Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af proteinimportkapacitet af skeletmuskulatur mitokondrier

Published: January 7, 2022 doi: 10.3791/63055
Automatic Translation
1, 1, 1
1Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Science, York University

Summary

Mitokondrier er vigtige metaboliske organeller, der udviser et højt niveau af fænotypisk plasticitet i skeletmuskulaturen. Import af proteiner fra cytosolen er en kritisk vej for organellebiogenese, der er afgørende for udvidelsen af reticulum og vedligeholdelse af mitokondriefunktion. Derfor tjener proteinimport som et barometer for cellulær sundhed.

Abstract

Mitokondrier er vigtige metaboliske og lovgivningsmæssige organeller, der bestemmer energiforsyningen samt cellens generelle sundhed. I skeletmuskulatur findes mitokondrier i en række komplekse morfologier, der spænder fra små ovale organeller til et bredt, reticulum-lignende netværk. At forstå, hvordan mitokondrie reticulum udvider sig og udvikler sig som reaktion på forskellige stimuli som ændringer i energiefterspørgslen, har længe været et forskningsemne. Et centralt aspekt af denne vækst, eller biogenese, er import af prækursor proteiner, oprindeligt kodet af det nukleare genom, syntetiseret i cytosol, og translokeret i forskellige mitokondrie sub-rum. Mitokondrier har udviklet en sofistikeret mekanisme til denne importproces, der involverer mange selektive indre og ydre membrankanaler, kendt som proteinimportmaskineriet (PIM). Import til mitokondrie er afhængig af levedygtige membran potentiale og tilgængeligheden af organelle-afledte ATP gennem oxidativ fosforylering. Derfor kan dens måling tjene som et mål for organelle sundhed. PIM udviser også et højt niveau af adaptiv plasticitet i skeletmuskulaturen, der er tæt koblet til cellens energistatus. For eksempel har træningstræning vist sig at øge importkapaciteten, mens muskelbrug reducerer det, sammenfaldende med ændringer i markører for mitokondrieindhold. Selvom proteinimport er et kritisk skridt i biogenese og udvidelse af mitokondrier, undersøges processen ikke bredt i skeletmuskulaturen. Således skitserer dette papir, hvordan man bruger isolerede og fuldt funktionelle mitokondrier fra skeletmuskulatur til at måle proteinimportkapacitet for at fremme en større forståelse af de involverede metoder og en forståelse af betydningen af vejen for organelleomsætning i motion, sundhed og sygdom.

Introduction

Mitokondrier er organeller, der findes i komplekse morfologier i forskellige celletyper og er anerkendt for at besidde et stigende udvalg af funktioner, der er afgørende for cellulær sundhed. Som sådan kan de ikke længere skæres ned til energiproducerende organeller. Mitokondrier er vigtige metaboliske regulatorer, determinanter for celle skæbne, og signalering hubs, hvis funktioner kan tjene som nyttige indikatorer for den samlede cellulære sundhed. I skeletmuskulaturceller afslører elektronmikroskopiundersøgelser tilstedeværelsen af geografisk forskellige subsarcolemmale (SS) og intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som udviser en grad af tilslutningsmuligheder1,2,3,4, der nu anerkendes at være meget dynamisk og tilpasningsdygtig til ændringer i skeletmuskulaturaktivitetsniveauer samt med alder og sygdom. Mitokondrie indhold og funktion i muskel kan vurderes på mange måder5,6, og traditionelle metoder til organelle isolation er blevet anvendt til bedre at forstå respiratoriske og enzymatiske kapaciteter (Vmax) af mitokondrier adskiller sig fra indflydelsen af cellu 7,8. Disse traditionelle metoder har navnlig afsløret subtile biokemiske sondringer mellem mitokondrier isoleret fra subsarcolemmale og intermyofibrillar regioner, belying mulige funktionelle konsekvenser for stofskiftet i disse subcellulære regioner8,9,10,11.

Biogenesen af mitokondrier er unik i at kræve bidrag fra genprodukter fra både nukleare og mitokondrie DNA. Langt de fleste af disse er imidlertid afledt af kernen, da mtDNA transskription kun fører til syntesen af 13 proteiner. Da mitokondrier normalt omfatter >1000 proteiner, der er involveret i forskellige metaboliske veje, kræver biogenese af organelle et stramt reguleret middel til import og samling af prækursorproteiner fra cytosolen i de forskellige mitokondrieunderrum for at opretholde korrekt stoichimetri og funktion12,13. Atomkodede proteiner bestemt til mitokondrier normalt bære en mitokondrie målretning sekvens (MTS), der er rettet mod dem til organelle og letter deres sub-opdeling lokalisering. De fleste matrix-bundne proteiner indeholder en kløvelig N-terminal MTS, mens de bestemt til den ydre eller indre mitokondriemembran normalt har interne målretning domæner14. Importprocessen udføres af et sæt forskellige kanaler, der giver flere muligheder for at komme ind i organelle13. Translocase af den ydre membran (TOM) komplekse shuttles forstadier fra cytosol ind i intermembrane rummet, hvor de er anerkendt af translocase af den indre membran (TIM) kompleks. Dette kompleks er ansvarlig for at importere atomkodede prækursorer til matrixen, hvor proteaser kløve N-terminalen rettet mod presequence. Proteiner bestemt til den ydre membran kan indsættes direkte i denne membran gennem TOM-komplekset, mens de, der er bestemt til den indre membran, indsættes af et TIM-protein, specielt TIM22. Efter deres import behandles proteiner yderligere af residente proteaser og chaperoner og kombineres ofte for at danne større komplekser, som dem, der findes i elektrontransportkæden.

