Summary
Les mitochondries sont des organites métaboliques clés qui présentent un niveau élevé de plasticité phénotypique dans le muscle squelettique. L’importation de protéines du cytosol est une voie critique pour la biogenèse des organites, essentielle à l’expansion du réticulum et au maintien de la fonction mitochondriale. Par conséquent, l’importation de protéines sert de baromètre de la santé cellulaire.
Abstract
Les mitochondries sont des organites métaboliques et régulateurs clés qui déterminent l’approvisionnement en énergie ainsi que la santé globale de la cellule. Dans le muscle squelettique, les mitochondries existent dans une série de morphologies complexes, allant de petits organites ovales à un large réseau en forme de réticulum. Comprendre comment le réticulum mitochondrial se dilate et se développe en réponse à divers stimuli tels que les altérations de la demande d’énergie est depuis longtemps un sujet de recherche. Un aspect clé de cette croissance, ou biogenèse, est l’importation de protéines précurseurs, codées à l’origine par le génome nucléaire, synthétisées dans le cytosol et translocalisées dans divers sous-compartiments mitochondriaux. Les mitochondries ont développé un mécanisme sophistiqué pour ce processus d’importation, impliquant de nombreux canaux membranaires internes et externes sélectifs, connus sous le nom de machinerie d’importation de protéines (PIM). L’importation dans la mitochondrie dépend du potentiel membranaire viable et de la disponibilité de l’ATP dérivé des organites par phosphorylation oxydative. Par conséquent, sa mesure peut servir de mesure de la santé des organites. Le PIM présente également un haut niveau de plasticité adaptative dans le muscle squelettique qui est étroitement couplé à l’état énergétique de la cellule. Par exemple, il a été démontré que l’entraînement physique augmente la capacité d’importation, tandis que la désutilisation musculaire la réduit, coïncidant avec des changements dans les marqueurs du contenu mitochondrial. Bien que l’importation de protéines soit une étape critique dans la biogenèse et l’expansion des mitochondries, le processus n’est pas largement étudié dans le muscle squelettique. Ainsi, cet article explique comment utiliser des mitochondries isolées et entièrement fonctionnelles du muscle squelettique pour mesurer la capacité d’importation de protéines afin de promouvoir une meilleure compréhension des méthodes impliquées et une appréciation de l’importance de la voie du renouvellement des organites dans l’exercice, la santé et la maladie.
Introduction
Les mitochondries sont des organites qui existent dans des morphologies complexes dans différents types de cellules et sont reconnus pour posséder un éventail croissant de fonctions essentielles à la santé cellulaire. En tant que tels, ils ne peuvent plus être réduits à de simples organites producteurs d’énergie. Les mitochondries sont des régulateurs métaboliques clés, des déterminants du devenir cellulaire et des centres de signalisation, dont les fonctions peuvent servir d’indicateurs utiles de la santé cellulaire globale. Dans les cellules musculaires squelettiques, les études de microscopie électronique révèlent la présence de mitochondries sous-sarmateuses (SS) et intermyofibrillaires (IMF) géographiquement distinctes, qui présentent un degré de connectivité1,2,3,4 qui est maintenant reconnu comme étant très dynamique et adaptable aux changements dans les niveaux d’activité musculaire squelettique, ainsi qu’avec l’âge et la maladie. Le contenu et la fonction mitochondriaux dans les muscles peuvent être évalués de nombreuses façons5,6, et des méthodes traditionnelles d’isolement des organites ont été appliquées pour mieux comprendre les capacités respiratoires et enzymatiques (Vmax) des mitochondries distinctes de l’influence du milieu cellulaire7,8. En particulier, ces méthodes traditionnelles ont révélé des distinctions biochimiques subtiles entre les mitochondries isolées des régions sous-sarmateuses et intermyofibrillaires, démentant les implications fonctionnelles possibles pour le métabolisme dans ces régions subcellulaires8,9,10,11.
La biogenèse des mitochondries est unique en ce sens qu’elle nécessite la contribution de produits géniques de l’ADN nucléaire et mitochondrial. Cependant, la grande majorité d’entre eux sont dérivés du noyau puisque la transcription de l’ADNmt ne conduit qu’à la synthèse de 13 protéines. Étant donné que les mitochondries comprennent normalement >1000 protéines impliquées dans diverses voies métaboliques, la biogenèse de l’organite nécessite un moyen étroitement régulé d’importation et d’assemblage des protéines précurseurs du cytosol dans les différents sous-compartiments mitochondriaux pour maintenir une stœchiométrie et une fonction appropriées12,13. Les protéines codées par le nucléaire destinées aux mitochondries portent normalement une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) qui les cible vers l’organite et facilite leur localisation sous-compartimentale. La plupart des protéines liées à la matrice contiennent un MTS N-terminal clivable, tandis que celles destinées à la membrane mitochondriale externe ou interne ont généralement des domaines de ciblage internes14. Le processus d’importation est effectué par un ensemble de canaux divers qui offrent de multiples voies d’entrée dans l’organite13. La translocase du complexe de membrane externe (TOM) transporte les précurseurs du cytosol dans l’espace intermembranaire, où ils sont reconnus par la translocase du complexe de membrane interne (TIM). Ce complexe est responsable de l’importation de précurseurs codés par le nucléaire dans la matrice, où les protéases clivent la préséquence de ciblage N-terminal. Les protéines destinées à la membrane externe peuvent être directement insérées dans cette membrane à travers le complexe TOM, tandis que celles destinées à la membrane interne sont insérées par une protéine TIM, en particulier TIM22. Après leur importation, les protéines sont ensuite traitées par les protéases et les chaperons résidents et se combinent souvent pour former des complexes plus grands, tels que ceux trouvés dans la chaîne de transport d’électrons.
L’importation de protéines mitochondriales elle-même sert également de mesure de la santé mitochondriale, car ce processus repose sur la présence d’un potentiel membranaire et d’une source d’énergie sous forme d’ATP15. Par exemple, lorsque le potentiel membranaire est dissipé, la protéine kinase PINK1 ne peut pas être absorbée par l’organite, ce qui conduit à des signaux de phosphorylation qui déclenchent l’apparition de la dégradation de l’organite par une voie appelée mitophagie16,17. Dans des circonstances similaires, lorsque l’importation est entravée, la protéine ATF5 ne peut pas pénétrer dans l’organite, et elle se transloque ensuite vers le noyau, où elle sert de facteur de transcription pour la régulation à la hausse de l’expression du gène UPR18,19. Ainsi, la mesure de l’efficacité de l’importation de protéines peut fournir un aperçu complet de la santé de l’organite, tandis que la réponse à l’expression génique peut être utilisée pour indiquer le degré de signalisation rétrograde au noyau.
Malgré son importance évidente pour la biogenèse des mitochondries et pour la santé cellulaire en général, la voie d’importation dans les mitochondries des mammifères est remarquablement sous-étudiée. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes spécifiques impliquées dans la mesure de l’importation de protéines précurseurs dans les mitochondries des muscles squelettiques et fournissons des données pour illustrer la réponse adaptative du système d’importation aux changements musculaires et à la désuétude, illustrant la contribution de l’importation de protéines à la plasticité adaptative du muscle squelettique.
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Protocol
Tous les animaux utilisés dans ces expériences sont gardés dans l’établissement de soins aux animaux de l’Université York. Les expériences sont menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux avec l’approbation du Comité des soins aux animaux de l’Université York (permis : 2017-08).
1. Isolement fonctionnel des mitochondries sous-sarmateuses et intermyofibrillaires du muscle squelettique
- Préparation du réactif:
- Préparez tous les tampons et supports comme indiqué dans le tableau 1.
- Réglez les tampons à un pH de 7,4 et conservez-les à 4 °C (jusqu’à 2 semaines), à l’exception de la protéase nagrase.
- Préparer la protéase de nagarse fraîche (tableau 1) à chaque fois.
- Prélèvement et hachage de tissus
REMARQUE: Un organigramme des étapes ci-dessous pour l’isolement des mitochondries est fourni à la figure 1.- Remplissez un flacon de scintillation en verre avec environ 20 mL de tampon 1 (tableau 1) et placez-le sur de la glace.
- Pendant que la souris est sous anesthésie, récoltez les muscles squelettiques (tibialis antérieur, quadriceps, gastrocnémien, etc.), environ 500-1000 mg, et placez les muscles dans le flacon de scintillation contenant du tampon réfrigéré 1.
NOTE: L’isoflurane gazeux est utilisé comme anesthésique à 2,5% à un débit de 0,4 L d’O2 / min. Un test de pincement est effectué pour s’assurer que l’animal ne répond pas. - Après le prélèvement de tissus, euthanasier l’animal par luxation cervicale.
- Pré-refroidir un verre de montre sur de la glace. Retirez toute graisse ou tissu conjonctif des muscles et hachez le tissu sur le verre de la montre jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une boue homogène.
- Placez le tissu haché dans un tube de centrifugation en plastique de 50 mL pré-réfrigéré (voir Tableau des matériaux) et enregistrez le poids exact.
- Diluer le tissu haché 10 fois avec le tampon 1 + ATP (tableau 1).
- Homogénéiser l’échantillon musculaire à l’aide d’un homogénéisateur à lames jumelées de 8 mm (voir tableau des matériaux) à une puissance de sortie de 9,8 Hz pendant 10 s, en s’assurant qu’il ne reste aucun morceau visible de muscle.
- Centrifuger les échantillons à 800 x g pendant 10 min à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Le but de cette étape est de séparer les fractions mitochondriales SS et IMF. Le supernate contient des mitochondries SS, tandis que le granulé contient des mitochondries IMF.
- Isolement mitochondrial SS
- Filtrer le supernate à travers une seule couche d’étamine dans un autre ensemble de tubes de centrifugation en plastique de 50 mL pour éliminer tout gros débris ou contaminant.
- Centrifuger le supernate à 9 000 x g pendant 10 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse.
- Jeter le surnate et remettre la pastille dans 3,5 mL de tampon 1 + ATP.
REMARQUE: Remettez en suspension avec un P1000 et faites-le avec soin. Les mitochondries sont des organites fragiles. Effectuez doucement et évitez de toucher la pastille avec l’embout de la pipette. - Centrifuger l’échantillon à 9 000 x g pendant 10 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse.
- Jetez le supernate à moins qu’un traitement supplémentaire pour isoler une fraction cytosolique dépourvue de noyaux, de mitochondries et d’autres organites ne soit souhaité. Remettre soigneusement la pastille dans environ 95 μL du milieu de remise en suspension (tableau 1) à l’aide d’une pipette P200.
REMARQUE: Semblable à l’étape 1.3.3, évitez de toucher la pastille avec l’embout de la pipette. Le volume du milieu de remise en suspension peut être modifié en fonction de la taille de la pastille. Il s’agit de la fraction mitochondriale SS, qui peut être stockée sur de la glace jusqu’à ce que la fraction IMF soit isolée. Si on le souhaite, la fraction cytosolique, dépourvue d’organites, peut être isolée en centrifugant le supernate à 100 000 x g dans une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) et en jetant ensuite la pastille.
- Isolement mitochondrial du FMI
- Diluer la pastille de l’étape 1.2.8 par 10 fois dans le tampon 1 + ATP. Resuspendez à l’aide d’un pilon en téflon en mélangeant doucement la pastille et le tampon jusqu’à ce que l’échantillon soit cohérent.
- Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un homogénéisateur à lames jumelées de 8 mm (voir tableau des matériaux) à une puissance de sortie de 9,8 Hz pendant 10 s.
- Centrifuger l’échantillon à 800 x g pendant 10 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse.
- Jeter le surnate et diluer la pastille mitochondriale IMF 10 fois à l’aide du tampon 2 et remettre en suspension à l’aide du pilon en téflon en mélangeant doucement jusqu’à ce qu’il soit homogène.
- Ajouter 25 μL/g de tissu à 10 mg/mL de protéase nagarse (tableau 1) et placer le tube de centrifugation sur son côté sur de la glace, en mélangeant doucement toutes les minutes en berçant le tube d’un côté à l’autre.
REMARQUE: L’ajout de nagarse aide à libérer les mitochondries IMF en effectuant une digestion limitée des myofibrilles. - Après 5 min, ajouter 20 mL de tampon 2 (tableau 1) pour diluer la protéase nagarse au point d’inactivité et arrêter la digestion.
- Centrifuger immédiatement l’échantillon à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse.
- Jeter le supernate et diluer le granulé 10 fois à l’aide du tampon 2 et remettre en suspension à l’aide d’un pilon en téflon en mélangeant doucement.
- Centrifuger l’échantillon à 800 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler le matériau fibreux.
- Versez le supernate dans un nouvel ensemble de tubes centrifuges en plastique de 50 mL, en veillant à ne pas perturber la pastille, qui peut être jetée.
- Centrifuger l’échantillon à 9 000 x g pendant 10 min à 4 °C comme à l’étape 1.4.7.
- Jeter le supernate, ajouter 3,5 mL de Buffer 2 et remettre doucement la pastille à l’aide d’une pipette P1000.
- Centrifuger l’échantillon à 9 000 x g pendant 10 min à 4 °C comme à l’étape 1.4.7.
- Jetez le surnate et remettez en suspension doucement la pastille avec environ 180 μL de milieu de remise en suspension à l’aide d’une pipette P200.
REMARQUE: Le volume du milieu de remise en suspension peut être modifié en fonction de la taille de la pastille. Il s’agit de la fraction mitochondriale IMF, qui peut être stockée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit utilisée dans le test d’importation.
2. Importation de protéines mitochondriales
- In vitro transcription
REMARQUE: Ces étapes suivantes décrivent comment préparer une protéine radiomarquée pour l’importation. La voie d’importation étudiée peut dicter le choix de la protéine cible, par exemple, pour évaluer l’importation dans la matrice mitochondriale, l’ornithine carbamyl transférase, OCT, et la malate déshydrogénase, MDH, sont couramment utilisés, tandis que Tom40 est couramment utilisé comme indication d’importation dans la membrane mitochondriale externe. Pour les étapes suivantes, l’ADN plasmidique codant pour la protéine de choix est nécessaire. La transcription de l’ADN plasmidique peut être effectuée avant l’isolement mitochondrial un jour séparé, et l’ARNm recueilli à partir de cette expérience peut être stocké et utilisé dans de futures expériences de traduction et d’importation.- Linéariser l’ADN : Combiner 40 μL d’ADN plasmidique (5 μg/μL), 5 μL de tampon enzymatique 10x et 5 μL d’enzyme de restriction et incuber à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE: Les enzymes de restriction utilisées peuvent varier en fonction du plasmide, ce qui peut nécessiter un tampon enzymatique différent, et l’ADN des conditions expérimentales peut être utilisé dans n’importe quelle quantité / volume, car le modèle peut être mis à l’échelle vers le haut ou vers le bas. - Purifier et précipiter l’ADN linéarisé à l’aide de phénol et d’éthanol. Effectuez toutes les étapes suivantes (2.1.3-2.1.15) dans des tubes stériles de 1,5 mL et utilisez une centrifugeuse de table (voir tableau des matériaux) pour les étapes de centrifugation.
- Ajouter le volume approprié de H2O stérile de sorte que le volume final soit égal à 400 μL. Ensuite, ajoutez 400 μL de phénol.
- Mélanger vigoureusement par inversion pendant ~10 s, et centrifuger à 17 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Retirez et enregistrez la phase supérieure.
- Ajouter 400 μL de phénol:chloroforme:isoamylalcool (25:24:1, v:v:v).
- Mélanger vigoureusement par inversion pendant ~10 s, et centrifuger à 17 000 g pendant 1 min à 4 °C. Retirez et enregistrez la phase supérieure.
- Ajouter 400 μL de chloroforme:isoamylalcool (24:1, v:v).
- Mélanger vigoureusement par inversion pendant ~10 s, et centrifuger à 17 000 g pendant 1 min à 4 °C. Retirez et enregistrez la phase supérieure.
- Ajouter 40 μL d’acétate de sodium 3M (pH 7,0) et ajouter 1 mL d’éthanol à 95 %.
- Placer les tubes stériles de 1,5 mL dans un congélateur à -80 °C sur le côté pendant 15 min.
- Centrifuger les échantillons à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Jetez le surnate et lavez la pastille avec 300 μL d’éthanol à 80%.
- Centrifuger les échantillons à 17 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
- Jetez le surnate et séchez la pastille à l’air. Une fois que le granulé est sec, il devrait être clair.
- Remettre en suspension la pastille dans 20 μL de H2O stérile
- Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux) et assurez-vous que le rapport A260:280 est supérieur à 1,8.
- Diluer l’ADN à une concentration de 0,8 μg/μL dans du H2O stérile.
- Transcrire l’ADN : Combiner le plasmide (0,8 μg/μL, 60,8 μL), le H2O stérile (8,4 μL), le NTP de 10 mM (5,2 μL), l’ATP de 10 mM (10,0 μL), le M-7-G (11,6 μL), le mélange mentionné à l’étape 2.1,19 (15,6 μL), l’ARN (5,2 μL) et une ARN polymérase appropriée (4,8 μL) pour former un « mélange à réaction unique » (volume total = 121,6 μL) et incuber pendant 90 min à la température optimale pour la polymérase (37 °C pour la polymérase T7 ; 40 °C pour la polymérase SP6)
- Pour préparer le mélange, ajouter 200 μL de 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL de 1 M MgAc2, 500 μL de 4 M KAc, 100 μL de 20 mM de spermidine, 100 μL de 0,5 M DTT et 200 μL de H20 stérile.
REMARQUE: La réaction peut être augmentée ou réduite en volume tant que les proportions fournies de réactifs sont maintenues. L’ARN polymérase utilisée est dictée par la séquence de promoteurs bactériens dans le plasmide utilisé. - Ensuite, purifiez et précipitez l’ARNm à l’aide de phénol et d’éthanol comme aux étapes 2.1.2-2.1.15. Porter le volume à 400 μL avec du H2O stérile (ajouter 280 μL) et procéder comme décrit aux étapes 2.1.2-2.1.15. Remettre en suspension la pastille finale dans 20 μL de H2O stérile.
- Mesurez la concentration d’ARNm à l’aide d’un spectrophotomètre, assurez-vous que le rapport A260:280 est d’environ 2,0.
- Diluer l’ARNm à 2,8 μg/μL dans du H2O stérile et le conserver à -20 °C dans des aliquotes de 50 μL.
- Linéariser l’ADN : Combiner 40 μL d’ADN plasmidique (5 μg/μL), 5 μL de tampon enzymatique 10x et 5 μL d’enzyme de restriction et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Traduction in vitro
REMARQUE: La traduction de l’ADN souhaité doit être effectuée le jour même de l’expérience d’importation. Cette expérience nécessite l’utilisation d’acides aminés radiomarqués et, par conséquent, l’utilisateur doit avoir un permis pour l’utilisation de radio-isotopes, et toute manipulation et élimination doivent être conformes aux politiques / exigences de l’institution. Les mesures de sécurité des radio-isotopes ont été omises ou décrites brièvement, car elles différeront probablement selon l’établissement.- Préparer suffisamment de mélange de réactions de translation (tableau 2) pour fournir environ 20 μL par échantillon de mitochondries à utiliser dans l’expérience d’importation et inclure le même volume pour une voie de traduction.
- Incuber la réaction pendant 30 min à 30 °C (le temps peut varier avec l’ARNm, 25-60 min).
- Consigner l’utilisation de 35S-méthionine conformément aux exigences de sûreté radioactive de l’établissement et éliminer tout ce qui est entré en contact avec le radio-isotope conformément aux lignes directrices de l’établissement.
- Importation de protéines
REMARQUE: Des mitochondries fraîchement isolées sont nécessaires pour les étapes suivantes. Reportez-vous au protocole d’isolement mitochondrial. D’autres méthodes d’isolement peuvent être utilisées tant que les mitochondries sont viables et fonctionnelles. Pour les étapes suivantes, les échantillons mitochondriaux utilisés sont remis en suspension dans un tampon de remise en suspension comme décrit ci-dessus (Tableau 1). La concentration en protéines de l’échantillon mitochondrial doit également être mesurée avant de commencer le test d’importation.- Environ 15 minutes après le début de la réaction de traduction, aliquoter 90 μg de mitochondries dans des tubes stériles de 1,5 mL et pré-incuber à 30 °C pendant environ 10 min.
REMARQUE: Aliquote plus de mitochondries que ce qui sera réellement utilisé dans l’expérience; seulement 75 μg seront réellement utilisés. Cependant, la citation aliquote en excès n’est pas une exigence. - Dans un nouvel ensemble de tubes stériles de 1,5 mL, mélanger 75 μg de mitochondries avec 18 μL de la réaction de traduction et incuber à 30 °C pendant le temps souhaité.
- Conserver le volume restant de la réaction de translation sur la glace; cela sera utilisé plus tard.
REMARQUE: L’importation est un processus dépendant du temps, il peut donc être prudent de commencer par une expérience de cours temporel allant de 1 à 60 minutes d’incubation. Un temps de réaction typique est de 30 min. - Pendant ce temps, préparez le coussin de saccharose en combinant 1 g de saccharose, 200 μL de 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL de 1 M HEPES (pH 7,4), et portez le volume à 5 mL en utilisant du H2O stérile.
- Préparer un nouvel ensemble de tubes stériles de 1,5 mL correspondant à chaque tube dans la réaction d’importation. Aliquote 600 μL du coussin de saccharose dans chaque tube et garder sur la glace jusqu’à ce que la réaction d’importation soit terminée.
- Pour mettre fin à la réaction d’importation après le temps d’incubation approprié, retirez le tube de 30 °C, placez-le sur de la glace, puis transférez soigneusement la réaction d’importation sur le dessus du tube avec le coussin de saccharose.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée très lentement pour s’assurer que les mitochondries ne sont pas endommagées / rompues. Le coussin de saccharose aide à ralentir la migration des mitochondries et « amortit » sa descente vers le bas du tube lors de l’étape de centrifugation suivante. - Centrifuger les échantillons + coussin de saccharose à 17 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Préparer le tampon de rupture en combinant 25 mL de 2,4 M de sorbitol, 2 mL de 1 M HEPES (pH 7,4) et 72 mL de H2O double distillé.
- Préparer le tampon de lyse pour l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE : Mélanger 50 mL de glycérol chauffé, 11,5 g de FDS, 31,25 mL de Tris (pH 6,8) et porter le volume à 500 mL avec du H2O doublement distillé.
- Pour la préparation de l’échantillon, mélanger 475 μL de tampon de lyse avec 25 μL de β-mercaptoéthanol à utiliser dans une étape ultérieure.
REMARQUE: Le tampon de lyse peut être fabriqué à l’avance et stocké à température ambiante; cependant, l’ajout de β-mercaptoéthanol doit être fait frais. - À l’aide d’une pipette P1000, retirez soigneusement le surnate et ne dérangez pas le granulé. Éliminer le supernate dans un conteneur de déchets radioactifs approprié.
- Pour l’importation dans la membrane externe, effectuez cette opération à l’aide de Tom40, remettez la pastille dans 50 μL de carbonate de sodium 0,1 M fraîchement préparé (pH 11,5) et incubez sur de la glace pendant 30 min.
- Après l’incubation, centrifuger l’échantillon de 14 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Cette étape n’est effectuée que pour les réactions d’importation de la membrane externe.
- Pour préparer les échantillons à l’électrophorèse SDS-PAGE, ajoutez 20 μL de tampon de rupture, 20 μL de tampon de lyse et β-mercaptoéthanol et remettez bien en suspension. Ajouter 5 μL de colorant d’échantillon.
- Préparer la voie de contrôle/translation en combinant 3 μL de la réaction de translation restante de l’étape 2.3.3 avec 37 μL de tampon de lyse et 5 μL de colorant d’échantillon. Bien mélanger.
- Faire bouillir les échantillons pendant 5 min à 95 °C et tourner doucement à basse vitesse pour éviter de granuler les mitochondries.
- Appliquez les échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS.
REMARQUE: Le pourcentage de gel et la durée d’exécution ultérieure dépendront de la protéine importée. Par exemple, l’OCT est de 37 kDa et sa bande traitée mature est légèrement plus petite; par conséquent, un gel à 12% permet une bonne séparation de ces bandes. - Une fois l’électrophorèse terminée, retirez le gel et placez-le dans du H2O double distillé.
- Faire bouillir le gel dans 5% de TCA dans une hotte pendant 5 min, en remuant / déplaçant continuellement le gel pour éviter de se fissurer.
REMARQUE: TCA aide à solidifier le gel pour la visualisation; cela peut être fait dans un plateau métallique sur un brûleur Bunsen. Utilisez suffisamment de TCA pour couvrir généreusement le gel, ~ 1/2 plein. - Retirez le gel et replacez-le dans du H2O double distillé. Agitez-le sur une plaque rotative pendant 1 min à ~50 tr/min.
- Lavez le gel dans 10 mM Tris sur une plaque rotative pendant 5 min à ~50 tr/min, encore une fois en utilisant assez pour couvrir généreusement le gel, ~1/2 du récipient.
- Précipiter la protéine en lavant le gel dans 1 M d’acide salicyclique sur une plaque rotative pendant 30 min, en utilisant à nouveau suffisamment d’acide salicyclique pour couvrir généreusement le gel, ~ 1/2 du récipient utilisé.
- Déshydrater le gel comme décrit aux étapes 2.3.24-2.3.31.
REMARQUE: Cela peut être fait de plusieurs façons. Un séchoir à gel (voir tableau des matériaux) offre une option rapide (décrite ci-dessous); Cependant, d’autres méthodes / kits disponibles dans le commerce peuvent être utilisés qui peuvent être plus rentables mais plus longs. Les kits de séchage sur gel peuvent être utilisés comme une alternative qui ne nécessite pas l’application de chaleur ou d’aspiration, mais permet plutôt au gel de sécher à l’air libre entre les feuilles de cellophane pour éviter toute distorsion. - Placez une grande feuille de papier buvard sur le lit poreux du séchoir à gel. Placez une feuille d’essuie-tout dans la zone où le gel sera appliqué.
