Summary
线粒体是关键的代谢细胞器，在骨骼肌中表现出高水平的表型可塑性。从细胞质基质中导入蛋白质是细胞器生物发生的关键途径，对于网状物的扩增和线粒体功能的维持至关重要。 因此，蛋白质进口是细胞健康的晴雨表。
Abstract
线粒体是关键的代谢和调节细胞器，决定能量供应以及细胞的整体健康状况。在骨骼肌中，线粒体存在于一系列复杂的形态中，从小的椭圆形细胞器到广泛的网状网络。 了解线粒体网如何随着各种刺激（如能量需求的变化）而膨胀和发展，长期以来一直是研究的主题。 这种生长或生物发生的一个关键方面是前体蛋白的导入，这些前体蛋白最初由核基因组编码，在细胞质基质中合成，并转移到各种线粒体亚室中。线粒体已经为这种导入过程开发了一种复杂的机制，涉及许多选择性的内膜和外膜通道，称为蛋白质导入机制（PIM）。导入线粒体取决于活膜电位和通过氧化磷酸化获得的细胞器衍生的ATP的可用性。因此，它的测量可以作为细胞器健康的衡量标准。PIM还在骨骼肌中表现出高水平的适应性可塑性，与细胞的能量状态紧密耦合。 例如，运动训练已被证明可以增加导入能力，而肌肉使用可以减少导入能力，这与线粒体含量标志物的变化相吻合。虽然蛋白质导入是线粒体生物发生和扩张的关键步骤，但该过程在骨骼肌中并未得到广泛研究。 因此，本文概述了如何使用骨骼肌中分离和功能齐全的线粒体来测量蛋白质导入能力，以促进对所涉及的方法的更多理解，并了解细胞器更新途径在运动，健康和疾病中的重要性。
Introduction
线粒体是存在于不同细胞类型复杂形态中的细胞器，并且被认为具有对细胞健康至关重要的越来越多的功能。因此，它们不能再仅仅被削减为产生能量的细胞器。线粒体是关键的代谢调节因子，细胞命运的决定因素和信号传导中枢，其功能可以作为整体细胞健康的有用指标。在骨骼肌细胞中，电子显微镜研究揭示了地理上不同的构体下（SS）和肌原纤维间（IMF）线粒体的存在，它们表现出一定程度的连接性1，2，3，4现在被认为是高度动态的，并且能够适应骨骼肌活动水平的变化，以及年龄和疾病。可以通过多种方式评估肌肉中的线粒体含量和功能5，6，并且已经应用了传统的细胞器分离方法来更好地了解线粒体的呼吸和酶促能力（Vmax），这与细胞环境的影响不同7，8。特别是，这些传统方法揭示了从构肌下和肌原纤维间区域分离的线粒体之间的微妙生化差异，掩盖了这些亚细胞区域代谢的可能功能意义8，9，10，11。
线粒体的生物发生是独特的，需要来自核和线粒体DNA的基因产物的贡献。然而，其中绝大多数来自细胞核，因为mtDNA转录仅导致13种蛋白质的合成。由于线粒体通常由参与不同代谢途径的>1000蛋白组成，因此细胞器的生物发生需要严格调节的方式将前体蛋白从细胞质基质导入和组装到各种线粒体亚室中，以维持适当的化学计量学和功能12，13。用于线粒体的核编码蛋白通常携带线粒体靶向序列（MTS），该序列将它们靶向细胞器并促进其亚区室定位。大多数基质结合蛋白含有可切割的N末端MTS，而那些发往线粒体膜外或内侧的蛋白通常具有内部靶向结构域14。导入过程由一组不同的通道进行，这些通道为进入细胞器提供了多种途径13。外膜（TOM）复合物的转座将前体从细胞质基质运送到膜间空间，在那里它们被内膜（TIM）复合物的转座体识别。该复合物负责将核编码的前体导入基质中，其中蛋白酶切割N端靶向预序列。发往外膜的蛋白质可以通过TOM复合物直接插入该膜中，而那些发往内膜的蛋白质则由TIM蛋白插入，特别是TIM22。在导入之后，蛋白质由常驻蛋白酶和伴侣进一步处理，并且通常结合形成更大的复合物，例如在电子传递链中发现的复合物。
线粒体蛋白导入本身也可以作为线粒体健康的测量，因为该过程依赖于膜电位的存在和ATP15形式的能量来源。例如，当膜电位消散时，蛋白激酶PINK1不能被细胞器吸收，这导致磷酸化信号，通过称为线粒体自噬的途径触发细胞器降解的开始16，17。在类似情况下，当导入受阻时，蛋白质ATF5不能进入细胞器，随后易位到细胞核，在那里它作为UPR基因表达上调的转录因子18，19。因此，测量蛋白质导入效率可以提供对细胞器健康状况的全面洞察，而基因表达响应可用于指示向细胞核的逆行信号传导的程度。
尽管它对线粒体的生物发生和一般的细胞健康具有明显的重要性，但哺乳动物线粒体的导入途径研究不足。在本报告中，我们描述了测量前体蛋白导入骨骼肌线粒体所涉及的具体步骤，并提供数据来说明导入系统对肌肉变化和废弃的适应性反应，说明蛋白质导入对骨骼肌适应性可塑性的贡献。
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Protocol
这些实验中使用的所有动物都保存在约克大学的动物护理设施中。这些实验是根据加拿大动物护理委员会指南进行的，并得到了约克大学动物护理委员会的批准（许可证：2017-08）。
1. 从骨骼肌中分离出构肌下和肌原纤维间线粒体的功能分离
- 试剂制备：
- 按照 表1所述准备所有缓冲液和培养基。
- 将缓冲液设置为pH 7.4并储存在4°C（长达2周），除了nagrase蛋白酶。
- 每次准备新鲜的纳加斯蛋白酶（表1）。
- 组织去除和切碎
注： 图1提供了以下分离线粒体的步骤流程图。- 用约20 mL缓冲液1（表1）填充玻璃闪烁小瓶，并将其放在冰上。
- 当小鼠处于麻醉状态时，收获骨骼肌（胫骨前部，股四头肌，腓肠肌等），约500-1000mg，并将肌肉置于含有冷却缓冲液1的闪烁小瓶中。
注意：气态异氟醚在2.5%的流速下用作麻醉剂，流速为0.4 L O2 / min。执行捏合测试以确保动物无反应。 - 组织收集后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。
- 在冰上预冷手表玻璃杯。从肌肉中取出任何脂肪或结缔组织，并在手表玻璃上切碎组织，直到它成为均匀的浆液。
- 将切碎的组织放入预冷的50 mL塑料离心管中（ 见材料表）并记录确切的重量。
- 用缓冲液1 + ATP将切碎的组织稀释10倍（表1）。
- 使用8 mm双刀片均质机（见 材料表）以9.8 Hz的功率输出对肌肉样品进行均质化10秒，确保没有可见的肌肉块残留。
- 使用高速离心机将样品以800× g 离心10分钟（见 材料表）。
注意：此步骤的目的是分离SS和IMF线粒体部分。上层含有SS线粒体，而颗粒含有IMF线粒体。
- SS 线粒体分离
- 将上衣物通过单层干酪布过滤到另一组50 mL塑料离心管中，以去除任何大碎屑或污染物。
- 使用高速离心机在4°C下以9，000× g 离心上超酸盐10分钟。
- 弃去上标并将沉淀重悬于3.5 mL缓冲液1 + ATP中。
注：使用P1000重悬并小心。线粒体是脆弱的细胞器。轻轻进行，避免用移液器吸头接触沉淀。 - 使用高速离心机在4°C下以9，000× g 离心样品10分钟。
- 丢弃上位细胞，除非需要进一步处理以分离没有细胞核、线粒体和其他细胞器的胞质部分。使用P200移液管将沉淀小心地重悬于约95μL重悬培养基（表1）中。
注意：与步骤1.3.3类似，避免用移液器吸头触摸沉淀。重悬培养基的体积可以根据沉淀的大小而改变。这是SS线粒体部分，可以储存在冰上，直到IMF部分被分离出来。如果需要，可以通过在超速离心机中以100，000× g 离心上标（见 材料表）然后丢弃沉淀来分离没有细胞器的胞质部分。
- IMF线粒体分离
- 将步骤1.2.8中的沉淀在缓冲液1 + ATP中稀释10倍。使用特氟龙杵重悬，将沉淀和缓冲液轻轻混合在一起，直到样品一致。
