Summary
Mitokondrier er viktige metabolske organeller som viser et høyt nivå av fenotypisk plastisitet i skjelettmuskulatur. Import av proteiner fra cytosol er en kritisk vei for organelle biogenese, avgjørende for utvidelse av retikulum og vedlikehold av mitokondriefunksjon. Derfor fungerer proteinimport som et barometer for cellulær helse.
Abstract
Mitokondrier er viktige metabolske og regulatoriske organeller som bestemmer energiforsyningen så vel som cellens generelle helse. I skjelettmuskulatur eksisterer mitokondrier i en rekke komplekse morfologier, alt fra små ovale organeller til et bredt, retikulumlignende nettverk. Å forstå hvordan mitokondrie-retikulumet utvider seg og utvikler seg som svar på ulike stimuli som endringer i energietterspørselen, har lenge vært et forskningstema. Et sentralt aspekt ved denne veksten, eller biogenese, er import av forløperproteiner, opprinnelig kodet av atomgenomet, syntetisert i cytosolen og omplassert til ulike mitokondrie-underrom. Mitokondrier har utviklet en sofistikert mekanisme for denne importprosessen, som involverer mange selektive indre og ytre membrankanaler, kjent som proteinimportmaskineriet (PIM). Import til mitokondrie er avhengig av levedyktig membranpotensial og tilgjengeligheten av organell-avledet ATP gjennom oksidativ fosforylering. Derfor kan målingen tjene som et mål på organelle helse. PIM har også et høyt nivå av adaptiv plastisitet i skjelettmuskulatur som er tett koblet til cellens energistatus. For eksempel har trening vist seg å øke importkapasiteten, mens muskeldisuse reduserer den, sammenfallende med endringer i markører av mitokondrieinnhold. Selv om proteinimport er et kritisk skritt i biogenesen og utvidelsen av mitokondrier, er prosessen ikke mye studert i skjelettmuskulatur. Dermed skisserer dette papiret hvordan man bruker isolerte og fullt funksjonelle mitokondrier fra skjelettmuskulatur for å måle proteinimportkapasitet for å fremme en større forståelse av metodene som er involvert og en forståelse av viktigheten av veien for organellomsetning i trening, helse og sykdom.
Introduction
Mitokondrier er organeller som eksisterer i komplekse morfologier i forskjellige celletyper og er anerkjent for å ha et økende utvalg av funksjoner som er kritiske for cellulær helse. Som sådan kan de ikke lenger sprutes ned bare til energiproduserende organeller. Mitokondrier er viktige metabolske regulatorer, determinanter for celle skjebne, og signalerende knutepunkter, hvis funksjoner kan tjene som nyttige indikatorer på generell cellulær helse. I skjelettmuskulaturceller viser elektronmikroskopistudier tilstedeværelsen av geografisk distinkte subsarcolemmal (SS) og intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som viser en grad av tilkoblingsmuligheter1,2,3,4 som nå er anerkjent for å være svært dynamisk og tilpasningsdyktig til endringer i skjelettmuskulaturaktivitetsnivåer, samt med alder og sykdom. Mitokondrieinnhold og funksjon i muskel kan vurderes på mange måter5,6, og tradisjonelle metoder for organelleisolasjon har blitt brukt for å bedre forstå respiratoriske og enzymatiske kapasiteter (Vmax) av mitokondrier forskjellig fra påvirkning av cellulære miljøer7,8. Spesielt har disse tradisjonelle metodene avslørt subtile biokjemiske forskjeller mellom mitokondrier isolert fra subsarcolemmale og intermyofibrillar regioner, belying mulige funksjonelle implikasjoner for metabolisme i disse subcellulære regionene8,9,10,11.
Biogenesen av mitokondrier er unik i å kreve bidrag av genprodukter fra både kjernefysisk og mitokondrie-DNA. Imidlertid er de aller fleste av disse avledet fra kjernen siden mtDNA transkripsjon bare fører til syntese av 13 proteiner. Siden mitokondrier normalt består av > 1000 proteiner involvert i ulike metabolske veier, krever biogenese av organellet et tett regulert importmiddel og montering av forløperproteiner fra cytosolen til de forskjellige mitokondrie-underrommene for å opprettholde riktig stoichiometri og funksjon12,13. Kjernefysiske kodede proteiner som skal til mitokondrier, har vanligvis en mitokondriemålrettingssekvens (MTS) som retter seg mot dem mot organellen og letter deres sub-romlige lokalisering. De fleste matrisebundne proteiner inneholder en cleavable N-terminal MTS, mens de som er bestemt for den ytre eller indre mitokondriemembranen vanligvis har interne målrettingsdomener14. Importprosessen utføres av et sett med forskjellige kanaler som gir flere veier for inngang til organelle13. Translocase av den ytre membranen (TOM) komplekse skyttelbusser forløpere fra cytosol inn i intermembrane rommet, hvor de er anerkjent av translocase av den indre membranen (TIM) komplekset. Dette komplekset er ansvarlig for å importere kjernefysiske forløpere til matrisen, der proteaser holder N-terminalen rettet mot presequence. Proteiner som er bestemt for den ytre membranen kan settes direkte inn i denne membranen gjennom TOM-komplekset, mens de som er bestemt for den indre membranen settes inn av et TIM-protein, spesielt TIM22. Etter importen blir proteiner videre behandlet av bosatte proteaser og anstander og kombineres ofte for å danne større komplekser, for eksempel de som finnes i elektrontransportkjeden.
Mitokondrieproteinimport i seg selv fungerer også som en måling av mitokondriehelse, da denne prosessen er avhengig av tilstedeværelsen av membranpotensial og en energikilde i form av ATP15. For eksempel, når membranpotensialet er spredt, kan proteinkinase PINK1 ikke tas opp av organellen, og dette fører til fosforyleringssignaler som utløser utbruddet av organellets nedbrytning gjennom en vei som kalles mitophagy16,17. Under lignende omstendigheter, når importen hindres, kan ikke proteinet ATF5 komme inn i organellen, og det translokaliseres deretter til kjernen, hvor det fungerer som en transkripsjonsfaktor for oppregulering av UPR-genuttrykk18,19. Dermed kan måling av proteinimporteffektivitet gi omfattende innsikt i organellets helse, mens genuttrykksresponsen kan brukes til å indikere graden av retrograd signalering til kjernen.
Til tross for sin åpenbare betydning for biogenesen av mitokondrier og for cellulær helse generelt, er importveien i pattedyr mitokondrier bemerkelsesverdig undervurdert. I denne rapporten beskriver vi de spesifikke trinnene som er involvert i måling av import av forløperproteiner til skjelettmuskulatur mitokondrier og gir data for å illustrere importsystemets adaptive respons på endringer i muskler og disuse, noe som illustrerer proteinimportens bidrag til den adaptive plastisiteten til skjelettmuskulaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr som brukes i disse eksperimentene opprettholdes i dyrepleieanlegget ved York University. Forsøkene gjennomføres i samsvar med Canadian Council on Animal Care retningslinjer med godkjenning fra York University Animal Care Committee (Tillatelse: 2017-08).
1. Funksjonell isolasjon av subsarcolemmal og intermyofibrillar mitokondrier fra skjelettmuskulatur
- Reagens forberedelse:
- Klargjør alle buffere og medier som nevnt i tabell 1.
- Sett bufferne på pH 7,4 og oppbevar dem ved 4 °C (opptil 2 uker), unntatt nagraseprotease.
- Forbered fersk nagarse protease (tabell 1) hver gang.
- Vevsfjerning og mincing
MERK: Et flytskjema over trinnene nedenfor for isolering av mitokondrier finnes i figur 1.- Fyll et hetteglass med glasssculler med ~20 ml buffer 1 (tabell 1) og legg det på is.
- Mens musen er under bedøvelse, høst skjelettmuskulaturen (tibialis fremre, quadriceps, gastrocnemius etc.), ca 500-1000 mg, og plasser musklene i scintillation hetteglasset som inneholder kjølt Buffer 1.
MERK: Gassformige isofluran brukes som bedøvelsesmiddel ved 2,5 % ved en strømningshastighet på 0,4 L O2/min. En klemmetest utføres for å sikre at dyret ikke er responsivt. - Etter vevsinnsamling, euthanize dyret via cervical dislokasjon.
- Forkjøl et klokkeglass på isen. Fjern fett eller bindevev fra musklene og hakk vevet på klokkeglasset til det er en homogen slurry.
- Plasser hakket vev i et forhåndskjølt 50 ml plastsenrifugeringsrør (se Materialtabell) og registrer den nøyaktige vekten.
- Fortynn hakket vev 10 ganger med buffer 1 + ATP (tabell 1).
- Homogeniser muskelprøven ved hjelp av en 8 mm homogenisator med to kniver (se Materialtabell) med en effekt på 9,8 Hz i 10 s, slik at ingen synlige biter av muskler gjenstår.
- Sentrifuger prøvene på 800 x g i 10 minutter ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge (se Materialfortegnelser).
MERK: Formålet med dette trinnet er å skille SS og IMF mitokondriefraksjoner. Supernatet inneholder SS mitokondrier, mens pellets inneholder IMF mitokondrier.
- SS mitokondrie isolasjon
- Filtrer supernaten gjennom et enkelt lag med osteklut i et annet sett med 50 ml plastsentrifugeringsrør for å fjerne store rusk eller forurensninger.
- Sentrifuger supernaten ved 9000 x g i 10 minutter ved 4 °C ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge.
- Kast supernaten og resuspender pelletsen i 3,5 ml buffer 1 + ATP.
MERK: Resuspend med en P1000 og gjør dette nøye. Mitokondrier er skjøre organeller. Utfør forsiktig og unngå å berøre pelletsen med pipettespissen. - Sentrifuger prøven ved 9000 x g i 10 min ved 4 °C ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge.
- Kast supernaten med mindre ytterligere behandling for å isolere en cytosolisk brøkdel uten kjerner, mitokondrier og andre organeller er ønsket. Resuspend pelletsen forsiktig i omtrent 95 μL av resuspensasjonsmediet (tabell 1) ved hjelp av en P200 pipette.
MERK: I likhet med trinn 1.3.3, må du unngå å berøre pelletsen med pipettespissen. Volumet av resuspensasjonsmediet kan endres avhengig av pelletsens størrelse. Dette er SS mitokondriefraksjonen, som kan lagres på is til IMF-fraksjonen er isolert. Om ønskelig kan den cytosoliske fraksjonen, uten organeller, isoleres ved å sentrifugere supernaten ved 100.000 x g i en ultracentrifuge (se Materialtabell) og deretter kaste pelletsen.
- IMF mitokondrie isolasjon
- Fortynn pelletsen fra trinn 1.2.8 med 10 ganger buffer 1 + ATP. Resuspend ved hjelp av en Teflon pestle ved å forsiktig blande pellets og buffer sammen til prøven er konsistent.
- Homogeniser prøven ved hjelp av en 8 mm homogenisator med to kniver (se Materialtabell) med en effekt på 9,8 Hz i 10 s.
- Sentrifuger prøven ved 800 x g i 10 min ved 4 °C ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge.
- Kast den supernate og fortynn IMF mitokondriepellet 10 ganger ved hjelp av Buffer 2 og resuspend ved hjelp av Teflon pestle ved å blande forsiktig til den er homogen.
- Tilsett 25 μL/g vev til 10 mg/ml nagarseprotease (tabell 1) og plasser sentrifugeringsrøret på siden på is, bland forsiktig hvert minutt ved å gynge rørsiden til siden.
MERK: Tilsetningen av nagarse bidrar til å frigjøre IMF-mitokondrier ved å utføre begrenset fordøyelse av myofibrilene. - Etter 5 min, tilsett 20 ml buffer 2 (tabell 1) for å fortynne nagarse protease til inaktivitetspunktet og stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuger straks prøven ved 5000 x g i 5 min ved 4 °C ved hjelp av en høyhastighets sentrifuge.
- Kast supernaten og fortynn pelletsen 10 ganger ved hjelp av Buffer 2 og resuspend ved hjelp av en Teflon pestle ved å blande forsiktig.
- Sentrifuger prøven ved 800 x g i 15 min ved 4 °C for å pelletse det fibrøse materialet.
- Hell supernaten i et nytt sett med 50 ml plastsentrifugerør, forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen, som kan kastes.
- Sentrifuger prøven ved 9000 x g i 10 min ved 4 °C, som i trinn 1.4.7.
- Kast supernatet, tilsett 3,5 ml buffer 2 og resuspender pellet forsiktig ved hjelp av en P1000 pipette.
- Sentrifuger prøven ved 9000 x g i 10 min ved 4 °C, som i trinn 1.4.7.
- Kast den supernate og resuspend pellet forsiktig med omtrent 180 μL resuspension medium ved hjelp av en P200 pipette.
MERK: Volumet på resuspensasjonsmediet kan endres avhengig av pelletsens størrelse. Dette er IMF mitokondriefraksjonen, som kan lagres på is til den skal brukes i importanalysen.
2. Import av mitokondrieprotein
- In vitro transkripsjon
MERK: Disse påfølgende trinnene skisserer hvordan du lager et radiomerket protein for import. Importveien som undersøkes kan diktere valg av målprotein, for eksempel for å evaluere import til mitokondriematrisen, ornitinkarbamyloverføringsase, OKT og malate dehydrogenase, MDH, brukes ofte, mens Tom40 ofte brukes som en indikasjon på import til den ytre mitokondriemembranen. For følgende trinn er det nødvendig med plasmid DNA-koding av det valgte proteinet. Transkripsjonen av plasmid DNA kan gjøres før mitokondrieisolasjonen på en egen dag, og mRNA samlet inn fra dette eksperimentet kan lagres og brukes i fremtidige oversettelses- og importeksperimenter.- Lineariser DNA: Kombiner 40 μL plasmid DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffer og 5 μL restriksjonsenzym og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
MERK: Begrensningen enzymer som brukes kan variere basert på plasmid, som kan kreve en annen enzymbuffer, og eksperimentelle forhold DNA kan brukes i hvilken som helst mengde / volum, da malen kan skaleres opp eller ned. - Rense og utfelle det lineariserte DNA-et ved hjelp av fenol og etanol. Utfør alle de påfølgende trinnene (2.1.3-2.1.15) i sterile 1,5 ml rør, og bruk en sentrifuge på bordplaten (se Materiallisten) for sentrifugeringstrinnene.
- Tilsett riktig volum steril H2O slik at det endelige volumet tilsvarer 400 μL. Tilsett deretter 400 μL fenol.
- Bland kraftig ved inversjon i ~ 10 s, og sentrifuge ved 17.000 x g i 1 min ved 4 °C. Trekk ut og lagre den øvre fasen.
- Tilsett 400 μL fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1, v:v:v).
- Bland kraftig ved inversjon i ca. 10 s, og sentrifuger ved 17 000 g i 1 min ved 4 °C. Trekk ut og lagre den øvre fasen.
- Tilsett 400 μL kloroform:isoamylalkohol (24:1, v:v).
- Bland kraftig ved inversjon i ca. 10 s, og sentrifuger ved 17 000 g i 1 min ved 4 °C. Trekk ut og lagre den øvre fasen.
- Tilsett 40 μL 3M natriumacetat (pH 7,0), og tilsett 1 ml 95% etanol.
- Plasser sterile 1,5 ml rør i -80 °C fryser på siden i 15 minutter.
- Sentrifuger prøvene ved 17 000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Kast supernaten og vask pelletsen med 300 μL 80% etanol.
- Sentrifuger prøvene ved 17 000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Kast den supernate og lufttørk pelletsen. Når pelletsen er tørr, bør den være klar.
- Resuspend pellets i 20 μL steril H2O
- Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer (se Materialtabell) og sørg for at forholdet mellom A260 og 280 er over 1,8.
- Fortynn DNA-et til en konsentrasjon på 0,8 μg/μL i steril H2O.
- Transkriber DNA: Kombiner plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steril H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), blandingen, blandingen som nevnt trinn 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) og en passende RNA polymerase (4.8 μL) for å danne "en reaksjon blanding" (totalt volum = 121.6 μL) og inkubere i 90 min ved optimal temperatur for polymerase (37 °C for Tase polymer; 40 °C for SP6-polymerase)
- For å forberede blandingen tilsettes 200 μL 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL 1 M MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM spermidin, 100 μL 0,5 M DTT og 200 μL steril H0.
MERK: Reaksjonen kan skaleres opp eller ned i volum så lenge de medfølgende proporsjonene av reagenser opprettholdes. RNA-polymerasen som brukes, dikteres av bakteriell promotorsekvens i plasmidet som brukes. - Deretter renser og utfeller du mRNA ved hjelp av fenol og etanol som i trinn 2.1.2-2.1.15. Ta volumet opp til 400 μL med steril H2O (tilsett 280 μL) og fortsett som beskrevet i trinn 2.1.2-2.1.15. Resuspend den endelige pellet i 20 μL steril H2O.
- Mål konsentrasjonen av mRNA ved hjelp av et spektrofotometer, sørg for at A260: 280-forholdet er ~ 2,0.
- Fortynn mRNA til 2,8 μg/μL i steril H2O, og oppbevar ved -20 °C i 50 μL aliquots.
- Lineariser DNA: Kombiner 40 μL plasmid DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffer og 5 μL restriksjonsenzym og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- In vitro oversettelse
MERK: Oversettelsen av ønsket DNA må utføres samme dag som importeksperimentet. Dette eksperimentet krever bruk av radiomerkede aminosyrer, og derfor må brukeren ha tillatelse til bruk av radioisotoper, og all håndtering og avhending må være i samsvar med institusjonens retningslinjer/krav. Trinn som involverer radioisotope sikkerhetstiltak har blitt utelatt eller beskrevet kort, da disse sannsynligvis vil variere basert på institusjonen.- Forbered nok oversettelsesreaksjonsblanding (tabell 2) til å levere ~20 μL per prøve av mitokondrier som skal brukes i importeksperimentet, og inkluder det samme volumet for en oversettelsesbane.
- Inkuber reaksjonen i 30 min ved 30 °C (tiden kan variere med mRNA, 25-60 min).
- Registrer 35S-metioninbruken i henhold til institusjonens radioaktive sikkerhetskrav og kast alt som har kommet i kontakt med radioisotopen i henhold til institusjonens retningslinjer.
- Protein import
MERK: Nyisolerte mitokondrier kreves for de neste trinnene. Se mitokondrieisolasjonsprotokollen. Andre isolasjonsmetoder kan brukes så lenge mitokondriene er levedyktige og funksjonelle. For de påfølgende trinnene blir mitokondrieprøvene som brukes, resuspendert i en resuspensasjonsbuffer som beskrevet ovenfor (Tabell 1). Proteinkonsentrasjonen av mitokondrieprøven må også måles før importanalysen startes.- Omtrent 15 min etter starten av oversettelsesreaksjonen, aliquot 90 μg mitokondrier i sterile 1,5 ml rør og pre-inkubere ved 30 °C i ~10 min.
MERK: Aliquot flere mitokondrier enn det som faktisk vil bli brukt i eksperimentet; bare 75 μg vil faktisk bli brukt. Imidlertid er aliquoting i overkant ikke et krav. - I et friskt sett med sterile 1,5 ml rør kombinerer du 75 μg mitokondrier med 18 μL av oversettelsesreaksjonen og inkuberer ved 30 °C for ønsket tid.
- Hold det gjenværende volumet av oversettelsesreaksjonen på is; Dette vil bli brukt senere.
MERK: Import er en tidsavhengig prosess, så det kan være forsvarlig å starte med et tidskurseksperiment som spenner i inkubasjonstider fra 1-60 min. En typisk reaksjonstid er 30 min. - I løpet av denne tiden, forberede sukrose puten ved å kombinere 1 g sukrose, 200 μL av 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL av 1 M HEPES (pH 7.4), og bringe volumet til 5 ml ved hjelp av steril H2O.
- Forbered et nytt sett med sterile 1,5 ml rør som tilsvarer hvert rør i importreaksjonen. Aliquot 600 μL av sukroseputen i hvert rør og hold på is til importreaksjonen er over.
- For å avslutte importreaksjonen etter riktig inkubasjonstid, fjern røret fra 30 °C, legg det på is og overfør deretter importreaksjonen forsiktig på toppen av røret med sukroseputen.
MERK: Dette trinnet må gjøres veldig sakte for å sikre at mitokondriene ikke blir skadet / sprukket. Sukroseputen bidrar til å bremse migreringen av mitokondriene og "putene" nedstigningen til bunnen av røret under det påfølgende sentrifugeringstrinnet. - Sentrifuger prøvene + sukroseputen ved 17 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Forbered bruddbufferen ved å kombinere 25 ml 2,4 M sorbitol, 2 ml 1 M HEPES (pH 7,4) og 72 ml dobbeltdestillert H2O.
- Klargjør lysisbuffer for SDS-PAGE gelelektroforese: Kombiner 50 ml oppvarmet glyserol, 11,5 g SDS, 31,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) og ta volumet til 500 ml med dobbeltdestillert H2O.
- For prøvepreparering blander du 475 μL lysisbuffer med 25 μL β-mercaptoetanol som skal brukes i et senere trinn.
MERK: Lysis buffer kan gjøres på forhånd og lagres ved romtemperatur; Imidlertid skal tilsetningen av β-mercaptoetanol gjøres frisk. - Bruk en P1000 pipette, fjern forsiktig supernaten og ikke forstyrr pelletsen. Kast supernaten i en egnet radioaktiv avfallsbeholder.
- For import til den ytre membranen, utfør dette ved hjelp av Tom40, resuspend pellet i 50 μL nylaget 0,1 M natriumkarbonat (pH 11,5) og inkuber på is i 30 minutter.
- Etter inkubasjonen sentrifugerer du prøven 14 000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Dette trinnet gjøres bare for ytre membranimportreaksjoner.
- For å forberede prøvene for SDS-PAGE elektroforese, tilsett 20 μL bruddbuffer, 20 μL lysisbuffer og β-mercaptoethanol og resuspend godt. Tilsett 5 μL prøvefargestoff.
- Forbered kontroll-/oversettelsesbanen ved å kombinere 3 μL av den gjenværende oversettelsesreaksjonen fra trinn 2.3.3 med 37 μL lysisbuffer og 5 μL prøvefargestoff. Bland godt.
- Kok prøvene i 5 min ved 95 °C og spinn forsiktig ned med lav hastighet for å unngå pelletering av mitokondrier.
- Påfør prøvene på en SDS polyakrylamidgel.
MERK: Gelprosenten og påfølgende kjøretid vil avhenge av hvilket protein som importeres. For eksempel er OCT 37 kDa, og det modne bearbeidede båndet er litt mindre; Derfor tillater en 12% gel god separasjon av disse båndene. - Når elektroforesen er fullført, fjern gelen og legg den i dobbeltdestillert H2O.
- Kok gelen i 5% TCA i en avtrekkshette i 5 min, rør kontinuerlig / flytt gelen for å unngå sprekker.
MERK: TCA bidrar til å størkne gelen for visualisering; Dette kan gjøres i en metallbrett over en Bunsen brenner. Bruk nok TCA til å sjenerøst dekke gelen, ~ 1/2 full. - Fjern gelen og legg den tilbake i dobbeltdestillert H2O. Agitate den på en roterende plate i 1 min ved ~ 50 rpm.
- Vask gelen i 10 mM Tris på en roterende plate i 5 min ved ~ 50 rpm, igjen ved hjelp av nok til å sjenerøst dekke gelen, ~ 1/2 av beholderen.
- Utfell proteinet ved å vaske gelen i 1 M salisylsyre på en roterende plate i 30 min, igjen ved hjelp av nok salisylsyre til å sjenerøst dekke gelen, ~ 1/2 av beholderen som brukes.
- Dehydrer gelen som beskrevet i trinn 2.3.24-2.3.31.
MERK: Dette kan gjøres på flere måter. En geltørker (se Materialfortegner) gir et tidseffektivt alternativ (beskrevet nedenfor); Andre kommersielt tilgjengelige metoder/sett kan imidlertid brukes som kan være mer kostnadseffektive, men mer tidkrevende. Geltørkingssett kan brukes som et alternativ som ikke krever bruk av varme eller sug, men i stedet tillater gelen å lufttørke mellom cellofanplater for å forhindre forvrengning. - Legg et stort ark med blottingspapir ned på geltørkerens porøse seng. Legg ett ark med papirhåndkle i området der gelen skal påføres.