- Coupez un morceau de papier buvard de 15 cm x 20 cm et placez-le sur l’essuie-tout.
- Retirez le gel du récipient à l’aide d’un deuxième morceau de papier buvard de 15 cm x 20 cm et posez-le à plat sur le dessus du premier morceau.
- Coupez un morceau de pellicule de plastique légèrement plus grand, ~ 20 cm x 25 cm, et placez-le sur du gel, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de plis ou de bulles sous l’enveloppe.
REMARQUE: Cela peut prendre quelques tentatives, mais il est impératif qu’il n’y ait pas de poches d’air piégées. - Posez doucement le couvercle en plastique du séchoir à gel sur le dessus de l’emballage, en veillant à nouveau à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou de plis.
- Allumez la pompe/le vide et assurez-vous que le couvercle en plastique a formé un joint. Testez le joint en soulevant un coin du couvercle en plastique et attendez qu’il soit à nouveau scellé.
- Fermez le séchoir à gel et faites fonctionner pendant 90 min. Réglez la température pour commencer à 30 °C, atteignez progressivement 80 °C, puis revenez à 30 °C à la fin de la course.
- Une fois déshydraté, le gel se solidifiera et se sentira mince en papier. Enveloppez le gel dans la pellicule de plastique utilisée dans le processus de séchage.
- Placez le gel déshydraté dans une cassette de film avec un film de phosphore (voir Tableau des matériaux), avec le côté blanc face au gel. Les temps d’exposition varient mais peuvent être de 24 à 48 heures pour la visualisation des bandes.
- Visualisez à l’aide de l’autoradiographie à l’aide de tout imageur approprié capable d’imagerie au phosphore.
- Environ 15 minutes après le début de la réaction de traduction, aliquoter 90 μg de mitochondries dans des tubes stériles de 1,5 mL et pré-incuber à 30 °C pendant environ 10 min.
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Representative Results
Nous avons largement illustré que ce protocole est un test valide pour déterminer le taux d’importation dans les mitochondries musculaires squelettiques isolées fonctionnelles et intactes. Par rapport aux affections non traitées, l’importation de protéines précurseurs typiques telles que la malate déshydrogénase (MDH) dans la matrice est sensible au potentiel membranaire car elle peut être inhibée par la valinomycine, un découpleur de la chaîne respiratoire (Figure 2A). L’importation est également entravée lorsque les membranes internes et externes mitochondriales sont solubilisées en présence du détergent Triton X-100. Le processus d’importation est sensible à la présence d’ATP externe, qui sert à déplier des protéines précurseurs pour la translocation à travers les membranes, et est étroitement contrôlé par le taux de respiration et l’approvisionnement en ATP (données non présentées20). Des différences distinctes dans l’importation sont également observées entre les fractions mitochondriales intermyofibrillaires et sous-saloflémates, en partie en raison des variations de l’expression de la machinerie d’importation des protéines, ainsi que de la fréquence respiratoire entre ces mitochondries (Figure 2B).
Les mitochondries dans le muscle squelettique sont des organites très dynamiques qui répondent facilement aux changements de la demande d’énergie. Le contenu mitochondrial dans le muscle augmente après des périodes d’exercice chronique ou en réponse à une activité contractile induite par la stimulation électrique (voir pour la revue21). Par exemple, 7 jours d’activité contractile chronique du muscle squelettique du rat augmentent l’importation dans l’OM et la matrice de 1,6 fois et 1,4 fois, respectivement22 (Figure 3A, 3B). Ces changements dans le contenu mitochondrial sont provoqués, en partie, par des altérations de la capacité du système d’importation de protéines mitochondriales. En effet, une relation étroite entre le taux d’importation de protéines précurseurs et une bonne estimation de la teneur mitochondriale, mesurée par le marqueur IV complexe cytochrome oxydase sous contrôle ou dans des conditions dénervées, peut être illustrée23 (Figure 3C).
L’adaptabilité du système d’importation dans le muscle aux altérations de l’activité contractile suggère que l’exercice pourrait être utilisé comme traitement pour résoudre les défauts dans la voie d’importation s’il est identifié. Au cours de l’étude de l’apoptose à médiation mitochondriale à l’aide d’animaux Bax-Bak à double knockout, nous avons remarqué que la réduction du contenu mitochondrial dans les muscles de ces animaux de laboratoire s’accompagnait d’une diminution de l’importation de protéines précurseurs dans la matrice. Nous avons ensuite étudié la possibilité que l’exercice puisse rétablir cette capacité d’importation. En effet, après 6 semaines d’entraînement volontaire à la course à la roue, l’importation de protéines a été rétablie à des niveaux de contrôle chez les animaux knockout24, illustrant la plasticité adaptative de la voie d’importation pour sauver le contenu et la fonction mitochondriaux (Figure 4).
Figure 1 : Schéma du flux de travail pour isoler les mitochondries SS et IMF du muscle squelettique sur la base des travaux précédents8. Ce protocole permet l’isolement des mitochondries fonctionnelles en fonction de leur emplacement géographique dans le muscle squelettique. Les mitochondries SS sont libérées plus rapidement et plus facilement, tandis que les mitochondries IMF nécessitent une étape de digestion supplémentaire avec de la protéase pour les démêler des myofibrilles. Notez que l’isolement de ces sous-fractions peut se faire en tandem. Une procédure similaire mise à jour a récemment été publiée25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Importation de protéines dans la matrice mitochondriale. (A) Les taux normaux d’importation de MDH sont indiqués dans les mitochondries SS et IMF (voies 4 et 7) et le produit de traduction du précurseur MDH (voie 1). La bande inférieure représente le MDH mature importé. L’ajout de valinomycine inhibe l’importation de protéines MDH dans la matrice des mitochondries SS et IMF, car ce découpleur dissipe le potentiel membranaire (voies 2 et 5). Triton-X est un détergent qui solubilise la membrane interne, inhibant ainsi l’importation de MDH dans ces sous-fractions (voies 3 et 6). L’importation de protéines a été effectuée pour des durées croissantes, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min et 30 min. Ces données montrent que l’importation est un processus dépendant du temps et que les mitochondries SS et IMF ont des taux ou des capacités d’importation (B) différents. TL, voie de traduction; VAL, valinomycine; TRI, Triton-X; CTL, contrôle; SS, sous-sarcomposant; FMI, intermyofibrillaire. Cette figure a été modifiée à partir de Takahashi M & Hood DA20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’importation de protéines est adaptable et étroitement liée aux estimations de la teneur en mitochondries. Les rats Sprague Dawley ont été soumis à une stimulation électrique pour induire une activité contractile, un modèle d’entraînement physique. (A) L’importation de Tom40 dans l’OM était 1,6 fois plus élevée dans les muscles provenant d’animaux stimulés de manière chronique par rapport aux témoins à un moment donné. (B) L’importation d’OCT dans la matrice mitochondriale a été augmentée à chaque point d’incubation et, dans l’ensemble, cela a entraîné une augmentation de 1,4 fois des mitochondries provenant de muscles stimulés de manière chronique. (C) L’importation est positivement corrélée avec un indice de contenu mitochondrial, tel qu’évalué par l’activité COX, r = 0,69. Ces mesures ont été prises sur des animaux soumis à une dénervation, dont il a été démontré qu’elle diminuait le contenu mitochondrial et le taux d’importation. Contre, contrôle; Tanière, dénervée; Stim, stimulé; TL, voie de traduction; * p < 0,05. Les figures 3A et 3B ont été adaptées de Joseph A-M & Hood DA22 et 3C de Singh B & Hood DA23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La formation sauve les défauts d’importation in vivo. Les animaux à double élimination Bax/Bak présentent une importation réduite de protéines dans la matrice mitochondriale de 37%. Six semaines de fonctionnement volontaire des roues ont permis de réduire le défaut d’importation aux niveaux de contrôle. WT, type sauvage; DKO, double KO; TL, voie de traduction; * p < 0,05 effet principal du génotype; ¶ p < 0,05 effet principal de la formation. Ce chiffre a été adapté de Zhang Y et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Tampon 1 : | Tampon 1 + ATP: | Tampon 2 : | Milieu de remise en suspension : | Protéase de Nagarse |
| 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 100 mM KCl | 10 mg/mL dans le tampon 2 |
| 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 5 mM MgSO4 | 10 mM MOPS | REMARQUE: Faire frais et garder sur la glace |
| EDTA 5 mM | EDTA 5 mM | 5 mM EGTA | 0,2 % BSA | |
| Tris de 50 mM | Tris de 50 mM | Tris de 50 mM | ||
| 1 mM ATP | 1mM ATP |
Tableau 1 : Tampons et supports de remise en suspension.
| % du volume de réaction | 1 Mélange de réactions | |
| Lysat de réticulocytes | 64.10% | 11,8 μL |
| Acides aminés (-méthionine) | 2.20% | 0,4 μL |
| H2O stérile | 21.60% | 3,97 μL |
| 35 S-méthionine | 7.20% | 1,33 μL |
| ARNm | 5.40% | 1,0 μL |
| Total Volume | 18,5 μL | |
| NOTE: | ||
| 1) Ajouter la 35S-méthionine en dernier; | ||
| 2) Décongeler le lysat lentement sur la glace et limiter les cycles de gel/dégel à deux. Il est recommandé que le lysat soit alicité à l’arrivée | ||
| 3) Le volume d’ARNm peut être ajusté pour optimiser l’efficacité translationnelle en modifiant le volume stérile de H2O en conséquence. | ||
Tableau 2 : Mélange de réactions de traduction
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Discussion
Les mitochondries dépendent uniquement de l’expression et de la coordination des génomes nucléaire et mitochondrial pour leur synthèse et leur expansion dans les cellules. Cependant, le génome nucléaire code la grande majorité (99%) du protéome mitochondrial, ce qui souligne l’importance de la machinerie d’importation des protéines pour soutenir la biogenèse mitochondriale. L’importation sert également d’événement de signalisation important, car le défaut d’importation peut favoriser l’initiation de la réponse protéique dépliée et / ou de la mitophagie15,16,26. Étant donné que l’importation repose sur l’expression de multiples canaux fonctionnels et chaperons, d’un potentiel membranaire intact, ainsi que de la disponibilité de l’ATP, l’évaluation de l’importation de protéines mitochondriales peut fournir des informations précieuses sur la santé et l’état énergétique de l’organite.
L’évaluation de la capacité d’importation des protéines dans les mitochondries nécessite l’isolement de l’organite du tissu environnant à l’aide de techniques de centrifugation différentielle standard. L’importation est évaluée de la même manière que l’on évaluerait la Vmax des activités enzymatiques mitochondriales, d’une manière hautement contrôlée en fonction du temps et de la concentration du substrat et indépendamment des influences cytosoliques cellulaires. La méthode d’isolement présentée ici, ou des interprétations similaires de celle-ci, sont utilisées depuis de nombreuses années pour évaluer la respiration mitochondriale et les activités enzymatiques8,9,10,11. Cette technique n’est pas sans limites, car elle perturbe la morphologie normale des mitochondries telles qu’elles existent in situ27, qui dans le muscle squelettique est très complexe, allant de petites structures sphéroïdes à un réseau réticulaire très ramifié3, en fonction de leur emplacement sous-sarcommateux ou intermyofibrillaire dans la cellule musculaire. En outre, l’utilisation de la protéase nagarse a fait l’objet d’un examen minutieux3,28. Une mise à jour de cette méthode, utilisant la trypsine au lieu de nagarse, a récemment été publiée25, et la trypsine a été utilisée par d’autres pour isoler les mitochondries musculaires29. En effet, toute autre méthode d’isolement qui donne des mitochondries fonctionnellement intactes peut être utilisée, y compris les techniques qui n’utilisent pas de protéases30 ou celles conçues pour de petits échantillons de la taille d’une biopsie provenant de muscles humains31. La méthode présentée ici a l’avantage d’isoler rapidement et facilement les mitochondries SS, mais un plus grand rendement et une plus grande pureté des mitochondries peuvent être obtenus grâce à l’isolement de la sous-fraction IMF. S’il est fait avec soin, ce protocole d’isolement peut entraîner des organites fonctionnellement intacts avec un rapport de contrôle respiratoire élevé, indiquant des taux appropriés de respiration des états 3 et 48.
Il est également impératif pour la mesure de l’importation de protéines mitochondriales que ces organites maintiennent leur potentiel membranaire, car l’importation à travers la membrane interne dépend de cette force motrice électrophorétique de protons, qui sert à attirer des séquences précurseurs chargées positivement et à aider à arbitrer le transport du précurseur dans l’espace matriciel chargé négativement. Dans de telles conditions, les comparaisons de la fonction mitochondriale et de l’importation peuvent être évaluées entre des situations expérimentales physiologiquement pertinentes, telles que l’exercice, le vieillissement et la désuétude musculaire, par exemple. À cet égard, des travaux antérieurs ont montré que l’importation est une voie hautement adaptable qui répond à des états altérés d’utilisation et de désutilisation musculaires et est sensible à l’inhibition via une émission excessive de ROS10,22,23,32. Cette plasticité est due, en partie, à des changements adaptatifs dans l’expression des composants de la machinerie d’importation de protéines. Étant donné que cette technique repose sur l’isolement des mitochondries, toute régulation de la voie d’importation pouvant provenir de facteurs cytosoliques ou de diaphonie inter-organites est retirée de l’interprétation de l’expérience. Il s’agit à la fois d’une limitation et d’une force de la technique, car des conclusions peuvent être tirées de la capacité de la voie d’importation elle-même (similaire à la Vmax de l’activité enzymatique), mais les signaux transitoires ou externes qui peuvent se produire avec le modèle expérimental peuvent être perdus. Pour contourner cela, il est possible d’incuber la réaction d’importation avec un échantillon de la fraction cytosolique, isolé comme décrit ci-dessus, afin d’évaluer les changements dans l’environnement cytosolique susceptibles d’influencer les taux d’importation, comme cela a été fait précédemment22. En outre, les composants des machines d’importation sont soumis à des modifications post-traductionnelles aiguës qui peuvent modifier leurs fonctions. Des travaux récents ont montré que la phosphorylation de récepteurs d’importation TOM spécifiques peut être liée à la mitophagie33. En effet, un domaine de recherche qui mérite plus d’attention est la modulation aiguë du processus d’importation via des voies de signalisation intrinsèques médiées par les ROS ou par une modification covalente des récepteurs d’importation et des chaperons, comme documenté dans la levure et d’autres organismes inférieurs34,35.
L’importation de protéines dans les mitochondries représente une passerelle vers la croissance adaptative des organites et est un indicateur sensible de la santé mitochondriale. Comprendre comment ce processus est régulé peut éclairer la régulation de la biogenèse mitochondriale, la signalisation UPR et l’initiation de la mitophagie. L’importation de protéines mitochondriales n’est pas un processus largement étudié dans les modèles expérimentaux de mammifères, et le développement du vaste potentiel de recherche dans ce domaine pourrait nous aider à mieux comprendre les maladies dans lesquelles le dysfonctionnement mitochondrial est apparent ou représentent une cible thérapeutique attrayante pour promouvoir la santé mitochondriale.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts, financier ou autre, n’est déclaré par les auteurs.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr G.C. Shore de l’Université McGill, le Dr A. Strauss de la Washington School of Medicine et le Dr .M.T. Ryan de l’Université La Trobe pour les dons originaux de plasmides d’expression qui ont été utilisés pour cette recherche. Ces travaux ont été soutenus par un financement du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à D. A. Hood. D. A. Hood est également titulaire d’une chaire de recherche du Canada en physiologie cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | - | - | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | - | - | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | - | - | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
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