Summary
ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。
Abstract
ミトコンドリアは、細胞の全体的な健康と同様にエネルギー供給を決定する主要な代謝および調節オルガネラである。骨格筋では、ミトコンドリアは、小さな楕円形のオルガネラから広いレチクルムのようなネットワークに至るまで、一連の複雑な形態に存在する。 ミトコンドリアレチクルムがエネルギー需要の変化などの多様な刺激に対応してどのように拡大し発展するかを理解することは、長い間研究のトピックとなっています。 この成長の重要な側面、または生物形成は、核ゲノムによって元々コードされた前駆体タンパク質の輸入であり、サイトゾルで合成され、様々なミトコンドリアサブコンパートメントに転位する。ミトコンドリアは、タンパク質輸入機械(PIM)として知られている多くの選択的な内膜および外膜チャネルを含む、この輸入プロセスのための洗練されたメカニズムを開発しました。ミトコンドリアへの輸入は、酸化リン酸化による生存可能な膜電位およびオルガネラ由来ATPの利用可能性に依存する。したがって、その測定はオルガネラの健康の尺度として役立ちます。PIMはまた細胞のエネルギー状態に密接に結合される骨格筋の適応可塑性の高レベルを示す。 例えば, 運動訓練は、輸入能力を高めるために示されています, 筋肉の使用が減少しながら, ミトコンドリアの含有量のマーカーの変化と一致.タンパク質のインポートは、ミトコンドリアの生物形成と拡張の重要なステップであるが、このプロセスは骨格筋で広く研究されていません。 本稿では、骨格筋から孤立した完全機能ミトコンドリアを使用してタンパク質の輸入能力を測定し、運動、健康、疾患におけるオルガネラターンオーバー経路の重要性をより深く理解する方法を概説する。
Introduction
ミトコンドリアは、異なる細胞型の複雑な形態に存在するオルガネラであり、細胞の健康に不可欠な機能の増加配列を有すると認識されている。したがって、彼らはもはやエネルギーを生み出すオルガネラに打ちのめすることはできません。ミトコンドリアは、主要な代謝調節因子であり、細胞運命の決定因子であり、シグナルハブであり、その機能は全体的な細胞の健康の有用な指標として役立つ可能性がある。骨格筋細胞では、電子顕微鏡検査研究は、地理的に異なる皮質下(SS)およびミトコンドリア間(IMF)ミトコンドリアの存在を明らかにし、現在は非常にダイナミックで、骨格筋活動レベルの変化に適応可能であると認識されている。ミトコンドリアの筋肉の含有量および機能は、多くの方法で評価することができます5,6、および細胞milieu7,8の影響とは異なるミトコンドリアの呼吸および酵素能力(Vmax)をよりよく理解するためにオルガネラ分離の伝統的な方法が適用されています。特に、これらの伝統的な方法は、サブサルコレム領域とミノフィブリラー領域から単離されたミトコンドリアの微妙な生化学的区別を明らかにし、これらの細胞下領域における代謝に対する機能的な影響の可能性を示唆している8,9,10,11。
ミトコンドリアの生物形成は、核およびミトコンドリアDNAの両方からの遺伝子産物の寄与を必要とする唯一の特徴である。しかし、mtDNAの転写は13個のタンパク質の合成につながるだけなので、これらの大部分は核に由来しています。ミトコンドリアは通常、多様な代謝経路に関与する>1000タンパク質を含むため、オルガネラの生物形成は、適切な化学測定および機能を維持するために、細胞質ゾルから様々なミトコンドリアサブコンパートメントへの前駆体タンパク質の輸入および組み立ての厳重に調節された手段を必要とする12,13。ミトコンドリアに向かう核コード化タンパク質は、通常、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を運び、それらを標的とし、そのサブ区画局在化を促進する。ほとんどのマトリックス結合タンパク質はクレアブルN末端MTSを含み、外側または内側のミトコンドリア膜に向かうタンパク質は通常、内部標的ドメイン14を有する。インポートプロセスは、オルガネル13に入るための複数の道を提供する多様なチャネルのセットによって行われます。外膜(TOM)のトランスロケースは、細胞質ゾルから膜間空間に前駆体をシャトルし、そこで内膜(TIM)複合体のトランスロケースによって認識される。この複合体は、核コード化された前駆体をマトリックスにインポートし、プロテアーゼがN末端ターゲティング前配列を切断する役割を担う。外膜に向かうタンパク質は、TOM複合体を介してこの膜に直接挿入することができ、内膜に向かうタンパク質はTIMタンパク質、特にTIM22によって挿入される。タンパク質は、インポート後に、共存プロテアーゼとシャペロンによってさらに処理され、しばしば結合して電子輸送鎖に見られるようなより大きな複合体を形成します。
ミトコンドリアタンパク質のインポート自体は、このプロセスは、膜電位とATP15の形でエネルギー源の存在に依存しているので、ミトコンドリアの健康の測定としても機能します。例えば、膜電位が消滅すると、プロテインキナーゼPINK1はオルガネラによって取り込むことができず、これはmitophagy16,17と呼ばれる経路を介して小器官の分解の発症を引き起こすリン酸化シグナルにつながります。同様の状況下では、インポートが妨げられると、タンパク質ATF5はオルガネラに入ることができず、その後核に移り変え、UPR遺伝子発現のアップレギュレーションの転写因子として機能します18,19。したがって、タンパク質のインポート効率を測定することで、オルガネラの健康に関する包括的な洞察を提供することができ、一方、遺伝子発現応答は、核への逆行シグナル伝達の程度を示すために使用することができる。
ミトコンドリアの生物形成と一般的な細胞の健康にとって明らかな重要性にもかかわらず、哺乳類ミトコンドリアの輸入経路は著しく研究されている。本報告では、骨格筋ミトコンドリアへの前駆体タンパク質のインポート測定に関わる具体的なステップを説明し、筋肉や使用の変化に対する輸入系の適応応答を示すデータを提供し、骨格筋の適応可塑性に対するタンパク質のインポートの寄与を示す。
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Protocol
これらの実験で使用されるすべての動物は、ヨーク大学の動物ケア施設で維持されています。実験は、ヨーク大学動物ケア委員会(許可:2017-08)の承認を得て、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われます。
1. 骨格筋からのサブサルコレムとミトコンドリア間の機能的分離
- 試薬の準備:
- 表 1 に示すように、すべてのバッファーとメディアを準備します。
- バッファーを pH 7.4 に設定し、ナガーゼプロテアーゼを除く 4 °C (最大 2 週間) で保存します。
- 毎回新鮮なナグアーセプロテアーゼ(表1)を準備します。
- 組織除去とミンチ
注: ミトコンドリアの分離に関する以下の手順のフローチャートを 図 1 に示します。- ガラスシンチレーションバイアルに緩衝液1の〜20mL(表1)を充填し、氷の上に置きます。
- マウスが麻酔下にある間、骨格筋(脛骨前、四頭筋、胃腸炎など)を収穫し、約500〜1000mg、チルド緩衝液1を含むシンチレーションバイアルに筋肉を入れる。
注:気体イソフルランは、O2/minの0.4 Lの流量で2.5%の麻酔薬として使用されます。ピンチテストを行い、動物が応答しないことを確認します。 - 組織の採取に続いて、子宮頸部脱臼を介して動物を安楽死させる。
- 氷の上で時計ガラスを事前に冷やします。筋肉から脂肪または結合組織を取り除き、均質なスラリーになるまで時計ガラスの組織をミンチします。
- 細切り組織を冷やした50 mLプラスチック遠心チューブ( 材料表を参照)に入れ、正確な重量を記録します。
- ひき肉を10倍に希釈し、バッファー1+ATP(表1)で希釈します。
- 10 sの9.8 Hzの出力で8mm双刃ホモジナイザー( 材料表を参照)を使用して筋肉サンプルを均質化し、筋肉の目に見える塊が残らないようにします。
- 高速遠心分離機を使用して、800 x g でサンプルを 10 分間遠心します( 材料表を参照)。
注: このステップの目的は、SS と IMF ミトコンドリアの分数を分離することです。スーパーネイトにはSSミトコンドリアが含まれ、ペレットにはIMFミトコンドリアが含まれています。
- SSミトコンドリア分離
- チーズクロスの単層を通して50 mLプラスチック遠心分離チューブの別のセットにスーパーネイトをフィルタリングして、大きな破片や汚染物質を除去します。
- 高速遠心分離機を使用して4°Cで10分間、9,000 x g で遠心分離機。
- スーパーネイトを廃棄し、バッファー 1 + ATP の 3.5 mL でペレットを再懸濁します。
注: P1000 で再中断し、慎重に行ってください。ミトコンドリアは壊れやすいオルガネラです。ピペットチップでペレットに触れないように、穏やかに実行してください。 - 高速遠心分離機を使用して、4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心します。
- 核、ミトコンドリア、および他のオルガネラを欠いた細胞種画分を分離するさらなる処理が望まれる場合を除き、超在性を捨てる。P200ピペットを用いて、約95μLの再懸濁液媒体(表1)にペレットを慎重に再懸濁します。
注:ステップ1.3.3と同様に、ピペットチップでペレットに触れないようにしてください。再懸濁液の体積はペレットの大きさに応じて変えることができる。これは、IMFの分数が分離されるまで氷の上に保存することができるSSミトコンドリア分画です。所望であれば、細胞質画分は、オルガネラを欠き、超遠心分離機で100,000xgで遠心し(材料表を参照)、その後ペレットを廃棄することによって単離することができる。
- IMFミトコンドリア分離
- ステップ1.2.8のペレットをバッファー1+ATPで10倍希釈します。サンプルが一貫するまでペレットとバッファーを穏やかに混合して、テフロンの害虫を使用して再中断します。
- 10 sの場合は9.8 Hzの出力で8mm双刃ホモジナイザー( 材料表を参照)を使用してサンプルを均質化します。
- 高速遠心分離機を使用して4°Cで10分間800 x g でサンプルを遠心します。
- 超素子を廃棄し、バッファー2を使用してIMFミトコンドリアペレットを10倍希釈し、均質になるまで穏やかに混合してテフロン害虫を使用して再中断します。
- 25 μL/gの組織を10 mg/mLナグアルセプロテアーゼ(表1)に加え、遠心チューブを氷の上に置き、チューブを左右に揺らすことで毎分軽く混合します。
注:ナガセの添加は、筋原線維の限定的な消化を行うことによってIMFミトコンドリアを解放するのに役立ちます。 - 5分後、20mLのバッファー2(表1)を加えて、ナゲセプロテアーゼを非活動のポイントまで希釈し、消化を止めます。
- 高速遠心分離機を使用して、4°Cで5分間5分間5,000 x g でサンプルを直ちに遠心します。
- スーパーネイトを捨て、バッファー2を使用してペレットを10倍希釈し、軽く混合してテフロン害虫を使用して再中断します。
- サンプルを4°Cで15分間800xgで遠心分離し、繊維状材料をペレットする。
- 50 mLプラスチック遠心分離チューブの新しいセットにスーパーネイトを注ぎ、廃棄することができるペレットを破壊しないように注意してください。
- ステップ1.4.7のように4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心する。
- スーパーネイトを捨て、バッファー2の3.5mLを加え、P1000ピペットを使用してペレットを静かに再中断します。
- ステップ1.4.7のように4°Cで10分間9,000 x g でサンプルを遠心する。
- P200ピペットを使用して、スーパーネイトを廃棄し、約180 μLの再懸濁液媒体でペレットを緩やかに再懸濁します。
注:再懸濁液媒体の体積はペレットのサイズに応じて変更することができます。これはIMFミトコンドリア分画であり、輸入アッセイで使用されるまで氷上に保存することができます。
2. ミトコンドリアタンパク質の輸入
- In vitro 転写
注:これらの後続の手順は、インポート用に放射ラベル付きタンパク質を準備する方法を概説します。調査中のインポート経路は、例えばミトコンドリアマトリックスへの輸入を評価するために、標的タンパク質の選択を指示し得る、オルニチンカルバミルトランスファーゼ、OCT、およびマレートデヒドロゲナーゼ、MDHは、一般的に使用され、Tom40は、一般的に外ミトコンドリア膜への輸入の指標として使用される。以下の工程では、好みのタンパク質をコードするプラスミドDNAが必要である。プラスミドDNAの転写は、ミトコンドリア分離の前に別の日に行うことができるので、この実験から採取したmRNAは、将来の翻訳および輸入実験で保存され、使用することができます。- DNAを直線化する:プラスミドDNA40μL(5μg/μL)、10x酵素緩衝液5μL、制限酵素5μLを組み合わせ、37°Cで30分間インキュベートします。
注:使用される制限酵素は、異なる酵素バッファーを必要とするプラスミドに基づいて変化する可能性があり、テンプレートをスケールアップまたはスケールダウンすることができるため、DNA は任意の量/体積で使用できます。 - フェノールとエタノールを用いて、リニア化されたDNAを精製し、沈殿させる。滅菌1.5 mLチューブで後続のステップ(2.1.3-2.1.15)をすべて実行し、遠心分離工程には卓上遠心分離機( 材料表を参照)を使用します。
- 最終ボリュームが400 μLになるように、適切な無菌H2Oのボリュームを追加します。その後、400 μLのフェノールを加えます。
- ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000 x g で4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
- 400 μLのフェノールを加える:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v:v:v)。
- ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000gで4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
- 400 μL のクロロホルム:イソアミルアルコール (24:1、 v:v) を加えます。
- ~10sの反転で激しく混ぜ、遠心分離機を17,000gで4°Cで1分間混ぜます。 上のフェーズを撤回して保存します。
- 3M酢酸ナトリウム(pH 7.0)を40μL加え、1mLの95%エタノールを加えます。
- 滅菌1.5mLチューブを-80°C冷凍庫に15分間置きます。
- サンプルを17,000 x g で4°Cで10分間遠心します。
- スーパーネイトを捨て、80%エタノールの300 μLでペレットを洗います。
- サンプルを4°Cで2分間17,000 x g で遠心します。
- 上天を捨て、ペレットを空気乾燥させます。ペレットが乾燥したら、それは明確でなければなりません。
- 滅菌H2Oの20 μLでペレットを再懸濁
- 分光光度計( 材料表を参照)を使用してDNA濃度を測定し、A260:280 比が1.8以上であることを確認します。
- DNAを滅菌H2O中の0.8 μG/μLの濃度に希釈します。
- DNAを書き起こす:プラスミド(0.8 μg/μL、60.8 μL)、無菌H2O(8.4 μL)、10mM NTP(5.2 μL)、10 mM ATP(10.0 μL)、1 mM M-7-G(11.6 μL)、前述のミックスステップ2と同じミックス 1.19(15.6 μL)、RNAsin(5.2 μL)、適切なRNAポリメラーゼ(4.8 μL)を形成して「1つの反応ミックス」(全容量= 121.6 μL)を形成し、ポリメラーゼの最適温度(T7ポリメラーゼでは37°C)で90分間インキュベートする。SP6ポリメラーゼの場合は40°C)
- 1M HEPES(pH 7.9)の200 μL、1M MgAc2の100 μL、4 M KAcの500 μL、20mMのマッミジンの100 μL、0.5 M DTTの100 μL、滅菌H20の200 μLを加えてミックスを調製します。
注:反応は、提供された試薬の割合が維持されている限り、ボリュームをスケールアップまたはスケールダウンすることができます。使用されるRNAポリメラーゼは、使用されているプラスミド内の細菌プロモーター配列によって決定される。 - 次いで、ステップ2.1.2-2.1.15のようにフェノールとエタノールを用いてmRNAを精製し沈殿させます。滅菌H2O(280 μLを追加)で最大400 μLまでボリュームを持ち、ステップ2.1.2-2.1.15の説明に従って進みます。滅菌H2Oの20 μLで最終ペレットを再懸濁します。
- 分光光度計を用いてmRNAの濃度を測定し、A260:280 比が〜2.0であることを確認する。
- mRNAを滅菌H2Oで2.8 μg/μLに希釈し、50 μLアリコートで-20°Cで保存します。
- DNAを直線化する:プラスミドDNA40μL(5μg/μL)、10x酵素緩衝液5μL、制限酵素5μLを組み合わせ、37°Cで30分間インキュベートします。
- インビトロ 翻訳
注: 目的の DNA の翻訳は、インポート実験の同じ日に行う必要があります。この実験では、放射性標識アミノ酸の使用が必要であり、したがって、ユーザは放射性同位元素の使用のための許可を持っている必要があり、すべての取り扱いと処分は、機関のポリシー/要件に従ってでなければなりません。放射性同位元素の安全対策に関する措置は、機関に基づいて異なる可能性が高いため、省略または簡単に説明されています。- インポート実験で使用するミトコンドリアのサンプルあたり〜20μLを供給するのに十分な翻訳反応ミックス(表2)を準備し、翻訳レーンに同じ体積を含めます。
- 30°Cで30分間の反応をインキュベートする(時間はmRNA、25〜60分で変化し得る)。
- 施設の放射性安全要件に従って 35S-メチオニンの使用を記録し、機関のガイドラインに従って放射性同位元素に接触したものを処分します。
- タンパク質のインポート
注:次のステップでは、孤立したばかりのミトコンドリアが必要です。ミトコンドリア絶縁プロトコルを参照してください。他の分離方法は、ミトコンドリアが実行可能で機能的である限り使用することができる。以降のステップでは、上述のリサスペンションバッファーに使用されるミトコンドリアサンプルが再懸濁される(表 1).ミトコンドリア試料のタンパク質濃度は、輸入アッセイを開始する前に測定する必要があります。- 翻訳反応開始後約15分、ミトコンドリア90μgを無菌1.5mLチューブにアリコートし、30°Cで約10分間培養する。
注:アリクォートは、実際に実験で使用されるものよりも多くのミトコンドリア。実際に使用されるのは75μgだけです。しかし、過剰にアリクォートすることは要件ではありません。 - 無菌1.5mLチューブの新鮮なセットで、ミトコンドリアの75 μgと18 μLの翻訳反応を組み合わせ、30°Cでインキュベートして所望の時間を過ごせます。
- 氷の上に翻訳反応の残りの量を保ちます。これは後で使用されます。
注:インポートは時間依存のプロセスであるため、1〜60分のインキュベーション時間に及ぶタイムコースの実験から始める方が賢明かもしれません。典型的な反応時間は30分です。 - この間、スクロース1g、2.5M KClの200 μL、10μL 1 M MgCl2、1M HEPES(pH 7.4)の100 μLを組み合わせてショ糖クッションを調製し、滅菌H2Oを使用して体積を5 mLにします。
- インポート反応の各チューブに対応する無菌1.5 mLチューブの新しいセットを準備します。各チューブにスクロースクッションのアリコート600 μLを取り込み、インポート反応が終わるまで氷の上に保管します。
- 適切なインキュベーション時間後にインポート反応を終了するには、30°Cからチューブを取り出し、氷の上に置き、スクロースクッションでチューブの上にインポート反応を慎重に移します。
注:このステップは、ミトコンドリアが損傷/破裂していないことを確認するために非常にゆっくりと行う必要があります。スクロースクッションはミトコンドリアの移動を遅くし、その後の遠心段階の間に管の底への降下を「クッション」するのに役立ちます。 - サンプル+スクロースクッションを17,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 2.4 Mソルビトール25 mL、1 M HEPES(pH 7.4)の2mL、ダブル蒸留H2Oの72 mLを組み合わせて、ブレークバッファーを準備します。
- SDS-PAGEゲル電気泳動用のリシスバッファーを調製する:50 mLの加熱グリセロール、11.5 gのSDS、31.25 mLの1 Mトリス(pH 6.8)を組み合わせ、2倍蒸留H2Oで体積を500 mLにします。
- サンプル調製のために、後のステップで使用される25 μLのβメルカプトエタノールと475 μLのリシスバッファーを混合します。
注意:Lysisバッファーは、事前に作られ、室温で保存することができます。しかし、βメルカプトエタノールの添加は新鮮に行われる。 - P1000ピペットを使用して、慎重にスーパーネイトを除去し、ペレットを乱しません。適切な放射性廃棄物容器にスーパーネートを処分する。
- 外膜へのインポートの場合は、Tom40を使用してこれを実行し、作りたての0.1 M炭酸ナトリウム(pH 11.5)の50μLでペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
- インキュベーションに続き、サンプル14,000xgを4°Cで5分間遠心する。 このステップは、外膜のインポート反応に対してのみ行われます。
- SDS-PAGE電気泳動用のサンプルを調製するには、20 μLのブレークバッファー、20 μL のリシスバッファー、およびβメルカプトエタノールを加え、再中断します。5 μLのサンプル染料を加えます。
- ステップ2.3.3からの残りの翻訳反応の3μLと37μLのリシスバッファーと5μLのサンプル色素を組み合わせて、制御/翻訳レーンを準備します。よく混ぜます。
- サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ミトコンドリアをペレット化しないように低速で軽くスピンダウンします。
- サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルに塗布します。
注: ゲルの割合と後続の実行時間は、インポートされるタンパク質によって異なります。たとえば、OCT は 37 kDa で、成熟したバンドは少し小さくなります。したがって、12%のゲルは、これらのバンドの良好な分離を可能にする。 - 電気泳動が完了したら、ゲルを取り出し、二重蒸留H2Oに入れ。
- ヒュームフードで5%TCAのゲルを5分間沸騰させ、ひび割れを避けるためにゲルを継続的に攪拌/移動させます。
注:TCAは、可視化のためのゲルを固めるのに役立ちます。これは、ブンゼンバーナーの上の金属トレイで行うことができます。ゲルを寛大にカバーするのに十分なTCAを使用してください, 〜1/2 満杯. - ゲルを取り出し、二重蒸留H2Oに戻し、~50rpmで1分間回転板に攪拌します。
- 10 mMトリスで5分間回転プレートで洗浄し、容器の1/2を十分にカバーするのに十分な量を再び使用します。
- 1 Mのサリ環酸を回転板上で30分間洗浄してタンパク質を沈殿させ、再びゲルを寛大に覆うのに十分なサリチル酸を使用し、使用されている容器の〜1/2。
- ステップ 2.3.24-2.3.31 に記載されているようにゲルを脱水します。
注: これは、いくつかの方法で行うことができます。ゲルドライヤー( 材料表を参照)は、時間効率の高いオプション(下記を参照)を提供します。しかし、他の市販の方法/キットは、より費用対効果が高いが、より時間がかかる可能性がある使用することができます。ゲル乾燥キットは、熱や吸引の適用を必要とせず、代わりにゲルがセロファンシート間で空気乾燥して歪みを防ぐ代替手段として利用することができます。 - 大きなブロッティングペーパーをゲルドライヤーの多孔質ベッドの上に置きます。ゲルを塗布する場所にペーパータオルを1枚置きます。
- 15cm×20cmのブロッティング紙を切り、ペーパータオルの上に置きます。
- 15cm x 20 cmブロッティングペーパーの2枚目を使用して容器からゲルをすくい取り、最初の部分の上に平らに置きます。
- 少し大きなラップを20cm x 25cm切り、ゲルの上に置き、折り目や泡を包み込まないようにします。
注:これはいくつかの試みが必要な場合がありますが、閉じ込められたエアポケットが存在することが不可欠です。 - ジェルドライヤーのプラスチックカバーをラップの上にそっと置き、泡や折り目がないことを再び確認します。
- ポンプ/真空をオンにし、プラスチックカバーがシールを形成していることを確認します。プラスチックカバーの角を持ち上げてシールをテストし、再シールするのを待ちます。
- ゲル乾燥機を閉じ、90分間実行します。温度を30°Cから始め、80°Cに徐々に達し、その後、走行終了時に30°Cに戻します。
- 脱水するとゲルが固まり、紙が薄く感じるようにします。乾燥工程で使用したラップでゲルを包みます。
- 脱水ゲルをリンフィルム( 材料表参照)を使用したフィルムカセットに入れ、白い側をゲルに向けます。露光時間は変化しますが、バンドの可視化には24〜48時間です。
- リンイメージングが可能な任意の適切なイメージャーを使用して、オートラジオグラフィーを使用して視覚化します。
- 翻訳反応開始後約15分、ミトコンドリア90μgを無菌1.5mLチューブにアリコートし、30°Cで約10分間培養する。
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Representative Results
我々は、このプロトコルが機能的で無傷の骨格筋ミトコンドリアへの輸入率を決定するための有効なアッセイであることを広く示している。未処置の状態と比較して、マレートデヒドロゲナーゼ(MDH)などの典型的な前駆体タンパク質をマトリックスにインポートすると、気相鎖アンカプラであるバリノマイシンによって阻害され得るため、膜電位に敏感である (図2A)。また、ミトコンドリア内膜および外膜が洗浄剤Triton X-100の存在下で可溶化すると、輸入も妨げられる。インポートプロセスは、膜間の転座のための前駆体タンパク質を展開するのに役立つ外部ATPの存在に敏感であり、呼吸速度とATP提供(データは示されていない20)によって厳しく制御されます。インポートの明確な違いはまた、タンパク質輸入機械発現の変動、ならびにこれらのミトコンドリア間の呼吸速度 (図2B)によるミノフィブリラー間および皮下ミトコンドリア画分の間にも観察される。
骨格筋のミトコンドリアは、エネルギー需要の変化に容易に反応する非常にダイナミックなオルガネラである。筋肉中のミトコンドリアの含有量は、慢性運動の期間の後に、または電気刺激誘発収縮活性に応答して増加する(レビュー21を参照)。例えば、ラット骨格筋の慢性収縮活性の7日間は、OMとマトリックスへの輸入をそれぞれ1.6倍と1.4倍に増強します。 22(図3A,3B)。ミトコンドリア含有量のこれらの変化は、ミトコンドリアタンパク質輸入系の容量の変化によって部分的にもたらされる。実際、制御条件下またはデンエルベート条件下の複雑なIVマーカーシトクロムオキシダーゼによって測定される前駆体タンパク質の輸入速度とミトコンドリア含有量の良好な推定値との密接な関係を、23 (図3C)に示すことができる。
筋肉中の収縮活動の変化に対する輸入系の適応性は、運動が特定されれば輸入経路の欠陥を解決するための治療として使用することができることを示唆している。バクスバク二重ノックアウト動物を用いたミトコンドリア媒介性アポトーシスの調査中に、これらの実験動物の筋肉中のミトコンドリア含有量の減少は、前駆体タンパク質のマトリックスへの輸入の減少を伴うことに気づいた。その後、この輸入能力を回復する可能性を調査しました。実際、6週間の自主的な車輪の実行訓練の後、ノックアウトanimals24の制御レベルにタンパク質のインポートが回復し、ミトコンドリアの含有量および機能を救うために輸入経路の適応可塑性を示す(図4)。
図1:前の研究に基づいてSSとIMFミトコンドリアを骨格筋から分離するためのワークフローの概略図8。 このプロトコルは骨格筋の中の地理的位置に基づいて機能的なミトコンドリアの分離を可能にする。SSミトコンドリアはより迅速かつ容易に解放され、IMFミトコンドリアは筋原線維からそれらを解くためにプロテアーゼとのさらなる消化ステップを必要とする。これらの亜屈折の分離は、並行して行うことができることに注意してください。更新された同様の手順が最近公開されました25。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ミトコンドリアマトリックスへのタンパク質インポート(A)MDHの通常の輸入速度は、SSおよびIMFミトコンドリア(レーン4および7)および前駆体MDH(レーン1)の翻訳産物に示されている。下のバンドは、インポートされた成熟 MDH を表します。バリノマイシンの添加は、このアンカプラが膜電位(レーン2および5)を放散するので、SSおよびIMFミトコンドリアのマトリックスへのMDHタンパク質のインポートを阻害する。Triton-Xは内膜を可溶化する洗剤であり、それによってMDHのこれらの亜屈折(レーン3および6)への輸入を阻害する。タンパク質のインポートは、時間の増加、4分、7分、10分、15分、および30分のために行った。これらのデータは、輸入は時間依存のプロセスであり、また、SSとIMFミトコンドリアが輸入のための異なるレートまたは能力を有することを示している(B)。TL、翻訳レーン;VAL, バリノマイシン;トリ、トリトン-X;CTL、コントロール;SS, 皮膜下;IMF、ミノフィブリラー。高橋M・フードDA20から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タンパク質のインポートは適応可能であり、ミトコンドリア含有量の推定値に密接にリンクされています。 スプレイグ・ドーリーラットは、運動訓練のモデルである収縮活性を誘発するために電気刺激を受けた。(A) OMへのTom40輸入は、任意の時点でコントロールと比較して、慢性的に刺激された動物からの筋肉で1.6倍高かった。(B)10月のミトコンドリアマトリックスへの輸入は、インキュベーションの各時点で増加し、全体的に、これは慢性的に刺激された筋肉からのミトコンドリアの1.4倍の増加をもたらした。(C) 輸入は、コクジスト活性によって評価されるミトコンドリア含有量の指標と正の相関である、r=0.69。これらの測定値は、デエル化を受けた動物から採取され、ミトコンドリア含有量および輸入率を低下させることが示されている。コン、コントロール;デン、デナーバト;スティム、刺激;TL、翻訳レーン;* p < 0.05.図3Aと3Bは、シンB&フッドDA23からジョセフA-M&フッドDA22と3Cから適応しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:訓練は 、in vivoで輸入欠陥を救う。 バックス/バク二重ノックアウト動物は、ミトコンドリアマトリックスへのタンパク質輸入を37%減少させます。6週間の自主的な車輪の実行は、制御レベルに輸入欠陥を救出しました。WT、ワイルドタイプ;DKO、ダブルノックアウト。TL、翻訳レーン;* p < 0.05 遺伝子型の主な効果;p < 0.05 トレーニングの主な効果。この図は張Yら24から適応された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファ 1: | バッファ 1 + ATP: | バッファ2: | リサスペンション媒体: | ナグリセプロテアーゼ |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/mL バッファー 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 10 mM モップ | 注:新鮮にし、氷の上に保ちます |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0.2% BSA | |
| 50 mM トリス | 50 mM トリス | 50 mM トリス | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
表1:バッファおよびリサスペンションメディア
| 反応量の割合 | 1 反応ミックス | |
| 網球リサテ | 64.10% | 11.8 μL |
| アミノ酸 (-メチオニン) | 2.20% | 0.4 μL |
| 滅菌H2O | 21.60% | 3.97 μL |
| 35S-メチオニン | 7.20% | 1.33 μL |
| mRNA | 5.40% | 1.0 μL |
| 総ボリューム | 18.5 μL | |
| 手記： | ||
| 1) 最後に35S-メチオニンを追加します。 | ||
| 2)氷の上でゆっくりとライセートを解凍し、凍結/解凍サイクルを2に制限する。到着時にリセートを引用することをお勧めします | ||
| 3) mRNAの容積は、それに応じて滅菌H2Oの体積を変えることによって翻訳効率を最適化するために調節することができる。 | ||
表2:翻訳反応ミックス
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Discussion
ミトコンドリアは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の発現と協調性に依存し、細胞内での合成と拡張に対して独自に依存しています。しかし、核ゲノムはミトコンドリアプロテオームの大部分(99%)をコードしており、ミトコンドリア生物新生をサポートするタンパク質輸入機械の重要性を強調しています。インポートは、インポートの失敗が展開されたタンパク質応答および/またはmitophagy15,16,26の開始を促進することができるので、重要なシグナル伝達イベントとしても機能します。インポートは、複数の機能チャネルとシャペロンの発現、無傷の膜電位、ATPの入手可能性に依存しているため、ミトコンドリアタンパク質のインポートの評価は、オルガネラの健康とエネルギー状態に関する貴重な洞察を提供することができます。
ミトコンドリアへのタンパク質のインポート能力の評価では、標準的な差動遠心技術を用いて、周囲の組織からオルガネラを分離する必要があります。インポートはミトコンドリア酵素活性のVmaxを評価するのと同じ方法で評価され、時間および基質濃度に依存する高度に制御された方法で、細胞細胞質の影響から独立した。ここで提示される分離法、またはそれの同様のレンディションは、ミトコンドリア呼吸および酵素活性8,9,10,11を評価するために長年使用されてきた。この技術は、骨格筋が小さなスフェロイド構造から高度に分岐した網状網3に至るまで、骨格筋に存在するmitochondriaの正常な形態を破壊するので、その制限がないわけではない。また、プロテアーゼナゲスの使用は精査中3,28件です。この方法の更新, ナグスの代わりにトリプシンを使用して, 最近公開されています25, トリプシンは、筋肉ミトコンドリアを分離するために他の人によって使用されています 29.実際、機能的に無傷のミトコンドリアを生み出す代替分離法は、プロテアーゼ30を採用しない技術や、ヒトmuscle31からの小さな生検サイズのサンプル用に設計されたものを含む、使用することができる。ここで提示される方法は、SSミトコンドリアを迅速かつ容易に単離する利点を有するが、より大きな収率およびミトコンドリアの純度は、IMF亜分離の分離によって得ることができる。慎重に行えば、この分離プロトコルは、状態3および4呼吸の適切な速度を示す、高い呼吸制御比を有する機能的に無傷のオルガネラをもたらす可能性がある8。
また、ミトコンドリアタンパク質のインポートでは、内膜を横切るインポートがこの電気泳動陽子動機力に依存するため、正に帯電した前駆体を引き付け、前駆体を負に帯電したマトリックス空間への輸送を仲介するのに役立つため、これらのオルガネラが膜電位を維持することが不可欠です。このような条件下では、ミトコンドリア機能とインポートの比較は、例えば運動、老化、および筋肉の使用などの生理学的に関連する実験状況の間で評価することができる。この点で、以前の研究では、インポートは筋肉の使用と使用の変化した状態に応答し、過度のROS放出10、22、23、32を介して阻害に敏感である非常に適応性の高い経路であることを示しています。この可塑性は、部分的には、タンパク質輸入機械成分の発現の適応的変化によるものである。この技術はミトコンドリアの単離に依存しているため、細胞種因子またはオルガネラ間クロストークに起因する可能性のある輸入経路に関する規制は、実験の解釈から除去される。これは、インポート経路自体の容量(酵素活性のVmaxに似ている)の結論として、技術の限界と強度の両方であるが、実験モデルで発生する可能性のある一過性または外部信号が失われる可能性がある。これを回避するために、先に行われたように、インポート速度に影響を与える可能性のあるサイトソリック環境の変化を評価するために、上述のように分離したサイトソリック画のサンプルでインポート反応をインキュベートすることができる。さらに、輸入機械部品は、その機能を変更する可能性のある、翻訳後の急激な変更の対象となります。最近の研究では、特定のTOMインポート受容体のリン酸化がmitophagy33にリンクすることができることが示されている。実際、より注意を払う研究の分野は、ROSによって媒介される固有のシグナル伝達経路を介した、または酵母および他の低生物34,35に記載されているように、輸入受容体およびシャペロンの共有結合修飾による輸入プロセスの急性変調である。
ミトコンドリアへのタンパク質のインポートは、適応小器官の成長への入り口を表し、ミトコンドリアの健康の敏感な指標です。このプロセスがどのように調節されているかを理解することは、ミトコンドリア生物新生の調節、UPRシグナル伝達、およびマイトファジーの開始に光を当てることができます。ミトコンドリアタンパク質のインポートは、哺乳類の実験モデルでは広く研究されていないプロセスであり、この分野の研究の広大な可能性の開発は、ミトコンドリア機能不全が明らかである疾患のより深い理解を達成するのに役立つか、またはミトコンドリアの健康を促進するための魅力的な治療標的を表す可能性があります。
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Disclosures
金銭的またはその他の利益相反は、著者によって宣言されていません。
Acknowledgments
著者らは、マギル大学のG.Cショア博士、ワシントン医学部のA.シュトラウス博士、ラ・トローブ大学の.M T.ライアン博士に対し、この研究に使用された発現プラスミドの当初の寄付に感謝したいと考えています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)からD.A.フッドへの資金提供によって支えられた。D. A. フッドは、細胞生理学のカナダ研究委員長の保有者でもあります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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