Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63055

⸱

7 januari 2022

 ,  , 
1Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Science, York University

In dit artikel

Samenvatting

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie. Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Samenvatting

Mitochondriën zijn belangrijke metabole en regulerende organellen die de energievoorziening en de algehele gezondheid van de cel bepalen. In de skeletspieren bestaan mitochondriën in een reeks complexe morfologieën, variërend van kleine ovale organellen tot een breed, reticulumachtig netwerk. Begrijpen hoe het mitochondriale reticulum zich uitbreidt en ontwikkelt als reactie op diverse stimuli zoals veranderingen in de energievraag, is al lang een onderwerp van onderzoek. Een belangrijk aspect van deze groei, of biogenese, is de import van precursoreiwitten, oorspronkelijk gecodeerd door het nucleaire genoom, gesynthetiseerd in het cytosol en getransloceerd in verschillende mitochondriale subcompartimenten. Mitochondriën hebben een geavanceerd mechanisme ontwikkeld voor dit importproces, waarbij veel selectieve binnen- en buitenmembraankanalen betrokken zijn, bekend als de eiwitimportmachinerie (PIM). Import in het mitochondrion is afhankelijk van levensvatbare membraanpotentiaal en de beschikbaarheid van organel-afgeleide ATP door oxidatieve fosforylering. Daarom kan de meting ervan dienen als een maat voor de gezondheid van organellen. De PIM vertoont ook een hoge mate van adaptieve plasticiteit in de skeletspieren die nauw verbonden is met de energiestatus van de cel. Van oefeningstraining is bijvoorbeeld aangetoond dat het de importcapaciteit verhoogt, terwijl spierontwensen deze vermindert, samenvallend met veranderingen in markers van mitochondriale inhoud. Hoewel eiwitimport een cruciale stap is in de biogenese en uitbreiding van mitochondriën, wordt het proces niet op grote schaal bestudeerd in skeletspieren. Dit artikel schetst dus hoe geïsoleerde en volledig functionele mitochondriën uit skeletspieren kunnen worden gebruikt om de eiwitimportcapaciteit te meten om een beter begrip van de betrokken methoden en een waardering van het belang van de route voor organelomzet bij lichaamsbeweging, gezondheid en ziekte te bevorderen.

Inleiding

Mitochondriën zijn organellen die bestaan in complexe morfologieën in verschillende celtypen en waarvan wordt erkend dat ze een toenemend scala aan functies bezitten die van cruciaal belang zijn voor de cellulaire gezondheid. Als zodanig kunnen ze niet langer alleen worden gereduceerd tot energieproducerende organellen. Mitochondriën zijn belangrijke metabole regulatoren, determinanten van het lot van cellen en signaleringshubs, waarvan de functies kunnen dienen als nuttige indicatoren voor de algehele cellulaire gezondheid. In skeletspiercellen onthullen elektronenmicroscopiestudies de aanwezigheid van geografisch verschillende subsarcolemmale (SS) en intermyofibrillaire (IMF) mitochondriën, die een mate van connectiviteit vertonen1,2,3,4 waarvan nu wordt erkend dat ze zeer dynamisch zijn en zich kunnen aanpassen aan veranderingen in skeletspieractiviteitsniveaus, evenals met leeftijd en ziekte. Mitochondriale inhoud en functie in spieren kunnen op verschillende manieren worden beoordeeld5,6, en traditionele methoden van organelisolatie zijn toegepast om de ademhalings- en enzymatische capaciteiten (Vmax) van mitochondriën beter te begrijpen die verschillen van de invloed van het cellulaire milieu7,8. In het bijzonder hebben deze traditionele methoden subtiele biochemische verschillen onthuld tussen mitochondriën geïsoleerd uit subsarcolemmale en intermyofibrillaire regio's, wat mogelijke functionele implicaties voor het metabolisme in deze subcellulaire regio's ligt8,9,10,11.