Mitokondrieproteinimport i sig selv fungerer også som en måling af mitokondriesundhed, da denne proces er afhængig af tilstedeværelsen af membranpotentiale og en energikilde i form af ATP15. For eksempel, når membranpotentialet spredes, kan proteinkinaase PINK1 ikke tages op af organelle, og dette fører til fosforylationssignaler, der udløser begyndelsen af nedbrydningen af organelle gennem en vej kaldet mitophagy16,17. Under lignende omstændigheder, når importen hindres, kan proteinet ATF5 ikke komme ind i organelle, og det translokerer efterfølgende til kernen, hvor det tjener som transskription faktor for up-regulering af UPR genekspression18,19. Således kan måling af proteinimporteffektivitet give omfattende indsigt i organellens sundhed, mens genekspressionsvaret kan bruges til at angive graden af retrograd signalering til kernen.

På trods af sin åbenlyse betydning for biogenese af mitokondrier og for cellulær sundhed generelt er importvejen i pattedyr mitokondrier bemærkelsesværdigt understudiet. I denne rapport beskriver vi de specifikke trin, der er involveret i målingen af import af prækursorproteiner til skeletmuskulatur mitokondrier og giver data til at illustrere importsystemets adaptive reaktion på ændringer i muskler og disuse, hvilket illustrerer proteinimportens bidrag til skeletmuskulaturens adaptive plasticitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr, der anvendes i disse forsøg, opretholdes i dyreplejefaciliteten på York University. Forsøgene udføres i overensstemmelse med canadian Council on Animal Care retningslinjer med godkendelse fra York University Animal Care Committee (Tilladelse: 2017-08).

1. Funktionel isolering af subsarcolemmal og intermyofibrillar mitokondrier fra skeletmuskulatur

  1. Reagenspræparat:
    1. Forbered alle buffere og medier som nævnt i tabel 1.
    2. Indstil bufferne til pH 7,4 og opbevares ved 4 °C (op til 2 uger), undtagen nagrase protease.
    3. Forbered frisk nagarse protease (tabel 1) hver gang.
  2. Fjernelse og hakkekød af væv
    BEMÆRK: Et rutediagram over nedenstående trin til isolering af mitokondrier findes i figur 1.
    1. Fyld et glas scintillation hætteglas med ~ 20 mL buffer 1 (tabel 1) og læg det på is.
    2. Mens musen er under bedøvelse, høste skeletmuskulatur (skinneben forreste, quadriceps, gastrocnemius osv.), ca 500-1000 mg, og placere musklerne i scintillation hætteglas indeholder kølet Buffer 1.
      BEMÆRK: Gasformigt isofluran anvendes som bedøvelsesmiddel ved 2,5% ved en strømningshastighed på 0,4 L O2/min. Der udføres en knivspidstest for at sikre, at dyret ikke reagerer.
    3. Efter vævsindsamling aflive dyret via cervikal dislokation.
    4. Pre-chill et ur glas på is. Fjern fedt eller bindevæv fra musklerne og hakke væv på urglasset, indtil det er en homogen gylle.
    5. Læg hakket væv i et forkølet 50 mL plastcentrifugeringsrør (se Materialetabel), og registrer den nøjagtige vægt.
    6. Fortynd det hakkede væv 10 gange med Buffer 1 + ATP (tabel 1).
    7. Homogeniser muskelprøven ved hjælp af en 8 mm tobladet homogenisator (se Materialetabel) ved en effekt på 9,8 Hz i 10 s, hvilket sikrer, at der ikke er synlige muskelklumper tilbage.
    8. Centrifuge prøverne ved 800 x g i 10 min ved hjælp af en højhastighedscentrifuge (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Formålet med dette trin er at adskille SS og IMF mitokondrie fraktioner. Supernatet indeholder SS mitokondrier, mens pellet indeholder IMF mitokondrier.
  3. SS mitokondrie isolation
    1. Filtrer supernaten gennem et enkelt lag ostelærred i et andet sæt 50 mL plastcentrifugeringsrør for at fjerne store snavs eller forurenende stoffer.
    2. Centrifuge supernatet ved 9.000 x g i 10 min ved 4 °C ved hjælp af en højhastighedscentrifuge.
    3. Kassér supernatet, og brug pelleten igen i 3,5 mL buffer 1 + ATP.
      BEMÆRK: Resuspend med en P1000 og gøre dette omhyggeligt. Mitokondrier er skrøbelige organeller. Udfør forsigtigt og undgå at røre ved pellet med pipettespidsen.
    4. Centrifugprøven ved 9.000 x g i 10 min ved 4 °C ved hjælp af en højhastighedscentrifuge.
    5. Kassér supernaten, medmindre yderligere behandling for at isolere en cytosolisk fraktion uden kerner, mitokondrier og andre organeller ønskes. Bær pelleten forsigtigt i ca. 95 μL af resuspensionsmediet (tabel 1) ved hjælp af en P200-pipette.
      BEMÆRK: I lighed med trin 1.3.3 undgås pelleten at røre ved pellet med pipettespidsen. Volumenet af resuspensionsmediet kan ændres afhængigt af pelletens størrelse. Dette er SS mitokondriefraktionen, som kan opbevares på is, indtil IMF-fraktionen er isoleret. Hvis det ønskes, kan den cytosoliske fraktion, blottet for organeller, isoleres ved at centrifugere supertonen ved 100.000 x g i en ultracentrifuge (se materialetabel) og derefter kassere pelleten.
  4. IMF mitokondrie isolation
    1. Pellet fortyndes fra trin 1.2.8 med 10 gange i Buffer 1 + ATP. Resuspend ved hjælp af en Teflon støder ved forsigtigt at blande pellet og buffer sammen, indtil prøven er konsekvent.
    2. Homogeniser prøven ved hjælp af en 8 mm tobladet homogenisator (se Materialetabel) ved en effekt på 9,8 Hz i 10 s.
    3. Centrifugprøven ved 800 x g i 10 min ved 4 °C ved hjælp af en højhastighedscentrifuge.
    4. Kassér supernat og fortynd IMF mitokondrie pellet 10 gange ved hjælp af Buffer 2 og resuspend ved hjælp af Teflon støderen ved forsigtigt at blande, indtil det er homogen.
    5. Tilsæt 25 μL/g væv til 10 mg/mL nagarse protease (tabel 1) og læg centrifugeringsrøret på siden på isen, bland forsigtigt hvert minut ved at rokke røret side til side.
      BEMÆRK: Tilføjelsen af nagarse hjælper med at befri IMF mitokondrier ved at udføre begrænset fordøjelse af myofibrils.
    6. Efter 5 min tilsættes 20 mL Buffer 2 (tabel 1) for at fortynde nagarse protease til inaktivitetspunktet og stoppe fordøjelsen.
    7. Prøven centrifugeres straks ved 5 000 x g i 5 min ved 4 °C ved hjælp af en højhastighedscentrifuge.
    8. Kassér supernaten, og fortynd pelleten 10 gange ved hjælp af Buffer 2 og genbrug ved hjælp af en Teflon-støder ved forsigtigt at blande.
    9. Centrifugprøven ved 800 x g i 15 min ved 4 °C for at pille det fibrøse materiale.
    10. Hæld supernaten i et nyt sæt 50 mL plastcentrifugerør, pas på ikke at forstyrre pelleten, som kan kasseres.
    11. Centrifuge prøven ved 9 000 x g i 10 min ved 4 °C som i trin 1.4.7.
    12. Kassér supernaten, tilsæt 3,5 mL Buffer 2, og genbrug forsigtigt pelleten ved hjælp af en P1000-pipette.
    13. Centrifuge prøven ved 9 000 x g i 10 min ved 4 °C som i trin 1.4.7.
    14. Kassér supernatet og genbrug pellet forsigtigt med ca. 180 μL resuspension medium ved hjælp af en P200 pipette.
      BEMÆRK: Volumenet af resuspensionsmediet kan ændres afhængigt af pelletens størrelse. Dette er IMF mitokondrie fraktion, som kan opbevares på is, indtil det skal anvendes i import assay.

