Summary
Mitokondrier är viktiga metaboliska organeller som uppvisar en hög nivå av fenotypisk plasticitet i skelettmuskulaturen. Importen av proteiner från cytosolen är en kritisk väg för organelle biogenesis, avgörande för expansionen av retikulum och upprätthållandet av mitokondriell funktion. Därför fungerar proteinimport som en barometer för cellulär hälsa.
Abstract
Mitokondrier är viktiga metaboliska och regulatoriska organeller som bestämmer energiförsörjning samt cellens allmänna hälsa. I skelettmuskulaturen finns mitokondrier i en serie komplexa morfologier, allt från små ovala organeller till ett brett, reticulumliknande nätverk. Att förstå hur mitokondriellt retikulum expanderar och utvecklas som svar på olika stimuli som förändringar i energiefterfrågan har länge varit ett forskningsämne. En viktig aspekt av denna tillväxt, eller biogenes, är importen av prekursorproteiner, ursprungligen kodade av det nukleära genomet, syntetiserat i cytosolen och omlokaliserat till olika mitokondriella delfack. Mitokondrier har utvecklat en sofistikerad mekanism för denna importprocess, som involverar många selektiva inre och yttre membrankanaler, så kallade proteinimportmaskineriet (PIM). Import till mitokondrion är beroende av livskraftig membranpotential och tillgången på organell-härledd ATP genom oxidativ fosforylering. Därför kan dess mätning fungera som ett mått på organellhälsa. PIM uppvisar också en hög nivå av adaptiv plasticitet i skelettmuskulaturen som är tätt kopplad till cellens energistatus. Till exempel har träning visat sig öka importkapaciteten, medan muskelavanvändning minskar den, sammanfaller med förändringar i markörer för mitokondriellt innehåll. Även om proteinimport är ett kritiskt steg i biogenes och expansion av mitokondrier, studeras processen inte allmänt i skelettmuskulaturen. Således beskriver detta dokument hur man använder isolerade och fullt fungerande mitokondrier från skelettmuskulaturen för att mäta proteinimportkapacitet för att främja en större förståelse för de metoder som är inblandade och en uppskattning av vikten av vägen för organell omsättning i motion, hälsa och sjukdom.
Introduction
Mitokondrier är organeller som finns i komplexa morfologier i olika celltyper och är erkända för att ha ett ökande utbud av funktioner som är kritiska för cellulär hälsa. Som sådan kan de inte längre täljas ner bara till energiproducerande organeller. Mitokondrier är viktiga metaboliska regulatorer, bestämningsfaktorer för cellens öde och signalnav, vars funktioner kan fungera som användbara indikatorer på övergripande cellulär hälsa. I skelettmuskulaturceller visar elektronmikroskopistudier förekomsten av geografiskt distinkt subsarkolemmal (SS) och intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som uppvisar en grad av anslutning1,2,3,4 som nu är erkänd för att vara mycket dynamisk och anpassningsbar till förändringar i skelettmuskulaturaktivitetsnivåer, liksom med ålder och sjukdom. Mitokondriellt innehåll och funktion i muskler kan bedömas på många sätt5,6, och traditionella metoder för organell isolering har tillämpats för att bättre förstå andningsorganen och enzymatiska kapaciteter (Vmax) av mitokondrier skiljer sig från påverkan av cellulära miljön7,8. I synnerhet har dessa traditionella metoder avslöjat subtila biokemiska skillnader mellan mitokondrier isolerade från subsarkolemmala och intermyofibrillar regioner, belysning möjliga funktionella konsekvenser för metabolism i dessa subcellulära regioner8,9,10,11.
Mitokondriernas biogenes är unik för att kräva bidrag från genprodukter från både nukleärt och mitokondriellt DNA. De allra flesta av dessa härrör dock från kärnan eftersom mtDNA-transkription endast leder till syntesen av 13 proteiner. Eftersom mitokondrier normalt består av >1000 proteiner som är involverade i olika metaboliska vägar, kräver biogenes av organellen ett tätt reglerat import- och monteringsmedel för prekursorproteiner från cytosolen i de olika mitokondriella delfacken för att upprätthålla korrekt stökiometri och funktion12,13. Kärnkodade proteiner avsedda för mitokondrier bär normalt en mitokondriell målsekvens (MTS) som riktar dem mot organellen och underlättar deras sub-compartmental lokalisering. De flesta matrisbundna proteiner innehåller en klyvbar N-terminal MTS, medan de som är avsedda för det yttre eller inre mitokondriella membranet vanligtvis har interna måldomäner14. Importprocessen utförs av en uppsättning olika kanaler som ger flera vägar för inträde i organelle13. Translocasen av det yttre membranet (TOM) komplex shuttles prekursorer från cytosolen in i intermembrane utrymme, där de känns igen av translocase av det inre membranet (TIM) komplex. Detta komplex är ansvarigt för import av kärnkodade prekursorer till matrisen, där proteaser klyver N-terminalen som riktar sig till presequence. Proteiner avsedda för det yttre membranet kan sättas in direkt i detta membran genom TOM-komplexet, medan de som är avsedda för det inre membranet sätts in av ett TIM-protein, särskilt TIM22. Efter deras import bearbetas proteiner vidare av bosatta proteaser och förkläden och kombineras ofta för att bilda större komplex, såsom de som finns i elektrontransportkedjan.