De biogenese van mitochondriën is uniek in het vereisen van de bijdrage van genproducten uit zowel nucleair als mitochondriaal DNA. De overgrote meerderheid hiervan is echter afgeleid van de kern, omdat mtDNA-transcriptie alleen leidt tot de synthese van 13 eiwitten. Aangezien mitochondriën normaal gesproken >1000 eiwitten bevatten die betrokken zijn bij diverse metabole routes, vereist biogenese van het organel een strak gereguleerd middel voor import en assemblage van precursoreiwitten uit het cytosol in de verschillende mitochondriale subcompartimenten om de juiste stoichiometrie en functie te behouden12,13. Nucleair gecodeerde eiwitten bestemd voor mitochondriën dragen normaal gesproken een mitochondriale targetingsequentie (MTS) die hen op het organel richt en hun subcompartimentale lokalisatie vergemakkelijkt. De meeste matrixgebonden eiwitten bevatten een splijtbare N-terminale MTS, terwijl die bestemd voor het buitenste of binnenste mitochondriale membraan meestal interne targetingdomeinen hebben14. Het importproces wordt uitgevoerd door een reeks verschillende kanalen die meerdere mogelijkheden bieden voor toegang tot het organel13. De translocase van het buitenmembraan (TOM) complex pendelt voorlopers van het cytosol naar de intermembraanruimte, waar ze worden herkend door de translocase van het binnenmembraan (TIM) complex. Dit complex is verantwoordelijk voor het importeren van nucleair gecodeerde precursoren in de matrix, waar proteasen de N-terminal splitsen en zich richten op presequence. Eiwitten bestemd voor het buitenmembraan kunnen rechtstreeks in dit membraan worden ingebracht via het TOM-complex, terwijl die bestemd voor het binnenmembraan worden ingebracht door een TIM-eiwit, met name TIM22. Na hun import worden eiwitten verder verwerkt door residente proteasen en chaperones en combineren ze vaak om grotere complexen te vormen, zoals die in de elektronentransportketen.

Mitochondriale eiwitimport zelf dient ook als een meting van mitochondriale gezondheid, omdat dit proces afhankelijk is van de aanwezigheid van membraanpotentiaal en een bron van energie in de vorm van ATP15. Wanneer bijvoorbeeld de membraanpotentiaal wordt gedissipeerd, kan eiwitkinase PINK1 niet door het organel worden opgenomen, en dit leidt tot fosforyleringssignalen die het begin van de afbraak van het organel veroorzaken via een route die mitofagie wordt genoemd16,17. Onder vergelijkbare omstandigheden, wanneer de import wordt belemmerd, kan het eiwit ATF5 het organel niet binnendringen en transloceert het vervolgens naar de kern, waar het dient als transcriptiefactor voor de up-regulatie van UPR-genexpressie18,19. Zo kan het meten van eiwitimportefficiëntie uitgebreid inzicht geven in de gezondheid van het organel, terwijl de genexpressierespons kan worden gebruikt om de mate van retrograde signalering naar de kern aan te geven.

Ondanks het duidelijke belang ervan voor de biogenese van mitochondriën en voor de cellulaire gezondheid in het algemeen, is de importroute in mitochondriën van zoogdieren opmerkelijk onderbelicht. In dit rapport beschrijven we de specifieke stappen die betrokken zijn bij het meten van de import van precursoreiwitten in mitochondriën van de skeletspieren en leveren we gegevens om de adaptieve reactie van het importsysteem op veranderingen in spieren en onbruik te illustreren, wat de bijdrage van de eiwitimport aan de adaptieve plasticiteit van skeletspieren illustreert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren die in deze experimenten worden gebruikt, worden onderhouden in de dierenverzorgingsfaciliteit van de Universiteit van York. De experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care met goedkeuring van de York University Animal Care Committee (Permit: 2017-08).

1. Functionele isolatie van subsarcolemmale en intermyofibrillaire mitochondriën uit de skeletspieren

  1. Reagens voorbereiding:
    1. Bereid alle buffers en media voor zoals vermeld in tabel 1.
    2. Stel de buffers in op pH 7,4 en bewaren bij 4 °C (tot 2 weken), behalve nagrasprotease.
    3. Bereid elke keer verse nagarse protease (tabel 1).
  2. Weefselverwijdering en gehakt
    OPMERKING: Een stroomdiagram van de onderstaande stappen voor de isolatie van mitochondriën is opgenomen in figuur 1.
    1. Vul een glazen injectieflacon met sprankelende injectieflacon met ~20 ml buffer 1 (tabel 1) en plaats deze op ijs.
    2. Terwijl de muis onder narcose is, oogst skeletspieren (tibialis anterior, quadriceps, gastrocnemius enz.), ongeveer 500-1000 mg, en plaats de spieren in de scintillatieflacon met gekoelde Buffer 1.
      OPMERKING: Gasvormig isofluraan wordt gebruikt als een verdovingsmiddel bij 2,5% bij een stroomsnelheid van 0,4 L O2/min. Een knijptest wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het dier niet reageert.
    3. Na weefselverzameling euthanaseer het dier via cervicale dislocatie.
    4. Pre-chill een horlogeglas op ijs. Verwijder vet of bindweefsel uit de spieren en hak het weefsel op het horlogeglas fijn totdat het een homogene brij is.
    5. Plaats het gehakte weefsel in een voorgekoelde plastic centrifugatiebuis van 50 ml (zie materiaaltabel) en noteer het exacte gewicht.
    6. Verdun het gehakte weefsel 10-voudig met Buffer 1 + ATP (tabel 1).
    7. Homogeniseer het spiermonster met behulp van een 8 mm twin-blade homogenisator (zie Tabel met materialen) bij een uitgangsvermogen van 9,8 Hz gedurende 10 s, zodat er geen zichtbare brokken spier overblijven.
    8. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 800 x g met behulp van een snelle centrifuge (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Het doel van deze stap is om SS- en IMF-mitochondriale fracties te scheiden. De supernate bevat SS-mitochondriën, terwijl de pellet IMF-mitochondriën bevat.
  3. SS mitochondriale isolatie
    1. Filter de supernate door een enkele laag kaasdoek in een andere set plastic centrifugatiebuizen van 50 ml om groot vuil of verontreinigingen te verwijderen.
    2. Centrifugeer de supernate bij 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met behulp van een snelle centrifuge.
    3. Gooi de supernate weg en resuspend de pellet in 3,5 ml buffer 1 + ATP.
      OPMERKING: Resuspend met een P1000 en doe dit zorgvuldig. Mitochondriën zijn fragiele organellen. Voer voorzichtig uit en raak de pellet niet aan met de pipetpunt.
    4. Centrifugeer het monster bij 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met behulp van een snelle centrifuge.
    5. Gooi de supernate weg, tenzij verdere verwerking om een cytosolische fractie zonder kernen, mitochondriën en andere organellen te isoleren gewenst is. Resuspend de pellet zorgvuldig in ongeveer 95 μL van het resuspensiemedium (tabel 1) met behulp van een P200-pipet.
      OPMERKING: Net als bij stap 1.3.3, vermijd het aanraken van de pellet met de pipetpunt. Het volume van het resuspensiemedium kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van de pellet. Dit is de mitochondriale fractie van SS, die op ijs kan worden opgeslagen totdat de IMF-fractie is geïsoleerd. Indien gewenst kan de cytosolische fractie, zonder organellen, worden geïsoleerd door de supernate op 100.000 x g in een ultracentrifuge te centrifugeren (zie Tabel met materialen) en vervolgens de pellet weg te gooien.
  4. Mitochondriale isolatie van het IMF
    1. Verdun de pellet vanaf stap 1.2.8 10-voudig in Buffer 1 + ATP. Resuspend met behulp van een teflon stamper door de pellet voorzichtig te mengen en samen te bufferen totdat het monster consistent is.
    2. Homogeniseer het monster met behulp van een 8 mm twin-blade homogenisator (zie tabel met materialen) bij een uitgangsvermogen van 9,8 Hz gedurende 10 s.
    3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 800 x g met behulp van een snelle centrifuge.
    4. Gooi de supernate weg en verdun de mitochondriale pellet van het IMF 10-voudig met Buffer 2 en resuspend met de teflon stamper door voorzichtig te mengen totdat deze homogeen is.
    5. Voeg 25 μL/g weefsel toe aan 10 mg/ml nagarseprotease (tabel 1) en plaats de centrifugatiebuis op zijn kant op ijs, waarbij elke minuut voorzichtig wordt gemengd door de buis naast elkaar te wiegen.
      OPMERKING: De toevoeging van nagarse helpt imf-mitochondriën te bevrijden door een beperkte vertering van de myofibrillen uit te voeren.
    6. Voeg na 5 minuten 20 ml buffer 2 (tabel 1) toe om het nagarse-protease te verdunnen tot het punt van inactiviteit en de spijsvertering te stoppen.
    7. Centrifugeer het monster onmiddellijk bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een snelle centrifuge.
    8. Gooi de supernate weg en verdun de pellet 10-voudig met Buffer 2 en resuspend met een teflon stamper door voorzichtig te mengen.
    9. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 800 x g om het vezelmateriaal te pelleteren.
    10. Giet de supernate in een nieuwe set plastic centrifugebuizen van 50 ml, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord, die kan worden weggegooid.
    11. Centrifugeer het monster bij 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C zoals in stap 1.4.7.
    12. Gooi de supernate weg, voeg 3,5 ml Buffer 2 toe en voer de pellet voorzichtig opnieuw op met een P1000-pipet.
    13. Centrifugeer het monster bij 9.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C zoals in stap 1.4.7.
    14. Gooi de supernate weg en resuspend de pellet voorzichtig met ongeveer 180 μL resuspensiemedium met behulp van een P200-pipet.
      OPMERKING: Het volume van het resuspensiemedium kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van de pellet. Dit is de mitochondriale fractie van het IMF, die op ijs kan worden opgeslagen totdat deze wordt gebruikt in de importtest.