2. Mitokondrie protein import

  1. In vitro transskription
    BEMÆRK: Disse efterfølgende trin skitserer, hvordan man forbereder et radiomærket protein til import. Den undersøgte importvej kan diktere valget af målprotein, for eksempel for at evaluere import til mitokondriematrixen, ornithine carbamyloverførselase, OLT og malate dehydrogenase, MDH, er almindeligt anvendt, mens Tom40 er almindeligt anvendt som en indikation af import til den ydre mitokondriemembran. For de følgende trin, plasmid DNA kodning protein valg er påkrævet. Transskriptionen af plasmid-DNA kan ske før mitokondrieisolationen på en separat dag, og mRNA indsamlet fra dette eksperiment kan opbevares og bruges i fremtidige oversættelses- og importeksperimenter.
    1. Linearisere DNA'et: Kombiner 40 μL plasmid-DNA (5 μg/μL), 5 μL 10x enzymbuffer og 5 μL restriktionsenzym og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
      BEMÆRK: De anvendte restriktionsenzymer kan variere baseret på plasmiden, hvilket kan kræve en anden enzymbuffer, og eksperimentelle forhold DNA kan bruges i enhver mængde / volumen, da skabelonen kan skaleres op eller ned.
    2. Rense og udfælde det lineariserede DNA ved hjælp af phenol og ethanol. Alle de efterfølgende trin (2.1.3-2.1.15) udføres sterile 1,5 mL-rør, og der anvendes en bordpladecentrifuge (se Materialetabel) til centrifugeringstrinene.
    3. Tilsættes den passende mængde steril H2O, således at det endelige volumen svarer til 400 μL. Tilsæt derefter 400 μL phenol.
    4. Bland kraftigt ved inversion for ~ 10 s, og centrifuge ved 17.000 x g i 1 min ved 4 °C. Træk den øverste fase tilbage, og gem den øverste fase.
    5. Tilsættes 400 μL phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1, v:v:v).
    6. Bland kraftigt ved inversion for ~ 10 s, og centrifuge ved 17.000 g i 1 min ved 4 °C. Træk den øverste fase tilbage, og gem den øverste fase.
    7. Der tilsættes 400 μL chloroform:isoamylalkohol (24:1, v:v).
    8. Bland kraftigt ved inversion for ~ 10 s, og centrifuge ved 17.000 g i 1 min ved 4 °C. Træk den øverste fase tilbage, og gem den øverste fase.
    9. Der tilsættes 40 μL 3M natriumacetat (pH 7,0), og der tilsættes 1 ml ethanol.
    10. Sterile 1,5 mL rør i -80 °C fryser på deres side i 15 min.
    11. Centrifuge prøverne ved 17.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    12. Kassér supernaten, og vask pelleten med 300 μL 80 % ethanol.
    13. Centrifuge prøverne ved 17.000 x g i 2 min ved 4 °C.
    14. Kassér supernaten og lufttørrer pelleten. Når pellet er tør, skal den være klar.
    15. Brugpillen igen i 20 μL steril H2O
    16. Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer (se Materialetabel) og sørg for, at forholdet mellem A260 og 280 er over 1,8.
    17. Dna'et fortyndes til en koncentration på 0,8 μg/μL i steril H2O.
    18. Transskribere DNA: Kombiner plasmid (0,8 μg/μL, 60,8 μL), steril H2O (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP ( 10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), blandingen som nævnt trin 2.1.19 (15,6 μL), RRNA'er (5,2 μL) og en passende RNA-polymerase (4,8 μL) til at danne "én reaktionsblanding" (samlet volumen = 121,6 μL) og inkubere i 90 min ved den optimale temperatur for polymerase (37 °C for T7 polymerase) 40 °C for SP6 polymerase)
    19. For at forberede blandingen tilsættes 200 μL på 1M HEPES (pH 7.9), 100 μL på 1 M MgAc2, 500 μL på 4 M KAc, 100 μL på 20 mM spermidin, 100 μL på 0,5 M DTT og 200 μL steril H20.
      BEMÆRK: Reaktionen kan skaleres op eller ned i volumen, så længe de medfølgende proportioner af reagenser opretholdes. Den anvendte RNA-polymerase dikteres af bakteriepromotorsekvensen inden for den anvendte plasmid.
    20. Derefter renses og bundfald mRNA ved hjælp af phenol og ethanol som i trin 2.1.2-2.1.15. Volumenet fyldes op på 400 μL med steril H2O (tilsættes 280 μL) og fortsættes som beskrevet i trin 2.1.2-2.1.15. Den sidste pille i 20 μL steril H2O.
    21. Mål koncentrationen af mRNA ved hjælp af et spektrofotometer, sørg for, at A260:280-forholdet er ~ 2,0.
    22. MRNA fortyndes til 2,8 μg/μL i steril H2O, og opbevares ved -20 °C i 50 μL aliquots.
  2. In vitro oversættelse