Mitokondriell proteinimport i sig fungerar också som ett mått på mitokondriell hälsa, eftersom denna process förlitar sig på närvaron av membranpotential och en energikälla i form av ATP15. Till exempel, när membranpotentialen försvinner, kan proteinkinas PINK1 inte tas upp av organellen, vilket leder till fosforyleringssignaler som utlöser uppkomsten av nedbrytningen av organellen genom en väg som kallas mitophagy16,17. Under liknande omständigheter, när importen hindras, kan proteinet ATF5 inte komma in i organellen, och det omplacerar därefter till kärnan, där det fungerar som en transkriptionsfaktor för uppreglering av UPR-genuttryck18,19. Således kan mätning av proteinimport effektivitet ge omfattande inblick i organellens hälsa, medan genuttryckssvaret kan användas för att indikera graden av bakåtsträvande signalering till kärnan.
Trots dess uppenbara betydelse för biogenes av mitokondrier och för cellulär hälsa i allmänhet, importvägen i däggdjur mitokondrier är anmärkningsvärt understudied. I denna rapport beskriver vi de specifika stegen i mätningen av prekursorproteiner till skelettmuskulatur mitokondrier och tillhandahåller data för att illustrera importsystemets adaptiva svar på förändringar i muskler och oanvända, vilket illustrerar proteinimportens bidrag till skelettmuskulaturens adaptiva plasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som används i dessa experiment underhålls i djurvårdsanläggningen vid York University. Försöken utförs i enlighet med Canadian Council on Animal Cares riktlinjer med godkännande från York University Animal Care Committee (Tillstånd: 2017-08).
1. Funktionell isolering av subsarkolemmal och intermyofibrillär mitokondrier från skelettmuskulaturen
- Reagensberedning:
- Förbered alla buffertar och media enligt tabell 1.
- Ställ in buffertarna på pH 7.4 och förvara vid 4 °C (upp till 2 veckor), utom nagrase proteas.
- Förbered färsk nagarse proteas (tabell 1) varje gång.
- Vävnadsborttagning och malning
OBS: Ett flödesschema av stegen nedan för isolering av mitokondrier finns i figur 1.- Fyll en glasscintillationsflaska med ~20 ml buffert 1 (tabell 1) och placera den på is.
- Medan musen är under bedövningsmedel, skörda skelettmuskler (tibialis främre, quadriceps, gastrocnemius etc.), cirka 500-1000 mg, och placera musklerna i scintillation injektionsflaskan som innehåller kyld buffert 1.
OBS: Gasformig isofluran används som bedövningsmedel vid 2,5% vid en flödeshastighet på 0,4 L O2/min. Ett nyptest utförs för att säkerställa att djuret inte reagerar. - Efter vävnadssamling avliva djuret via livmoderhalscancer förskjutning.
- Förkyla ett klockglas på is. Ta bort fett eller bindväv från musklerna och färsa vävnaden på klockglaset tills det är en homogen slam.
- Placera den malda vävnaden i ett förkylt 50 ml centrifugeringsrör av plast (se Materialtabell) och registrera den exakta vikten.
- Späd ut den malda vävnaden 10 gånger med buffert 1 + ATP (tabell 1).
- Homogenisera muskelprovet med en 8 mm tvåbladig homogenisator (se Materialtabell) vid en uteffekt på 9,8 Hz i 10 s, vilket säkerställer att inga synliga muskelbitar finns kvar.
- Centrifugera proverna vid 800 x g i 10 minuter med hjälp av en höghastighetscentrifug (se Materialtabell).
OBS: Syftet med detta steg är att separera SS och IMF mitokondriella fraktioner. Supernaten innehåller SS mitokondrier, medan pelleten innehåller IMF mitokondrier.
- SS mitokondriell isolering
- Filtrera supernaten genom ett enda lager ostduk i en annan uppsättning av 50 ml plastcentrifugeringsrör för att avlägsna stora skräp eller föroreningar.
- Centrifugera supernaten vid 9 000 x g i 10 min vid 4 °C med en höghastighetscentrifuger.
- Kassera supernaten och återanvänd pelleten i 3,5 ml buffert 1 + ATP.
OBS: Återanvänd med en P1000 och gör detta noggrant. Mitokondrier är ömtåliga organeller. Utför försiktigt och undvik att vidröra pelleten med pipettspetsen. - Centrifugera provet vid 9 000 x g i 10 min vid 4 °C med hjälp av en höghastighetscentrifuger.
