och signalvägar som påverkar och begränsar läkemedelsrespons (t.ex. FGF, HGF, EGF)26. Medan en tillväxtfaktor rika och skräddarsydda medier kan vara optimal för att expandera organoid kultur, bör läkemedelsupptrappning och känslighet bedömningar utföras i en minskad tillväxtfaktor media, som beskrivs ovan. Detta baseras på intern erfarenhet av att jämföra olika medieformuleringar och läkemedelssvarsdata (figur 3C). Medan medielösningar kan påverka graden av känslighet för viss läkemedelsbehandling och kan ändra IC50-värden , är robusta fenotyper av känslighet eller resistens uppenbara oberoende av medieformulering (figur 3C, D). Dessutom rekommenderas allmän konsekvens i medieformuleringen och profilering av läkemedelssvar mellan organoidkulturer, och en lika eller mer än fyra tekniska replikat per koncentration måste sås. Detta är särskilt viktigt för benchmark-intervall i känslighet kontra. motstånd för den hämmare av intresse.
Metodens begränsningar
Protokollet som presenteras här beskriver känsligheten hos NSCLC 3D cancer organoid modeller till riktade hämmare när patient-härledda cancerceller odlas. Ytterligare experiment, inklusive farmakodynamisk analys avseende väghämning och sekvenseringsanalys för förekomsten av föraren onkogen och sekundära mutationer, behövs för en detaljerad karakterisering av läkemedelsresistens och känslighet. Vidare redovisas inte åskådare faktorer som mikromiljöstimuli som härrör från interaktioner eller utsöndrade faktorer av icke-cancer åskådarceller i tumörmikromiljön, och nya protokoll behövs när samkulturella organoidmodeller med immun- eller stromalceller försöker. Det senaste arbetet har belyst användningen av organoida modeller för att rekapitulera tumör mikromiljö interaktioner och profil svar på immun kontrollpunktshämmare, såsom anti-PD-L1 behandling13,31.
Metodens betydelse för befintliga/alternativa metoder
3D cancer organoid modeller rekapitulera den genetiska mångfalden och bestämningsfaktorer för behandling svar som finns i den ursprungliga tumör4,5,6. I synnerhet kan rumsliga och tidsmässiga heterogenitet främja tumör evolution, och parallella uppkomsten och sekventiell utveckling av tumör subkloner kan uppstå32,33. Intratumor heterogenitet är betydande för valet av mer motståndskraftiga tumör celler under terapeutiskt tryck9,34,35. Protokollet som tillhandahålls här möjliggör en snabb bedömning av känsligheter för behandling med riktade hämmare i patientproximatprover. Således har organoida modeller fördelar jämfört med mer konventionella homogena cellinjemodeller som saknar genetisk mångfald eller långsiktiga studier med hjälp av cellinjer eller patientbaserade xenografter. Vidare tillåter det nuvarande protokollet skalning upp till flera armar av behandling och kombinationsbehandlingsmetoder med få begränsningar när det gäller kostnad och analytisk kapacitet. Att lägga till ett andra läkemedel av intresse vid en fast dos samtidigt som den primärt riktade inhibitoren trappas upp och jämförs med eskalering av den främst riktade inhibitoren ensam gör det möjligt att effektivt utvärdera de potentiella kombinatoriska effekterna och med minimal ytterligare biomassa som krävs (kompletterande figur 3). Jämfört med bildframställningsbaserade bedömningar som används för att övervaka organoid utveckling och läkemedelssvar, har den luminiscensbaserade cellöverlevnadsanalysen som beskrivs här liknande känslighet med minimal utrustning och utbildning som krävs.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Att utveckla en standardiserad pipeline som gör det möjligt att etablera cancerorganoida modeller från patientprover och den efterföljande läkemedelskänslighetsprofilering har betydande klinisk tillämplighetspotential. Ex vivo farmakologisk profilering har fått erkännande i att upptäcka sårbarheter och resistenta-associerade funktioner i tumörer, korrelerar till behandling svar hos patienter36,37. Ex vivo profilering av läkemedelskänslighet kan bidra till behandlingsval i kliniken och utformningen av rationella kombinationsbehandlingar som behandlar resistensmekanismer. Sammantaget kan detta tillvägagångssätt bidra till att möjliggöra förbättrade personliga strategier för molekylär terapi eller kombinatoriska behandlingsregimer. Det senare kan bidra till att rikta in sig på mekanismer för läkemedelstolerans och resistens tidigt och fördjupa det kliniska svaret för att förbättra patientens resultat i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar laboratorierna i Jeroen P Roose (UCSF) och Calvin J Kuo (Stanford) för deras bidrag när det gäller organoid kultur och protokollutveckling. Vi tackar vidare Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) för protokoll och prov etableringsinmatning. Detta forskningsprojekt genomfördes med stöd av NIH [U54CA224081]. F. Haderk stöddes av Mildred Scheel postdoktoralt stipendium från det tyska cancerbiståndet.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |