Summary
Mitocôndrias são organelas metabólicas chave que exibem um alto nível de plasticidade fenotípica no músculo esquelético. A importação de proteínas do citosol é um caminho crítico para a biogênese organela, essencial para a expansão do ritúlume e a manutenção da função mitocondrial. Portanto, a importação de proteínas serve como um barômetro da saúde celular.
Abstract
Mitocôndrias são organelas metabólicas e regulatórias fundamentais que determinam o fornecimento de energia, bem como a saúde geral da célula. No músculo esquelético, as mitocôndrias existem em uma série de morfologias complexas, que vão desde pequenas organelas ovais até uma rede ampla, semelhante a órticulo. Entender como o reticúrio mitocondrial se expande e se desenvolve em resposta a diversos estímulos, como alterações na demanda de energia, tem sido um tema de pesquisa há muito tempo. Um aspecto fundamental desse crescimento, ou biogênese, é a importação de proteínas precursoras, originalmente codificadas pelo genoma nuclear, sintetizadas no citosol, e translocadas em vários subcompartidários mitocondriais. Mitocôndrias desenvolveram um mecanismo sofisticado para este processo de importação, envolvendo muitos canais seletivos de membrana interna e externa, conhecidos como máquinas de importação de proteínas (PIM). A importação para a mitocôndria depende do potencial viável da membrana e da disponibilidade de ATP derivado de organela através da fosforilação oxidativa. Portanto, sua medição pode servir como medida de saúde organela. O PIM também exibe um alto nível de plasticidade adaptativa no músculo esquelético que é fortemente acoplado ao estado energético da célula. Por exemplo, o treinamento de exercícios tem sido mostrado para aumentar a capacidade de importação, enquanto o desuso muscular reduz,coincidentemente com mudanças nos marcadores de conteúdo mitocondrial. Embora a importação de proteínas seja um passo crítico na biogênese e expansão das mitocôndrias, o processo não é amplamente estudado no músculo esquelético. Assim, este artigo descreve como usar mitocôndrias isoladas e totalmente funcionais do músculo esquelético para medir a capacidade de importação de proteínas, a fim de promover uma maior compreensão dos métodos envolvidos e uma valorização da importância do caminho para a rotatividade de organelas no exercício, saúde e doenças.
Introduction
Mitocôndrias são organelas que existem em morfologias complexas em diferentes tipos celulares e são reconhecidas por possuir uma gama crescente de funções que são fundamentais para a saúde celular. Como tal, eles não podem mais ser reduzidos apenas a organelas produtoras de energia. Mitocôndrias são os principais reguladores metabólicos, determinantes do destino celular e centros de sinalização, das quais as funções podem servir como indicadores úteis da saúde celular geral. Nas células musculares esqueléticas, estudos de microscopia eletrônica revelam a presença de mitocôndrias subsarambimais geograficamente distintas (SS) e intermyofibrilar (FMI), que exibem um grau de conectividade1,2,3,4 que agora é reconhecida como altamente dinâmica e adaptável às mudanças nos níveis de atividade muscular esquelética, bem como com idade e doença. O conteúdo mitocondrial e a função muscular podem ser avaliados de inúmeras formas5,6, e métodos tradicionais de isolamento de organela têm sido aplicados para entender melhor as capacidades respiratórias e enzimáticas (Vmax) das mitocôndrias distintas da influência do meio celular7,8. Em particular, esses métodos tradicionais revelaram sutis distinções bioquímicas entre mitocôndrias isoladas das regiões subsarcolemmal e intermiofibrilar, desfaçando possíveis implicações funcionais para o metabolismo nessas regiões subcelulares8,9,10,11.
A biogênese das mitocôndrias é única em exigir a contribuição de produtos genéticos do DNA nuclear e mitocondrial. No entanto, a grande maioria deles são derivados do núcleo, uma vez que a transcrição do MTDNA só leva à síntese de 13 proteínas. Uma vez que as mitocôndrias normalmente compreendem >1000 proteínas envolvidas em diversas vias metabólicas, a biogênese da organela requer um meio bem regulado de importação e montagem de proteínas precursoras do citosol nos vários subcompartidores mitocondriais para manter a estequiometria e a função adequadas12,13. Proteínas codificadas por nuclear destinadas a mitocôndrias normalmente carregam uma sequência de alvo mitocondrial (MTS) que as visa à organela e facilita sua localização subcompartidária. A maioria das proteínas ligadas à matriz contém um MTS terminal N cleavável, enquanto aquelas destinadas à membrana mitocondrial externa ou interna geralmente têm domínios internos de segmentação14. O processo de importação é realizado por um conjunto de diversos canais que fornecem múltiplas vias para entrada na organela13. A translocase do complexo de membrana externa (TOM) transporta precursores do citosol para o espaço intermembrano, onde são reconhecidos pela translocase do complexo de membrana interna (TIM). Este complexo é responsável pela importação de precursores codificados nucleares para a matriz, onde os proteases cortam a preseqüência de alvo do terminal N. As proteínas destinadas à membrana externa podem ser diretamente inseridas nesta membrana através do complexo TOM, enquanto as destinadas à membrana interna são inseridas por uma proteína TIM, especificamente TIM22. Após sua importação, as proteínas são processadas por proteases residentes e acompanhantes e muitas vezes se combinam para formar complexos maiores, como os encontrados na cadeia de transporte de elétrons.