- Kassera supernaten om inte ytterligare bearbetning för att isolera en cytosolisk fraktion utan atomkärnor, mitokondrier och andra organeller önskas. Återanvänd pelleten försiktigt i ungefär 95 μL av resuspensionmediet (tabell 1) med hjälp av en P200-pipett.
OBS: I likhet med steg 1.3.3, undvik att röra vid pelleten med pipettens spets. Volymen på resuspensionmediet kan ändras beroende på pelletens storlek. Detta är SS mitokondriella fraktion, som kan lagras på is tills IMF-fraktionen är isolerad. Om så önskas kan den cytosolliska fraktionen, utan organeller, isoleras genom att centrifugera supernaten vid 100 000 x g i en ultracentrifuge (se Materialtabell) och därefter kassera pelleten.
- IMF:s mitokondriella isolering
- Späd pelleten från steg 1.2.8 med 10-faldig i buffert 1 + ATP. Återanvänds med hjälp av en Teflon-mortel genom att försiktigt blanda pelleten och buffra ihop tills provet är konsekvent.
- Homogenisera provet med en 8 mm tvåbladig homogenisator (se Materialtabell) vid en uteffekt på 9,8 Hz i 10 s.
- Centrifugera provet vid 800 x g i 10 min vid 4 °C med en höghastighetscentrifuger.
- Kassera supernaten och späd ut IMF:s mitokondriella pellet 10 gånger med buffert 2 och återanvänd den med teflonplågan genom att försiktigt blanda tills den är homogen.
- Tillsätt 25 μL/g vävnad till 10 mg/ml nagarseproteas (tabell 1) och placera centrifugeringsröret på sidan på is, blanda försiktigt varje minut genom att gunga röret från sida till sida.
OBS: Tillägget av nagarse hjälper till att befria IMF mitokondrier genom att utföra begränsad matsmältning av myofibrils. - Efter 5 min, tillsätt 20 ml buffert 2 (tabell 1) för att späda nagarse proteas till inaktivitetspunkten och stoppa matsmältningen.
- Centrifugera omedelbart provet vid 5 000 x g i 5 min vid 4 °C med en höghastighetscentrifuger.
- Kassera supernaten och späd pelleten 10 gånger med buffert 2 och återanvänd den med en Teflon-mortel genom att försiktigt blanda.
- Centrifugera provet vid 800 x g i 15 minuter vid 4 °C för att pelletera det fibrösa materialet.
- Häll supernaten i en ny uppsättning av 50 ml plastcentrifugerrör, var noga med att inte störa pelleten, som kan kasseras.
- Centrifugera provet vid 9 000 x g i 10 minuter vid 4 °C enligt steg 1.4.7.
- Kassera supernaten, tillsätt 3,5 ml buffert 2 och återanvänd försiktigt pelleten med en P1000-pipett.
- Centrifugera provet vid 9 000 x g i 10 minuter vid 4 °C enligt steg 1.4.7.
- Kassera supernaten och återanvänd pelleten försiktigt med ungefär 180 μL resuspensionmedium med hjälp av en P200-pipett.
OBS: Volymen på resuspensionmediet kan ändras beroende på pelletens storlek. Detta är IMF:s mitokondriella fraktion, som kan lagras på is tills den ska användas i importanalysen.
2. Import av mitokondriellt protein
- In vitro transkription
OBS: Dessa efterföljande steg beskriver hur man förbereder ett radiomärkt protein för import. Den importväg som undersöks kan diktera valet av målprotein, till exempel för att utvärdera import till mitokondriell matris, ornitinkaramyltransteas, OCT och malate dehydrogenas, MDH, används ofta, medan Tom40 ofta används som en indikation på import till det yttre mitokondriella membranet. För följande steg krävs plasmid DNA-kodning av det protein som valts. Transkription av plasmid-DNA kan göras före mitokondriell isolering på en separat dag, och mRNA som samlas in från detta experiment kan lagras och användas i framtida översättnings- och importexperiment.- Linjärisera DNA: Kombinera 40 μL plasmid-DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffert och 5 μL restriktionsenzym och inkubera vid 37 °C i 30 min.
OBS: De restriktionsenzymer som används kan variera beroende på plasmiden, vilket kan kräva en annan enzymbuffert, och experimentella tillstånd DNA kan användas i vilken mängd/volym som helst, eftersom mallen kan skalas upp eller ner. - Rena och fäll ut det linjäriserade DNA med fenol och etanol. Utför alla efterföljande steg (2.1.3-2.1.15) i sterila 1,5 ml-rör och använd en bordscentrifug (se Materialtabell) för centrifugeringsstegen.
- Tillsätt lämplig volym steril H2O så att den slutliga volymen är lika med 400 μL. Tillsätt sedan 400 μL fenol.
- Blanda kraftigt genom inversion i ~10 s och centrifugera vid 17 000 x g i 1 min vid 4 °C. Dra tillbaka och spara den övre fasen.
- Tillsätt 400 μL fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1, v:v:v).
- Blanda kraftigt genom inversion i ~10 s och centrifugera vid 17 000 g i 1 min vid 4 °C. Dra tillbaka och spara den övre fasen.
- Tillsätt 400 μL kloroform:isoamylalkohol (24:1, v:v).
- Blanda kraftigt genom inversion i ~10 s och centrifugera vid 17 000 g i 1 min vid 4 °C. Dra tillbaka och spara den övre fasen.
- Tillsätt 40 μL 3M natriumacetat (pH 7,0) och tillsätt 1 ml 95% etanol.
- Placera sterila 1,5 ml rör i -80 °C frys på sidan i 15 min.
- Centrifugera proverna vid 17 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Kassera supernaten och tvätta pelleten med 300 μL 80% etanol.
- Centrifugera proverna vid 17 000 x g i 2 min vid 4 °C.
- Kassera supernaten och lufttorka pelleten. När pelleten är torr bör den vara klar.
- Återanvänd pelleten i 20 μL steril H2O
- Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer (se Materialtabell) och se till att A260:280-förhållandet ligger över 1,8.
- Späd UT DNA till en koncentration av 0,8 μg/μL i steril H2O.
- Transkribera DNA: Kombinera plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steril H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP ( 10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), blandningen som nämnts steg 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) och ett lämpligt RNA-polymeras (4.8 μL) för att bilda "en reaktionsblandning" (total volym = 121,6 μL) och inkubera i 90 min vid optimal temperatur för polymerasetet (37 °C för T7-polymeras; 40 °C för SP6 polymeras)
- För att bereda blandningen tillsätt 200 μL 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL av 1 M MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM spermidin, 100 μL av 0,5 M DTT och 200 μL steril H20.
OBS: Reaktionen kan skalas upp eller ner i volym så länge de angivna proportionerna av reagenser bibehålls. Det RNA-polymeras som används dikteras av den bakteriepromotorsekvens inom den plasmid som används. - Reiga och fäll sedan ut mRNA med fenol och etanol som i steg 2.1.2-2.1.15. För upp volymen till 400 μL med steril H2O (tillsätt 280 μL) och fortsätt enligt beskrivningen i steg 2.1.2-2.1.15. Återanvänd den sista pelleten i 20 μL steril H2O.
- Mät koncentrationen av mRNA med hjälp av en spektrofotometer, se till att A260:280-förhållandet är ~2,0.
- Späd mRNA till 2,8 μg/μL i steril H2O och förvara vid -20 °C i 50 μL alikvoter.
- Linjärisera DNA: Kombinera 40 μL plasmid-DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffert och 5 μL restriktionsenzym och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Översättning in vitro
OBS: Översättningen av önskat DNA måste utföras samma dag som importexperimentet. Detta experiment kräver användning av radiomärkta aminosyror, och därför måste användaren ha tillstånd för användning av radioisotoper, och all hantering och bortskaffande måste ske i enlighet med institutionens policyer/krav. Åtgärder som inbegriper radioisotope säkerhetsåtgärder har utelämnats eller beskrivits kortfattat, eftersom dessa sannolikt kommer att skilja sig åt beroende på institutionen.- Förbered tillräckligt med översättningsreaktionsblandning (tabell 2) för att leverera ~20 μL per prov av mitokondrier som ska användas i importexperimentet och inkludera samma volym för ett översättningsfält.
- Inkubera reaktionen i 30 min vid 30 °C (tiden kan variera med mRNA, 25-60 min).
- Registrera användningen av 35S-metropin enligt institutionens radioaktiva säkerhetskrav och kassera allt som har kommit i kontakt med radioisotopen enligt institutionens riktlinjer.
- Proteinimport
OBS: Nyisolerade mitokondrier krävs för nästa steg. Se mitokondriell isoleringsprotokoll. Andra isoleringsmetoder kan användas så länge mitokondrierna är livskraftiga och funktionella. För de följande stegen återanvänds de mitokondriella prover som används i en resuspensionbuffert enligt beskrivningen ovan (Tabell 1). Proteinkoncentrationen i mitokondriellt prov måste också mätas innan importanalysen påbörjas.- Ungefär 15 min efter att översättningsreaktionen inleddes, alikvot 90 μg mitokondrier i sterila 1,5 ml-rör och förinkuberas vid 30 °C i ~10 min.
OBS: Aliquot mer mitokondrier än vad som faktiskt kommer att användas i experimentet; Endast 75 μg kommer att användas. Att övervärdering inte är ett krav. - Kombinera 75 μg mitokondrier med 18 μL av översättningsreaktionen i en ny uppsättning sterila 1,5 ml rör och inkubera vid 30 °C under önskad tid.
- Behåll den återstående volymen av översättningsreaktionen på is; detta kommer att användas senare.
OBS: Import är en tidsberoende process, så det kan vara klokt att börja med ett tidskursexperiment som sträcker sig i inkubationstider från 1-60 min. En typisk reaktionstid är 30 min. - Förbered sackaroskudden under denna tid genom att kombinera 1 g sackaros, 200 μL på 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL 1 M HEPES (pH 7,4) och få volymen till 5 ml med steril H2O.
- Förbered en ny uppsättning sterila 1,5 ml rör som motsvarar varje rör i importreaktionen. Alikvot 600 μL sackaroskudden i varje rör och förvaras på is tills importreaktionen är över.
- För att avsluta importreaktionen efter lämplig inkubationstid, ta bort röret från 30 °C, placera det på is och överför sedan försiktigt importreaktionen ovanpå röret med sackaroskudden.
OBS: Detta steg måste göras mycket långsamt för att säkerställa att mitokondrierna inte skadas/brister. Sackaroskudden hjälper till att bromsa mitokondriernas migrering och "dämpar" nedstigningen till botten av röret under det efterföljande centrifugeringssteget. - Centrifugera proverna + sackaroskudden vid 17 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Förbered brytande buffert genom att kombinera 25 ml 2,4 M sorbitol, 2 ml 1 M HEPES (pH 7,4) och 72 ml dubbeldestillerad H2O.
- Förbered lysbuffert för SDS-PAGE gelelektrofores: Kombinera 50 ml uppvärmd glycerol, 11,5 g SDS, 31,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) och få volymen till 500 ml med dubbeldestillerad H2O.
- För provberedning, blanda 475 μL lysbuffert med 25 μL β-mercaptoethanol som ska användas i ett senare steg.
OBS: Lysis buffert kan göras i förväg och lagras i rumstemperatur; Tillsats av β-mercaptoethanol ska dock göras färskt. - Använd en P1000-pipett och ta försiktigt bort supernaten och stör inte pelleten. Kassera supernaten i en lämplig behållare för radioaktivt avfall.
- För import till det yttre membranet, utför detta med Tom40, återanvänd pelleten i 50 μL nyberedd 0,1 M natriumkarbonat (pH 11,5) och inkubera på is i 30 min.
- Centrifugera provet 14 000 x g i 5 minuter vid 4 °C efter inkubationen. Detta steg görs endast för yttre membranimportreaktioner.
- För att förbereda proverna för SDS-PAGE elektrofores, tillsätt 20 μL brytande buffert, 20 μL lysbuffert och β-mercaptoethanol och resuspend väl. Tillsätt 5 μL provfärg.
- Förbered kontroll-/översättningsbanan genom att kombinera 3 μL av den återstående översättningsreaktionen från steg 2.3.3 med 37 μL lysbuffert och 5 μL provfärg. Blanda väl.
- Koka proverna i 5 min vid 95 °C och snurra försiktigt ner med låg hastighet för att undvika pelletering av mitokondrier.
- Applicera proverna på en SDS polyakrylamidgel.
OBS: Gelprocenten och efterföljande körtid beror på vilket protein som importeras. Oct är till exempel 37 kDa, och dess mogna bearbetade band är något mindre; Därför möjliggör en 12% gel god separation av dessa band. - När elektroforesen är klar, ta bort gelén och placera den i dubbeldestillerad H2O.
- Koka gelén i 5% TCA i en rökhuv i 5 min, rör kontinuerligt om/flytta gelén för att undvika sprickbildning.
OBS: TCA hjälper till att stelna gelén för visualisering; Detta kan göras i en metallbricka över en Bunsenbrännare. Använd tillräckligt med TCA för att generöst täcka gelén, ~1/2 full. - Ta bort gelén och placera den i dubbeldestillerad H2O.
- Tvätta gelén i 10 mM Tris på en roterande platta i 5 min vid ~50 rpm, återigen med tillräckligt för att generöst täcka gelén, ~1/2 av behållaren.
- Fäll ut proteinet genom att tvätta gelén i 1 M Salicyclic syra på en roterande platta i 30 min, återigen med tillräckligt med Salicyclic syra för att generöst täcka gelén, ~ 1/2 av behållaren som används.
- Dehydrera gelén enligt beskrivningen i steg 2.3.24-2.3.31.
OBS: Detta kan göras på ett antal sätt. En geltork (se Materialtabell) ger ett tidseffektivt alternativ (beskrivs nedan); Andra kommersiellt tillgängliga metoder/kit kan dock användas som kan vara mer kostnadseffektiva men mer tidskrävande. Geltorkningssatser kan användas som ett alternativ som inte kräver applicering av värme eller sug utan istället tillåter gelén att lufttorka mellan cellofanplåtar för att förhindra distorsion. - Placera ett stort ark blottingpapper på geltorkens porösa säng. Placera ett pappershandduksark i det område där gelén ska appliceras.
- Skär en 15 cm x 20 cm bit blottingpapper och lägg den på pappershandduken.
- Skopa ut gelén från behållaren med en andra bit av 15 cm x 20 cm blottingpapper och lägg den platt ovanpå den första biten.
- Skär en något större bit plastfolie, ~ 20 cm x 25 cm, och placera den på gel, vilket säkerställer inga veck eller bubblor under omslaget.
OBS: Detta kan ta några försök, men det är absolut nödvändigt att det inte finns några fångade luftfickor. - Lägg försiktigt ner geltorkens plasthölje ovanpå wrapen, återigen för att säkerställa att det inte finns några bubblor eller veck.
- Sätt på pumpen/vakuumet och se till att plasthöljet har bildat en tätning. Testa tätningen genom att lyfta ett hörn av plasthöljet och vänta tills det förseglas igen.
- Stäng geltorken och kör i 90 minuter. Ställ in temperaturen på 30 °C, nå gradvis 80 °C och återgå sedan till 30 °C i slutet av körningen.
- När gelén är uttorkad stelnar den och känns papperstunn. Linda gelén i plastfolien som används i torkningsprocessen.
- Placera den uttorkade gelen i en filmkassett med en fosforfilm (se Materialtabellen), med den vita sidan vänd mot gelén. Exponeringstiderna varierar men kan vara 24-48 timmar för visualisering av band.
- Visualisera med hjälp av autoradiografi med hjälp av en lämplig bildspelare som kan avbilda fosfor.
- Ungefär 15 min efter att översättningsreaktionen inleddes, alikvot 90 μg mitokondrier i sterila 1,5 ml-rör och förinkuberas vid 30 °C i ~10 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har utförligt illustrerat att detta protokoll är en giltig analys för att bestämma importhastigheten till funktionella och intakta isolerade skelettmuskulatur mitokondrier. I jämförelse med obehandlade förhållanden är importen av typiska prekursorproteiner som malatedehydrogenas (MDH) till matrisen känslig för membranpotential eftersom den kan hämmas av valinomycin, en andningskedja som inte motsvarar systemet (figur 2A). Importen hindras också när mitokondriella inre och yttre membran solubiliseras i närvaro av tvättmedlet Triton X-100. Importprocessen är känslig för förekomsten av extern ATP, som tjänar till att utveckla prekursorproteiner för flyttning över membranen, och kontrolleras noggrant av andningshastigheten och ATP-tillhandahållandet (data visas inte20). Distinkta skillnader i importen observeras också mellan intermyofibrillära och subsarkolemmala mitokondriella fraktioner, delvis på grund av variationer i uttryck för proteinimportmaskiner, liksom andningsfrekvensen mellan dessa mitokondrier (figur 2B).
Mitokondrier i skelettmuskulaturen är mycket dynamiska organeller som svarar lätt på förändringar i energibehovet. Mitokondriellt innehåll i muskeln ökar efter perioder av kronisk träning eller som svar på elektrisk stimuleringsinducerad kontraktil aktivitet (se för granskning21). Till exempel ökar 7 dagars kronisk kontraktil aktivitet hos råttskeletala muskler importen till OM och matrisen med 1,6 gånger respektive 1,4 gånger22(figur 3A, 3B). Dessa förändringar i mitokondriellt innehåll orsakas delvis av förändringar i mitokondriellt proteinimportsystem. Ett nära samband mellan importhastigheten av prekursorproteiner och en god uppskattning av mitokondriellt innehåll, mätt med den komplexa IV-markörcykroma oxideasen under kontroll eller denervated villkor, kan illustreras23 (figur 3C).
Importsystemets anpassningsförmåga i muskeln till förändringar i kontraktil aktivitet tyder på att motion skulle kunna användas som en behandling för att lösa defekter i importvägen om det identifieras. Under undersökningen av mitokondriellt medierad apoptos med Bax-Bak dubbel knockout djur, märkte vi att det minskade mitokondriellt innehållet i musklerna hos dessa experimentella djur åtföljdes av en minskning av importen av prekursorproteiner i matrisen. Vi undersökte sedan möjligheten att övningen kunde återställa denna importkapacitet. Efter sex veckors frivillig utbildning i hjulkörning återställdes proteinimporten till kontrollnivåerna hos utslagsdjuren24, vilket illustrerar den adaptiva plasticiteten hos importvägen för att rädda mitokondriellt innehåll och funktion (figur 4).