2. Mitochondriale eiwitimport

  1. In vitro transcriptie
    OPMERKING: In deze volgende stappen wordt beschreven hoe u een radioactief gelabeld eiwit kunt voorbereiden voor import. De onderzochte invoerroute kan de keuze van het doeleiwit dicteren, bijvoorbeeld om de invoer in de mitochondriale matrix te evalueren, ornithinecaramyltransferase, OCT en malaatdehydrogenase, MDH, worden vaak gebruikt, terwijl Tom40 vaak wordt gebruikt als een indicatie van invoer in het buitenste mitochondriale membraan. Voor de volgende stappen is plasmide-DNA vereist dat codeert voor het eiwit naar keuze. De transcriptie van plasmide-DNA kan voorafgaand aan de mitochondriale isolatie op een afzonderlijke dag worden gedaan en het mRNA dat uit dit experiment wordt verzameld, kan worden opgeslagen en gebruikt in toekomstige translatie- en importexperimenten.
    1. Lineariseer het DNA: Combineer 40 μL plasmide DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffer en 5 μL restrictie-enzym en incubateer bij 37 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: De gebruikte restrictie-enzymen kunnen variëren op basis van het plasmide, waarvoor mogelijk een andere enzymbuffer nodig is, en experimentele omstandigheden DNA kan in elke hoeveelheid / volume worden gebruikt, omdat de sjabloon omhoog of omlaag kan worden geschaald.
    2. Zuiver en precipiteer het lineaire DNA met fenol en ethanol. Voer alle volgende stappen (2.1.3-2.1.15) uit in steriele buizen van 1,5 ml en gebruik een tafelcentrifuge (zie materiaaltabel) voor de centrifugatiestappen.
    3. Voeg het juiste volume steriel H2O toe zodat het uiteindelijke volume gelijk is aan 400 μL. Voeg vervolgens 400 μL fenol toe.
    4. Meng krachtig door inversie gedurende ~10 s en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Trek je terug en sla de bovenste fase op.
    5. Voeg 400 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol toe (25:24:1, v:v:v:v).
    6. Meng krachtig door inversie gedurende ~10 s en centrifugeer bij 17.000 g gedurende 1 min bij 4 °C. Trek je terug en sla de bovenste fase op.
    7. Voeg 400 μL chloroform:isoamylalcohol toe (24:1, v:v).
    8. Meng krachtig door inversie gedurende ~10 s en centrifugeer bij 17.000 g gedurende 1 min bij 4 °C. Trek je terug en sla de bovenste fase op.
    9. Voeg 40 μL 3M natriumacetaat (pH 7,0) toe en voeg 1 ml 95% ethanol toe.
    10. Plaats steriele buizen van 1,5 ml in een vriezer van -80 °C gedurende 15 minuten op hun kant.
    11. Centrifugeer de monsters bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    12. Gooi de supernate weg en was de pellet met 300 μL 80% ethanol.
    13. Centrifugeer de monsters bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    14. Gooi de supernate weg en droog de pellet aan de lucht. Zodra de pellet droog is, moet deze helder zijn.
    15. Resuspend de pellet in 20 μL steriel H2O
    16. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer (zie Materiaaltabel) en zorg ervoor dat de A260:280-verhouding hoger is dan 1,8.
    17. Verdun het DNA tot een concentratie van 0,8 μg/μL in steriel H2O.
    18. Transcribeer het DNA: Combineer plasmide (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steriel H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), het mengsel zoals vermeld stap 2.1.19 (15,6 μL), RNAAsine (5,2 μL) en een geschikt RNA-polymerase (4,8 μL) om "één reactiemix" te vormen (totaal volume = 121,6 μL) en incubateer gedurende 90 minuten bij de optimale temperatuur voor het polymerase (37 °C voor T7-polymerase; 40 °C voor SP6 polymerase)