A importação de proteína mitocondrial também serve como uma medida da saúde mitocondrial, pois esse processo conta com a presença de potencial de membrana e uma fonte de energia na forma de ATP15. Por exemplo, quando o potencial da membrana é dissipado, a proteína quinase PINK1 não pode ser absorída pela organela, e isso leva a sinais de fosforilação que desencadeiam o início da degradação da organela através de uma via chamada mitofagia16,17. Em circunstâncias semelhantes, quando a importação é impedida, a proteína ATF5 não pode entrar na organela, e posteriormente se transloca para o núcleo, onde serve como fator de transcrição para a regulação da expressão genética UPR18,19. Assim, medir a eficiência de importação de proteínas pode fornecer uma visão abrangente da saúde da organela, enquanto a resposta à expressão genética pode ser usada para indicar o grau de sinalização retrógrada para o núcleo.
Apesar de sua óbvia importância para a biogênese das mitocôndrias e para a saúde celular em geral, a via de importação em mitocôndrias mamíferas é notavelmente subestudada. Neste relatório, descrevemos as etapas específicas envolvidas na medição da importação de proteínas precursoras em mitocôndrias musculares esqueléticas e fornecemos dados para ilustrar a resposta adaptativa do sistema de importação às alterações musculares e desuso, ilustrando a contribuição da importação de proteínas para a plasticidade adaptativa do músculo esquelético.
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Protocol
Todos os animais usados nesses experimentos são mantidos na unidade de cuidados com animais da Universidade de York. Os experimentos são realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais com aprovação do Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de York (Licença: 2017-08).
1. Isolamento funcional das mitocôndrias subsarcolemmal e intermyofibrilar do músculo esquelético
- Preparação do reagente:
- Prepare todos os buffers e mídia mencionados na Tabela 1.
- Defina os buffers para pH 7.4 e armazene a 4 °C (até 2 semanas), exceto nagrase protease.
- Prepare protease nagarse fresca (Tabela 1) cada vez.
- Remoção de tecido e picar
NOTA: Um fluxograma das etapas abaixo para o isolamento das mitocôndrias é fornecido na Figura 1.- Encha um frasco de cintilação de vidro com ~20 mL de Buffer 1 (Tabela 1) e coloque-o no gelo.
- Enquanto o camundongo estiver sob anestésico, colhe músculos esqueléticos (tibialis anterior, quadríceps, gastrocnemius etc.), aproximadamente 500-1000 mgs, e coloque os músculos no frasco de cintilação contendo tampão refrigerado 1.
NOTA: O isoflurane gasoso é usado como anestésico a 2,5% a uma taxa de fluxo de 0,4 L de O2/min. Um teste de pinça é realizado para garantir que o animal não seja responsivo. - Após a coleta de tecidos, eutanize o animal por deslocamento cervical.
- Pré-chill um copo de relógio no gelo. Remova qualquer gordura ou tecido conjuntivo dos músculos e pique o tecido no vidro do relógio até que seja um chorume homogêneo.
- Coloque o tecido picado em um tubo de centrifugação de plástico pré-refrigerado de 50 mL (ver Tabela de Materiais) e regise o peso exato.
- Diluir o tecido picado 10 vezes com Buffer 1 + ATP (Tabela 1).
- Homogeneize a amostra muscular usando um homogeneizador de lâmina dupla de 8 mm (ver Tabela de Materiais) a uma potência de 9,8 Hz para 10 s, garantindo que não restem pedaços visíveis de músculo.
- Centrifugar as amostras a 800 x g por 10 minutos usando uma centrífuga de alta velocidade (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O objetivo desta etapa é separar as frações mitocondriais das SS e do FMI. O supernato contém mitocôndrias SS, enquanto a pelota contém mitocôndrias do FMI.
- Isolamento mitocondrial SS
- Filtre o supernato através de uma única camada de pano de queijo em outro conjunto de tubos de centrifugação de plástico de 50 mL para remover quaisquer detritos grandes ou contaminantes.
- Centrifugar o supernato a 9.000 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
- Descarte o supernato e resuspenque a pelota em 3,5 mL de Buffer 1 + ATP.
NOTA: Resuspend com um P1000 e faça isso com cuidado. Mitocôndrias são organelas frágeis. Execute suavemente e evite tocar na pelota com a ponta da pipeta. - Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
- Descarte o supernato a menos que um processamento adicional para isolar uma fração citosolítica desprovida de núcleos, mitocôndrias e outras organelas seja desejada. Resuspense a pelota cuidadosamente em aproximadamente 95 μL do meio de ressuspensão (Tabela 1) usando uma pipeta P200.
NOTA: Semelhante ao passo 1.3.3, evite tocar na pelota com a ponta da pipeta. O volume do meio de resuspensão pode ser alterado dependendo do tamanho da pelota. Esta é a fração mitocondrial da SS, que pode ser armazenada no gelo até que a fração do FMI seja isolada. Se desejar, a fração citosolica, desprovida de organelas, pode ser isolada por centrifugar o supernato a 100.000 x g em uma ultracentrifuagem (ver Tabela de Materiais) e, posteriormente, descartando a pelota.
- Isolamento mitocondrial do FMI
- Diluir a pelota da etapa 1.2.8 por 10 vezes em Buffer 1 + ATP. Resuspend usando um pilão de Teflon misturando suavemente a pelota e tampão juntos até que a amostra seja consistente.
- Homogeneize a amostra utilizando um homogeneizador de lâmina dupla de 8 mm (ver Tabela de Materiais) a uma potência de 9,8 Hz para 10 s.
- Centrifugar a amostra a 800 x g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
- Descarte o supernato e dilua a pelota mitocondrial do FMI 10 vezes usando buffer 2 e resuspend usando o pilão de Teflon misturando suavemente até que seja homogêneo.
- Adicione 25 μL/g de tecido a 10 mg/mL nagarse protease (Tabela 1) e coloque o tubo de centrifugação de lado no gelo, misturando suavemente a cada minuto balançando o tubo de um lado para o outro.
NOTA: A adição de nagarse ajuda a libertar mitocôndrias do FMI realizando digestão limitada dos miofibrils. - Após 5 min, adicione 20 mL de Buffer 2 (Tabela 1) para diluir a protease nagarse ao ponto de inatividade e parar a digestão.
- Imediatamente centrifugar a amostra a 5.000 x g por 5 min a 4 °C usando uma centrífuga de alta velocidade.
- Descarte o supernato e dilua a pelota 10 vezes usando buffer 2 e resuspend usando um pilão de Teflon misturando suavemente.
- Centrifugar a amostra a 800 x g por 15 min a 4 °C para pelotar o material fibroso.
- Despeje o supernato em um novo conjunto de tubos de centrífuga de plástico de 50 mL, cuidado para não interromper a pelota, que pode ser descartada.
- Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C como na etapa 1.4.7.
- Descarte o supernato, adicione 3,5 mL de Buffer 2 e resuspenque suavemente a pelota usando uma pipeta P1000.
- Centrifugar a amostra a 9.000 x g por 10 min a 4 °C como na etapa 1.4.7.
- Descarte o supernato e resuspenque a pelota suavemente com cerca de 180 μL de meio de resuspensão usando uma pipeta P200.
NOTA: O volume do meio de resuspensão pode ser alterado dependendo do tamanho da pelota. Esta é a fração mitocondrial do FMI, que pode ser armazenada no gelo até que seja usada no ensaio de importação.
2. Importação de proteína mitocondrial
- In vitro transcrição
NOTA: Estas etapas subsequentes descrevem como preparar uma proteína radiolabellada para importação. O caminho de importação sob investigação pode ditar a escolha da proteína alvo, por exemplo, para avaliar a importação para a matriz mitocondrial, ornitina carbamyl transferase, OCT, e desidrogenase malate, MDH, são comumente usados, enquanto Tom40 é comumente usado como uma indicação de importação para a membrana mitocondrial externa. Para as etapas seguintes, é necessário codificar o DNA plasmid da proteína escolhida. A transcrição do DNA plasmídeo pode ser feita antes do isolamento mitocondrial em um dia separado, e o mRNA coletado deste experimento pode ser armazenado e usado em experimentos futuros de tradução e importação.- Linearize o DNA: Combine 40 μL de DNA plasmídeo (5 μg/μL), 5 μL de tampão de enzima de 10x e 5 μL de enzima de restrição e incubar a 37 °C por 30 min.
NOTA: As enzimas de restrição utilizadas podem variar de acordo com o plasmídeo, que pode exigir um tampão de enzima diferente, e o DNA de condições experimentais pode ser usado em qualquer quantidade/volume, pois o modelo pode ser dimensionado para cima ou para baixo. - Purificar e precipitar o DNA linearizado usando fenol e etanol. Realize todas as etapas subsequentes (2.1.3-2.1.15) em tubos estéreis de 1,5 mL e use uma centrífuga de mesa (ver Tabela de Materiais) para as etapas de centrifugação.
- Adicione o volume apropriado de H2O estéril para que o volume final seja igual a 400 μL. Em seguida, adicione 400 μL de fenol.
- Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 x g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
- Adicione 400 μL de fenol:clorofórmio:isoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
- Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
- Adicione 400 μL de clorofórmio:isoamylalcohol (24:1, v:v).
- Misture vigorosamente por inversão para ~10 s, e centrífuga a 17.000 g por 1 min a 4 °C. Retire e salve a fase superior.
- Adicione 40 μL de acetato de sódio de 3M (pH 7,0), e adicione 1 mL de 95% de etanol.
- Coloque tubos estéreis de 1,5 mL no congelador -80 °C ao seu lado por 15 minutos.
- Centrifugar as amostras a 17.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Descarte o supernato e lave a pelota com 300 μL de 80% de etanol.
- Centrifugar as amostras a 17.000 x g por 2 min a 4 °C.
- Descarte o supernato e seque a pelota. Uma vez que a pelota está seca, deve estar clara.
- Resuspend a pelota em 20 μL de H2O estéril
- Meça a concentração de DNA usando um espect autortômetro (ver Tabela de Materiais) e certifique-se de que a razão A260:280 esteja acima de 1,8.
- Diluir o DNA a uma concentração de 0,8 μg/μL em H2O estéril.
- Transcreva o DNA: Combine plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), H2O estéril (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), ATP de 10 mM (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), mistura mencionado etapa 2.1.19 (15.6 μL), RNAsin (5.2 μL) e uma polimerase RNA apropriada (4.8 μL) para formar "uma mistura de reação" (volume total = 121,6 μL) e incubar por 90 min na temperatura ideal para o polímero (37 °C para polímero T7; 40 °C para polimerase SP6)
- Para preparar a mistura adicione 200 μL de 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL de 1 M MgAc2, 500 μL de 4 M KAc, 100 μL de 20 mM de espermidina, 100 μL de 0,5 M DTT e 200 μL de H20 estéril.
NOTA: A reação pode ser dimensionada para cima ou para baixo em volume, desde que as proporções fornecidas de reagentes sejam mantidas. A polimerase RNA utilizada é ditada pela sequência de promotores bacterianos dentro do plasmídeo que está sendo usado. - Em seguida, purfique e precipitar o mRNA usando fenol e etanol como nas etapas 2.1.2-2.1.1.15. Leve o volume até 400 μL com H2O estéril (adicione 280 μL) e prossiga conforme descrito nas etapas 2.1.2-2.1.15. Resuspend a última pelota em 20 μL de H2O estéril.
- Meça a concentração de mRNA usando um espectrofotômetro, certifique-se de que a razão A260:280 seja ~2.0.
- Diluir o mRNA para 2,8 μg/μL em H2O estéril e armazenar a -20 °C em 50 alíquotas de μL.
- Linearize o DNA: Combine 40 μL de DNA plasmídeo (5 μg/μL), 5 μL de tampão de enzima de 10x e 5 μL de enzima de restrição e incubar a 37 °C por 30 min.
- Tradução in vitro
NOTA: A tradução do DNA desejado deve ser realizada no mesmo dia do experimento de importação. Este experimento requer o uso de aminoácidos radiolabeled e, portanto, o usuário deve ter uma permissão para o uso de radioisótopos, e todo o manuseio e descarte devem estar de acordo com as políticas/requisitos da instituição. As etapas que envolvem medidas de segurança do radioisótopos foram omitidas ou descritas brevemente, pois provavelmente diferem com base na instituição.- Prepare o mix de reação de tradução suficiente (Tabela 2) para fornecer ~20 μL por amostra de mitocôndrias a serem usadas no experimento de importação e inclua o mesmo volume para uma faixa de tradução.
- Incubar a reação por 30 min a 30 °C (o tempo pode variar com mRNA, 25-60 min).
- Regissite o uso de 35S-methionina de acordo com os requisitos de segurança radioativa da instituição e descarte qualquer coisa que tenha entrado em contato com o radioisótopo de acordo com as diretrizes da instituição.
- Importação de proteínas
NOTA: Mitocôndrias recém-isoladas são necessárias para os próximos passos. Consulte o protocolo de isolamento mitocondrial. Outros métodos de isolamento podem ser usados desde que as mitocôndrias sejam viáveis e funcionais. Para as etapas subsequentes, as amostras mitocondriais utilizadas são resuspensadas em um buffer de ressuspensão conforme descrito acima (Tabela 1). A concentração proteica da amostra mitocondrial também deve ser medida antes de iniciar o ensaio de importação.- Cerca de 15 minutos após o início da reação de tradução, alíquota de 90 μg de mitocôndrias em tubos estéreis de 1,5 mL e pré-incubação a 30 °C por ~10 min.
NOTA: Alíquota mais mitocôndrias do que o que realmente será usado no experimento; apenas 75 μg serão realmente utilizados. No entanto, alíquotar em excesso não é uma exigência. - Em um conjunto fresco de tubos estéreis de 1,5 mL, combine 75 μg de mitocôndrias com 18 μL da reação de tradução e incubar a 30 °C pelo tempo desejado.
- Manter o volume restante da reação de tradução no gelo; isso será utilizado mais tarde.
NOTA: A importação é um processo dependente do tempo, por isso pode ser prudente começar com um experimento de curso de tempo que varia em tempos de incubação de 1 a 60 min. Um tempo típico de reação é de 30 minutos. - Durante este período, prepare a almofada de sacarose combinando 1 g de sacarose, 200 μL de 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL de 1 M HEPES (pH 7.4), e leve o volume para 5 mL usando H2O estéril.
- Prepare um novo conjunto de tubos estéreis de 1,5 mL correspondentes a cada tubo na reação de importação. Alíquota de 600 μL da almofada de sacarose em cada tubo e mantenha no gelo até que a reação de importação acabe.
- Para encerrar a reação de importação após o tempo de incubação adequado, retire o tubo a partir de 30 °C, coloque-o no gelo e, em seguida, transfira cuidadosamente a reação de importação em cima do tubo com a almofada de sacarose.
NOTA: Esta etapa precisa ser feita muito lentamente para garantir que as mitocôndrias não sejam danificadas/rompidas. A almofada de sacarose ajuda a retardar a migração das mitocôndrias e "almofadas" sua descida para o fundo do tubo durante a etapa de centrifugação subsequente. - Centrifugar as amostras + almofada de sacarose a 17.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Prepare o tampão de quebra combinando 25 mL de sorbitol de 2,4 M, 2 mL de 1 M HEPES (pH 7.4) e 72 mL de H2O destilado duplo.
- Prepare o tampão de lise para eletroforese de gel SDS-PAGE: Combine 50 mL de glicerol aquecido, 11,5 g de SDS, 31,25 mL de 1 M Tris (pH 6.8) e leve o volume para 500 mL com H2O destilado duplo.
- Para a preparação da amostra, misture 475 μL de tampão de lise com 25 μL de β-mercaptoetanol a ser usado posteriormente.
NOTA: O tampão de lise pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente; no entanto, a adição de β-mercaptoetanol deve ser feita de novo. - Usando uma pipeta P1000, remova cuidadosamente o supernato e não perturbe a pelota. Descarte o supernato em um recipiente de resíduos radioativos apropriado.
- Para importação para a membrana externa, realize isso usando Tom40, resuspenque a pelota em 50 μL de carbonato de sódio recém-preparado (pH 11,5) e incubar no gelo por 30 minutos.
- Após a incubação, centrifugar a amostra 14.000 x g por 5 min a 4 °C. Esta etapa só é feita para reações de importação de membrana externa.
- Para preparar as amostras para eletroforese SDS-PAGE, adicione 20 μL de tampão de quebra, 20 μL de tampão de lise e β-mercaptoetanol e resuspense bem. Adicione 5 μL de corante de amostra.
- Prepare a faixa de controle/tradução combinando 3 μL da reação de tradução restante da etapa 2.3.3 com 37 μL de tampão de lise e 5 μL de corante amostral. Misture bem.
- Ferva as amostras por 5 min a 95 °C e gire suavemente a uma velocidade baixa para evitar a dotria.
- Aplique as amostras em um gel de poliacrilamida SDS.
NOTA: A porcentagem de gel e o tempo de execução subsequente dependerão de qual proteína está sendo importada. Por exemplo, OCT é de 37 kDa, e sua banda processada madura é ligeiramente menor; portanto, um gel de 12% permite uma boa separação dessas bandas. - Quando a eletroforese estiver completa, remova o gel e coloque-o em H2O destilado duplo.
- Ferva o gel em 5% TCA em um capô de fumaça por 5 minutos, mexendo continuamente/movendo o gel para evitar rachaduras.
NOTA: O TCA ajuda a solidificar o gel para visualização; isso pode ser feito em uma bandeja de metal sobre um queimador Bunsen. Use TCA suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 cheio. - Retire o gel e coloque-o de volta em H2O destilado duplo. Agitar-o em uma placa giratória por 1 min a ~50 rpm.
- Lave o gel em 10 mM Tris em uma placa rotativa por 5 min a ~50 rpm, novamente usando o suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 do recipiente.
- Precipitar a proteína lavando o gel em ácido salicíclico de 1 M em uma placa rotativa por 30 min, novamente usando ácido salicíclico suficiente para cobrir generosamente o gel, ~1/2 do recipiente que está sendo usado.
- Desidratar o gel conforme descrito nas etapas 2.3.24-2.3.31.
NOTA: Isso pode ser feito de várias maneiras. Um secador de gel (ver Tabela de Materiais) oferece uma opção de tempo eficiente (descrita abaixo); no entanto, outros métodos/kits disponíveis comercialmente podem ser usados que podem ser mais econômicos, mas mais demorados. Os kits de secagem de gel podem ser utilizados como uma alternativa que não requer a aplicação de calor ou sucção, mas permite que o gel seque entre as folhas de celofane para evitar distorções. - Coloque uma grande folha de papel manchado na cama porosa do secador de gel. Coloque uma folha de papel toalha na área onde o gel será aplicado.
- Corte um pedaço de papel de 15 cm x 20 cm de papel manchado e coloque-o sobre a toalha de papel.
- Retire o gel do recipiente usando um segundo pedaço de papel de 15 cm x 20 cm e coloque-o em cima da primeira peça.
- Corte um pedaço um pouco maior de plástico, ~20 cm x 25 cm, e coloque-o em gel, garantindo que não haja vincos ou bolhas sob o envoltório.
NOTA: Isso pode levar algumas tentativas, mas é imperativo que não haja bolsões de ar presos. - Deite suavemente a tampa plástica do secador de gel por cima do envoltório, garantindo novamente que não haja bolhas ou vincos.
- Ligue a bomba/o vácuo e certifique-se de que a tampa plástica tenha formado uma vedação. Teste o selo levantando um canto da tampa plástica e espere que ele sela.
- Feche a secadora de gel e corra por 90 min. Coloque a temperatura para começar em 30 °C, atinja gradualmente 80 °C e volte para 30 °C no final da corrida.
- Uma vez desidratado, o gel se solidificará e sentirá papel fino. Enrole o gel no plástico usado no processo de secagem.
- Coloque o gel desidratado em uma fita de filme com um filme de fósforo (ver Tabela de Materiais), com o lado branco voltado para o gel. Os tempos de exposição variam, mas podem ser de 24 a 48 h para visualização de bandas.
- Visualize usando autoradiografia usando qualquer imager adequado capaz de imagens de fósforo.
- Cerca de 15 minutos após o início da reação de tradução, alíquota de 90 μg de mitocôndrias em tubos estéreis de 1,5 mL e pré-incubação a 30 °C por ~10 min.
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Representative Results
Ilustramos extensivamente que este protocolo é um ensaio válido para determinar a taxa de importação em mitocôndrias musculares esqueléticas funcionais e intactas. Em comparação com as condições não tratadas, a importação de proteínas precursoras típicas como o malate desidrogenase (MDH) para a matriz é sensível ao potencial da membrana porque pode ser inibida pela valinomicina, um desacoplador da cadeia respiratória (Figura 2A). A importação também é impedida quando as membranas interiores e externas mitocondriais são solubilizadas na presença do detergente Tritão X-100. O processo de importação é sensível à presença de ATP externo, que serve para desdobrar proteínas precursoras para translocação através das membranas, e é fortemente controlado pela taxa de respiração e provisão ATP (dados não mostrados20). Diferenças distintas na importação também são observadas entre frações mitocondriais intermyofibrilares e subsarcolemmal, em parte devido a variações na expressão da maquinaria de importação de proteínas, bem como a taxa respiratória entre essas mitocôndrias (Figura 2B).
Mitocôndrias no músculo esquelético são organelas altamente dinâmicas que respondem prontamente às mudanças na demanda de energia. O teor mitocondrial no músculo aumenta após períodos de exercício crônico ou em resposta à atividade contratil induzida por estimulação elétrica (ver para revisão21). Por exemplo, 7 dias de atividade contratil crônica do músculo esquelético de rato aumenta a importação para o OM e matriz em 1,6 vezes e 1,4 vezes, respectivamente22 (Figura 3A, 3B). Essas mudanças no conteúdo mitocondrial são provocadas, em parte, por alterações na capacidade do sistema de importação de proteínas mitocondriais. De fato, uma estreita relação entre a taxa de importação de proteínas precursoras e uma boa estimativa do conteúdo mitocondrial, medida pelo complexo marcador IV citocromo oxidase sob controle ou condições deserdadas, pode ser ilustrada23(Figura 3C).
A adaptabilidade do sistema de importação muscular a alterações na atividade contratil sugere que o exercício poderia ser usado como tratamento para resolver defeitos na via de importação, se identificado. Durante a investigação da apoptose mitocondrílica mediada usando animais de duplo nocaute Bax-Bak, notamos que o teor mitocondrial reduzido nos músculos desses animais experimentais foi acompanhado por uma diminuição na importação de proteínas precursoras para a matriz. Investigamos então a possibilidade de que o exercício pudesse restaurar essa capacidade de importação. De fato, após 6 semanas de treinamento voluntário de corrida de rodas, a importação de proteínas foi restaurada para os níveis de controle nos animais de nocaute24, ilustrando a plasticidade adaptativa da via de importação para resgate de conteúdo mitocondrial e função (Figura 4).
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho para isolar as mitocôndrias de SS e FMI do músculo esquelético com base no trabalho anterior8. Este protocolo permite o isolamento de mitocôndrias funcionais com base em sua localização geográfica dentro do músculo esquelético. As mitocôndrias SS são mais rápidas e facilmente liberadas, enquanto as mitocôndrias do FMI requerem um passo de digestão adicional com protease para desembaraçá-las dos miofibrils. Observe que o isolamento dessas subfrações pode ser feito em conjunto. Um procedimento atualizado e semelhante foi publicado recentemente25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Importação de proteínas para a matriz mitocondrial. (A) As taxas normais de importação para MDH são mostradas nas mitocôndrias SS e FMI (faixas 4 e 7) e no produto de tradução do precursor MDH (pista 1). A faixa inferior representa o MDH maduro importado. A adição de valinomicina inibe a importação de proteína MDH na matriz das mitocôndrias da SS e do FMI, pois este desacoplador dissipa o potencial de membrana (faixas 2 e 5). Triton-X é um detergente que solubiliza a membrana interna, inibindo assim a importação de MDH para essas subfrações (faixas 3 e 6). A importação de proteínas foi realizada para o aumento das duraçãos do tempo, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min e 30 min. Esses dados ilustram que a importação é um processo dependente do tempo e também que as mitocôndrias das SS e do FMI têm diferentes taxas ou capacidades de importação (B). TL, pista de tradução; VAL, valinomicina; TRI, Triton-X; CTL, controle; SS, subsarcolemmal; FMI, intermyofibrilar. Este valor foi modificado de Takahashi M & Hood DA20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A importação de proteínas é adaptável e fortemente ligada às estimativas de conteúdo mitocondrial. Os ratos sprague Dawley foram submetidos a estimulação elétrica para induzir atividade contratil, um modelo de treinamento de exercícios. (A) A importação de Tom40 para o OM foi 1,6 vezes maior em músculos de animais cronicamente estimulados em comparação com os controles em qualquer ponto de tempo. (B) A importação de OCT para a matriz mitocondrial foi aumentada em cada ponto de incubação, e no geral, isso resultou em um aumento de 1,4 vezes nas mitocôndrias de músculos cronicamente estimulados. (C) A importação está positivamente correlacionada com um índice de conteúdo mitocondrial, avaliado pela atividade cox, r = 0,69. Essas medidas foram tomadas a partir de animais submetidos à denervação, o que tem demonstrado diminuição do conteúdo mitocondrial e da taxa de importação. Contra, controle; Den, denervated; Stim, estimulado; TL, pista de tradução; * p < 0,05. As figuras 3A e 3B foram adaptadas de Joseph A-M & Hood DA22 e 3C da Singh B & Hood DA23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Treinamento resgata defeitos de importação in vivo. Os animais de duplo nocaute bax/bak apresentam redução da importação de proteínas para a matriz mitocondrial em 37%. Seis semanas de corrida voluntária resgataram o defeito de importação para níveis de controle. WT, tipo selvagem; DKO, nocaute duplo; TL, pista de tradução; * p < 0,05 efeito principal do genótipo; P < 0,05 efeito principal do treinamento. Este número foi adaptado de Zhang Y et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer 1: | Buffer 1 + ATP: | Buffer 2: | Meio de resuspensão: | Protease de Nagarse |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/mL no Buffer 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | MOPS de 10 mM | NOTA: Faça fresco e mantenha no gelo |
| 5 mM EDTA | 5 mM EDTA | 5 mM EGTA | 0,2% BSA | |
| Tris de 50 mM | Tris de 50 mM | Tris de 50 mM | ||
| ATP de 1 mM | ATP de 1mM |
Tabela 1: Buffers e mídia de resuspensão.
| % do volume de reação | 1 Mistura de reação | |
| Lysate regulocyte | 64.10% | 11,8 μL |
| Aminoácidos (-metologia) | 2.20% | 0,4 μL |
| H2O estéril | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 S-meionina | 7.20% | 1,33 μL |
| Mrna | 5.40% | 1,0 μL |
| Total Volume | 18,5 μL | |
| NOTA: | ||
| 1) Adicionar 35S-methionina por último; | ||
| 2) Descongele o lise lentamente no gelo e limite os ciclos de congelamento/degelo a dois. Recomenda-se que o lisato seja aliquotado na chegada | ||
| 3) O volume de mRNA pode ser ajustado para otimizar a eficiência translacional alterando o volume Estéril H2O em conformidade. | ||
Tabela 2: Mistura de reação de tradução
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Discussion
Mitocôndrias são exclusivamente dependentes da expressão e coordenação dos genomas nuclear e mitocondrial para sua síntese e expansão dentro das células. No entanto, o genoma nuclear codifica a grande maioria (99%) do proteome mitocondrial, e isso ressalta a importância do maquinário de importação de proteínas no suporte à biogênese mitocondrial. A importação também serve como um importante evento de sinalização, pois a falta de importação pode promover o início da resposta proteica desdobrada e/ou mitofagia15,16,26. Uma vez que a importação se baseia na expressão de múltiplos canais funcionais e acompanhantes, um potencial de membrana intacta, bem como a disponibilidade de ATP, a avaliação da importação de proteína mitocondrial pode fornecer informações valiosas sobre o estado de saúde e energia da organela.
A avaliação da capacidade de importação de proteínas em mitocôndrias requer o isolamento da organela do tecido circundante utilizando técnicas de centrifugação diferencial padrão. A importação é avaliada da mesma forma que se avaliaria o Vmax das atividades enzimáticas mitocondriais, de forma altamente controlada dependente da concentração de tempo e substrato e independente de influências citosolíticas celulares. O método de isolamento aqui apresentado, ou representações similares dele, têm sido utilizados por muitos anos para avaliar a respiração mitocondrial e as atividades enzimais8,9,10,11. Esta técnica não é sem suas limitações, pois interrompe a morfologia normal das mitocôndrias como elas existem no situ27, que no músculo esquelético é altamente complexa, desde pequenas estruturas eferidas, até uma rede reticular altamente ramificada3, dependendo de sua localização subsarcolêmal ou intermyofibrilar dentro da célula muscular. Além disso, o uso do protease nagarse está sob escrutínio3,28. Uma atualização deste método, usando trippsina em vez de nagarse, foi publicada recentemente25, e a trippsina tem sido usada por outros para isolar mitocôndrias musculares29. De fato, qualquer método alternativo de isolamento que produz mitocôndrias funcionalmente intactas pode ser usado, incluindo técnicas que não empregam proteases30 ou aquelas projetadas para pequenas amostras do tamanho de uma biópsia de músculos humanos31. O método aqui apresentado tem a vantagem de isolar as mitocôndrias SS de forma rápida e fácil, mas um maior rendimento e pureza das mitocôndrias pode ser obtido através do isolamento da subfração do FMI. Se feito com cuidado, este protocolo de isolamento pode resultar em organelas funcionalmente intactas com uma alta razão de controle respiratório, indicativo de taxas adequadas de respiração 3 e 4.
Também é imperativo para a medição da importação de proteína mitocondrial que essas organelas mantenham seu potencial de membrana, pois a importação através da membrana interna depende dessa força motivo de próton eletroforético, que serve para atrair sequências precursoras positivamente carregadas e ajudar a mediar o transporte do precursor para o espaço matricial carregado negativamente. Sob tais condições, comparações da função mitocondrial e da importação podem ser avaliadas entre situações experimentais fisiologicamente relevantes, como exercício, envelhecimento e desuso muscular, por exemplo. Nesse sentido, trabalhos anteriores mostraram que a importação é um caminho altamente adaptável que responde a estados alterados de uso e desuso muscular e sensível à inibição por meio de emissões excessivas de ROS10,22,23,32. Essa plasticidade deve-se, em parte, a mudanças adaptativas na expressão dos componentes da máquina de importação de proteínas. Uma vez que essa técnica se baseia no isolamento das mitocôndrias, qualquer regulação sobre a via de importação que possa decorrer de fatores citossóicos ou crosstalk inter-organela é removida da interpretação do experimento. Trata-se tanto de uma limitação quanto de uma força da técnica, pois podem ser feitas conclusões da capacidade da própria via de importação (semelhante ao Vmax da atividade enzimante), mas sinais transitórios ou externos que podem ocorrer com o modelo experimental podem ser perdidos. Para contornar isso, é possível incubar a reação de importação com uma amostra da fração citosolica, isolada como descrito acima, a fim de avaliar alterações no ambiente citosolico que possam influenciar as taxas de importação, como feito anteriormente22. Além disso, os componentes da máquina de importação estão sujeitos a modificações agudas pós-translacionais que podem alterar suas funções. Trabalhos recentes mostraram que a fosforilação de receptores específicos de importação tom pode estar ligada à mitofagia33. De fato, uma área de pesquisa que merece mais atenção é a modulação aguda do processo de importação por vias de sinalização intrínseca mediadas pela ROS ou por modificação covalente de receptores de importação e acompanhantes, como documentado na levedura e em outros organismos inferiores34,35.
A importação de proteínas para mitocôndrias representa uma porta de entrada para o crescimento de organelas adaptativas e é um indicador sensível da saúde mitocondrial. Entender como esse processo é regulado pode lançar luz sobre a regulação da biogênese mitocondrial, sinalização UPR e o início da mitofagia. A importação de proteínas mitocondriais não é um processo amplamente estudado em modelos experimentais de mamíferos, e o desenvolvimento do vasto potencial de pesquisa nessa área poderia nos ajudar a alcançar uma maior compreensão das doenças nas quais a disfunção mitocondrial é aparente ou representam um alvo terapêutico atraente para promover a saúde mitocondrial.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses, financeiro ou não, é declarado pelos autores.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. G.C. Shore da Universidade McGill, Dr. A. Strauss da Faculdade de Medicina de Washington, e dr.M.T. Ryan da Universidade de La Trobe pelas doações originais de plasmídeos de expressão que foram usados para esta pesquisa. Este trabalho foi apoiado por financiamento do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) para D. A. Hood. D. A. Hood também é o titular de uma Cadeira de Pesquisa no Canadá em Fisiologia Celular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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