Figur 1: Schematisk arbetsflöde för isolering av SS och IMF mitokondrier från skelettmuskulatur baserat på tidigare arbete8. Detta protokoll tillåter isolering av funktionella mitokondrier baserat på deras geografiska läge inom skelettmuskulaturen. SS mitokondrier frigörs snabbare och lättare, medan IMF:s mitokondrier kräver ytterligare ett matsmältningssteg med proteas för att frigöra dem från myofibrillerna. Observera att isoleringen av dessa underfractions kan göras tillsammans. Ett uppdaterat liknande förfarande har nyligen publicerats25. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Proteinimport till mitokondriell matris. (A) Normal importhastighet för MDH visas i SS- och IMF-mitokondrier (körfält 4 och 7) och översättningsprodukten av föregångaren MDH (lane 1). Det nedre bandet representerar den importerade mogna MDH. Tillsats av valinomycin hämmar MDH-proteinimporten i matrisen av SS och IMF mitokondrier, eftersom denna uncoupler avleder membranpotentialen (körfält 2 och 5). Triton-X är ett tvättmedel som såddringsperar det inre membranet och därmed hämmar MDH-import till dessa delfractions (körfält 3 och 6). Proteinimport utfördes för ökande tidslängder, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min och 30 min. Dessa uppgifter visar att import är en tidsberoende process och även att SS och IMF:s mitokondrier har olika importnivåer eller importkapacitet (B). TL, översättningsbana; VAL, valinomycin; TRI, Triton-X; CTL, kontroll; SS, subsarkolemmal; IMF, intermyofibrillar. Denna siffra ändrades från Takahashi M & Hood DA20. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Proteinimporten är anpassningsbar och tätt kopplad till uppskattningar av mitokondriellt innehåll. Sprague Dawley råttor utsattes för elektrisk stimulering för att inducera kontraktil aktivitet, en modell för träning träning. (A) Tom40-importen till OM var 1,6 gånger högre i muskel från kroniskt stimulerade djur jämfört med kontroller vid en given tidpunkt. (B) OCT import till mitokondriell matris ökades vid varje tidpunkt för inkubation, och totalt sett resulterade detta i en 1,4-faldig ökning av mitokondrier från kroniskt stimulerade muskeln. C) Importen är positivt korrelerad med ett index över mitokondriellt innehåll, bedömt med COX-aktivitet, r = 0,69. Dessa mätningar togs från djur som utsattes för denervation, vilket har visat sig minska mitokondriellt innehåll och importhastigheten. Con, kontroll; Den, denervated; Stim, stimulerad; TL, översättningsbana; * p < 0,05. Figurerna 3A och 3B är anpassade från Joseph A-M & Hood DA22 och 3C från Singh B & Hood DA23. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Utbildningsräddningar importfel in vivo. Bax/Bak dubbel knockout djur uppvisar minskad protein import till mitokondriell matris med 37%. Sex veckors frivillig hjulkörning räddade importfelet till kontrollnivåer. WT, vildtyp; DKO, dubbel knockout; TL, översättningsbana; * p < 0,05 huvudeffekt av genotyp; P < 0,05 huvudeffekt av träning. Denna siffra har anpassats från Zhang Y et al.24. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Buffert 1: | Buffert 1 + ATP: | Buffert 2: | Resuspension medium: | Nagarse proteas |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/ml i buffert 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 10 mM MOPS | OBS: Gör färskt och håll på is |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0.2% BSA | |
| 50 mM Tris | 50 mM Tris | 50 mM Tris | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tabell 1: Buffertar och resuspension media.
| % av reaktionsvolymen | 1 Reaktionblandning | |
| Retikulocyt lysate | 64.10% | 11,8 μL |
| Aminosyror (-methionin) | 2.20% | 0,4 μL |
| Steril H2O | 21.60% | 3.97 μL |
| 35 År S-methionin | 7.20% | 1.33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1.0 μL |
| Total volym | 18,5 μL | |
| NOT: | ||
| 1) Tillsätt 35S-methionin sist; | ||
| 2) Tina lysat långsamt på is och begränsa frysnings-/upptiningscyklerna till två. Det rekommenderas att lysaten alikvoteras vid ankomsten | ||
| 3) Volymen av mRNA kan justeras för att optimera translationell effektivitet genom att ändra den sterila H2O-volymen i enlighet därmed. | ||
Tabell 2: Blandning av översättningsreaktioner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrier är unikt beroende av uttryck och samordning av både nukleära och mitokondriella genom för deras syntes och expansion inom celler. Det nukleära genomet kodar dock den stora majoriteten (99%) av mitokondriellt proteom, och detta understryker vikten av proteinimportmaskineriet för att stödja mitokondriell biogenes. Import fungerar också som en viktig signaleringshändelse, eftersom underlåtenhet att importera kan främja initieringen av det utfällda proteinsvaret och/eller mitophagy15,16,26. Eftersom importen bygger på uttryck av flera funktionella kanaler och förkläden, en intakt membranpotential, liksom tillgången på ATP, kan utvärderingen av mitokondriell proteinimport ge värdefull inblick i organellens hälsa och energistatus.