    19. Voeg voor de bereiding van het mengsel 200 μL 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL 1 M MgAc2, 500 μL 4 M KAc, 100 μL 20 mM spermidine, 100 μL 0,5 M DTT en 200 μL steriel H20 toe.
      OPMERKING: De reactie kan in volume omhoog of omlaag worden geschaald zolang de opgegeven verhoudingen van reagentia worden gehandhaafd. Het gebruikte RNA-polymerase wordt bepaald door de bacteriële promotorsequentie in het plasmide dat wordt gebruikt.
    20. Zuiver en precipiteer vervolgens het mRNA met fenol en ethanol zoals in stappen 2.1.2-2.1.1.15. Breng het volume op 400 μL met steriel H2O (voeg 280 μL toe) en ga verder zoals beschreven in stappen 2.1.2-2.1.15. Resuspend de uiteindelijke pellet in 20 μL steriel H2O.
    21. Meet de concentratie mRNA met een spectrofotometer, zorg ervoor dat de A260:280 verhouding ~2,0 is.
    22. Verdun het mRNA tot 2,8 μg/μL in steriel H2O en bewaar bij -20 °C in 50 μL aliquots.
  2. In vitro vertaling
    OPMERKING: De vertaling van het gewenste DNA moet worden uitgevoerd op dezelfde dag van het importexperiment. Dit experiment vereist het gebruik van radioactief gelabelde aminozuren en daarom moet de gebruiker een vergunning hebben voor het gebruik van radio-isotopen en moet alle behandeling en verwijdering in overeenstemming zijn met het beleid / de vereisten van de instelling. Stappen met radio-isotoop veiligheidsmaatregelen zijn weggelaten of kort beschreven, omdat deze waarschijnlijk zullen verschillen op basis van de instelling.
    1. Bereid voldoende translatiereactiemix voor (tabel 2) om ~20 μL per monster mitochondriën te leveren voor gebruik in het importexperiment en neem hetzelfde volume op voor een translatietraject.
    2. Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 30 °C (tijd kan variëren met mRNA, 25-60 min).
    3. Registreer het gebruik van 35S-methionine volgens de radioactieve veiligheidseisen van de instelling en verwijder alles wat in contact is gekomen met de radio-isotoop volgens de richtlijnen van de instelling.
  3. Eiwit import
    OPMERKING: Vers geïsoleerde mitochondriën zijn nodig voor de volgende stappen. Raadpleeg het mitochondriale isolatieprotocol. Andere isolatiemethoden kunnen worden gebruikt zolang de mitochondriën levensvatbaar en functioneel zijn. Voor de volgende stappen worden de gebruikte mitochondriale monsters geresuspendeerd in een resuspensiebuffer zoals hierboven beschreven (Tabel 1). De eiwitconcentratie van het mitochondriale monster moet ook worden gemeten voordat met de importtest wordt begonnen.
    1. Ongeveer 15 minuten na het begin van de translatiereactie, aliquot 90 μg mitochondriën in steriele buizen van 1,5 ml en pre-incuberen bij 30 °C gedurende ~ 10 minuten.
      OPMERKING: Aliquot meer mitochondriën dan wat daadwerkelijk zal worden gebruikt in het experiment; slechts 75 μg zal daadwerkelijk worden gebruikt. Overmaat is echter geen vereiste.
    2. Combineer in een verse set steriele buizen van 1,5 ml 75 μg mitochondriën met 18 μL van de translatiereactie en incubeer bij 30 °C gedurende de gewenste tijd.
    3. Houd het resterende volume van de vertaalreactie op ijs; dit zal later worden gebruikt.
      OPMERKING: Importeren is een tijdsafhankelijk proces, dus het kan verstandig zijn om te beginnen met een tijdsverloopexperiment variërend in incubatietijden van 1-60 minuten. Een typische reactietijd is 30 min.
    4. Bereid gedurende deze tijd het sucrosekussen door 1 g sucrose, 200 μL van 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL van 1 M HEPES (pH 7,4) te combineren en breng het volume op 5 ml met behulp van steriel H2O.
    5. Bereid een nieuwe set steriele buizen van 1,5 ml voor die overeenkomen met elke buis in de importreactie. Aliquoteer 600 μL van het sucrosekussen in elke buis en blijf op ijs totdat de importreactie voorbij is.
    6. Om de invoerreactie na de juiste incubatietijd te beëindigen, verwijdert u de buis van 30 °C, plaatst u deze op ijs en brengt u de invoerreactie voorzichtig over op de buis met het sucrosekussen.
      OPMERKING: Deze stap moet heel langzaam worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de mitochondriën niet worden beschadigd / gescheurd. Het sucrosekussen helpt de migratie van de mitochondriën te vertragen en "dempt" de afdaling naar de bodem van de buis tijdens de daaropvolgende centrifugatiestap.
    7. Centrifugeer de monsters + sucrosekussen bij 17.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    8. Bereid de breekbuffer door 25 ml 2,4 m sorbitol, 2 ml 1 m HEPES (pH 7,4) en 72 ml dubbel gedestilleerd H2O te combineren.
    9. Bereid lysisbuffer voor SDS-PAGE gel-elektroforese voor: combineer 50 ml verwarmde glycerol, 11,5 g SDS, 31,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) en breng het volume op 500 ml met dubbel gedestilleerd H2O.
    10. Meng voor de monstervoorbereiding 475 μL lysisbuffer met 25 μL β-mercaptoethanol voor gebruik in een latere stap.
      OPMERKING: Lysis-buffer kan van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur worden bewaard; de toevoeging van β-mercaptoethanol moet echter vers gebeuren.
    11. Gebruik een P1000 pipet, verwijder voorzichtig de supernate en verstoor de pellet niet. Gooi de supernate weg in een geschikte container voor radioactief afval.
    12. Voer dit uit met Tom40 voor import in het buitenmembraan, resuspend de pellet in 50 μL vers bereid 0,1 M natriumcarbonaat (pH 11,5) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    13. Centrifugeer het monster na de incubatie 14.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Deze stap wordt alleen gedaan voor buitenmembraanimportreacties.
    14. Om de monsters voor te bereiden op SDS-PAGE elektroforese, voegt u 20 μL breukbuffer, 20 μL lysisbuffer en β-mercaptoethanol toe en resuspend well. Voeg 5 μL monsterkleurstof toe.
    15. Bereid de controle-/translatiestrook voor door 3 μL van de resterende translatiereactie uit stap 2.3.3 te combineren met 37 μL lysisbuffer en 5 μL monsterkleurstof. Meng goed.
    16. Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C en draai zachtjes met een lage snelheid naar beneden om te voorkomen dat mitochondriën worden gepelletiseerd.
    17. Breng de monsters aan op een SDS polyacrylamide gel.
      OPMERKING: Het gelpercentage en de daaropvolgende looptijd zijn afhankelijk van welk eiwit wordt geïmporteerd. OCT is bijvoorbeeld 37 kDa en de volwassen verwerkte band is iets kleiner; daarom zorgt een gel van 12% voor een goede scheiding van deze banden.
    18. Zodra de elektroforese is voltooid, verwijdert u de gel en plaatst u deze in dubbel gedestilleerd H2O.
    19. Kook de gel in 5% TCA in een zuurkast gedurende 5 minuten, waarbij de gel voortdurend wordt geroerd/verplaatst om scheuren te voorkomen.
      OPMERKING: TCA helpt de gel te stollen voor visualisatie; dit kan in een metalen bakje boven een Bunsen brander. Gebruik voldoende TCA om de gel royaal te bedekken, ~ 1/2 vol.
    20. Verwijder de gel en plaats hem terug in dubbel gedestilleerd H2O. Roer hem gedurende 1 minuut op een roterende plaat bij ~50 rpm.
    21. Was de gel in 10 mM Tris op een roterende plaat gedurende 5 minuten bij ~ 50 rpm, opnieuw met voldoende om de gel royaal te bedekken, ~ 1/2 van de container.
    22. Precipiteer het eiwit door de gel gedurende 30 minuten in 1 M salicylzuur op een roterende plaat te wassen, opnieuw met voldoende salicyclisch zuur om de gel royaal te bedekken, ~ 1/2 van de gebruikte container.
    23. Droog de gel uit zoals beschreven in stappen 2.3.24-2.3.31.
      LET OP: Dit kan op een aantal manieren. Een geldroger (zie Tabel met materialen) biedt een tijdbesparende optie (hieronder beschreven); er kunnen echter andere in de handel verkrijgbare methoden/kits worden gebruikt die kosteneffectiever maar tijdrovender kunnen zijn. Geldroogkits kunnen worden gebruikt als een alternatief dat niet de toepassing van warmte of zuigkracht vereist, maar in plaats daarvan de gel aan de lucht laat drogen tussen cellofaanvellen om vervorming te voorkomen.
    24. Leg een groot vel vloeipapier op het poreuze bed van de geldroger. Plaats een vel keukenpapier in het gebied waar de gel zal worden aangebracht.
    25. Snijd een stuk 15 cm x 20 cm vloeipapier en leg dit op het keukenpapier.
    26. Schep de gel uit de container met een tweede stuk 15 cm x 20 cm vloeipapier en leg het plat op het eerste stuk.
    27. Snijd een iets groter stuk plasticfolie, ~ 20 cm x 25 cm, en plaats het op gel, zodat er geen vouwen of bubbels onder de wikkel vallen.
      OPMERKING: Dit kan een paar pogingen kosten, maar het is absoluut noodzakelijk dat er geen opgesloten luchtzakken zijn.
    28. Leg voorzichtig het plastic deksel van de geldroger over de folie en zorg er opnieuw voor dat er geen bubbels of vouwen zijn.
    29. Zet de pomp/stofzuiger aan en zorg ervoor dat de kunststof afdekking een afdichting heeft gevormd. Test de afdichting door een hoek van de plastic hoes op te tillen en wacht tot deze opnieuw is afgedicht.
    30. Sluit de geldroger en laat 90 minuten lopen. Stel de temperatuur in om te beginnen bij 30 °C, geleidelijk 80 °C te bereiken en vervolgens aan het einde van de run terug te keren naar 30 °C.
    31. Eenmaal uitgedroogd, zal de gel stollen en flinterdun aanvoelen. Wikkel de gel in de plasticfolie die wordt gebruikt bij het droogproces.
    32. Plaats de gedehydrateerde gel in een filmcassette met een fosforfilm (zie Materialentabel), met de witte kant naar de gel gericht. Belichtingstijden variëren, maar kunnen 24-48 uur zijn voor visualisatie van banden.
    33. Visualiseer met behulp van autoradiografie met behulp van een geschikte imager die in staat is tot fosforbeeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben uitgebreid geïllustreerd dat dit protocol een geldige test is voor het bepalen van de snelheid van import in functionele en intacte geïsoleerde mitochondriën van de skeletspieren. In vergelijking met onbehandelde omstandigheden is de invoer van typische precursoreiwitten zoals malaate dehydrogenase (MDH) in de matrix gevoelig voor membraanpotentiaal omdat het kan worden geremd door valinomycine, een respiratoire ketenontkoppeling (figuur 2A). Import wordt ook belem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Mitochondriën zijn uniek afhankelijk van de expressie en coördinatie van zowel het nucleaire als het mitochondriale genoom voor hun synthese en expansie in cellen. Het nucleaire genoom codeert echter voor de overgrote meerderheid (99%) van het mitochondriale proteoom, en dit onderstreept het belang van de eiwitimportmachinerie bij het ondersteunen van mitochondriale biogenese. Import dient ook als een belangrijke signaleringsgebeurtenis, omdat het niet importeren de initiatie van de ongevouwen eiwitrespons en / of mitofa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er worden geen belangenconflicten, financieel of anderszins, door de auteurs verklaard.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. G.C. Shore van McGill University, Dr. A. Strauss van de Washington School of Medicine en Dr.M.T. Ryan van La Trobe University bedanken voor de originele donaties van expressieplasmiden die voor dit onderzoek werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) aan D.A. Hood. D. A. Hood is ook de houder van een Canada Research Chair in Cell Physiology.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2% BSASigmaA2153
35S-methioninePerkin ElmerNEG709A500UCAankoop vereist een geldige radio-isotoopvergunning
ATPSigmaA7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR PaperThermo Fisher05-714-5
Cassette voor filmKodakKodak Xomatic
CentrifugeerbuisThermo Fisher3138-0050
ChloroformThermo FisherC298-4
DTTSigmaD9779-5G
EDTABioShopEDT002
EGTASigmaE4378
Gel DryerBioRadModel 583
Gel Drying KitSigma of BioRadZ377570-1PAK of OW-GDF-10Er zijn verschillende opties commercieel verkrijgbaar via veel bedrijven, dit zijn slechts enkele voorbeelden.
GlycerolCaledon Laboratory Chemicals5350-1-40
HEPESSigmaH3375
High Speed CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-25 Centrifuge
HomogenisatorIKAT25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, of 3-methylbutanolSigmaI9392
KAcBioShopPOA301.500
KClSigmaP3911
M7GNew England BiolabS1404SVerdun met 1000ul 20mM HEPES om 1mM stock te maken
MgClBioShopMAG510
MgSO4Thermo FisherM65-500
MOPSBioShopMOP001
NaClBioShopSOD001
NTPThermo FisherR0191
OCT Plasmid--Gedoneerd door Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada
pGEM4Z/hTom40 Plasmid--Gedoneerd door Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australië
pGMDH Plasmid--Gedoneerd door Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
PhenolSigmaP4557
Phenol:Chloroform:IsoamyalcoholSigmaP3803Kan ook worden gemaakt met de verstrekte verhouding
Phosphorus FilmFujifilmBAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysatePromegaL4960Vries/ontdooicycli vermijden; verdeel lysate bij aankomst; aminozuren worden ook in het kit geleverd
RNAsinPromegaN2311
Rotor voor High Speed CentrifugeBeckman CoulterJA-25.50
SDSBioShopSDS001.500Let op: schadelijk bij inslikking of inademing, draag een masker.
Sodium acetateBioshopSAA 304
Sodium CarbonateVWRBDH9284
Sodium salicylateMillipore Sigma106601
SorbitolSigmaS6021
SP6 RNA PolymerasePromegaP1085
SpectrophotometerThermo FisherNanodrop 2000
SpermidineSigmaS-2626
SucroseBioShopSUC507
T7 RNA PolymerasePromegaP2075
Tabletop CentrifugeThermo FisherAccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acidThermo FisherA322-500
TrisBioShopTRS001
β-mercaptoethanolSigmaM6250-100ML

Referenties

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83(2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182(2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Mitochondriële biogeneseisolatie van mitochondriëneiwitimportmechanismeSDS-PAGE elektroforesemitochondriële membraanpotentiaaloxidatieve fosforyleringautoradiografische beeldvormingmitochondriële myopathieën
Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.