    BEMÆRK: Oversættelsen af det ønskede DNA skal ske samme dag som importforsøget. Dette forsøg kræver brug af radiomærkede aminosyrer, og derfor skal brugeren have tilladelse til brug af radioisotoper, og al håndtering og bortskaffelse skal være i overensstemmelse med institutionens politikker/krav. Skridt, der involverer radioisotop sikkerhedsforanstaltninger er blevet udeladt eller beskrevet kort, da disse sandsynligvis vil variere baseret på institutionen.
    1. Forbered nok oversættelse reaktion mix (tabel 2) til at levere ~ 20 μL pr prøve af mitokondrier, der skal anvendes i import eksperiment og omfatter det samme volumen for en oversættelse lane.
    2. Inkuberes reaktionen i 30 min ved 30 °C (tiden kan variere med mRNA, 25-60 min).
    3. Registrer brugen af 35S-methionin i henhold til institutionens krav til radioaktiv sikkerhed og kassér alt, hvad der er kommet i kontakt med radioisotopen i henhold til institutionens retningslinjer.
  3. Import af protein
    BEMÆRK: Frisk isoleret mitokondrier er nødvendige for de næste skridt. Der henvises til mitokondrie isolation protokol. Andre isolationsmetoder kan anvendes, så længe mitokondrier er levedygtige og funktionelle. For de efterfølgende trin suspenderes de mitokondrieprøver, der anvendes, i en resuspensionsbuffer som beskrevet ovenfor (Tabel 1). Proteinkoncentrationen af mitokondrieprøven skal også måles, inden importanalysen påbegyndes.
    1. Ca. 15 min efter starten af oversættelsesreaktionen skal der være 90 μg mitokondrier i sterile 1,5 mL rør og præinkuberes ved 30 °C i ~10 min.
      BEMÆRK: Aliquot mere mitokondrier end hvad der rent faktisk vil blive brugt i eksperimentet; der vil kun blive anvendt 75 μg. Men aliquoting i overskud er ikke et krav.
    2. I et nyt sæt sterile 1,5 mL-rør kombineres 75 μg mitokondrier med 18 μL af oversættelsesreaktionen og inkuberes ved 30 °C i den ønskede tid.
    3. Behold den resterende mængde af oversættelsesreaktionen på isen. dette vil blive udnyttet senere.
      BEMÆRK: Import er en tidsafhængig proces, så det kan være klogt at starte med et tidsforløbseksperiment, der spænder i inkubationstider fra 1-60 min. En typisk reaktionstid er 30 min.
    4. I løbet af denne periode forberedes saccharosepuden ved at kombinere 1 g saccharose, 200 μL på 2,5 M KCl, 10 μL 1 M MgCl2, 100 μL på 1 M HEPES (pH 7,4), og volumenet til 5 mL ved hjælp af steril H2O.
    5. Forbered et nyt sæt sterile 1,5 mL rør svarende til hvert rør i importreaktionen. Aliquot 600 μL af saccharosepuden i hvert rør og hold på is, indtil importreaktionen er overstået.
    6. For at afslutte importreaktionen efter den relevante inkubationstid skal røret fjernes fra 30 °C, lægge det på is og derefter forsigtigt overføre importreaktionen oven på røret med saccharosepuden.
      BEMÆRK: Dette trin skal gøres meget langsomt for at sikre, at mitokondrier ikke beskadiges / bristes. Saccharosepuden hjælper med at bremse migrationen af mitokondrier og "puder" dens nedstigning til bunden af røret under det efterfølgende centrifugeringstrin.
    7. Centrifuge prøverne + saccharosepude ved 17.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    8. Indbered brudbufferen ved at kombinere 25 mL 2,4 M sorbitol, 2 mL af 1 M HEPES (pH 7,4) og 72 mL dobbeltdestilleret H2O.
    9. Klar lysisbuffer til SDS-PAGE gelelektroforese: Kombiner 50 mL opvarmet glycerol, 11,5 g SDS, 31,25 mL 1 M Tris (pH 6.8) og bring volumenet op på 500 mL med dobbeltdestilleret H2O.
    10. Til prøveforberedelse blandes 475 μL lysisbuffer med 25 μL β-mercaptoethanol, der skal anvendes i et senere trin.
      BEMÆRK: Lysis buffer kan laves på forhånd og opbevares ved stuetemperatur; Tilføjelsen af β-mercaptoethanol skal dog gøres frisk.
    11. Brug en P1000 pipette skal du forsigtigt fjerne supernaten og ikke forstyrre pellet. Supernaten bortskaffes i en passende beholder til radioaktivt affald.
    12. Ved import til den ydre membran skal dette udføres ved hjælp af Tom40, genbruge pelleten i 50 μL frisklavet 0,1 M natriumcarbonat (pH 11,5) og inkuberes på is i 30 min.
    13. Efter inkubationen centrifugeres prøven 14.000 x g i 5 min ved 4 °C. Dette trin udføres kun for ydre membranimportreaktioner.
    14. For at forberede prøverne til SDS-PAGE elektroforese tilsættes 20 μL brudbuffer, 20 μL lysisbuffer og β-mercaptoethanol og genanvendes godt. Der tilsættes 5 μL prøvefarve.
    15. Kontrol-/oversættelsesbanen kombineres ved at kombinere 3 μL af den resterende oversættelsesreaktion fra trin 2.3.3 med 37 μL lysisbuffer og 5 μL prøvefarve. Bland godt.
