Summary
I mitocondri sono organelli metabolici chiave che mostrano un alto livello di plasticità fenotipica nel muscolo scheletrico. L'importazione di proteine dal citosol è una via critica per la biogenesi degli organelli, essenziale per l'espansione del reticolo e il mantenimento della funzione mitocondriale. Pertanto, l'importazione di proteine funge da barometro della salute cellulare.
Abstract
I mitocondri sono organelli metabolici e regolatori chiave che determinano l'approvvigionamento energetico e la salute generale della cellula. Nel muscolo scheletrico, i mitocondri esistono in una serie di morfologie complesse, che vanno da piccoli organelli ovali a un'ampia rete simile al reticolo. Capire come il reticolo mitocondriale si espande e si sviluppa in risposta a diversi stimoli come le alterazioni della domanda di energia è stato a lungo un argomento di ricerca. Un aspetto chiave di questa crescita, o biogenesi, è l'importazione di proteine precursori, originariamente codificate dal genoma nucleare, sintetizzate nel citosol e traslocate in vari sottocomparti mitocondriali. I mitocondri hanno sviluppato un meccanismo sofisticato per questo processo di importazione, che coinvolge molti canali selettivi della membrana interna ed esterna, noti come meccanismo di importazione delle proteine (PIM). L'importazione nel mitocondrio dipende dal potenziale di membrana vitale e dalla disponibilità di ATP derivato dagli organelli attraverso la fosforilazione ossidativa. Pertanto la sua misurazione può servire come misura della salute degli organelli. Il PIM mostra anche un alto livello di plasticità adattiva nel muscolo scheletrico che è strettamente accoppiato allo stato energetico della cellula. Ad esempio, l'allenamento fisico ha dimostrato di aumentare la capacità di importazione, mentre il disuso muscolare lo riduce, in coincidenza con i cambiamenti nei marcatori del contenuto mitocondriale. Sebbene l'importazione di proteine sia un passo fondamentale nella biogenesi e nell'espansione dei mitocondri, il processo non è ampiamente studiato nel muscolo scheletrico. Pertanto, questo documento delinea come utilizzare mitocondri isolati e completamente funzionali dal muscolo scheletrico per misurare la capacità di importazione di proteine al fine di promuovere una maggiore comprensione dei metodi coinvolti e un apprezzamento dell'importanza del percorso per il turnover degli organelli nell'esercizio fisico, nella salute e nella malattia.
Introduction
I mitocondri sono organelli che esistono in morfologie complesse in diversi tipi di cellule e sono riconosciuti per possedere una gamma crescente di funzioni che sono fondamentali per la salute cellulare. In quanto tali, non possono più essere ridotti semplicemente agli organelli che producono energia. I mitocondri sono regolatori metabolici chiave, determinanti del destino cellulare e hub di segnalazione, le cui funzioni possono servire come utili indicatori della salute cellulare generale. Nelle cellule muscolari scheletriche, gli studi di microscopia elettronica rivelano la presenza di mitocondri subsarcolemmali (SS) e intermiofibrillari (IMF) geograficamente distinti, che mostrano un grado di connettività1,2,3,4 che è ora riconosciuto come altamente dinamico e adattabile ai cambiamenti nei livelli di attività muscolare scheletrica, nonché con l'età e la malattia. Il contenuto e la funzione mitocondriale nel muscolo possono essere valutati in numerosi modi5,6 e sono stati applicati metodi tradizionali di isolamento degli organelli per comprendere meglio le capacità respiratorie ed enzimatiche (Vmax) dei mitocondri distinte dall'influenza dell'ambiente cellulare7,8. In particolare, questi metodi tradizionali hanno rivelato sottili distinzioni biochimiche tra mitocondri isolati dalle regioni subsarcolemmali e intermiofibrillari, smentendo possibili implicazioni funzionali per il metabolismo in queste regioni subcellulari8,9,10,11.
La biogenesi dei mitocondri è unica nel richiedere il contributo di prodotti genici sia dal DNA nucleare che da quello mitocondriale. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono derivati dal nucleo poiché la trascrizione del mtDNA porta solo alla sintesi di 13 proteine. Poiché i mitocondri comprendono normalmente proteine >1000 coinvolte in diverse vie metaboliche, la biogenesi dell'organello richiede un mezzo strettamente regolato di importazione e assemblaggio di proteine precursori dal citosol nei vari sottocompartimenti mitocondriali per mantenere una corretta stechiometria e funzione12,13. Le proteine codificate nucleare destinate ai mitocondri normalmente trasportano una sequenza di targeting mitocondriale (MTS) che le indirizza all'organello e facilita la loro localizzazione sub-compartimentale. La maggior parte delle proteine legate alla matrice contengono un MTS N-terminale scissibile, mentre quelle destinate alla membrana mitocondriale esterna o interna di solito hanno domini di targeting interni14. Il processo di importazione viene effettuato da una serie di canali diversi che forniscono più strade per l'ingresso nell'organello13. Il complesso translocase della membrana esterna (TOM) trasporta i precursori dal citosol nello spazio intermembrana, dove sono riconosciuti dal translocase del complesso della membrana interna (TIM). Questo complesso è responsabile dell'importazione di precursori codificati nucleari nella matrice, dove le proteasi scisdono la presequenza di targeting N-terminale. Le proteine destinate alla membrana esterna possono essere inserite direttamente in questa membrana attraverso il complesso TOM, mentre quelle destinate alla membrana interna sono inserite da una proteina TIM, nello specifico TIM22. Dopo la loro importazione, le proteine vengono ulteriormente elaborate da proteasi e chaperoni residenti e spesso si combinano per formare complessi più grandi, come quelli che si trovano nella catena di trasporto degli elettroni.
L'importazione stessa di proteine mitocondriali serve anche come misura della salute mitocondriale, poiché questo processo si basa sulla presenza di potenziale di membrana e una fonte di energia sotto forma di ATP15. Ad esempio, quando il potenziale di membrana viene dissipato, la proteina chinasi PINK1 non può essere assorbita dall'organello, e questo porta a segnali di fosforilazione che innescano l'insorgenza della degradazione dell'organello attraverso una via chiamata mitofagia16,17. In circostanze analoghe, quando l'importazione è ostacolata, la proteina ATF5 non può entrare nell'organello e successivamente trasloca nel nucleo, dove funge da fattore di trascrizione per l'up-regolazione dell'espressione genica UPR18,19. Pertanto, la misurazione dell'efficienza dell'importazione di proteine può fornire una visione completa della salute dell'organello, mentre la risposta all'espressione genica può essere utilizzata per indicare il grado di segnalazione retrograda al nucleo.
Nonostante la sua ovvia importanza per la biogenesi dei mitocondri e per la salute cellulare in generale, la via di importazione nei mitocondri dei mammiferi è notevolmente poco studiata. In questo rapporto, descriviamo i passaggi specifici coinvolti nella misurazione dell'importazione di proteine precursori nei mitocondri del muscolo scheletrico e forniamo dati per illustrare la risposta adattativa del sistema di importazione ai cambiamenti muscolari e al disuso, illustrando il contributo dell'importazione proteica alla plasticità adattativa del muscolo scheletrico.
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Protocol
Tutti gli animali utilizzati in questi esperimenti sono mantenuti nella struttura di cura degli animali della York University. Gli esperimenti sono condotti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care con l'approvazione del Comitato per la cura degli animali della York University (Permesso: 2017-08).
1. Isolamento funzionale dei mitocondri subsarcolemmali e intermiofibrillari dal muscolo scheletrico
- Preparazione del reagente:
- Preparare tutti i buffer e i supporti come indicato nella Tabella 1.
- Impostare i tamponi a pH 7,4 e conservare a 4 °C (fino a 2 settimane), ad eccezione della proteasi della nagrasi.
- Preparare ogni volta la proteasi nagarse fresca (Tabella 1).
- Rimozione dei tessuti e tritatura
NOTA: Un diagramma di flusso dei passaggi seguenti per l'isolamento dei mitocondri è fornito nella Figura 1.- Riempire un flaconcino di vetro a scintillazione con ~20 ml di Tampone 1 (Tabella 1) e metterlo sul ghiaccio.
- Mentre il topo è sotto anestesia, raccogliere i muscoli scheletrici (tibiale anteriore, quadricipite, gastrocnemio ecc.), circa 500-1000 mg, e posizionare i muscoli nella fiala di scintillazione contenente Tampone 1 refrigerato.
NOTA: L'isoflurano gassoso viene utilizzato come anestetico al 2,5% ad una portata di 0,4 L di O2/min. Viene eseguito un test di pizzico per garantire che l'animale non risponda. - Dopo la raccolta dei tessuti, eutanasizzare l'animale tramite lussazione cervicale.
- Pre-raffreddare un bicchiere dell'orologio sul ghiaccio. Rimuovere qualsiasi grasso o tessuto connettivo dai muscoli e tritare il tessuto sul vetro dell'orologio fino a quando non è un liquame omogeneo.
- Posizionare il tessuto tritato in un tubo di centrifugazione di plastica pre-refrigerato da 50 ml (vedere Tabella dei materiali) e registrare il peso esatto.
- Diluire il tessuto tritato 10 volte con Tampone 1 + ATP (Tabella 1).
- Omogeneizzare il campione muscolare utilizzando un omogeneizzatore a doppia lama da 8 mm (vedi Tabella dei materiali) a una potenza di 9,8 Hz per 10 s, assicurando che non rimangano pezzi visibili di muscolo.
- Centrifugare i campioni a 800 x g per 10 minuti utilizzando una centrifuga ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Lo scopo di questo passaggio è quello di separare le frazioni mitocondriali SS e IMF. Il supernato contiene mitocondri SS, mentre il pellet contiene mitocondri IMF.
- Isolamento mitocondriale SS
- Filtrare il supernato attraverso un singolo strato di garza in un altro set di tubi di centrifugazione in plastica da 50 ml per rimuovere eventuali detriti o contaminanti di grandi dimensioni.
- Centrifugare il supernato a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
- Scartare il supernato e risospesciare il pellet in 3,5 ml di Tampone 1 + ATP.
NOTA: Sospendere nuovamente con un P1000 e farlo con attenzione. I mitocondri sono organelli fragili. Eseguire delicatamente ed evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta. - Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
- Scartare il supernato a meno che non si desideri un'ulteriore elaborazione per isolare una frazione citosolica priva di nuclei, mitocondri e altri organelli. Risospenare accuratamente il pellet in circa 95 μL del mezzo di risospensione (Tabella 1) utilizzando una pipetta P200.
NOTA: analogamente al passaggio 1.3.3, evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta. Il volume del mezzo di risospensione può essere modificato a seconda delle dimensioni del pellet. Questa è la frazione mitocondriale SS, che può essere immagazzinata sul ghiaccio fino a quando la frazione IMF non viene isolata. Se lo si desidera, la frazione citosolica, priva di organelli, può essere isolata centrifugando il supernato a 100.000 x g in un ultracentrifuga (vedi Tabella dei materiali) e successivamente scartando il pellet.
- Isolamento mitocondriale IMF
- Diluire il pellet dal punto 1.2.8 di 10 volte nel tampone 1 + ATP. Risospesso utilizzando un pestello di Teflon mescolando delicatamente il pellet e il tampone insieme fino a quando il campione è coerente.
- Omogeneizzare il campione utilizzando un omogeneizzatore a doppia lama da 8 mm (vedi Tabella dei materiali) con una potenza di uscita di 9,8 Hz per 10 s.
- Centrifugare il campione a 800 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
- Scartare il supernato e diluire il pellet mitocondriale IMF 10 volte usando Buffer 2 e risospesciare usando il pestello di Teflon mescolando delicatamente fino a quando non è omogeneo.
- Aggiungere 25 μL/g di tessuto a 10 mg/mL di proteasi nagarse (Tabella 1) e posizionare il tubo di centrifugazione su un lato sul ghiaccio, mescolando delicatamente ogni minuto facendo oscillare il tubo da un lato all'altro.
NOTA: L'aggiunta di nagarse aiuta a liberare i mitocondri del FMI eseguendo una digestione limitata delle miofibrille. - Dopo 5 minuti, aggiungere 20 ml di Tampone 2 (Tabella 1) per diluire la proteasi nagarse fino al punto di inattività e interrompere la digestione.
- Centrifugare immediatamente il campione a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
- Scartare il supernato e diluire il pellet 10 volte usando Buffer 2 e risospesciare usando un pestello di Teflon mescolando delicatamente.
- Centrifugare il campione a 800 x g per 15 min a 4 °C per pellettare il materiale fibroso.
- Versare il supernato in un nuovo set di tubi centrifuga in plastica da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet, che può essere scartato.
- Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C come al punto 1.4.7.
- Scartare il supernato, aggiungere 3,5 ml di Buffer 2 e risospesciare delicatamente il pellet usando una pipetta P1000.
- Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C come al punto 1.4.7.
- Scartare il supernato e risospesciare delicatamente il pellet con circa 180 μL di mezzo di risospensione utilizzando una pipetta P200.
NOTA: Il volume del mezzo di risospensione può essere modificato a seconda delle dimensioni del pellet. Questa è la frazione mitocondriale imf, che può essere conservata sul ghiaccio fino a quando non deve essere utilizzata nel test di importazione.
2. Importazione di proteine mitocondriali
- In vitro trascrizione
NOTA: questi passaggi successivi descrivono come preparare una proteina radiomarcata per l'importazione. La via di importazione in esame può dettare la scelta della proteina bersaglio, ad esempio, per valutare l'importazione nella matrice mitocondriale, l'ornitina carbamil transferasi, l'OCT e la malato deidrogenasi, MDH, sono comunemente usati, mentre Tom40 è comunemente usato come indicazione di importazione nella membrana mitocondriale esterna. Per i seguenti passaggi, è richiesto il DNA plasmidico che codifica la proteina di scelta. La trascrizione del DNA plasmidico può essere effettuata prima dell'isolamento mitocondriale in un giorno separato e l'mRNA raccolto da questo esperimento può essere memorizzato e utilizzato in futuri esperimenti di traduzione e importazione.- Linearizzare il DNA: combinare 40 μL di DNA plasmidico (5 μg/μL), 5 μL di tampone enzimatico 10x e 5 μL di enzima di restrizione e incubare a 37 °C per 30 min.
NOTA: Gli enzimi di restrizione utilizzati possono variare in base al plasmide, che può richiedere un diverso tampone enzimatico, e le condizioni sperimentali del DNA possono essere utilizzate in qualsiasi quantità / volume, poiché il modello può essere ridimensionato verso l'alto o verso il basso. - Purificare e precipitare il DNA linearizzato usando fenolo ed etanolo. Eseguire tutte le fasi successive (2.1.3-2.1.15) in tubi sterili da 1,5 ml e utilizzare una centrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali) per le fasi di centrifugazione.
- Aggiungere il volume appropriato di H2O sterile in modo che il volume finale sia uguale a 400 μL. Quindi, aggiungere 400 μL di fenolo.
- Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
- Aggiungere 400 μL di fenolo:cloroformio:isoamilalcol (25:24:1, v:v:v).
- Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
- Aggiungere 400 μL di cloroformio:isoamilalcol (24:1, v:v).
- Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
- Aggiungere 40 μL di acetato di sodio 3M (pH 7,0) e aggiungere 1 mL di etanolo al 95%.
- Posizionare i tubi sterili da 1,5 ml in un congelatore a -80 °C su un lato per 15 minuti.
- Centrifugare i campioni a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Scartare il supernato e lavare il pellet con 300 μL di etanolo all'80%.
- Centrifugare i campioni a 17.000 x g per 2 min a 4 °C.
- Scartare il supernato e asciugare all'aria il pellet. Una volta che il pellet è asciutto, dovrebbe essere chiaro.
- Risospendare il pellet in 20 μL di H2O sterile
- Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali) e assicurarsi che il rapporto A260:280 sia superiore a 1,8.
- Diluire il DNA ad una concentrazione di 0,8 μg/μL in H2O sterile.
- Trascrivere il DNA: Combinare plasmide (0,8 μg/μL, 60,8 μL), H2O sterile (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), la miscela come menzionato fase 2.1.19 (15,6 μL), RNAsina (5,2 μL) e un'appropriata RNA polimerasi (4,8 μL) per formare "una miscela di reazione" (volume totale = 121,6 μL) e incubare per 90 minuti alla temperatura ottimale per la polimerasi (37 °C per T7 polimerasi; 40 °C per SP6 polimerasi)
- Per preparare la miscela aggiungere 200 μL di 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL di 1 M MgAc2, 500 μL di 4 M KAc, 100 μL di 20 mM spermidina, 100 μL di 0,5 M DTT e 200 μL di H20 sterile.
NOTA: La reazione può essere scalata verso l'alto o verso il basso in volume purché vengano mantenute le proporzioni fornite di reagenti. L'RNA polimerasi utilizzata è dettata dalla sequenza del promotore batterico all'interno del plasmide utilizzato. - Quindi, purificare e precipitare l'mRNA usando fenolo ed etanolo come nei passaggi 2.1.2-2.1.15. Portare il volume fino a 400 μL con H2O sterile (aggiungere 280 μL) e procedere come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.15. Risospendare il pellet finale in 20 μL di H2O sterile.
- Misurare la concentrazione di mRNA utilizzando uno spettrofotometro, assicurarsi che il rapporto A260:280 sia ~2.0.
- Diluire l'mRNA a 2,8 μg/μL in H2O sterile e conservare a -20 °C in aliquote da 50 μL.
- Linearizzare il DNA: combinare 40 μL di DNA plasmidico (5 μg/μL), 5 μL di tampone enzimatico 10x e 5 μL di enzima di restrizione e incubare a 37 °C per 30 min.
- Traduzione in vitro
NOTA: La traduzione del DNA desiderato deve essere effettuata lo stesso giorno dell'esperimento di importazione. Questo esperimento richiede l'uso di amminoacidi radiomarcati, e quindi l'utente deve avere un permesso per l'uso di radioisotopi, e tutta la manipolazione e lo smaltimento devono essere in conformità con le politiche / requisiti dell'istituzione. Le misure di sicurezza dei radioisotopi sono state omesse o descritte brevemente, poiché probabilmente differiranno a seconda dell'istituzione.- Preparare un mix di reazioni di traduzione sufficiente (Tabella 2) per fornire ~ 20 μL per campione di mitocondri da utilizzare nell'esperimento di importazione e includere lo stesso volume per una corsia di traduzione.
- Incubare la reazione per 30 minuti a 30 °C (il tempo può variare con l'mRNA, 25-60 min).
- Registrare l'uso di 35S-metionina secondo i requisiti di sicurezza radioattiva dell'istituzione e smaltire tutto ciò che è entrato in contatto con il radioisotopo secondo le linee guida dell'istituzione.
- Importazione di proteine
NOTA: i mitocondri appena isolati sono necessari per i passaggi successivi. Fare riferimento al protocollo di isolamento mitocondriale. Altri metodi di isolamento possono essere utilizzati purché i mitocondri siano vitali e funzionali. Per le fasi successive, i campioni mitocondriali utilizzati vengono risospesi in un tampone di risospensione come descritto sopra (Tabella 1). Anche la concentrazione proteica del campione mitocondriale deve essere misurata prima di iniziare il test di importazione.- Circa 15 minuti dopo l'inizio della reazione di traslazione, aliquota 90 μg di mitocondri in tubi sterili da 1,5 ml e pre-incubazione a 30 °C per ~10 min.
NOTA: Aliquot più mitocondri di quelli che saranno effettivamente utilizzati nell'esperimento; solo 75 μg saranno effettivamente utilizzati. Tuttavia, l'aliquota in eccesso non è un requisito. - In un nuovo set di tubi sterili da 1,5 mL, combinare 75 μg di mitocondri con 18 μL della reazione di traslazione e incubare a 30 °C per il tempo desiderato.
- Mantenere il volume rimanente della reazione di traduzione sul ghiaccio; questo verrà utilizzato in seguito.
NOTA: l'importazione è un processo dipendente dal tempo, quindi potrebbe essere prudente iniziare con un esperimento di corso temporale che varia in tempi di incubazione da 1 a 60 minuti. Un tempo di reazione tipico è di 30 min. - Durante questo periodo, preparare il cuscino di saccarosio combinando 1 g di saccarosio, 200 μL di 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL di 1 M HEPES (pH 7,4) e portare il volume a 5 mL utilizzando H2O sterile.
- Preparare un nuovo set di tubi sterili da 1,5 ml corrispondenti a ciascun tubo nella reazione di importazione. Aliquota 600 μL del cuscino di saccarosio in ciascun tubo e mantenere sul ghiaccio fino al termine della reazione di importazione.
- Per terminare la reazione di importazione dopo il tempo di incubazione appropriato, rimuovere il tubo da 30 °C, metterlo su ghiaccio e quindi trasferire con cura la reazione di importazione sulla parte superiore del tubo con il cuscino di saccarosio.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito molto lentamente per garantire che i mitocondri non siano danneggiati / rotti. Il cuscino di saccarosio aiuta a rallentare la migrazione dei mitocondri e "ammortizza" la sua discesa verso il fondo del tubo durante la successiva fase di centrifugazione. - Centrifugare i campioni + cuscino di saccarosio a 17.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Preparare il tampone di rottura combinando 25 mL di sorbitolo da 2,4 M, 2 mL di 1 M HEPES (pH 7,4) e 72 mL di H2O a doppia distillazione.
- Preparare il tampone di lisi per l'elettroforesi su gel SDS-PAGE: combinare 50 mL di glicerolo riscaldato, 11,5 g di SDS, 31,25 mL di 1 M Tris (pH 6,8) e portare il volume a 500 mL con H2O a doppia distillazione.
- Per la preparazione del campione, miscelare 475 μL di tampone di lisi con 25 μL di β-mercaptoetanolo da utilizzare in una fase successiva.
NOTA: il tampone di lisi può essere effettuato in anticipo e conservato a temperatura ambiente; tuttavia, l'aggiunta di β-mercaptoetanolo deve essere fatta fresca. - Utilizzando una pipetta P1000, rimuovere con cura il supernato e non disturbare il pellet. Smaltire il supernato in un apposito contenitore per rifiuti radioattivi.
- Per l'importazione nella membrana esterna, eseguire questa operazione utilizzando Tom40, risospescere il pellet in 50 μL di carbonato di sodio 0,1 M appena preparato (pH 11,5) e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione, centrifugare il campione 14.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Questo passaggio viene eseguito solo per le reazioni di importazione della membrana esterna.
- Per preparare i campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE, aggiungere 20 μL di tampone di rottura, 20 μL di tampone di lisi e β-mercaptoetanolo e risospeso bene. Aggiungere 5 μL di colorante campione.
- Preparare la corsia di controllo/traslazione combinando 3 μL della reazione di traslazione rimanente dal punto 2.3.3 con 37 μL di tampone di lisi e 5 μL di colorante campione. Mescolare bene.
- Far bollire i campioni per 5 minuti a 95 °C e ruotare delicatamente a bassa velocità per evitare di pellettizzare i mitocondri.
- Applicare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS.
NOTA: la percentuale di gel e il successivo tempo di esecuzione dipenderanno dalla proteina importata. Ad esempio, OCT è 37 kDa e la sua banda elaborata matura è leggermente più piccola; pertanto, un gel al 12% consente una buona separazione di queste bande. - Una volta completata l'elettroforesi, rimuovere il gel e metterlo in H2O a doppio distillato.
- Far bollire il gel in TCA al 5% in una cappa aspirante per 5 minuti, mescolando / spostando continuamente il gel per evitare screpolature.
NOTA: TCA aiuta a solidificare il gel per la visualizzazione; questo può essere fatto in un vassoio di metallo sopra un bruciatore Bunsen. Usa abbastanza TCA per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 pieno. - Rimuovere il gel e rimetterlo in H2O a doppio distillato. Agitarlo su una piastra rotante per 1 minuto a ~ 50 giri / min.
- Lavare il gel in Tris da 10 mM su una piastra rotante per 5 minuti a ~ 50 giri / min, di nuovo usando abbastanza per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 del contenitore.
- Precipitare la proteina lavando il gel in acido saliciclico 1 M su una piastra rotante per 30 minuti, di nuovo usando abbastanza acido saliciclico per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 del contenitore utilizzato.
- Disidratare il gel come descritto nei passaggi 2.3.24-2.3.31.
NOTA: questo può essere fatto in diversi modi. Un essiccatore di gel (vedi Tabella dei materiali) fornisce un'opzione efficiente in termini di tempo (descritta di seguito); tuttavia è possibile utilizzare altri metodi / kit disponibili in commercio che possono essere più convenienti ma più dispendiosi in termini di tempo. I kit di essiccazione del gel possono essere utilizzati come alternativa che non richiede l'applicazione di calore o aspirazione, ma consente invece al gel di asciugarsi all'aria tra i fogli di cellophane per evitare distorsioni. - Posizionare un grande foglio di carta assorbente sul letto poroso dell'essiccatore di gel. Posizionare un foglio di carta assorbente nell'area in cui verrà applicato il gel.
- Tagliare un pezzo di carta assorbente di 15 cm x 20 cm e posizionarlo sul tovagliolo di carta.
- Estrarre il gel dal contenitore usando un secondo pezzo di carta assorbente da 15 cm x 20 cm e adagiarlo in piano sopra il primo pezzo.
- Tagliare un pezzo leggermente più grande di pellicola trasparente, ~ 20 cm x 25 cm, e posizionarlo su gel, assicurandosi che non ci siano pieghe o bolle sotto l'involucro.
NOTA: questa operazione potrebbe richiedere alcuni tentativi, ma è imperativo che non vi siano sacche d'aria intrappolate. - Stendere delicatamente il coperchio di plastica dell'essiccatore di gel sopra l'involucro, assicurandosi nuovamente che non ci siano bolle o pieghe.
- Accendere la pompa / vuoto e assicurarsi che il coperchio di plastica abbia formato un sigillo. Testare il sigillo sollevando un angolo del coperchio di plastica e attendere che si richiuda.
- Chiudere l'essiccatore di gel e funzionare per 90 minuti. Impostare la temperatura in modo che inizi a 30 °C, raggiunga gradualmente 80 °C e poi torni a 30 °C alla fine della corsa.
- Una volta disidratato, il gel si solidificherà e si sentirà sottile come la carta. Avvolgere il gel nell'involucro di plastica utilizzato nel processo di essiccazione.
- Posizionare il gel disidratato in una cassetta di film con un film di fosforo (vedi Tabella dei materiali), con il lato bianco rivolto verso il gel. I tempi di esposizione variano ma possono essere 24-48 ore per la visualizzazione delle bande.
- Visualizza utilizzando l'autoradiografia utilizzando qualsiasi imager adatto in grado di eseguire l'imaging al fosforo.
- Circa 15 minuti dopo l'inizio della reazione di traslazione, aliquota 90 μg di mitocondri in tubi sterili da 1,5 ml e pre-incubazione a 30 °C per ~10 min.
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Representative Results
Abbiamo ampiamente illustrato che questo protocollo è un test valido per determinare il tasso di importazione nei mitocondri muscolari scheletrici isolati funzionali e intatti. Rispetto alle condizioni non trattate, l'importazione di proteine precursori tipiche come la malato deidrogenasi (MDH) nella matrice è sensibile al potenziale di membrana perché può essere inibita dalla valinomicina, un disaccoppiatore della catena respiratoria (Figura 2A). L'importazione è ostacolata anche quando le membrane interne ed esterne mitocondriali sono solubilizzate in presenza del detergente Triton X-100. Il processo di importazione è sensibile alla presenza di ATP esterno, che serve a dispiegare le proteine precursori per la traslocazione attraverso le membrane, ed è strettamente controllato dalla velocità di respirazione e dalla fornitura di ATP (dati non mostrati20). Differenze distinte nell'importazione si osservano anche tra le frazioni mitocondriali intermiofibrillari e subsarcolemmali, in parte a causa delle variazioni nell'espressione dei macchinari di importazione proteica, nonché della frequenza respiratoria tra questi mitocondri (Figura 2B).
I mitocondri nel muscolo scheletrico sono organelli altamente dinamici che rispondono prontamente ai cambiamenti nella domanda di energia. Il contenuto mitocondriale nel muscolo aumenta dopo periodi di esercizio cronico o in risposta all'attività contrattile indotta dalla stimolazione elettrica (vedere per la revisione21). Ad esempio, 7 giorni di attività contrattile cronica del muscolo scheletrico di ratto aumentano l'importazione nell'OM e nella matrice rispettivamente di 1,6 volte e 1,4 volte22 (Figura 3A, 3B). Questi cambiamenti nel contenuto mitocondriale sono causati, in parte, da alterazioni nella capacità del sistema di importazione delle proteine mitocondriali. In effetti, è possibile illustrare una stretta relazione tra il tasso di importazione delle proteine precursori e una buona stima del contenuto mitocondriale, misurato dal complesso marcatore IV citocromo ossidasi sotto controllo o in condizioni denervate23 (Figura 3C)..
L'adattabilità del sistema di importazione muscolare alle alterazioni dell'attività contrattile suggerisce che l'esercizio fisico potrebbe essere usato come trattamento per risolvere i difetti nella via di importazione, se identificato. Durante l'indagine sull'apoptosi mitocondrialmente mediata utilizzando animali a doppio knockout Bax-Bak, abbiamo notato che il ridotto contenuto mitocondriale nei muscoli di questi animali da esperimento era accompagnato da una diminuzione dell'importazione di proteine precursori nella matrice. Abbiamo quindi esaminato la possibilità che l'esercizio potesse ripristinare questa capacità di importazione. Infatti, dopo 6 settimane di addestramento volontario su ruota, l'importazione di proteine è stata ripristinata a livelli di controllo negli animali knockout24, illustrando la plasticità adattativa del percorso di importazione per salvare il contenuto e la funzione mitocondriale (Figura 4) .
Figura 1: Schema del flusso di lavoro per isolare i mitocondri SS e IMF dal muscolo scheletrico sulla base del lavoro precedente8. Questo protocollo consente l'isolamento dei mitocondri funzionali in base alla loro posizione geografica all'interno del muscolo scheletrico. I mitocondri delle SS sono più rapidamente e facilmente liberati, mentre i mitocondri IMF richiedono un'ulteriore fase di digestione con proteasi per districarli dalle miofibrille. Si noti che l'isolamento di queste sottofrazioni può essere fatto in tandem. Recentemente è stata pubblicata una procedura simile e aggiornata25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Importazione di proteine nella matrice mitocondriale. (A) I normali tassi di importazione per MDH sono mostrati nei mitocondri SS e IMF (corsie 4 e 7) e nel prodotto di traduzione del precursore MDH (corsia 1). La banda inferiore rappresenta l'MDH maturo importato. L'aggiunta di valinomicina inibisce l'importazione di proteine MDH nella matrice dei mitocondri SS e IMF, poiché questo disaccoppiatore dissipa il potenziale di membrana (corsie 2 e 5). Triton-X è un detergente che solubilizza la membrana interna, inibendo così l'importazione di MDH in queste sottofrazioni (corsie 3 e 6). L'importazione di proteine è stata effettuata per periodi di tempo crescenti, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min e 30 min. Questi dati illustrano che l'importazione è un processo dipendente dal tempo e anche che i mitocondri SS e IMF hanno tassi o capacità diversi per l'importazione (B). TL, corsia di traduzione; VAL, valinomicina; TRI, Tritone-X; CTL, controllo; SS, subsarcolemmale; FMI, intermiofibrillare. Questa figura è stata modificata da Takahashi M & Hood DA20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'importazione di proteine è adattabile e strettamente legata alle stime del contenuto mitocondriale. I ratti Sprague Dawley sono stati sottoposti a stimolazione elettrica per indurre attività contrattile, un modello di allenamento fisico. (A) L'importazione di Tom40 nell'OM era 1,6 volte superiore nei muscoli provenienti da animali cronicamente stimolati rispetto ai controlli in un dato momento. (B) L'importazione di OCT nella matrice mitocondriale è aumentata in ogni momento di incubazione e, nel complesso, ciò ha comportato un aumento di 1,4 volte dei mitocondri da muscolo cronicamente stimolato. (C) L'importazione è correlata positivamente con un indice di contenuto mitocondriale, valutato dall'attività di COX, r = 0,69. Queste misurazioni sono state prese da animali che sono stati sottoposti a denervazione, che ha dimostrato di ridurre il contenuto mitocondriale e il tasso di importazione. Contro, controllo; Den, denervato; Stim, stimolato; TL, corsia di traduzione; * p < 0,05. Le figure 3A e 3B sono state adattate da Joseph A-M & Hood DA22 e 3C da Singh B & Hood DA23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La formazione salva i difetti di importazione in vivo. Gli animali a doppio knockout Bax/Bak mostrano una ridotta importazione di proteine nella matrice mitocondriale del 37%. Sei settimane di corsa della ruota volontaria hanno salvato il difetto di importazione per controllare i livelli. WT, wildtype; DKO, doppio knockout; TL, corsia di traduzione; * p < 0,05 effetto principale del genotipo; ¶ p < 0,05 effetto principale dell'allenamento. Questa cifra è stata adattata da Zhang Y et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer 1: | Buffer 1 + ATP: | Buffer 2: | Mezzo di risospensione: | Proteasi di Nagarse |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/mL nel tampone 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | MOPS 10 mM | NOTA: Fare fresco e tenere sul ghiaccio |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0,2% BSA | |
| Tris 50 mM | Tris 50 mM | Tris 50 mM | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tabella 1: Buffer e supporti di risospensione.
| % del volume di reazione | 1 Miscela di reazione | |
| Lisato di reticolociti | 64.10% | 11,8 μL |
| Aminoacidi (-metionina) | 2.20% | 0,4 μL |
| H2O sterile | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 anni S-metionina | 7.20% | 1,33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1,0 μL |
| Volume totale | 18,5 μL | |
| NOTA: | ||
| 1) Aggiungere 35S-metionina per ultimo; | ||
| 2) Scongelare lentamente il lisato sul ghiaccio e limitare i cicli di congelamento / disgelo a due. Si raccomanda di aliquotare il lisato all'arrivo | ||
| 3) Il volume di mRNA può essere regolato per ottimizzare l'efficienza traslazionale alterando di conseguenza il volume sterile di H2O. | ||
Tabella 2: Mix di reazioni di traslazione
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Discussion
I mitocondri dipendono in modo univoco dall'espressione e dal coordinamento dei genomi nucleari e mitocondriali per la loro sintesi ed espansione all'interno delle cellule. Tuttavia, il genoma nucleare codifica la stragrande maggioranza (99%) del proteoma mitocondriale, e questo sottolinea l'importanza del meccanismo di importazione delle proteine nel sostenere la biogenesi mitocondriale. L'importazione funge anche da importante evento di segnalazione, poiché la mancata importazione può promuovere l'inizio della risposta proteica dispiegata e / o mitofagia15,16,26. Poiché l'importazione si basa sull'espressione di più canali funzionali e chaperoni, un potenziale di membrana intatto e la disponibilità di ATP, la valutazione dell'importazione di proteine mitocondriali può fornire preziose informazioni sullo stato di salute ed energia dell'organello.
La valutazione della capacità di importazione di proteine nei mitocondri richiede l'isolamento dell'organello dal tessuto circostante utilizzando tecniche standard di centrifugazione differenziale. L'importazione viene valutata nello stesso modo in cui si valuterebbe il Vmax delle attività enzimatiche mitocondriali, in modo altamente controllato dipendente dal tempo e dalla concentrazione del substrato e indipendente dalle influenze citosoliche cellulari. Il metodo di isolamento qui presentato, o interpretazioni simili di esso, sono stati utilizzati per molti anni per valutare la respirazione mitocondriale e le attività enzimatiche8,9,10,11. Questa tecnica non è priva di limiti, in quanto interrompe la normale morfologia dei mitocondri così come esistono in situ27, che nel muscolo scheletrico è altamente complesso, che va da piccole strutture sferoidi, a una rete reticolare altamente ramificata3, a seconda della loro posizione subsarcommale o intermiofibrillare all'interno della cellula muscolare. Inoltre, l'uso del nagarse proteasi è stato oggetto di esame3,28. Un aggiornamento di questo metodo, utilizzando la tripsina invece del nagarse, è stato recentemente pubblicato25 e la tripsina è stata utilizzata da altri per isolare i mitocondri muscolari29. In effetti, può essere utilizzato qualsiasi metodo di isolamento alternativo che produca mitocondri funzionalmente intatti, comprese le tecniche che non impiegano proteasi30 o quelle progettate per piccoli campioni di dimensioni bioptiche dal muscolo umano31. Il metodo qui presentato ha il vantaggio di isolare i mitocondri delle SS in modo rapido e semplice, ma una maggiore resa e purezza dei mitocondri può essere ottenuta attraverso l'isolamento della sottofrazione IMF. Se fatto con attenzione, questo protocollo di isolamento può portare a organelli funzionalmente intatti con un alto rapporto di controllo respiratorio, indicativo di tassi appropriati di respirazione dello stato 3 e 48.
È anche imperativo per la misurazione dell'importazione di proteine mitocondriali che questi organelli mantengano il loro potenziale di membrana, poiché l'importazione attraverso la membrana interna dipende da questa forza motrice protonica elettroforetica, che serve ad attrarre sequenze precursori caricate positivamente e aiutare a mediare il trasporto del precursore nello spazio matriciale caricato negativamente. In tali condizioni, i confronti della funzione mitocondriale e dell'importazione possono essere valutati tra situazioni sperimentali fisiologicamente rilevanti, come l'esercizio fisico, l'invecchiamento e il disuso muscolare, per esempio. A questo proposito, lavori precedenti hanno dimostrato che l'importazione è un percorso altamente adattabile che risponde a stati alterati di uso e disuso muscolare ed è sensibile all'inibizione attraverso un'eccessiva emissione di ROS10,22,23,32. Questa plasticità è dovuta, in parte, a cambiamenti adattivi nell'espressione dei componenti dei macchinari di importazione delle proteine. Poiché questa tecnica si basa sull'isolamento dei mitocondri, qualsiasi regolazione sulla via di importazione che possa derivare da fattori citosolici o crosstalk inter-organelli viene rimossa dall'interpretazione dell'esperimento. Questa è sia una limitazione che una forza della tecnica, in quanto si possono trarre conclusioni sulla capacità della via di importazione stessa (simile al Vmax dell'attività enzimatica), ma i segnali transitori o esterni che possono verificarsi con il modello sperimentale possono essere persi. Per aggirare questo problema, è possibile incubare la reazione di importazione con un campione della frazione citosolica, isolato come sopra descritto, al fine di valutare i cambiamenti nell'ambiente citosolico che possono influenzare i tassi di importazione, come fatto in precedenza22. Inoltre, i componenti dei macchinari di importazione sono soggetti a modifiche acute post-traduzionali che possono alterarne le funzioni. Lavori recenti hanno dimostrato che la fosforilazione di specifici recettori di importazione TOM può essere collegata alla mitofagia33. In effetti, un'area di ricerca che merita maggiore attenzione è la modulazione acuta del processo di importazione attraverso vie di segnalazione intrinseche mediate da ROS o da modificazioni covalenti di recettori e chaperoni di importazione, come documentato nel lievito e in altri organismi inferiori34,35.
L'importazione di proteine nei mitocondri rappresenta una porta d'accesso alla crescita adattiva degli organelli ed è un indicatore sensibile della salute mitocondriale. Capire come questo processo è regolato può far luce sulla regolazione della biogenesi mitocondriale, sulla segnalazione UPR e sull'inizio della mitofagia. L'importazione di proteine mitocondriali non è un processo ampiamente studiato nei modelli sperimentali dei mammiferi e lo sviluppo del vasto potenziale della ricerca in questo settore potrebbe aiutarci a raggiungere una maggiore comprensione delle malattie in cui la disfunzione mitocondriale è evidente o rappresenta un obiettivo terapeutico attraente per promuovere la salute mitocondriale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi, finanziario o di altro tipo, è dichiarato dagli autori.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. G.C. Shore della McGill University, il Dr. A. Strauss della Washington School of Medicine e il Dr.M.T. Ryan della La Trobe University per le donazioni originali di plasmidi di espressione che sono stati utilizzati per questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) a D. A. Hood. D. A. Hood è anche titolare di una cattedra di ricerca canadese in fisiologia cellulare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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