- 使用8 mm双叶片均质机（见 材料表）在9.8 Hz的功率输出下均质样品10 s。
- 使用高速离心机在4°C下以800× g 离心样品10分钟。
- 丢弃上层物质，使用缓冲液2将IMF线粒体颗粒稀释10倍，并使用特氟龙杵轻轻混合至均匀。
- 将25μL / g组织加入10mg / mL nagarse蛋白酶（表1），并将离心管放在冰上，通过左右摇摆管每分钟轻轻混合。
注意：添加纳加塞有助于通过对肌原纤维进行有限的消化来释放IMF线粒体。 - 5分钟后，加入20mL缓冲液2（表1）以稀释nagarses蛋白酶至不活动点并停止消化。
- 立即使用高速离心机在4°C下以5，000× g 离心样品5分钟。
- 丢弃上标并使用缓冲液2将沉淀稀释10倍，然后通过轻轻混合使用特氟龙杵重悬。
- 在4°C下以800× g 离心样品15分钟以沉淀纤维材料。
- 将上沥青倒入一套新的50 mL塑料离心管中，注意不要破坏沉淀，可以丢弃。
- 按照步骤1.4.7，在4°C下以9，000× g 离心样品10分钟。
- 弃去上标，加入3.5mL缓冲液2，并使用P1000移液器轻轻重悬沉淀。
- 按照步骤1.4.7，在4°C下以9，000× g 离心样品10分钟。
- 弃去上层物，使用P200移液管用约180μL重悬培养基轻轻重悬沉淀。
注意：根据沉淀的大小，可以改变重悬培养基的体积。这是IMF线粒体部分，可以储存在冰上，直到用于进口测定。
2. 线粒体蛋白导入
- In vitro 转录
注意：这些后续步骤概述了如何准备放射性标记的蛋白质以供进口。所研究的导入途径可能决定靶蛋白的选择，例如，评估导入线粒体基质，鸟氨酸氨基甲酰转移酶，OCT和苹果酸脱氢酶，MDH，是常用的，而Tom40通常用作导入线粒体外膜的指示。对于以下步骤，需要编码所选蛋白质的质粒DNA。质粒DNA的转录可以在单独的一天在线粒体分离之前完成，并且从该实验中收集的mRNA可以存储并用于未来的翻译和导入实验。- 线性化DNA：将40μL质粒DNA（5μg/ μL），5μL10x酶缓冲液和5μL限制性内切酶混合，并在37°C下孵育30分钟。
注意：所使用的限制性内切酶可能因质粒而异，质粒可能需要不同的酶缓冲液，并且实验条件DNA可以以任何量/体积使用，因为模板可以放大或缩小。 - 使用苯酚和乙醇纯化并沉淀线性化的DNA。在无菌的1.5 mL管中执行所有后续步骤（2.1.3-2.1.15），并使用台式离心机（见 材料表）进行离心步骤。
- 加入适当体积的无菌H2 O，使最终体积等于400μL。然后，加入400μL苯酚。
- 通过倒置剧烈混合约10秒，并在4°C下以17，000× g 离心1分钟。 撤回并保存上阶段。
- 加入400μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1，v：v：v）。
- 通过倒置剧烈混合约10秒，并在4°C下以17，000g离心1分钟。 撤回并保存上阶段。
- 加入400μL氯仿：异戊基醇（24：1，v：v）。
- 通过倒置剧烈混合约10秒，并在4°C下以17，000g离心1分钟。 撤回并保存上阶段。
- 加入40μL3M乙酸钠（pH 7.0），并加入1mL 95%乙醇。
- 将无菌的1.5 mL管置于-80°C冰箱中，侧放15分钟。
- 在4°C下以17，000× g 离心样品10分钟。
- 弃去上标并用300μL80%乙醇洗涤沉淀。
- 在4°C下以17，000× g 离心样品2分钟。
- 丢弃上层物并风干颗粒。一旦颗粒干燥，它应该是透明的。
- 将沉淀重悬于20μL无菌H 2 O中
- 使用分光光度计测量DNA浓度（见 材料表），并确保A260：280 比值高于1.8。
- 将DNA稀释至无菌H2 O中的浓度为0.8μg/ μL。
- 转录DNA：将质粒（0.8μg/ μL，60.8μL），无菌H2O（8.4μL），10mM NTP（5.2μL），10mM ATP（10.0μL），1mM M-7-G（11.6μL），所述混合物2.1.19（15.6μL），RNASin（5.2μL）和适当的RNA聚合酶（4.8μL）混合，形成"一种反应混合物"（总体积= 121.6μL），并在聚合酶的最佳温度下孵育90分钟（T7聚合酶为37°C;40 °C 用于 SP6 聚合酶）
- 为了制备混合物，加入200μL1M HEPES（pH 7.9），100μL1M MgAc2，500μL4M KAc，100μL20mM亚精胺，100μL0.5M DTT和200μL无菌H20。
注意：只要保持所提供的试剂比例，反应就可以按比例放大或缩小体积。所使用的RNA聚合酶由所用质粒内的细菌启动子序列决定。 - 然后，使用苯酚和乙醇纯化并沉淀mRNA，如步骤2.1.2-2.1.15所示。用无菌H2 O（加入280μL）将体积调高至400μL，并按照步骤2.1.2-2.1.15中所述进行。将最终沉淀重悬于20μL无菌H2 O中。
- 使用分光光度计测量mRNA的浓度，确保A260：280 比值~2.0。
- 将mRNA稀释至无菌H2 O中的2.8μg/ μL，并在-20°C下储存在50μL等分试样中。
- 线性化DNA：将40μL质粒DNA（5μg/ μL），5μL10x酶缓冲液和5μL限制性内切酶混合，并在37°C下孵育30分钟。
- 体外 翻译
注意：所需DNA的翻译必须在导入实验的同一天进行。该实验要求使用放射性标记的氨基酸，因此使用者必须持有放射性同位素的使用许可证，并且所有处理和处置必须符合该机构的政策/要求。涉及放射性同位素安全措施的步骤已被省略或简要描述，因为这些步骤可能因机构而异。- 准备足够的翻译反应混合物（表2），以为每个线粒体样品提供约20μL用于导入实验，并包括相同体积的翻译通道。
- 在30°C下孵育反应30分钟（时间可能与mRNA不同，25-60分钟）。
- 根据该机构的放射性安全要求记录 35S-蛋氨酸的使用，并根据该机构的指南处理与放射性同位素接触的任何东西。
- 蛋白质进口
注意：后续步骤需要新鲜分离的线粒体。请参阅线粒体分离方案。只要线粒体是可行的和功能性的，就可以使用其他分离方法。对于后续步骤，将所使用的线粒体样品重悬于如上所述的重悬缓冲液中（表 1).在开始进口测定之前，还必须测量线粒体样品的蛋白质浓度。- 翻译反应开始后约15分钟，将90μg线粒体等分到无菌的1.5mL管中，并在30°C下预孵育约10分钟。
注意：等分比实验中实际使用的线粒体更多;实际使用仅 75 μg。但是，超额等分不是必需的。 - 在一组新的无菌1.5mL管中，将75μg线粒体与18μL翻译反应混合，并在30°C下孵育所需时间。
- 将翻译反应的剩余体积保持在冰上;这将在以后使用。
注意：导入是一个与时间相关的过程，因此从孵育时间从1-60分钟不等的时程实验开始可能是明智的。典型的反应时间为30分钟。 - 在此期间，通过混合1克蔗糖，200μL2.5M KCl，10μL1M MgCl2，100μL1M HEPES（pH 7.4）来制备蔗糖垫，并使用无菌H2O将体积调至5mL。
- 准备一套新的无菌1.5 mL试管，对应于导入反应中的每管。将600μL蔗糖垫等分到每个管中，并保持在冰上，直到进口反应结束。
- 为了在适当的孵育时间后终止进口反应，将试管从30°C取出，将其放在冰上，然后小心地将进口反应转移到带有蔗糖垫的试管顶部。
注意：此步骤需要非常缓慢地完成，以确保线粒体不会受损/破裂。蔗糖垫有助于减缓线粒体的迁移，并在随后的离心步骤中"缓冲"其下降到管的底部。 - 将样品+蔗糖垫在4°C下以17，000× g 离心15分钟。
- 通过组合25 mL的2.4 M山梨糖醇，2 mL的1 M HEPES（pH 7.4）和72mL的双蒸馏H2O来制备破碎缓冲液。
- 准备用于 SDS-PAGE 凝胶电泳的裂解缓冲液：将 50 mL 加热的甘油、11.5 g SDS、31.25 mL 的 1 M Tris （pH 6.8） 混合，并将体积增至 500 mL 和双蒸馏 H2O。
- 对于样品制备，将475μL裂解缓冲液与25μL β巯基乙醇混合，以便在后续步骤中使用。
注：裂解缓冲液可提前制作，常温保存;然而，添加β-巯基乙醇是新鲜的。 - 使用P1000移液器，小心地取出上层物，不要干扰沉淀。将上超物质丢弃在适当的放射性废物容器中。
- 对于导入外膜，使用Tom40进行，将沉淀重悬于50μL新鲜制备的0.1M碳酸钠（pH 11.5）中，并在冰上孵育30分钟。
- 孵育后，将样品在4°C下离心14，000× g5 分钟。 该步骤仅用于外膜导入反应。
- 为了制备用于SDS-PAGE电泳的样品，加入20μL破碎缓冲液，20μL裂解缓冲液和β-巯基乙醇并重悬良好。加入5μL样品染料。
- 通过将步骤2.3.3的剩余翻译反应的3μL与37μL裂解缓冲液和5μL样品染料组合，制备对照/平移泳道。混合均匀。
- 将样品在95°C下煮沸5分钟，然后以低速轻旋转，以避免造粒线粒体。
- 将样品涂敷到SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
注意：凝胶百分比和随后的运行时间将取决于进口的蛋白质。例如，OCT为37 kDa，其成熟的加工带略小;因此，12%的凝胶可以很好地分离这些条带。 - 电泳完成后，取出凝胶并将其置于双蒸馏H2O中。
- 在通风橱中将凝胶在5%TCA中煮沸5分钟，连续搅拌/移动凝胶以避免开裂。
注意：TCA有助于凝固凝胶以进行可视化;这可以在本生燃烧器上的金属托盘中完成。使用足够的TCA来慷慨地覆盖凝胶，〜1/2满。 - 取出凝胶并将其放回双蒸馏的H2 O中，在旋转板上以~50rpm搅拌1分钟。
- 在旋转板上以约50rpm的速度在10mM Tris中洗涤凝胶5分钟，再次使用足以慷慨地覆盖凝胶，〜1/2的容器。
- 通过在旋转板上将凝胶在1M水杨酸中洗涤30分钟来沉淀蛋白质，再次使用足够的水杨酸慷慨地覆盖凝胶，〜1/2正在使用的容器。
- 如步骤2.3.24-2.3.31中所述对凝胶进行脱水。
注意：这可以通过多种方式完成。凝胶干燥机（见 材料表）提供了一种省时的选择（如下所述）;然而，可以使用其他市售方法/试剂盒，这些方法/试剂盒可能更具成本效益，但更耗时。凝胶干燥套件可用作替代方案，不需要加热或抽吸，而是允许凝胶在玻璃纸片之间风干以防止变形。 - 将一大张吸墨纸放在凝胶干燥机的多孔床上。将一张纸巾放在将要涂抹凝胶的区域。
- 切一张15厘米x 20厘米的吸墨纸，放在纸巾上。
- 使用第二张 15 cm x 20 cm 吸墨纸从容器中舀出凝胶，并将其平放在第一块的顶部。
- 切一块稍大的保鲜膜，约20厘米x 25厘米，然后将其放在凝胶上，确保包装下没有折痕或气泡。
注意：这可能需要几次尝试，但必须没有被困的气穴。 - 轻轻地将凝胶干燥机的塑料盖放在包装的顶部，再次确保没有气泡或折痕。
- 打开泵/真空，并确保塑料盖已形成密封。通过抬起塑料盖的一角并等待其重新密封来测试密封。
- 关闭凝胶干燥器并运行90分钟。设定温度从30°C开始，逐渐达到80°C，然后在运行结束时返回到30°C。
- 一旦脱水，凝胶会凝固并感觉像薄纸一样。将凝胶包裹在干燥过程中使用的保鲜膜中。
- 将脱水凝胶置于带有磷膜的胶片盒中（见 材料表），白色面朝向凝胶。曝光时间各不相同，但可以24-48小时，以显示波段。
- 使用任何能够进行磷成像的合适成像仪使用放射自显像进行可视化。
- 翻译反应开始后约15分钟，将90μg线粒体等分到无菌的1.5mL管中，并在30°C下预孵育约10分钟。
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Representative Results
我们已经广泛地说明了该协议是一种有效的测定方法，用于确定导入功能性和完整分离的骨骼肌线粒体的速率。与未经处理的条件相比，将典型的前体蛋白（如苹果酸脱氢酶（MDH））导入基质对膜电位敏感，因为它可以被一种呼吸链解聚剂valinomycin抑制（图2A）。当线粒体内膜和外膜在洗涤剂Triton X-100存在下溶解时，进口也会受到阻碍。导入过程对外部ATP的存在很敏感，外部ATP用于展开前体蛋白以在膜上易位，并且受到呼吸速率和ATP提供严格控制（数据未显示20）。在肌原纤维间和构体下线粒体部分之间也观察到导入的明显差异，部分原因是蛋白质导入机制表达的变化，以及这些线粒体之间的呼吸频率（图2B）
骨骼肌中的线粒体是高度动态的细胞器，很容易对能量需求的变化做出反应。肌肉中的线粒体含量在慢性运动后或对电刺激诱导的收缩活动的反应而增加（参见综述21）。例如，大鼠骨骼肌7天的慢性收缩活性分别使OM和基质的导入增加1.6倍和1.4倍22 （图3A，3B）。线粒体含量的这些变化部分是由线粒体蛋白质导入系统能力的改变引起的。事实上，前体蛋白的进口率与线粒体含量的良好估计之间的密切关系，通过控制或去雾化条件下的复合IV标记细胞色素氧化酶测量，可以说明23 （图3C）。
肌肉导入系统对收缩活动改变的适应性表明，如果发现运动，可以用作解决导入途径缺陷的治疗方法。在使用Bax-Bak双敲除动物研究线粒体介导的细胞凋亡期间，我们注意到这些实验动物肌肉中线粒体含量的降低伴随着前体蛋白导入基质的减少。然后，我们调查了演习可以恢复这种进口能力的可能性。事实上，经过6周的自愿轮跑训练，蛋白质导入恢复到敲除动物的控制水平24，说明了导入途径的适应性可塑性，以挽救线粒体含量和功能（图4）。
图 1：基于先前工作，从骨骼肌中分离 SS 和 IMF 线粒体的工作流程示意图8。 该协议允许根据功能性线粒体在骨骼肌内的地理位置进行分离。SS线粒体更快速，更容易释放，而IMF线粒体需要用蛋白酶进一步消化步骤，以将它们从肌原纤维中解开。请注意，这些子部分的隔离可以同时完成。最近发布了更新的类似程序25。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：蛋白质导入线粒体基质（A）MDH的正常进口率显示在SS和IMF线粒体（泳道4和7）以及前体MDH的翻译产物（泳道1）中。下限代表导入的成熟MDH。加入伐氨霉素可抑制MDH蛋白导入SS和IMF线粒体的基质，因为这种解肼剂会耗散膜电位（泳道2和5）。Triton-X是一种洗涤剂，可溶解内膜，从而抑制MDH导入这些子组分（泳道3和6）。蛋白质导入的时间持续时间增加，4分钟，7分钟，10分钟，15分钟和30分钟。这些数据表明，进口是一个与时间相关的过程，SS和IMF线粒体具有不同的进口率或能力（B）。TL，平移通道;VAL，伐利霉素;TRI， Triton-X;CTL，控制;党卫军，下构象;国际货币基金组织，肌间。这个数字是从Takahashi M& Hood DA20修改而来的。