    16. Kog prøverne i 5 min ved 95 °C og drej forsigtigt ned ved lav hastighed for at undgå pelleting mitokondrier.
    17. Prøverne påføres en SDS-polyacrylamidgel.
      BEMÆRK: Gelprocenten og den efterfølgende køretid afhænger af, hvilket protein der importeres. For eksempel er OCT 37 kDa, og det modne forarbejdede bånd er lidt mindre; derfor giver en 12% gel god adskillelse af disse bånd.
    18. Når elektroforesen er færdig, skal gelen fjernes og placeres i dobbeltdestilleret H2O.
    19. Kog gelen i 5% TCA i en røghætte i 5 min, kontinuerlig omrøring / flytning af gelen for at undgå revner.
      BEMÆRK: TCA hjælper størkne gelen til visualisering; dette kan gøres i en metalbakke over en Bunsen brænder. Brug nok TCA til generøst at dække gelen, ~ 1/2 fuld.
    20. Fjern gelen og læg den tilbage i dobbeltdestilleret H2O. Agiter den på en roterende plade i 1 min ved ~ 50 rpm.
    21. Vask gelen i 10 mM Tris på en roterende plade i 5 min ved ~ 50 rpm, igen ved hjælp af nok til generøst at dække gelen, ~ 1 / 2 af beholderen.
    22. Udfælde proteinet ved at vaske gelen i 1 M Salicyclic syre på en roterende plade i 30 min, igen ved hjælp af nok salicyclic syre til generøst at dække gelen, ~ 1 / 2 af beholderen, der anvendes.
    23. Dehydrere gelen som beskrevet i trin 2.3.24-2.3.31.
      BEMÆRK: Dette kan gøres på en række måder. En geltørrer (se materialetabel) giver en tidseffektiv løsning (beskrevet nedenfor); men andre kommercielt tilgængelige metoder / kits kan anvendes, der kan være mere omkostningseffektive, men mere tidskrævende. Geltørringssæt kan bruges som et alternativ, der ikke kræver anvendelse af varme eller sugning, men i stedet tillader gelen at lufttørre mellem cellofanplader for at forhindre forvrængning.
    24. Placer et stort ark blotting papir ned på geltørrerens porøse seng. Placer et ark køkkenrulle i det område, hvor gelen vil blive anvendt.
    25. Skær et 15 cm x 20 cm stykke blotting papir og læg det på køkkenrullen.
    26. Scoop ud gelen fra beholderen ved hjælp af et andet stykke 15 cm x 20 cm blotting papir og læg det fladt oven på det første stykke.
    27. Skær et lidt større stykke plastfolie, ~ 20 cm x 25 cm, og læg det ned på gel, hvilket sikrer ingen folder eller bobler under wrap.
      BEMÆRK: Dette kan tage et par forsøg, men det er bydende nødvendigt, at der ikke er nogen fanget luftlommer.
    28. Læg forsigtigt plastdækslet på geltørreren oven på indpakningen, hvilket igen sikrer, at der ikke er bobler eller folder.
    29. Tænd for pumpen/vakuumet, og sørg for, at plastdækslet har dannet en forsegling. Test forseglingen ved at løfte et hjørne af plastdækslet og vente på, at den forsegles igen.
    30. Luk geltørreren og kør i 90 minutter. Indstil temperaturen til at starte ved 30 °C, gradvist nå 80 °C, og derefter vende tilbage til 30 °C i slutningen af løbet.
    31. Når den er dehydreret, vil gelen størkne og føles papirtynde. Wrap gelen i plastfolie, der anvendes i tørringsprocessen.
    32. Placer den dehydrerede gel i en filmkassette med en fosforfilm (se Materialebord) med den hvide side vendt mod gelen. Eksponeringstider varierer, men kan være 24-48 timer for visualisering af bands.
    33. Visualiser ved hjælp af autoradiografi ved hjælp af en passende billeddannelse, der er i stand til fosforbilleddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har udførligt illustreret, at denne protokol er en gyldig analyse til bestemmelse af importhastigheden til funktionelle og intakte isolerede skeletmuskulatur mitokondrier. Sammenlignet med ubehandlede tilstande er importen af typiske prækursorproteiner som malat dehydrogenase (MDH) i matrixen følsom over for membranpotentiale, fordi det kan hæmmes af valinomycin, en respiratorisk kæde uncoupler (Figur 2A). Import hæmmes også, når mitokondrie indre og ydre membraner opløses i nærværelse af vaskemidlet Triton X-100. Importprocessen er følsom over for tilstedeværelsen af ekstern ATP, som tjener til at udfolde prækursorproteiner til translokation på tværs af membranerne og er stramt kontrolleret af respirationshastigheden og ATP-bestemmelse (data, der ikke er vist20). Der konstateres også tydelige forskelle i importen mellem intermyofibrillar og subsarcolemmal mitokondriefraktioner, til dels på grund af variationer i proteinimportmaskineryyudtrykket, samt åndedrætshastigheden mellem disse mitokondrier (figur 2B).