Utvärderingen av proteinimportkapaciteten till mitokondrier kräver isolering av organellen från den omgivande vävnaden med hjälp av standard differentiell centrifugeringsteknik. Importen utvärderas på samma sätt som man skulle utvärdera Vmax av mitokondriella enzymaktiviteter, på ett mycket kontrollerat sätt beroende på tid och substratkoncentration och oberoende av cellulära cytosoliska influenser. Isoleringsmetoden som presenteras här, eller liknande återgivningar av den, har använts i många år för att utvärdera mitokondriell andning och enzymaktiviteter8,9,10,11. Denna teknik är inte utan sina begränsningar, eftersom det stör den normala morfologin av mitokondrier som de finns i situ27, som i skelettmuskulaturen är mycket komplex, allt från små sfäroid strukturer, till en mycket grenad reticular nätverk3, beroende på deras subsarcolemmal eller intermyofibrillar plats inom muskelcellen. Dessutom har användningen av proteas nagarse granskats3,28. En uppdatering av denna metod, med trypsin istället för nagarse, har nyligen publicerats25, och trypsin har använts av andra för att isolera muskel mitokondrier29. I själva verket kan alla alternativa isoleringsmetoder som ger funktionellt intakta mitokondrier användas, inklusive tekniker som inte använder proteaser30 eller de som är utformade för små biopsistora prover från mänskliga muskler31. Metoden som presenteras här har fördelen att isolera SS mitokondrier snabbt och enkelt, men en större avkastning och renhet av mitokondrier kan erhållas genom isolering av IMF-subfraktion. Om det görs noggrant kan detta isoleringsprotokoll resultera i funktionellt intakta organeller med ett högt andningskontrollförhållande, vilket tyder på lämpliga hastigheter av tillstånd 3 och 4 andning8.
Det är också absolut nödvändigt för mätningen av mitokondriell proteinimport att dessa organeller behåller sin membranpotential, eftersom importen över det inre membranet är beroende av denna elektroforetiska protonmotivkraft, som tjänar till att locka positivt laddade prekursorsekvenser och hjälpa till att förmedla transporten av föregångaren till det negativt laddade matrisutrymmet. Under sådana förhållanden kan jämförelser av mitokondriell funktion och import utvärderas mellan fysiologiskt relevanta experimentella situationer, såsom motion, åldrande och muskelavanvändning, till exempel. I detta avseende har tidigare arbete visat att import är en mycket anpassningsbar väg som svarar på förändrade tillstånd av muskelanvändning och användning och är känslig för hämning via överdriven ROS-emission10,22,23,32. Denna plasticitet beror delvis på adaptiva förändringar i uttrycket av proteinimportmaskinkomponenterna. Eftersom denna teknik bygger på isolering av mitokondrier, tas alla bestämmelser om importvägen som kan härröra från cytosoliska faktorer eller interorganelle crosstalk bort från tolkningen av experimentet. Detta är både en begränsning och en styrka av tekniken, eftersom slutsatser kan dras av importvägens kapacitet (liknar enzymets Vmax-aktivitet), men övergående eller externa signaler som kan uppstå med den experimentella modellen kan gå förlorade. För att kringgå detta är det möjligt att inkubera importreaktionen med ett prov av den cytosoliska fraktionen, isolerad enligt beskrivningen ovan, för att utvärdera förändringar i den cytosoliska miljön som kan påverka importhastigheten, som tidigare gjorts22. Dessutom är importmaskiner föremål för akuta, postöversättningsändringar som kan ändra deras funktioner. Nyligen arbete har visat att fosforylering av specifika TOM importreceptorer kan kopplas till mitophagy33. Ett forskningsområde som förtjänar mer uppmärksamhet är den akuta modulering av importprocessen via inneboende signalvägar som förmedlas av ROS eller genom kovalent modifiering av importreceptorer och förkläden, vilket dokumenteras i jäst och andra lägre organismer34,35.
Proteinimport till mitokondrier representerar en inkörsport till adaptiv organelltillväxt och är en känslig indikator på mitokondriell hälsa. Att förstå hur denna process regleras kan kasta ljus över regleringen av mitokondriell biogenes, UPR-signalering och initiering av mitophagy. Mitokondriell proteinimport är inte en allmänt studerad process i däggdjurs experimentella modeller, och utvecklingen av den stora potentialen av forskning på detta område kan hjälpa oss att uppnå en större förståelse för sjukdomar där mitokondriell dysfunktion är uppenbar eller representerar ett attraktivt terapeutiskt mål för att främja mitokondriell hälsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter, ekonomiska eller på annat sätt, deklareras av författarna.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss från Washington School of Medicine och Dr.M.T. Ryan från La Trobe University för de ursprungliga donationerna av uttrycksplasmider som användes för denna forskning. Detta arbete stöddes av finansiering från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) till D. A. Hood. D. A. Hood är också innehavare av en kanadensisk forskningsstol i cellfysiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O.
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