- Klipp et 15 cm x 20 cm blottingspapir og legg det på papirhåndkleet.
- Scoop ut gelen fra beholderen ved hjelp av et annet stykke 15 cm x 20 cm blotting papir og legg den ned flatt på toppen av det første stykket.
- Klipp et litt større stykke plastfolie, ~ 20 cm x 25 cm, og legg det ned på gel, og sørg for ingen bretter eller bobler under omslaget.
MERK: Dette kan ta noen forsøk, men det er viktig at det ikke er noen fanget luftlommer. - Legg forsiktig ned plastdekselet på geltørkeren over toppen av omslaget, og sørg igjen for at det ikke er bobler eller bretter.
- Slå på pumpen/vakuumet og sørg for at plastdekselet har dannet en forsegling. Test forseglingen ved å løfte et hjørne av plastdekselet og vent til det forsegles på nytt.
- Lukk geltørkeren og løp i 90 min. Still inn temperaturen til å starte ved 30 °C, gradvis nå 80 °C, og gå deretter tilbake til 30 °C på slutten av løpet.
- Når gelen er dehydrert, vil den størkne og føles papirtynn. Pakk gelen i plastfolie som brukes i tørkeprosessen.
- Legg den dehydrerte gelen i en filmkassett med en fosforfilm (se Materialbord), med den hvite siden vendt mot gelen. Eksponeringstidene varierer, men kan være 24-48 timer for visualisering av bånd.
- Visualiser ved hjelp av autoradiografi ved hjelp av en passende imager som er i stand til fosforavbildning.
- Omtrent 15 min etter starten av oversettelsesreaksjonen, aliquot 90 μg mitokondrier i sterile 1,5 ml rør og pre-inkubere ved 30 °C i ~10 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har i stor grad illustrert at denne protokollen er en gyldig analyse for å bestemme importhastigheten til funksjonelle og intakte isolerte skjelettmuskulatur mitokondrier. Sammenlignet med ubehandlede forhold er import av typiske forløperproteiner som malate dehydrogenase (MDH) i matrisen følsom for membranpotensial fordi det kan hemmes av valinomycin, en respiratorisk kjedekobling (figur 2A). Import hindres også når mitokondrie indre og ytre membraner er solubilized i nærvær av vaskemiddel Triton X-100. Importprosessen er følsom for tilstedeværelsen av ekstern ATP, som tjener til å utfolde forløperproteiner for translokasjon over membranene, og styres tett av respirasjonshastigheten og ATP-tilsetningen (data ikke vist20). Det observeres også tydelige forskjeller i importen mellom intermyofibrillar og subsarcolemmal mitokondriefraksjoner, blant annet på grunn av variasjoner i proteinimportmaskiners uttrykk, samt luftveiene mellom disse mitokondriene (figur 2B).
Mitokondrier i skjelettmuskulatur er svært dynamiske organeller som reagerer lett på endringer i energietterspørselen. Mitokondrieinnhold i muskelen øker etter perioder med kronisk trening eller som svar på elektrisk stimuleringsindusert kontraktilaktivitet (se for gjennomgang21). For eksempel forbedrer 7 dager med kronisk kontraktil aktivitet av rotte skjelettmuskulatur import til OM og matrise med henholdsvis 1,6 ganger og 1,4 ganger, henholdsvis22 (figur 3A, 3B). Disse endringene i mitokondrieinnhold blir delvis forårsaket av endringer i kapasiteten til mitokondrieproteinimportsystemet. Faktisk kan et nært forhold mellom importraten av forløperproteiner og et godt estimat av mitokondrieinnhold, målt ved den komplekse IV-markøren cytokromoksidase under kontroll eller denerverte forhold, illustreres23 (figur 3C).
Tilpasningsevnen til importsystemet i muskel til endringer i kontraktil aktivitet tyder på at trening kan brukes som behandling for å løse feil i importveien hvis identifisert. Under undersøkelsen av mitokondriemediert apoptose ved hjelp av Bax-Bak doble knockout-dyr, la vi merke til at det reduserte mitokondrieinnholdet i musklene til disse eksperimentelle dyrene ble ledsaget av en reduksjon i importen av forløperproteiner i matrisen. Deretter undersøkte vi muligheten for at øvelsen kunne gjenopprette denne importkapasiteten. Faktisk, etter 6 uker med frivillig hjulkjøringstrening, ble proteinimport gjenopprettet for å kontrollere nivåene i knockout-dyrene24, noe som illustrerer den adaptive plastisiteten til importveien for å redde mitokondrieinnhold og funksjon (figur 4).