Mitokondrier i skeletmuskulatur er meget dynamiske organeller, der reagerer let på ændringer i energiefterspørgslen. Mitokondrieindholdet i musklen stiger efter perioder med kronisk motion eller som reaktion på elektrisk stimulation-induceret kontraktile aktivitet (se til gennemgang21). For eksempel øger 7 dages kronisk kontraktile aktivitet af rottemuskulaturmuskulatur import til OM og matrix med henholdsvis 1,6 og 1,4 gange22 (figur 3A, 3B). Disse ændringer i mitokondrieindholdet skyldes til dels ændringer i mitokondrieproteinimportsystemets kapacitet. Der kan faktisk illustreres et tæt forhold mellem importraten for prækursorproteiner og et godt skøn over mitokondrieindholdet målt ved den komplekse IV-markørcytochromoxidase under kontrol eller denervaterede forhold23(figur 3C).  

Importsystemets tilpasningsevne i muskel til ændringer i kontraktile aktiviteter tyder på, at motion kan anvendes som en behandling for at løse defekter i importvejen, hvis de identificeres. Under undersøgelsen af mitokondriemedieret apoptose ved hjælp af Bax-Bak dobbelt knockout dyr bemærkede vi, at det reducerede mitokondrieindhold i musklerne hos disse forsøgsdyr blev ledsaget af et fald i importen af prækursorproteiner i matrixen. Vi undersøgte derefter muligheden for, at øvelsen kunne genoprette denne importkapacitet. Efter 6 ugers frivillig kursus i hjulkørsel blev proteinimporten genoprettet for at kontrollere niveauet hos knockoutdyrene24, hvilket illustrerer den adaptive plasticitet af importvejen til redning af mitokondrieindhold og -funktion (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk af arbejdsgangen for isolering af SS og IMF mitokondrier fra skeletmuskulatur baseret på det tidligere arbejde8. Denne protokol tillader isolering af funktionelle mitokondrier baseret på deres geografiske placering i skeletmuskulaturen. SS mitokondrier er hurtigere og lettere befriet, mens IMF mitokondrier kræver en yderligere fordøjelse skridt med protease at udrede dem fra myofibrils. Bemærk, at isoleringen af disse underfraktioner kan gøres i tandem. En opdateret, lignende procedure er for nylig blevet offentliggjort25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Proteinimport til mitokondriematrixen. (A) Normale importsatser for MDH er vist i SS og IMF mitokondrier (vognbane 4 og 7) og oversættelsesproduktet af prækursor MDH (bane 1). Det nederste bånd repræsenterer den importerede modne MDH. Tilsætning af valinomycin hæmmer MDH-proteinimport i matrixen af SS og IMF mitokondrier, da denne uncoupler spreder membranpotentialet (vognbane 2 og 5). Triton-X er et vaskemiddel, der opløser den indre membran og derved hæmmer MDH-import i disse underfraktioner (vognbaner 3 og 6). Proteinimport blev udført for stigende varighed, 4 min, 7 min, 10 min, 15 min og 30 min. Disse data viser, at import er en tidsafhængig proces, og at SS og IMF mitokondrier har forskellige satser eller kapacitet til import (B). TL, oversættelsesbane; Val, valinomycin; TRI, Triton-X; CTL, kontrol; SS, subsarcolemmal; IMF, intermyofibrillar. Dette tal blev ændret fra Takahashi M &Hood DA20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Proteinimporten kan tilpasses og er tæt forbundet med skøn over mitokondrieindholdet. Sprague Dawley rotter blev udsat for elektrisk stimulation for at fremkalde kontraktile aktivitet, en model for motion uddannelse. (A) Tom40-importen til OM var 1,6 gange højere i muskler fra kronisk stimulerede dyr sammenlignet med kontrol på et givet tidspunkt. (B) OLT-importen til mitokondriematrixen blev øget ved hvert tidspunkt af inkubationen, og samlet set resulterede dette i en 1,4-dobling af mitokondrier fra kronisk stimulerede muskler. (C) Importen er positivt korreleret med et indeks over mitokondrieindhold, som vurderet af COX's aktivitet, r = 0,69. Disse målinger blev taget fra dyr, der blev udsat for denervation, hvilket har vist sig at mindske mitokondrieindholdet og importhastigheden. Con, kontrol; Den, denervated; Stim, stimuleret; TL, oversættelsesbane; * p < 0,05. Figur 3A og 3B er tilpasset fra Joseph A-M &Hood DA22 og 3C fra Singh B &Hood DA23. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Uddannelse redder importfejl in vivo. Bax / Bak dobbelt knockout dyr udviser reduceret proteinimport til mitokondrie matrix med 37%. Seks ugers frivillig hjulkørsel reddede importfejlen for at kontrollere niveauet. WT, vildtype; DKO, dobbelt knockout; TL, oversættelsesbane; * p < 0,05 hovedeffekt af genotype; ¶ p < 0,05 hovedeffekt af uddannelse. Dette tal er tilpasset fra Zhang Y et al.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer 1: Buffer 1 + ATP: Buffer 2: Resuspension medium: Nagarse protease
100 mM KCl 100 mM KCl 100 mM KCl 100 mM KCl 10 mg/mL i buffer 2
5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 10 mM MOPS BEMÆRK: Lav frisk og hold på is
5 mM EDTA 5 mM EDTA 5 mM EGTA 0,2% BSA
50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM Tris
1 mM ATP 1m ATP