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：蛋白质导入具有适应性，并且与线粒体含量的估计紧密相关。 Sprague Dawley大鼠受到电刺激以诱导收缩活动，这是一种运动训练的模型。（A）与任何给定时间点的对照组相比，长期受刺激动物的TOM40肌肉含量高出1.6倍。（B）在潜伏的每个时间点，进入线粒体基质的OCT输入都增加，总体而言，这导致长期刺激的肌肉的线粒体增加了1.4倍。（C）进口与线粒体含量指数呈正相关，经COX活性评估，r = 0.69。这些测量是从接受去神经支配的动物身上获得的，这已被证明可以降低线粒体含量和输入率。控制，控制;Den， denervated;刺激，刺激;TL，平移通道;* p < 0.05。图3A和3B改编自Joseph A-M& Hood DA22 ，3C改编自Singh B& Hood DA23。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：训练拯救体内导入缺陷。Bax/ Bak双敲除动物的蛋白质输入线粒体基质减少了37%。六周的自愿车轮运行将进口缺陷挽救到控制水平。WT， 野生型;DKO，双淘汰赛;TL，平移通道;* p <基因型主效应为0.05;¶ p < 0.05 训练的主效应。这个数字改编自张勇等人24。请点击此处查看此图的放大版本。
| 缓冲区 1： | 缓冲区 1 + ATP： | 缓冲区 2： | 重悬培养基： | 纳加塞蛋白酶 |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/mL 缓冲液 2 |
| 5 mM 氯化镁4 | 5 mM 氯化镁4 | 5 mM 氯化镁4 | 10 mM MOPS | 注意：新鲜并保持在冰上 |
| 5 mM 乙二胺四乙酸酯 | 5 mM 乙二胺四乙酸酯 | 5 mM EGTA | 0.2% 生物质酸 | |
| 50 mM Tris | 50 mM Tris | 50 mM Tris | ||
| 1 mM ATP | 1米全地形 |
表1：缓冲液和重悬培养基。
| 反应体积的 % | 1 反应混合物 | |
| 网织红细胞裂解物 | 64.10% | 11.8 μL |
| 氨基酸（-蛋氨酸） | 2.20% | 0.4 μL |
| 无菌 H2O | 21.60% | 3.97 μL |
| 36S-蛋氨酸 | 7.20% | 1.33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1.0 μL |
| 总交易量 | 18.5 μL | |
| 注意： | ||
| 1）最后加入 35S-蛋氨酸; | ||
| 2）在冰上缓慢解冻裂解液，并将冷冻/解冻周期限制在两个。建议在抵达时等分裂解液 | ||
| 3）可以通过相应地改变无菌H2O体积来调节mRNA的体积以优化翻译效率。 | ||
表2：翻译反应混合物
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Discussion
线粒体独特地依赖于核基因组和线粒体基因组的表达和协调，以在细胞内合成和扩增。然而，核基因组编码绝大多数（99%）的线粒体蛋白质组，这强调了蛋白质导入机制在支持线粒体生物发生方面的重要性。导入也是一个重要的信号传导事件，因为导入失败会促进未折叠蛋白质反应和/或线粒体自噬的启动15，16，26。由于导入依赖于多个功能通道和伴侣的表达，完整的膜电位以及ATP的可用性，因此线粒体蛋白导入的评估可以为细胞器的健康和能量状态提供有价值的见解。
评估蛋白质导入线粒体的能力需要使用标准差异离心技术从周围组织中分离细胞器。导入的评估方式与评估线粒体酶活性的Vmax相同，其高度受控的方式取决于时间和底物浓度，并且独立于细胞胞质的影响。这里介绍的分离方法或其类似再现已使用多年，以评估线粒体呼吸和酶活性8，9，10，11。这种技术并非没有局限性，因为它破坏了线粒体的正常形态，因为它们存在于原位27中，而线粒体在骨骼肌中高度复杂，从小的球状结构到高度分支的网状网络3，这取决于它们在肌肉细胞内的构瘤下或肌原纤维间位置。此外，蛋白酶nagarese的使用也受到严格审查3，28。最近发表了这种方法的更新，使用胰蛋白酶代替nagarses，并且胰蛋白酶已被其他人用于分离肌肉线粒体29。事实上，可以使用任何产生功能完整线粒体的替代分离方法，包括不使用蛋白酶30或设计用于来自人体肌肉的小型活检大小样本的技术31。这里介绍的方法具有快速，轻松地分离SS线粒体的优点，但是通过分离IMF子组分可以获得更高的线粒体产量和纯度。如果仔细进行，该分离方案可产生功能完整的细胞器，具有高呼吸控制比，表明状态3和4呼吸的适当速率8。
对于线粒体蛋白质导入的测量，这些细胞器保持其膜电位也是必不可少的，因为穿过内膜的导入取决于这种电泳质子动力，其用于吸引带正电的前体序列并帮助介导前体向带负电荷的基质空间的运输。在这种情况下，可以评估生理相关实验情况（例如运动，衰老和肌肉废弃）之间的线粒体功能和导入的比较。在这方面，先前的研究表明，导入是一种高度适应性的途径，对肌肉使用和废弃状态的改变做出反应，并且对通过过量ROS排放的抑制敏感10，22，23，32。这种可塑性部分是由于蛋白质导入机械组分表达的适应性变化。由于该技术依赖于线粒体的分离，因此从实验的解释中删除了可能源于胞质因子或细胞器间串扰的对导入途径的任何调节。这既是该技术的局限性，也是该技术的优势，因为可以对导入途径本身的能力（类似于酶活性的Vmax ）得出结论，但是实验模型可能发生的瞬态或外部信号可能会丢失。为了规避这种情况，可以像以前一样，用如上所述分离的胞质级分样品孵育进口反应，以评估可能影响进口率的胞质环境的变化22。此外，进口机械部件会受到急性的翻译后修改，这可能会改变其功能。最近的研究表明，特异性TOM输入受体的磷酸化可能与线粒体自噬有关33。事实上，值得更多关注的一个研究领域是通过ROS介导的内在信号通路或通过对进口受体和伴侣的共价修饰来急性调节进口过程，如酵母和其他低级生物体所记录的那样34，35。
蛋白质导入线粒体是适应性细胞器生长的门户，是线粒体健康的敏感指标。了解该过程是如何调节的，可以阐明线粒体生物发生的调节，UPR信号传导和线粒体自噬的开始。线粒体蛋白导入在哺乳动物实验模型中并不是一个广泛研究的过程，该领域研究的巨大潜力的发展可以帮助我们更好地了解线粒体功能障碍明显或代表促进线粒体健康的有吸引力的治疗靶点的疾病。
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Disclosures
作者未声明任何利益冲突，无论是财务上的还是其他方面的。
Acknowledgments
作者要感谢麦吉尔大学的G.C. Shore博士，华盛顿医学院的A. Strauss博士和拉筹伯大学的.M.T. Ryan博士最初捐赠了用于这项研究的表达质粒。这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）对D. A. Hood的资助。D. A. Hood也是加拿大细胞生理学研究主席的持有人。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O.
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