Figur 1: Skjematisk for arbeidsflyten for isolering av SS og IMF mitokondrier fra skjelettmuskulatur basert på forrige arbeid8. Denne protokollen tillater isolering av funksjonelle mitokondrier basert på deres geografiske plassering innen skjelettmuskulatur. SS mitokondrier frigjøres raskere og lettere, mens IMF-mitokondriene krever et ytterligere fordøyelsestrinn med protease for å løsne dem fra myofibrilene. Vær oppmerksom på at isolasjonen av disse subfraksjonene kan gjøres sammen. En oppdatert, lignende prosedyre har nylig blitt publisert25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Proteinimport til mitokondriematrisen. (A) Normale importrater for MDH vises i SS- og IMF-mitokondrier (bane 4 og 7) og oversettelsesproduktet til forløperen MDH (bane 1). Det nedre båndet representerer den importerte modne MDH. Tilsetning av valinomycin hemmer MDH proteinimport i matrisen av SS og IMF mitokondrier, da denne uncoupler sprer membranpotensialet (baner 2 og 5). Triton-X er et vaskemiddel som solubiliserer den indre membranen, og dermed hemmer MDH-import til disse subfraksjonene (bane 3 og 6). Proteinimport ble utført i økende tidsvarighet, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min og 30 min. Disse dataene illustrerer at import er en tidsavhengig prosess, og også at SS- og IMF-mitokondrier har forskjellige priser eller kapasiteter for import (B). TL, oversettelsesbane; VAL, valinomycin; TRI, Triton-X; CTL, kontroll; SS, subsarcolemmal; IMF, intermyofibrillar. Denne figuren ble endret fra Takahashi M &hood DA20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Proteinimport er tilpasningsdyktig og tett knyttet til estimater av mitokondrieinnhold. Sprague Dawley rotter ble utsatt for elektrisk stimulering for å indusere kontraktil aktivitet, en modell for trening. (A) Tom40 import til OM var 1,6 ganger høyere i muskel fra kronisk stimulerte dyr sammenlignet med kontroller til enhver tid. (B) OCT import til mitokondrie matrise ble økt ved hver gang inkubering, og totalt sett resulterte dette i en 1,4 ganger økning i mitokondrier fra kronisk stimulert muskel. (C) Importen er positivt korrelert med en indeks over mitokondrieinnhold, vurdert av COX-aktivitet, r = 0,69. Disse målingene ble tatt fra dyr som ble utsatt for fortetting, noe som har vist seg å redusere mitokondrieinnholdet og importhastigheten. Con, kontroll; Den, denervated; Stim, stim, stim, stim TL, oversettelsesbane; * p < 0,05. Figur 3A og 3B ble tilpasset fra Joseph A-M &hood DA22 og 3C fra Singh B &hood DA23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Trening redder importfeil in vivo. Bax/Bak doble knockout-dyr viser redusert proteinimport til mitokondriematrisen med 37%. Seks uker med frivillig hjulkjøring reddet importfeilen til kontrollnivåer. WT, wildtype; DKO, dobbel knockout; TL, oversettelsesbane; * p < 0,05 hovedeffekt av genotype; ¶ p < 0,05 hovedeffekt av trening. Denne figuren ble tilpasset fra Zhang Y et al.24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer 1: | Buffer 1 + ATP: | Buffer 2: | Resuspension medium: | Nagarse protease |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/ml i buffer 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 10 mM MOPS | MERK: Gjør fersk og hold på is |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0,2 % BSA | |
| 50 mM tris | 50 mM tris | 50 mM tris | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tabell 1: Buffere og resuspension media.
| % av reaksjonsvolumet | 1 Reaksjonsblanding | |
| Retikulosytt Lysate | 64.10% | 11,8 μL |
| Aminosyrer (-metionin) | 2.20% | 0,4 μL |
| Steril H2O | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 S-metionin | 7.20% | 1,33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1,0 μL |
| Totalt volum | 18,5 μL | |
| NOTAT: | ||
| 1) Tilsett 35S-metionin sist; | ||
| 2) Tine lysatet sakte på is, og begrens fryse-/tinesyklusene til to. Det anbefales at lysatet blir aliquoted ved ankomst | ||
| 3) Volumet av mRNA kan justeres for å optimalisere translasjonseffektiviteten ved å endre det sterile H2O-volumet tilsvarende. | ||
Tabell 2: Blanding av reaksjon av oversettelse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrier er unikt avhengige av uttrykket og koordineringen av både nukleære og mitokondriegenomer for deres syntese og ekspansjon i celler. Imidlertid koder atomgenomet det store flertallet (99%) av mitokondrieproteomet, og dette understreker betydningen av proteinimportmaskineriet for å støtte mitokondriebiogenese. Import fungerer også som en viktig signalhendelse, da manglende import kan fremme initiering av utfoldet proteinrespons og / eller mitophagy15,16,26. Siden import er avhengig av uttrykk for flere funksjonelle kanaler og anstander, et intakt membranpotensial, samt tilgjengeligheten av ATP, kan evalueringen av mitokondrieproteinimport gi verdifull innsikt i organellets helse- og energistatus.
Evalueringen av proteinimportkapasitet til mitokondrier krever isolering av organellen fra det omkringliggende vevet ved hjelp av standard differensialsentrifugeringsteknikker. Import vurderes på samme måte som man vil evaluere Vmax av mitokondrie enzym aktiviteter, på en svært kontrollert måte avhengig av tid og substrat konsentrasjon og uavhengig av cellulære cytosoliske påvirkninger. Isolasjonsmetoden som presenteres her, eller lignende gjengivelser av den, har blitt brukt i mange år for å evaluere mitokondrie respirasjon og enzymaktiviteter8,9,10,11. Denne teknikken er ikke uten begrensninger, da den forstyrrer den normale morfologien til mitokondrier som de eksisterer i situ27, som i skjelettmuskulatur er svært kompleks, alt fra små sfæroidstrukturer, til et svært forgrenet retikulært nettverk3, avhengig av deres subsarcolemmal eller intermyofibrillar plassering i muskelcellen. I tillegg har bruken av protease nagarse blitt gransket3,28. En oppdatering av denne metoden, ved hjelp av trypsin i stedet for nagarse, har nylig blitt publisert25, og trypsin har blitt brukt av andre til å isolere muskel mitokondrier29. Faktisk kan enhver alternativ isolasjonsmetode som gir funksjonelt intakt mitokondrier brukes, inkludert teknikker som ikke bruker proteaser30 eller de som er designet for små biopsi-størrelse prøver fra menneskelig muskel31. Metoden som presenteres her har fordelen av å isolere SS mitokondrier raskt og enkelt, men et større utbytte og renhet av mitokondrier kan oppnås gjennom isolasjon av IMF-subfraksjonen. Hvis det gjøres nøye, kan denne isolasjonsprotokollen resultere i funksjonelt intakte organeller med høyt respiratorisk kontrollforhold, noe som indikerer passende hastigheter på tilstand 3 og 4 åndedrett8.
Det er også viktig for måling av mitokondrieproteinimport at disse organellene opprettholder sitt membranpotensial, da import over den indre membranen er avhengig av denne elektroforetiske protonmotivkraften, som tjener til å tiltrekke seg positivt ladede forløpersekvenser og bidra til å formidle transporten av forløperen inn i det negativt ladede matriserommet. Under slike forhold kan sammenligninger av mitokondriefunksjon og import evalueres mellom fysiologisk relevante eksperimentelle situasjoner, for eksempel trening, aldring og muskeldisuse. I så måte har tidligere arbeid vist at import er en svært tilpasningsdyktig vei som reagerer på endrede tilstander av muskelbruk og disuse og er følsom for hemming via overdreven ROS-utslipp10,22,23,32. Denne plastisiteten skyldes delvis adaptive endringer i uttrykket av proteinimportmaskinkomponentene. Siden denne teknikken er avhengig av isolering av mitokondrier, fjernes enhver regulering på importveien som kan stamme fra cytosoliske faktorer eller interorganelle crosstalk fra tolkningen av eksperimentet. Dette er både en begrensning og en styrke av teknikken, da konklusjoner kan gjøres av kapasiteten til selve importveien (ligner Vmax for enzymaktivitet), men forbigående eller eksterne signaler som kan oppstå med den eksperimentelle modellen, kan gå tapt. For å omgå dette er det mulig å inkubere importreaksjonen med et utvalg av den cytosoliske fraksjonen, isolert som beskrevet ovenfor, for å evaluere endringer i det cytosoliske miljøet som kan påvirke importratene, som tidligere gjort tidligere22. I tillegg er importmaskinkomponenter gjenstand for akutte, postoversettelsesendringer som kan endre deres funksjoner. Nyere arbeid har vist at fosforylering av spesifikke TOM-importreseptorer kan knyttes til mitophagy33. Faktisk er et forskningsområde som krever mer oppmerksomhet den akutte moduleringen av importprosessen via iboende signalveier formidlet av ROS eller ved kovalent modifikasjon av importreseptorer og anstander, som dokumentert i gjær og andre lavere organismer34,35.
Proteinimport til mitokondrier representerer en inngangsport til adaptiv organellevekst og er en sensitiv indikator på mitokondriehelse. Å forstå hvordan denne prosessen er regulert kan belyse reguleringen av mitokondriebiogenese, UPR-signalering og initiering av mitophagy. Mitokondrieproteinimport er ikke en mye studert prosess i pattedyr eksperimentelle modeller, og utviklingen av det enorme potensialet for forskning på dette området kan hjelpe oss med å oppnå en større forståelse av sykdommer der mitokondrie dysfunksjon er tydelig eller representerer et attraktivt terapeutisk mål for å fremme mitokondriehelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på annen måte, deklareres av forfatterne.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss fra Washington School of Medicine, og Dr.M.T. Ryan fra La Trobe University for de opprinnelige donasjonene av uttrykksplasmider som ble brukt til denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) til D. A. Hood. D. A. Hood er også innehaver av en Canada Research Chair i Cell Physiology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O.
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