Tabel 1: Buffere og resuspensionsmedier.

% af reaktionsvolumenet 1 Reaktion mix
Reticulocyte Lysate 64.10% 11,8 μL
Aminosyrer (-methionin) 2.20% 0,4 μL
Steril H2O 21.60% 3,97 μL
35 S-methionin 7.20% 1,33 μL
Mrna 5.40% 1,0 μL
Samlet diskenhed 18,5 μL
SEDDEL:
1) Tilføj 35S-methionin sidste;
2) Optø lysatet langsomt på is, og begræns fryse /optø cykler til to. Det anbefales, at lysatet aliquoteres ved ankomsten
3) Mængden af mRNA kan justeres for at optimere translationel effektivitet ved at ændre det sterile H2O-volumen i overensstemmelse hermed.

Tabel 2: Oversættelsesreaktionsblanding

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondrier er entydigt afhængige af udtryk og koordinering af både de nukleare og mitokondrie genomer for deres syntese og ekspansion i celler. Det nukleare genom koder imidlertid langt størstedelen (99%) af mitokondrieprotomet, og dette understreger proteinimportmaskinernes betydning for at støtte mitokondriebiogenese. Import fungerer også som en vigtig signalbegivenhed, da manglende import kan fremme indledningen af det udfoldede proteinrespons og / eller mitophagy15,16,26. Da import er afhængig af ekspression af flere funktionelle kanaler og chaperoner, et intakt membranpotentiale samt tilgængeligheden af ATP, kan evalueringen af mitokondrieproteinimport give værdifuld indsigt i organellens sundhed og energistatus.

Evalueringen af proteinimportkapaciteten i mitokondrier kræver isolering af organelle fra det omgivende væv ved hjælp af standard differentialcentrifugeringsteknikker. Import vurderes på samme måde, som man ville vurdere Vmax af mitokondrieenzymaktiviteter på en meget kontrolleret måde, der er afhængig af tids- og substratkoncentration og uafhængig af cellulære cytosoliiske påvirkninger. Isolationsmetoden, der præsenteres her, eller lignende gengivelser af den, har været brugt i mange år til at evaluere mitokondrie respiration og enzymaktiviteter8,9,10,11. Denne teknik er ikke uden begrænsninger, da den forstyrrer den normale morfologi af mitokondrier, da de findes i situ27, som i skeletmuskulatur er meget kompleks, lige fra små spheroidstrukturer, til et stærkt forgrenet retikulært netværk3, afhængigt af deres subsarcolemmal eller intermyofibrillar placering i muskelcellen. Desuden er brugen af protease nagarse kommet under kontrol3,28. En opdatering til denne metode, ved hjælp af trypsin i stedet for nagarse, er for nylig blevet offentliggjort25, og trypsin er blevet brugt af andre til at isolere muskel mitokondrier29. Faktisk kan enhver alternativ isolationsmetode, der giver funktionelt intakt mitokondrier, anvendes, herunder teknikker, der ikke anvender proteaser30 eller dem, der er designet til små biopsi-størrelse prøver fra menneskelige muskler31. Den metode, der præsenteres her, har den fordel, at SS mitokondrier hurtigt og nemt isoleres, men et større udbytte og renhed af mitokondrier kan opnås gennem isolering af IMF-underfraktionen. Hvis det gøres omhyggeligt, kan denne isolationsprotokol resultere i funktionelt intakte organeller med et højt åndedrætsværnsforhold, hvilket indikerer passende satser på tilstand 3 og 4 respiration8.

