Summary
Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial. Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.
Abstract
Las mitocondrias son orgánulos metabólicos y reguladores clave que determinan el suministro de energía, así como la salud general de la célula. En el músculo esquelético, las mitocondrias existen en una serie de morfologías complejas, que van desde pequeños orgánulos ovalados hasta una amplia red similar a un retículo. Comprender cómo el retículo mitocondrial se expande y se desarrolla en respuesta a diversos estímulos, como las alteraciones en la demanda de energía, ha sido durante mucho tiempo un tema de investigación. Un aspecto clave de este crecimiento, o biogénesis, es la importación de proteínas precursoras, originalmente codificadas por el genoma nuclear, sintetizadas en el citosol y translocadas en varios subcompartimentos mitocondriales. Las mitocondrias han desarrollado un mecanismo sofisticado para este proceso de importación, que involucra muchos canales selectivos de membrana interna y externa, conocidos como la maquinaria de importación de proteínas (PIM). La importación a la mitocondria depende del potencial de membrana viable y de la disponibilidad de ATP derivado de orgánulos a través de la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, su medición puede servir como una medida de la salud de los orgánulos. El PIM también exhibe un alto nivel de plasticidad adaptativa en el músculo esquelético que está estrechamente acoplado al estado energético de la célula. Por ejemplo, se ha demostrado que el entrenamiento con ejercicios aumenta la capacidad de importación, mientras que el desuso muscular la reduce, coincidiendo con los cambios en los marcadores de contenido mitocondrial. Aunque la importación de proteínas es un paso crítico en la biogénesis y expansión de las mitocondrias, el proceso no está ampliamente estudiado en el músculo esquelético. Por lo tanto, este documento describe cómo utilizar mitocondrias aisladas y completamente funcionales del músculo esquelético para medir la capacidad de importación de proteínas con el fin de promover una mayor comprensión de los métodos involucrados y una apreciación de la importancia de la vía para el recambio de orgánulos en el ejercicio, la salud y la enfermedad.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos que existen en morfologías complejas en diferentes tipos de células y se reconoce que poseen una gama cada vez mayor de funciones que son críticas para la salud celular. Como tales, ya no pueden reducirse simplemente a orgánulos productores de energía. Las mitocondrias son reguladores metabólicos clave, determinantes del destino celular y centros de señalización, cuyas funciones pueden servir como indicadores útiles de la salud celular en general. En las células musculares esqueléticas, los estudios de microscopía electrónica revelan la presencia de mitocondrias subsarcolemmales (SS) e intermiofibrilares (IMF) geográficamente distintas, que exhiben un grado de conectividad1,2,3,4 que ahora se reconoce que es altamente dinámico y adaptable a los cambios en los niveles de actividad del músculo esquelético, así como con la edad y la enfermedad. El contenido mitocondrial y la función en el músculo pueden evaluarse de numerosas maneras5,6, y se han aplicado métodos tradicionales de aislamiento de orgánulos para comprender mejor las capacidades respiratorias y enzimáticas (Vmax) de las mitocondrias distintas de la influencia del medio celular7,8. En particular, estos métodos tradicionales han revelado sutiles distinciones bioquímicas entre mitocondrias aisladas de regiones subsarcolemmales e intermiofibrilares, desmintiendo posibles implicaciones funcionales para el metabolismo en estas regiones subcelulares8,9,10,11.
La biogénesis de las mitocondrias es única en requerir la contribución de productos genéticos del ADN nuclear y mitocondrial. Sin embargo, la gran mayoría de estos se derivan del núcleo, ya que la transcripción del ADNmt solo conduce a la síntesis de 13 proteínas. Dado que las mitocondrias normalmente comprenden >1000 proteínas involucradas en diversas vías metabólicas, la biogénesis del orgánulo requiere un medio estrechamente regulado de importación y ensamblaje de proteínas precursoras del citosol en los diversos subcompartimentos mitocondriales para mantener una estequiometría y función adecuadas12,13. Las proteínas codificadas nuclearmente destinadas a las mitocondrias normalmente llevan una secuencia de orientación mitocondrial (MTS) que las dirige al orgánulo y facilita su localización subcompartimental. La mayoría de las proteínas unidas a la matriz contienen un MTS N-terminal escindible, mientras que las destinadas a la membrana mitocondrial externa o interna suelen tener dominios de orientación internos14. El proceso de importación se lleva a cabo mediante un conjunto de canales diversos que proporcionan múltiples vías de entrada en el orgánulo13. La translocasa del complejo de membrana externa (TOM) transporta precursores desde el citosol hacia el espacio intermembrana, donde son reconocidos por la translocasa del complejo de membrana interna (TIM). Este complejo es responsable de importar precursores codificados nuclearmente a la matriz, donde las proteasas escinden la presecuencia de apuntamiento N-terminal. Las proteínas destinadas a la membrana externa se pueden insertar directamente en esta membrana a través del complejo TOM, mientras que las destinadas a la membrana interna se insertan mediante una proteína TIM, específicamente TIM22. Después de su importación, las proteínas son procesadas por proteasas y chaperonas residentes y, a menudo, se combinan para formar complejos más grandes, como los que se encuentran en la cadena de transporte de electrones.
La importación de proteínas mitocondriales en sí misma también sirve como una medida de la salud mitocondrial, ya que este proceso se basa en la presencia de potencial de membrana y una fuente de energía en forma de ATP15. Por ejemplo, cuando el potencial de membrana se disipa, la proteína quinasa PINK1 no puede ser absorbida por el orgánulo, y esto conduce a señales de fosforilación que desencadenan el inicio de la degradación del orgánulo a través de una vía llamada mitofagia16,17. En circunstancias similares, cuando se impide la importación, la proteína ATF5 no puede entrar en el orgánulo, y posteriormente se transloca al núcleo, donde sirve como factor de transcripción para la regulación ascendente de la expresión génica UPR18,19. Por lo tanto, medir la eficiencia de la importación de proteínas puede proporcionar una visión completa de la salud del orgánulo, mientras que la respuesta de expresión génica se puede utilizar para indicar el grado de señalización retrógrada al núcleo.
A pesar de su obvia importancia para la biogénesis de las mitocondrias y para la salud celular en general, la vía de importación en las mitocondrias de los mamíferos está notablemente poco estudiada. En este informe, describimos los pasos específicos involucrados en la medición de la importación de proteínas precursoras en las mitocondrias del músculo esquelético y proporcionamos datos para ilustrar la respuesta adaptativa del sistema de importación a los cambios en el músculo y el desuso, ilustrando la contribución de la importación de proteínas a la plasticidad adaptativa del músculo esquelético.
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Protocol
Todos los animales utilizados en estos experimentos se mantienen en el centro de cuidado de animales de la Universidad de York. Los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de York (Permiso: 2017-08).
1. Aislamiento funcional de mitocondrias subsarcolemmales e intermiofibrilares del músculo esquelético
- Preparación de reactivos:
- Prepare todos los búferes y medios como se menciona en la Tabla 1.
- Ajuste los tampones a pH 7.4 y guárdelos a 4 °C (hasta 2 semanas), excepto la proteasa de nagrasa.
- Preparar nagarse proteasa fresca (Tabla 1) cada vez.
- Extracción de tejido y picado
NOTA: En la Figura 1 se proporciona un diagrama de flujo de los pasos a continuación para el aislamiento de las mitocondrias.- Llene un vial de centelleo de vidrio con ~ 20 ml de Buffer 1 (Tabla 1) y colóquelo sobre hielo.
- Mientras el ratón está bajo anestesia, cosecha los músculos esqueléticos (tibialis anterior, cuádriceps, gastrocnemio, etc.), aproximadamente 500-1000 mg, y coloca los músculos en el vial de centelleo que contiene Buffer 1 refrigerado.
NOTA: El isoflurano gaseoso se utiliza como anestésico al 2,5% a un caudal de 0,4 L de O2/min. Se realiza una prueba de pellizco para garantizar que el animal no responda. - Después de la recolección de tejido, eutanasia al animal a través de la dislocación cervical.
- Pre-enfriar un vaso de reloj sobre hielo. Retire cualquier grasa o tejido conectivo de los músculos y pica el tejido en el vidrio del reloj hasta que sea una suspensión homogénea.
- Coloque el tejido picado en un tubo de centrifugación de plástico preenfriado de 50 ml (consulte la Tabla de materiales) y registre el peso exacto.
- Diluir el tejido picado 10 veces con Buffer 1 + ATP (Tabla 1).
- Homogeneice la muestra muscular utilizando un homogeneizador de doble hoja de 8 mm (consulte la Tabla de materiales) a una potencia de salida de 9,8 Hz durante 10 s, asegurando que no queden trozos visibles de músculo.
- Centrifugar las muestras a 800 x g durante 10 min utilizando una centrífuga de alta velocidad (ver Tabla de Materiales).
NOTA: El propósito de este paso es separar las fracciones mitocondriales SS e IMF. El supernato contiene mitocondrias SS, mientras que el pellet contiene mitocondrias IMF.
- Aislamiento mitocondrial de SS
- Filtre el sobrenado a través de una sola capa de gasa en otro conjunto de tubos de centrifugación de plástico de 50 ml para eliminar cualquier residuo o contaminante grande.
- Centrifugar el sobrenato a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
- Desechar el sobrenado y resuspend el pellet en 3,5 mL de Buffer 1 + ATP.
NOTA: Vuelva a suspender con un P1000 y hágalo con cuidado. Las mitocondrias son orgánulos frágiles. Realizar suavemente y evitar tocar el pellet con la punta de la pipeta. - Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
- Deseche el supernado a menos que se desee un procesamiento adicional para aislar una fracción citosólica desprovista de núcleos, mitocondrias y otros orgánulos. Resuspenda el pellet cuidadosamente en aproximadamente 95 μL del medio de resuspensión (Tabla 1) utilizando una pipeta P200.
NOTA: Similar al paso 1.3.3, evite tocar el pellet con la punta de la pipeta. El volumen del medio de resuspensión puede ser alterado dependiendo del tamaño del pellet. Esta es la fracción mitocondrial SS, que se puede almacenar en hielo hasta que se aísle la fracción IMF. Si se desea, la fracción citosólica, desprovista de orgánulos, se puede aislar centrifugando el sobrenato a 100.000 x g en una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) y posteriormente desechando el pellet.
- Aislamiento mitocondrial del FMI
- Diluya el pellet del paso 1.2.8 10 veces en Buffer 1 + ATP. Vuelva a suspender usando un mortero de teflón mezclando suavemente el pellet y el tampón hasta que la muestra sea consistente.
- Homogeneizar la muestra utilizando un homogeneizador de doble hoja de 8 mm (ver Tabla de Materiales) a una potencia de salida de 9,8 Hz durante 10 s.
- Centrifugar la muestra a 800 x g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
- Deseche el supernado y diluya el gránulo mitocondrial IMF 10 veces usando Buffer 2 y vuelva a suspenderlo usando el mortero de teflón mezclando suavemente hasta que sea homogéneo.
- Añadir 25 μL/g de tejido a 10 mg/ml de nagarse proteasa (Tabla 1) y colocar el tubo de centrifugación de lado sobre hielo, mezclando suavemente cada minuto meciendo el tubo de lado a lado.
NOTA: La adición de nagarse ayuda a liberar las mitocondrias IMF al realizar una digestión limitada de las miofibrillas. - Después de 5 min, agregue 20 ml de Buffer 2 (Tabla 1) para diluir la nagarse proteasa hasta el punto de inactividad y detener la digestión.
- Centrifugar inmediatamente la muestra a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga de alta velocidad.
- Deseche el sobrenado y diluya el pellet 10 veces usando Buffer 2 y vuelva a suspenderlo usando un mortero de teflón mezclando suavemente.
- Centrifugar la muestra a 800 x g durante 15 min a 4 °C para granular el material fibroso.
- Vierta el supernado en un nuevo conjunto de tubos centrífugos de plástico de 50 ml, con cuidado de no interrumpir el pellet, que se puede desechar.
- Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C como en el paso 1.4.7.
- Deseche el supernado, agregue 3.5 ml de Buffer 2 y vuelva a suspender suavemente el pellet con una pipeta P1000.
- Centrifugar la muestra a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C como en el paso 1.4.7.
- Deseche el sobrenado y vuelva a suspender el pellet suavemente con aproximadamente 180 μL de medio de resuspensión utilizando una pipeta P200.
NOTA: El volumen del medio de resuspensión puede ser alterado dependiendo del tamaño del pellet. Esta es la fracción mitocondrial del FMI, que se puede almacenar en hielo hasta que se utilizará en el ensayo de importación.
2. Importación de proteínas mitocondriales
- In vitro transcripción
NOTA: Estos pasos posteriores describen cómo preparar una proteína radiomarcada para la importación. La vía de importación bajo investigación puede dictar la elección de la proteína objetivo, por ejemplo, para evaluar la importación en la matriz mitocondrial, la ornitina carbamila transferasa, OCT, y la malato deshidrogenasa, MDH, se usan comúnmente, mientras que Tom40 se usa comúnmente como una indicación de importación en la membrana mitocondrial externa. Para los siguientes pasos, se requiere ADN plásmido que codifique la proteína de elección. La transcripción del ADN plásmido se puede hacer antes del aislamiento mitocondrial en un día separado, y el ARNm recogido de este experimento se puede almacenar y utilizar en futuros experimentos de traducción e importación.- Linealizar el ADN: Combinar 40 μL de ADN plásmido (5 μg/μL), 5 μL de tampón enzimático 10x y 5 μL de enzima de restricción e incubar a 37 °C durante 30 min.
NOTA: Las enzimas de restricción utilizadas pueden variar según el plásmido, lo que puede requerir un tampón enzimático diferente, y las condiciones experimentales del ADN se pueden usar en cualquier cantidad / volumen, ya que la plantilla se puede escalar hacia arriba o hacia abajo. - Purificar y precipitar el ADN linealizado utilizando fenol y etanol. Realice todos los pasos posteriores (2.1.3-2.1.15) en tubos estériles de 1,5 ml, y utilice una centrífuga de mesa (ver Tabla de materiales) para los pasos de centrifugación.
- Añadir el volumen apropiado de H2O estéril para que el volumen final sea igual a 400 μL. Luego, agregue 400 μL de fenol.
- Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 x g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
- Añadir 400 μL de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1, v:v:v).
- Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
- Añadir 400 μL de cloroformo:isoamilalcohol (24:1, v:v).
- Mezclar vigorosamente por inversión durante ~10 s, y centrifugar a 17.000 g durante 1 min a 4 °C. Retira y guarda la fase superior.
- Agregue 40 μL de acetato de sodio 3M (pH 7.0) y agregue 1 ml de etanol al 95%.
- Coloque los tubos estériles de 1,5 ml en el congelador de -80 °C de lado durante 15 min.
- Centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenado y lave el pellet con 300 μL de etanol al 80%.
- Centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 2 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenado y seque al aire el pellet. Una vez que el pellet está seco, debe estar claro.
- Resuspendir el pellet en 20 μL de H2O estéril
- Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales) y asegúrese de que la relación A260:280 esté por encima de 1.8.
- Diluir el ADN a una concentración de 0,8 μg/μL en H2O estéril.
- Transcribir el ADN: Combinar plásmido (0,8 μg/μL, 60,8 μL), H2O estéril (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), la mezcla mencionada paso 2.1.19 (15,6 μL), RNAsin (5,2 μL) y una ARN polimerasa apropiada (4,8 μL) para formar "una mezcla de reacción" (volumen total = 121,6 μL) e incubar durante 90 min a la temperatura óptima para la polimerasa (37 °C para la polimerasa T7; 40 °C para la polimerasa SP6)
- Para preparar la mezcla añadir 200 μL de 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL de 1 M MgAc2, 500 μL de 4 M KAc, 100 μL de 20 mM de espermidina, 100 μL de 0,5 M de TDT y 200 μL de H20 estéril.
NOTA: La reacción se puede escalar hacia arriba o hacia abajo en volumen siempre que se mantengan las proporciones proporcionadas de reactivos. La ARN polimerasa utilizada está dictada por la secuencia promotora bacteriana dentro del plásmido que se está utilizando. - Luego, purificar y precipitar el ARNm usando fenol y etanol como en los pasos 2.1.2-2.1.15. Lleve el volumen hasta 400 μL con H2O estéril (agregue 280 μL) y proceda como se describe en los pasos 2.1.2-2.1.15. Resuspend el pellet final en 20 μL de H2O estéril.
- Mida la concentración de ARNm utilizando un espectrofotómetro, asegúrese de que la relación A260:280 sea ~2.0.
- Diluir el ARNm a 2,8 μg/μL en H2O estéril y almacenar a -20 °C en alícuotas de 50 μL.
- Linealizar el ADN: Combinar 40 μL de ADN plásmido (5 μg/μL), 5 μL de tampón enzimático 10x y 5 μL de enzima de restricción e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Traducción in vitro
NOTA: La traducción del ADN deseado debe llevarse a cabo el mismo día del experimento de importación. Este experimento requiere el uso de aminoácidos radiomarcados y, por lo tanto, el usuario debe tener un permiso para el uso de radioisótopos, y todo el manejo y eliminación debe estar de acuerdo con las políticas / requisitos de la institución. Los pasos que involucran medidas de seguridad de radioisótopos se han omitido o descrito brevemente, ya que es probable que difieran según la institución.- Preparar suficiente mezcla de reacción de traducción (Tabla 2) para suministrar ~ 20 μL por muestra de mitocondrias para ser utilizada en el experimento de importación e incluir el mismo volumen para un carril de traducción.
- Incubar la reacción durante 30 min a 30 °C (el tiempo puede variar con arnm, 25-60 min).
- Registre el uso de 35S-metionina según los requisitos de seguridad radiactiva de la institución y deseche cualquier cosa que haya entrado en contacto con el radioisótopo según las pautas de la institución.
- Importación de proteínas
NOTA: Se requieren mitocondrias recién aisladas para los próximos pasos. Consulte el protocolo de aislamiento mitocondrial. Se pueden utilizar otros métodos de aislamiento siempre que las mitocondrias sean viables y funcionales. Para los pasos posteriores, las muestras mitocondriales utilizadas se resuspenden en un tampón de resuspensión como se describió anteriormente (Cuadro 1). La concentración de proteínas de la muestra mitocondrial también debe medirse antes de comenzar el ensayo de importación.- Aproximadamente 15 min después del inicio de la reacción de traducción, alícuota 90 μg de mitocondrias en tubos estériles de 1,5 ml y preincuba a 30 °C durante ~10 min.
NOTA: Alícuota más mitocondrias de las que realmente se utilizarán en el experimento; solo se utilizarán realmente 75 μg. Sin embargo, la alícuota en exceso no es un requisito. - En un conjunto fresco de tubos estériles de 1,5 ml, combine 75 μg de mitocondrias con 18 μL de la reacción de traducción e incube a 30 °C durante el tiempo deseado.
- Mantenga el volumen restante de la reacción de traducción en hielo; esto se utilizará más adelante.
NOTA: La importación es un proceso dependiente del tiempo, por lo que puede ser prudente comenzar con un experimento de curso de tiempo que varía en tiempos de incubación de 1 a 60 minutos. Un tiempo de reacción típico es de 30 min. - Durante este tiempo, prepare el cojín de sacarosa combinando 1 g de sacarosa, 200 μL de 2.5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL de 1 M HEPES (pH 7.4), y lleve el volumen a 5 mL usando H2O estéril.
- Preparar un nuevo juego de tubos estériles de 1,5 ml correspondientes a cada tubo en la reacción de importación. Alícuota 600 μL del cojín de sacarosa en cada tubo y manténgala en hielo hasta que finalice la reacción de importación.
- Para terminar la reacción de importación después del tiempo de incubación apropiado, retire el tubo de 30 °C, colóquelo en hielo y luego transfiera cuidadosamente la reacción de importación en la parte superior del tubo con el cojín de sacarosa.
NOTA: Este paso debe hacerse muy lentamente para garantizar que las mitocondrias no se dañen / rompan. El cojín de sacarosa ayuda a ralentizar la migración de las mitocondrias y "amortigua" su descenso a la parte inferior del tubo durante la siguiente etapa de centrifugación. - Centrifugar las muestras + cojín de sacarosa a 17.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Prepare el tampón de rotura combinando 25 ml de sorbitol de 2,4 M, 2 ml de 1 M de HEPES (pH 7,4) y 72 ml de H2O de doble destilación.
- Prepare el tampón de lisis para la electroforesis en gel SDS-PAGE: Combine 50 ml de glicerol calentado, 11,5 g de SDS, 31,25 ml de 1 M Tris (pH 6,8) y lleve el volumen a 500 ml con H2O de doble destilación.
- Para la preparación de la muestra, mezcle 475 μL de tampón de lisis con 25 μL de β-mercaptoetanol para ser utilizado en un paso posterior.
NOTA: El tampón de lisis se puede hacer con anticipación y almacenar a temperatura ambiente; sin embargo, la adición de β-mercaptoetanol debe hacerse fresca. - Usando una pipeta P1000, retire cuidadosamente el sobrenado y no moleste el pellet. Deseche el sobrenado en un contenedor de residuos radiactivos apropiado.
- Para la importación a la membrana externa, realice esto usando Tom40, resuspenda el pellet en 50 μL de carbonato de sodio recién preparado 0.1 M (pH 11.5) e incube en hielo durante 30 min.
- Después de la incubación, centrifugar la muestra 14.000 x g durante 5 min a 4 °C. Este paso solo se realiza para reacciones de importación de membrana externa.
- Para preparar las muestras para la electroforesis SDS-PAGE, agregue 20 μL de tampón de rotura, 20 μL de tampón de lisis y β-mercaptoetanol y resuspend bien. Añadir 5 μL de tinte de muestra.
- Prepare el carril de control/traslación combinando 3 μL de la reacción de traslación restante del paso 2.3.3 con 37 μL de tampón de lisis y 5 μL de colorante de muestra. Mezclar bien.
- Hervir las muestras durante 5 min a 95 °C y girar suavemente hacia abajo a baja velocidad para evitar la peletización de las mitocondrias.
- Aplique las muestras a un gel de poliacrilamida SDS.
NOTA: El porcentaje de gel y el tiempo de ejecución posterior dependerán de la proteína que se importe. Por ejemplo, la OCT es de 37 kDa, y su banda procesada madura es ligeramente más pequeña; por lo tanto, un gel al 12% permite una buena separación de estas bandas. - Una vez completada la electroforesis, retire el gel y colóquelo en H2O de doble destilación.
- Hervir el gel en TCA al 5% en una campana de humos durante 5 minutos, revolviendo / moviendo continuamente el gel para evitar que se agriete.
NOTA: TCA ayuda a solidificar el gel para la visualización; esto se puede hacer en una bandeja de metal sobre un quemador Bunsen. Use suficiente TCA para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 lleno. - Retire el gel y vuelva a colocarlo en H2O de doble destilación. Agítelo en una placa giratoria durante 1 minuto a ~ 50 rpm.
- Lave el gel en 10 mM Tris en una placa giratoria durante 5 min a ~ 50 rpm, nuevamente usando lo suficiente para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 del recipiente.
- Precipitar la proteína lavando el gel en 1 M de ácido salicíclico en una placa giratoria durante 30 min, nuevamente usando suficiente ácido salicíclico para cubrir generosamente el gel, ~ 1/2 del recipiente que se está utilizando.
- Deshidratar el gel como se describe en los pasos 2.3.24-2.3.31.
NOTA: Esto se puede hacer de varias maneras. Un secador de gel (consulte la Tabla de materiales) proporciona una opción eficiente en el tiempo (que se describe a continuación); sin embargo, se pueden utilizar otros métodos/kits disponibles comercialmente que pueden ser más rentables pero que requieren más tiempo. Los kits de secado en gel se pueden utilizar como una alternativa que no requiere la aplicación de calor o succión, sino que permite que el gel se seque al aire entre las láminas de celofán para evitar la distorsión. - Coloque una hoja grande de papel secante sobre la cama porosa del secador de gel. Coloque una hoja de toalla de papel en el área donde se aplicará el gel.
- Corta un trozo de papel secante de 15 cm x 20 cm y colócalo sobre la toalla de papel.
- Saque el gel del recipiente con una segunda pieza de papel secante de 15 cm x 20 cm y colóquelo plano sobre la primera pieza.
- Corte un trozo ligeramente más grande de envoltura de plástico, ~ 20 cm x 25 cm, y colóquelo sobre gel, asegurándose de que no haya pliegues o burbujas debajo de la envoltura.
NOTA: Esto puede tomar algunos intentos, pero es imperativo que no haya bolsas de aire atrapadas. - Coloque suavemente la cubierta de plástico del secador de gel sobre la parte superior de la envoltura, asegurándose nuevamente de que no haya burbujas ni pliegues.
- Encienda la bomba/aspiradora y asegúrese de que la cubierta de plástico haya formado un sello. Pruebe el sello levantando una esquina de la cubierta de plástico y espere a que se vuelva a sellar.
- Cierre el secador de gel y funcione durante 90 min. Ajuste la temperatura para que comience a 30 ° C, alcance gradualmente los 80 ° C y luego vuelva a 30 ° C al final de la carrera.
- Una vez deshidratado, el gel se solidificará y se sentirá delgado como el papel. Envuelva el gel en la envoltura de plástico utilizada en el proceso de secado.
- Coloque el gel deshidratado en un cassette de película con una película de fósforo (ver Tabla de Materiales), con el lado blanco mirando hacia el gel. Los tiempos de exposición varían, pero pueden ser de 24-48 h para la visualización de bandas.
- Visualice mediante autorradiografía utilizando cualquier generador de imágenes adecuado que sea capaz de obtener imágenes de fósforo.
- Aproximadamente 15 min después del inicio de la reacción de traducción, alícuota 90 μg de mitocondrias en tubos estériles de 1,5 ml y preincuba a 30 °C durante ~10 min.
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Representative Results
Hemos ilustrado ampliamente que este protocolo es un ensayo válido para determinar la tasa de importación en mitocondrias funcionales e intactas aisladas del músculo esquelético. En comparación con las condiciones no tratadas, la importación de proteínas precursoras típicas como la malato deshidrogenasa (MDH) en la matriz es sensible al potencial de membrana porque puede ser inhibida por la valinomicina, un desacoplador de la cadena respiratoria (Figura 2A). La importación también se ve obstaculizada cuando las membranas internas y externas mitocondriales se solubilizan en presencia del detergente Tritón X-100. El proceso de importación es sensible a la presencia de ATP externo, que sirve para desplegar proteínas precursoras para la translocación a través de las membranas, y está estrechamente controlado por la tasa de respiración y la provisión de ATP (datos no mostrados20). También se observan diferencias claras en la importación entre las fracciones mitocondriales intermiofibrilares y subsarcolemas, en parte debido a las variaciones en la expresión de la maquinaria de importación de proteínas, así como a la frecuencia respiratoria entre estas mitocondrias (Figura 2B).
Las mitocondrias en el músculo esquelético son orgánulos altamente dinámicos que responden fácilmente a los cambios en la demanda de energía. El contenido mitocondrial en el músculo aumenta después de períodos de ejercicio crónico o en respuesta a la actividad contráctil inducida por estimulación eléctrica (ver revisión21). Por ejemplo, 7 días de actividad contráctil crónica del músculo esquelético de rata mejora la importación en la OM y la matriz en 1,6 veces y 1,4 veces, respectivamente22 (Figura 3A, 3B).. Estos cambios en el contenido mitocondrial son provocados, en parte, por alteraciones en la capacidad del sistema de importación de proteínas mitocondriales. De hecho, se puede ilustrar una estrecha relación entre la tasa de importación de proteínas precursoras y una buena estimación del contenido mitocondrial, medida por el marcador IV complejo citocromo oxidasa bajo control o condiciones denervadas23 (Figura 3C).
La adaptabilidad del sistema de importación en el músculo a las alteraciones en la actividad contráctil sugiere que el ejercicio podría utilizarse como tratamiento para resolver defectos en la vía de importación si se identifica. Durante la investigación de la apoptosis mediada por mitocondrias utilizando animales de doble knockout de Bax-Bak, notamos que el contenido mitocondrial reducido en los músculos de estos animales de experimentación se acompañaba de una disminución en la importación de proteínas precursoras en la matriz. Luego investigamos la posibilidad de que el ejercicio pudiera restaurar esta capacidad de importación. De hecho, después de 6 semanas de entrenamiento voluntario en la tirada, la importación de proteínas se restableció a niveles de control en los animales knockout24, lo que ilustra la plasticidad adaptativa de la vía de importación para rescatar el contenido y la función mitocondrial (Figura 4).
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo para aislar las mitocondrias SS e IMF del músculo esquelético basado en el trabajo anterior8. Este protocolo permite el aislamiento de mitocondrias funcionales en función de su ubicación geográfica dentro del músculo esquelético. Las mitocondrias SS se liberan más rápida y fácilmente, mientras que las mitocondrias IMF requieren un paso de digestión adicional con proteasa para desenredarlas de las miofibrillas. Tenga en cuenta que el aislamiento de estas subfracciones se puede hacer en conjunto. Recientemente se ha publicado un procedimiento actualizado y similar25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Importación de proteínas en la matriz mitocondrial. (A) Las tasas normales de importación de MDH se muestran en las mitocondrias SS y IMF (carriles 4 y 7) y el producto de traducción del precursor MDH (carril 1). La banda inferior representa el MDH maduro importado. La adición de valinomicina inhibe la importación de proteínas MDH en la matriz de las mitocondrias SS e IMF, ya que este desacoplador disipa el potencial de membrana (carriles 2 y 5). Triton-X es un detergente que solubiliza la membrana interna, inhibiendo así la importación de MDH en estas subfracciones (carriles 3 y 6). La importación de proteínas se llevó a cabo durante períodos de tiempo crecientes, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min y 30 min. Estos datos ilustran que la importación es un proceso dependiente del tiempo y también que las mitocondrias SS y IMF tienen diferentes tasas o capacidades para la importación (B). TL, carril de traducción; VAL: valinomicina; TRI, Tritón-X; CTL, control; SS subsarcolemmal; FMI, intermiofibrilar. Esta figura fue modificada de Takahashi M & Hood DA20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La importación de proteínas es adaptable y está estrechamente vinculada a las estimaciones del contenido mitocondrial. Las ratas Sprague Dawley fueron sometidas a estimulación eléctrica para inducir actividad contráctil, un modelo de entrenamiento con ejercicios. (A) La importación de Tom40 en el OM fue 1,6 veces mayor en el músculo de animales estimulados crónicamente en comparación con los controles en un momento dado. (B) La importación de PTU en la matriz mitocondrial aumentó en cada punto temporal de incubación y, en general, esto resultó en un aumento de 1,4 veces en las mitocondrias del músculo estimulado crónicamente. (C) La importación se correlaciona positivamente con un índice de contenido mitocondrial, evaluado por la actividad de cox, r = 0,69. Estas mediciones se tomaron de animales que fueron sometidos a denervación, lo que ha demostrado disminuir el contenido mitocondrial y la tasa de importación. Contra, control; Guarida, denervada; Stim, estimulado; TL, carril de traducción; * p < 0,05. Las figuras 3A y 3B fueron adaptadas de Joseph A-M & Hood DA22 y 3C de Singh B & Hood DA23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Entrenamiento rescata defectos de importación in vivo. Los animales de doble knockout de Bax/Bak exhiben una importación reducida de proteínas en la matriz mitocondrial en un 37%. Seis semanas de funcionamiento voluntario de la rueda rescataron el defecto de importación a niveles de control. WT: tipo salvaje; DKO, doble nocaut; TL, carril de traducción; * p < 0,05 efecto principal del genotipo; ¶ p < 0,05 efecto principal del entrenamiento. Esta figura fue adaptada de Zhang Y et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer 1: | Búfer 1 + ATP: | Búfer 2: | Medio de resuspensión: | Proteasa de Nagarse |
| KCl de 100 mM | KCl de 100 mM | KCl de 100 mM | KCl de 100 mM | 10 mg/ml en Buffer 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | MOPS de 10 mM | NOTA: Refrescar y mantener en hielo |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0.2% BSA | |
| 50 mM Tris | 50 mM Tris | 50 mM Tris | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tabla 1: Buffers y medios de resuspensión.
| % del volumen de reacción | 1 Mezcla de reacción | |
| Lisado de reticulocitos | 64.10% | 11,8 μL |
| Aminoácidos (-metionina) | 2.20% | 0,4 μL |
| H2O estéril | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 S-metionina | 7.20% | 1,33 μL |
| ARNm | 5.40% | 1,0 μL |
| Volumen total | 18,5 μL | |
| NOTA: | ||
| 1) Añadir 35S-metionina por última vez; | ||
| 2) Descongelar el lisado lentamente en hielo y limitar los ciclos de congelación / descongelación a dos. Se recomienda que el lisado sea alicitado a la llegada | ||
| 3) El volumen de ARNm se puede ajustar para optimizar la eficiencia traslacional alterando el volumen estéril de H2O en consecuencia. | ||
Tabla 2: Mezcla de reacciones de traducción
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Discussion
Las mitocondrias dependen exclusivamente de la expresión y coordinación de los genomas nuclear y mitocondrial para su síntesis y expansión dentro de las células. Sin embargo, el genoma nuclear codifica la gran mayoría (99%) del proteoma mitocondrial, y esto subraya la importancia de la maquinaria de importación de proteínas para apoyar la biogénesis mitocondrial. La importación también sirve como un evento de señalización importante, ya que la falta de importación puede promover el inicio de la respuesta de proteína desplegada y / o mitofagia15,16,26. Dado que la importación se basa en la expresión de múltiples canales funcionales y chaperonas, un potencial de membrana intacto, así como la disponibilidad de ATP, la evaluación de la importación de proteínas mitocondriales puede proporcionar información valiosa sobre la salud y el estado energético del orgánulo.
La evaluación de la capacidad de importación de proteínas en las mitocondrias requiere el aislamiento del orgánulo del tejido circundante utilizando técnicas estándar de centrifugación diferencial. La importación se evalúa de la misma manera que se evaluaría el Vmax de las actividades enzimáticas mitocondriales, de una manera altamente controlada dependiente del tiempo y la concentración de sustrato e independiente de las influencias citosólicas celulares. El método de aislamiento que aquí se presenta, o versiones similares del mismo, se han utilizado durante muchos años para evaluar la respiración mitocondrial y las actividades enzimáticas8,9,10,11. Esta técnica no está exenta de limitaciones, ya que altera la morfología normal de las mitocondrias tal y como existen in situ27, que en el músculo esquelético es altamente compleja, abarcando desde pequeñas estructuras esferoides, hasta una red reticular altamente ramificada3, dependiendo de su localización subsarcolema o intermiofibrilar dentro de la célula muscular. Además, el uso de la proteasa nagarse ha sido objeto de escrutinio3,28. Recientemente se ha publicado una actualización de este método, utilizando tripsina en lugar de nagarse25, y la tripsina ha sido utilizada por otros para aislar las mitocondrias musculares29. De hecho, se puede utilizar cualquier método alternativo de aislamiento que produzca mitocondrias funcionalmente intactas, incluidas las técnicas que no emplean proteasas30 o las diseñadas para pequeñas muestras del tamaño de una biopsia del músculo humano31. El método presentado aquí tiene la ventaja de aislar las mitocondrias SS de forma rápida y sencilla, pero se puede obtener un mayor rendimiento y pureza de las mitocondrias a través del aislamiento de la subfracción IMF. Si se hace con cuidado, este protocolo de aislamiento puede dar lugar a orgánulos funcionalmente intactos con una alta relación de control respiratorio, indicativo de tasas apropiadas de respiración de estado 3 y 48.
También es imperativo para la medición de la importación de proteínas mitocondriales que estos orgánulos mantengan su potencial de membrana, ya que la importación a través de la membrana interna depende de esta fuerza motriz electroforética de protones, que sirve para atraer secuencias precursoras cargadas positivamente y ayudar a mediar el transporte del precursor al espacio de la matriz cargada negativamente. En tales condiciones, las comparaciones de la función mitocondrial y la importación se pueden evaluar entre situaciones experimentales fisiológicamente relevantes, como el ejercicio, el envejecimiento y el desuso muscular, por ejemplo. En este sentido, trabajos previos han demostrado que la importación es una vía altamente adaptable que responde a estados alterados de uso y desuso muscular y es sensible a la inhibición a través de la emisión excesiva de ROS10,22,23,32. Esta plasticidad se debe, en parte, a los cambios adaptativos en la expresión de los componentes de la maquinaria de importación de proteínas. Dado que esta técnica se basa en el aislamiento de las mitocondrias, cualquier regulación sobre la vía de importación que pueda provenir de factores citosólicos o de la diafonía entre orgánulos se elimina de la interpretación del experimento. Esto es tanto una limitación como una fortaleza de la técnica, ya que se pueden sacar conclusiones de la capacidad de la propia vía de importación (similar a la Vmax de la actividad enzimática), pero las señales transitorias o externas que pueden ocurrir con el modelo experimental pueden perderse. Para eludir esto, es posible incubar la reacción de importación con una muestra de la fracción citosólica, aislada como se describió anteriormente, con el fin de evaluar los cambios en el entorno citosólico que pueden influir en las tasas de importación, como se hizo anteriormente22. Además, los componentes de la maquinaria de importación están sujetos a modificaciones agudas y post-traduccionales que pueden alterar sus funciones. Trabajos recientes han demostrado que la fosforilación de receptores de importación TOM específicos puede estar relacionada con la mitofagia33. De hecho, un área de investigación que merece más atención es la modulación aguda del proceso de importación a través de vías de señalización intrínsecas mediadas por ROS o por modificación covalente de receptores de importación y chaperonas, como se documenta en levaduras y otros organismos inferiores34,35.
La importación de proteínas en las mitocondrias representa una puerta de entrada al crecimiento adaptativo de orgánulos y es un indicador sensible de la salud mitocondrial. Comprender cómo se regula este proceso puede arrojar luz sobre la regulación de la biogénesis mitocondrial, la señalización de UPR y el inicio de la mitofagia. La importación de proteínas mitocondriales no es un proceso ampliamente estudiado en modelos experimentales de mamíferos, y el desarrollo del vasto potencial de la investigación en esta área podría ayudarnos a lograr una mayor comprensión de las enfermedades en las que la disfunción mitocondrial es evidente o representan un objetivo terapéutico atractivo para promover la salud mitocondrial.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses, financieros o de otro tipo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. G.C. Shore de la Universidad McGill, al Dr. A. Strauss de la Escuela de Medicina de Washington y al Dr.M.T. Ryan de la Universidad de La Trobe por las donaciones originales de plásmidos de expresión que se utilizaron para esta investigación. Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a D. A. Hood. D. A. Hood también es titular de una Cátedra de Investigación de Canadá en Fisiología Celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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