Det er også bydende nødvendigt for målingen af mitokondrieproteinimport, at disse organeller opretholder deres membranpotentiale, da import over den indre membran er afhængig af denne elektroforeretiske protonmotiv kraft, som tjener til at tiltrække positivt ladede forløbersekvenser og hjælpe med at mægle transporten af forstaderen ind i det negativt ladede matrixrum. Under sådanne forhold kan sammenligninger af mitokondriefunktion og import evalueres mellem fysiologisk relevante eksperimentelle situationer, såsom motion, aldring og muskelbrug, for eksempel. I denne henseende har tidligere arbejde vist, at import er en meget tilpasningsdygtig vej, der reagerer på ændrede tilstande af muskelbrug og disuse og er følsom over for hæmning via overdreven ROS-emission10,22,23,32. Denne plasticitet skyldes til dels adaptive ændringer i ekspressionen af proteinimportmaskinerne. Da denne teknik er afhængig af isolering af mitokondrier, fjernes enhver regulering af importvejen, der kan stamme fra cytosoliske faktorer eller interorganelle krydstale, fra fortolkningen af eksperimentet. Dette er både en begrænsning og en styrke af teknikken, da der kan drages konklusioner af selve importvejens kapacitet (svarende til Vmax af enzymaktivitet), men forbigående eller eksterne signaler, der kan forekomme med forsøgsmodellen, kan gå tabt. For at omgå dette er det muligt at inkubere importreaktionen med en prøve af den cytosoliske fraktion, der er isoleret som beskrevet ovenfor, med henblik på at vurdere ændringer i det cytosoliske miljø, der kan påvirke importraterne, som det er gjort tidligere22. Derudover er importmaskiner komponenter underlagt akutte, post-translationelle ændringer, der kan ændre deres funktioner. Nylige arbejde har vist, at fosforylering af specifikke TOM import receptorer kan være knyttet til mitophagy33. Faktisk er et forskningsområde, der fortjener mere opmærksomhed, den akutte graduering af importprocessen via iboende signalveje medieret af ROS eller ved kovalent modifikation af importreceptorer og chaperoner, som dokumenteret i gær og andre lavere organismer34,35.

Proteinimport til mitokondrier repræsenterer en gateway til adaptiv organellevækst og er en følsom indikator for mitokondriesundhed. Forståelse af, hvordan denne proces er reguleret kan kaste lys over reguleringen af mitokondrie biogenese, UPR signalering, og indledningen af mitophagy. Mitokondrieproteinimport er ikke en bredt undersøgt proces i pattedyrs eksperimentelle modeller, og udviklingen af det enorme forskningspotentiale på dette område kan hjælpe os med at opnå en større forståelse af sygdomme, hvor mitokondrie dysfunktion er tydelig eller repræsenterer et attraktivt terapeutisk mål for at fremme mitokondriesundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter, økonomiske eller på anden måde, er erklæret af forfatterne.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss fra Washington School of Medicine og Dr.M.T. Ryan fra La Trobe University for de oprindelige donationer af udtryksplasmider, der blev brugt til denne forskning. Dette arbejde blev støttet af midler fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) til D. A. Hood. D. A. Hood er også indehaver af en Canada Research Chair i Cell Fysiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2% BSA Sigma A2153
35S-methionine Perkin Elmer NEG709A500UC Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP Sigma A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper Thermo Fisher 05-714-5
Cassette for film Kodak Kodak Xomatic
Centrifugation Tube Thermo Fisher 3138-0050
Chloroform Thermo Fisher C298-4
DTT Sigma D9779-5G
EDTA BioShop EDT002
EGTA Sigma E4378
Gel Dryer BioRad Model 583
Gel Drying Kit Sigma or BioRad Z377570-1PAK or OW-GDF-10 Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol Caledon Laboratory Chemicals 5350-1-40
HEPES Sigma H3375
High Speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer IKA T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol Sigma I9392
KAc BioShop POA301.500
KCl Sigma P3911
M7G New England Biolab S1404S Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl BioShop MAG510
MgSO4 Thermo Fisher M65-500
MOPS BioShop MOP001
NaCl BioShop SOD001
NTP Thermo Fisher R0191
OCT Plasmid - - Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada
pGEM4Z/hTom40 Plasmid - - Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid - - Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol Sigma P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol Sigma P3803 Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film Fujifilm BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate Promega L4960 Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin Promega N2311
Rotor for High Speed Centrifuge Beckman Coulter JA-25.50
SDS BioShop SDS001.500 Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate Bioshop SAA 304
Sodium Carbonate VWR BDH9284
Sodium salicylate Millipore Sigma 106601
Sorbitol Sigma S6021
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
Spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop 2000
Spermidine Sigma S-2626
Sucrose BioShop SUC507
T7 RNA Polymerase Promega P2075
Tabletop Centrifuge Thermo Fisher AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid Thermo Fisher A322-500
Tris BioShop TRS001
β-mercaptoethanol Sigma M6250-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, Pt 1 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Tags

Biokemi udgave 179 mitokondriebiogenese subsarcolemmal mitokondrier intermyofibrillar mitokondrier træningstræning in vitro transskription
Måling af proteinimportkapacitet af skeletmuskulatur mitokondrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oliveira, A. N., Richards, B. J.,… More

Oliveira, A. N., Richards, B. J., Hood, D. A. Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria. J. Vis. Exp. (179), e63055, doi:10.3791/63055 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter