Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Situ Visualisering af axonvækst og vækstkegledynamik i akutte ex vivo embryonale hjerneskivekulturer

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/63068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Axon Growth and Regeneration, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE)

Summary

Denne protokol demonstrerer en ligetil og robust metode til at studere in situ axon vækst og vækstkegle dynamik. Den beskriver, hvordan man forbereder ex vivo fysiologisk relevante akutte hjerneskiver og giver en brugervenlig analysepipeline.

Abstract

Under neuronal udvikling navigerer axoner i det kortikale miljø for at nå deres endelige destinationer og etablere synaptiske forbindelser. Vækstkegler - de sensoriske strukturer placeret ved de distale spidser af udvikling af axoner - udfører denne proces. At studere vækstkeglens struktur og dynamik er afgørende for at forstå aksonal udvikling og interaktionerne med det omgivende centralnervesystem (CNS), der gør det muligt at danne neurale kredsløb. Dette er vigtigt, når man udtænker metoder til at reintegrere axoner i neurale kredsløb efter skade i grundforskning og prækliniske sammenhænge. Hidtil er den generelle forståelse af vækstkegledynamik primært baseret på studier af neuroner dyrket i to dimensioner (2D). Selvom det utvivlsomt er grundlæggende for den nuværende viden om vækstkeglestrukturel dynamik og reaktion på stimuli, misrepræsenterer 2D-undersøgelser det fysiologiske tredimensionelle (3D) miljø, som neuronale vækstkegler støder på i intakt CNS-væv. For nylig blev kollagengeler anvendt til at overvinde nogle af disse begrænsninger, hvilket gjorde det muligt at undersøge neuronal udvikling i 3D. Imidlertid mangler både syntetiske 2D- og 3D-miljøer signalsignaler i CNS-væv, som styrer udvidelsen og pathfinding af at udvikle axoner. Denne protokol giver en metode til at studere axoner og vækstkegler ved hjælp af organotypiske hjerneskiver, hvor udviklende axoner støder på fysiologisk relevante fysiske og kemiske signaler. Ved at kombinere finjusteret in utero og ex utero elektroporation for sparsomt at levere fluorescerende reportere sammen med superopløsningsmikroskopi præsenterer denne protokol en metodologisk pipeline til visualisering af axon- og vækstkegledynamik in situ. Desuden er en detaljeret værktøjskassebeskrivelse af analysen af langtids- og levende cellebilleddannelsesdata inkluderet.

Introduction

Neuroner er stærkt polariserede celler, der repræsenterer den grundlæggende beregningsenhed i nervesystemet. De modtager og udsender information, der er afhængig af opdeling af input- og outputsteder: dendritter og axoner, henholdsvis1. Under udviklingen strækker axoner sig, mens de navigerer i et utroligt komplekst miljø for at nå deres destination. Axonnavigation styres af vækstkeglen, en sensorisk struktur placeret ved spidsen af den udviklende axon. Vækstkeglen er ansvarlig for at detektere miljømæssige signaler og oversætte dem til den dynamiske rumlige omorganisering af dets cytoskelet 2,3. De resulterende morfo-mekaniske reaktioner instruerer vækstkeglen til at strække sig eller trække sig tilbage fra det udløsende signal, hvilket fører til specifikke axonmanøvrer.

Den nuværende forståelse af axonudvidelse og vækstkegledynamik stammer fra undersøgelser, der evaluerer axonvækst over todimensionelle (2D) substrater 2,4,5,6,7. Disse banebrydende undersøgelser identificerede sofistikeret samspil mellem vækstkegler og vækstsubstrater og afslørede slående forskelle afhængige af substrategenskaber som klæbeevne og stivhed 8,9. Ledet af disse indsigter blev ekstracellulære miljøsignaler antaget at diktere axonvækst, hvor vækstkeglecytoskelettet udførte denne vækst 2,10,11,12. Især kan neuroner udvide axoner i ikke-klæbende substrater (f.eks. Polylysin, poly-ornithin)13. Desuden kan substratstivhed påvirke axonvæksthastigheden uafhængig af celleklæbende komplekser8. Derfor kan undersøgelse af vækstkegledynamik i 2D-substrater alene ikke nøjagtigt modellere styrkebalancen, der stammer fra interaktionen mellem aksonale vækstkegler med fysiologisk relevante tredimensionelle (3D) miljøer, såsom dem, der findes in vivo.

For at overvinde begrænsningerne i 2D-assays er axonvækst og vækstkegledynamik blevet undersøgt i 3D-matricer 8,9. Disse matricer udgør mere fysiologisk kontekst, men tillader alligevel at studere celle-iboende mekanismer for axonvækst. Det muliggør vækstkegleundersøgelse på en enkeltcellet måde under en række forskellige tilstande og farmakologiske behandlinger9. I sådanne 3D-miljøer viste axoner tydelig cytoskeletal dynamik og voksede hurtigere end dem, der blev observeret i 2D-dyrkede neuroner9. Disse elegante undersøgelser viste indflydelsen af en ekstra dimension på omorganiseringen af vækstkeglecytoskelettet og følgelig på dets adfærd.

På trods af tilsyneladende fordele ved 3D-matricer i forhold til 2D-overflader til støtte for indfødt-lignende neuronal udvikling og axonvækst, forbliver de et forenklet syntetisk stillads, der ikke kan afspejle kompleksiteten af dynamik observeret i centralnervesystemet (CNS) væv. Her blev levering af reporterplasmider ved ex utero og in utero elektroporation kombineret med hjerneorganotypisk skivekultur og in situ live superopløsningsbilleddannelse for at analysere vækstkegledynamik inden for en fysiologisk kontekst. Denne metode muliggør visualisering af udviklende axoner, mens man oplever 3-dimensionaliteten af in vivo-miljøer og kompleksiteten af dens fysisk-kemiske sammensætning. Endelig beskrives brugervenlige procedurer til måling af axonvækst og vækstkegledynamik ved hjælp af almindeligt licenseret og offentligt tilgængelig software.

Protocol

Dyreforsøg skal overholde de relevante institutionelle og føderale regler. Embryonale dag 15,5 og 12,5 (E15,5 og E12,5) gravide kvindelige C57BL/6JRj mus blev anvendt i denne protokol. Forsøgene blev udført i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven fra Delstatens Miljøagentur Nord Rhein-Westfalen (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).

1. Fremstilling af plasmider til injektion

  1. Isoler DNA ved hjælp af endotoksinfrit Maxiprep-sæt i henhold til producentens protokol (se Tabel over materialer).
  2. Bland udvalgt DNA i den ønskede koncentration (tabel 1) og 10% Fast Green-opløsning (se tabel over materialer) for at visualisere leveringen af DNA-blanding i hjernens ventrikler.
    BEMÆRK: Specifikke plasmider blev anvendt til sparsom mærkning af de kortikale neuroner (figur 1A), trådformede actinstrukturer (F-actin) i vækstkeglen (figur 1B) og dobbeltmærkning af vækstkeglerne inden for samme cortex (figur 1C). Alle plasmider (tabel 1), der anvendes i denne protokol, er blevet deponeret i Addgene (se tabel over materialer).
  3. Forbered glaskapillærer ved hjælp af en kapillær elektrodetrækper indstillet i henhold til følgende program: tryk: 500, varme: 800, træk: 30 og hastighed: 40.
  4. Læg 15 μL DNA/Fast Green-blanding i hver glaskapillær ved hjælp af mikrolæsserpipettespidser.
    BEMÆRK: Sørg for, at der ikke dannes bobler.
  5. Opbevar DNA-fyldte kapillærer i et 10 cm fad med et stykke modellervoks over fadets diameter. Kapillærer kan lastes og opbevares ved 4 °C dagen før forsøget. Forsegl bagenden af kapillæren med fleksibel film for at forhindre tørring.

2. Fremstilling af opløsninger

  1. Forbered Hanks bufferede saltopløsning suppleret med glucose (HBSS-G).
    1. Tilsæt 0,5% af 20% glukosebeholdning til en flaske 1x HBSS. Bland godt og opbevar ved 4 °C i op til 2 uger. Til embryoekstraktion, boble HBSS-G-opløsning med carbogen (95%O2 og 5% CO2) ved hjælp af boblende sten kort før embryoopsamling.
  2. Skive medieløsning
    1. Forbered friske skivemedier indeholdende neurobasal 1x, 5% hesteserum, 5% føkalkalveserum, B27-tilskud 1:50, L-glutamintilskud 1:400, penicillin-streptomycin 1:200 og Neuropan-2-supplement 1:100 (ved pH = 7,3) under sterile forhold (se materialetabel).
    2. Forbered 3 cm retter med 1 ml skivemedie hver. Anbring i inkubatoren ved 35 °C med 5 % CO2 i mindst 1 time før forsøget for at udligne mediets pH gennem gasudveksling.
      BEMÆRK: Medie-pH-ligevægt skyldes forsuring af mediet med CO2 fra inkubatoren. Skivemedier kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
  3. Agaroseopløsning med lavt smeltepunkt (3%)
    1. Den ønskede mængde agarosepulver med lavt smeltepunkt vejes, og opløses i et passende volumen på 1x HBSS-G i en glasflaske. Ca. 7 ml agaroseopløsning pr. Hjerne er nødvendig.
    2. Læg flasken i en mikrobølgeovn i 2-3 minutter, med hætten løst placeret, og ryst hver 10-20 s.
    3. Når pulveret er helt opløst, anbringes flasken i et vandbad eller perlebad, der er sat til 37 °C mindst 1 time før forsøget, så agarose kan køle af.
      BEMÆRK: Det anbefales at opvarme agarose to gange over 15 minutter for at sikre, at agarosepulveret opløses. Dette er afgørende for den korrekte vedhæftning af agarose til hjernevæv. Et termometer skal bruges til at måle temperaturen på agaroseopløsningen, mens hjernen indlejres, og sørg for, at den er mellem 37-40 °C. Hjerner fra forskellige ældre dyr har forskellig stivhed. Det anbefales at teste en række agarosekoncentrationer for at finde homogenitet mellem væv og agarose.
    4. Forbered fosfatbufret saltvand med 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
    5. Forbered fosfatbufret saltvand med 0,2% natriumazid (PBS-NaN3).
      BEMÆRK: Opløsninger beskrevet i trin 2.4-2.5 er til brug i det senere immunhistokemiske trin.

3. Forberedelse af operationsstationen

  1. Rengør operationsstationen med 70%-96% ethanol og placer driftsunderlaget på stationens overflade.
  2. Steriliser operationsinstrumenterne ved at skylle med 70% -96% ethanol efterfulgt af tør sterilisering i en varm perlesterilisator.
  3. Rengør platinpincetelektroder (se materialetabel) med 70%-96% ethanol, inden du tilslutter til pulsgeneratoren.
  4. Indsæt en DNA/Fast Green-fyldt glaskapillær i kapillærholderen. Umiddelbart før brug skal du forsigtigt afbryde kapillærspidsen ved hjælp af en fin saks og testopløsningsstrømmen inde i et 1,5 ml mikrocentrifugerør fyldt med forvarmet saltvand eller vand.
    BEMÆRK: Figur 2A,B viser opsætning af operationsstation og værktøjer, der anvendes til ex utero-elektroporation (EUE) og in utero-elektroporation (IUE).
  5. For IUE, opvarmning saltopløsning til 37 °C i et vandbad.

4. Embryoekstraktion

  1. Placer gravid mus i anæstesiinduktorkammer med 5% isofluran, indtil musen er dybt bedøvet. Bekræft anæstesi ved fravær af pedal tilbagetrækningsrefleks.
  2. Overfør musen til et operationsunderlag og oprethold isofluran på 1,5% -2% gennem en næsekegle.
  3. Påfør salve på begge øjne for at forhindre hornhindetørring.
  4. Barber musens mave, og brug derefter 70% -96% ethanol-gennemblødt gasbind til at fjerne barberet hår. Rengør området med betadin.
  5. Brug steril lille kirurgisk saks til at lave et 2 cm hudsnit langs abdominal midterlinjen efterfulgt af et muskelsnit på 1,5 cm.
    BEMÆRK: Snitstørrelsen afhænger af embryostørrelsen. Faktisk vil større embryoner kræve et større snit for at imødekomme deres ekstraktion.
  6. Skær et hul i midten af gasbindet tilstrækkeligt bredt til at passe til hudsnittet (~ 2 cm i diameter), blød det med varmt saltvand og læg det rundt om abdominalåbningen.
  7. Træk begge livmoderhorn ud ved hjælp af en vatpind gennemblødt i varmt saltvand eller ved hjælp af tang, og tag forsigtigt fat i mellemrummet mellem embryoner for at trække dem ud. Placer embryoner på våd gasbind (figur 2C).
    BEMÆRK: Selv en lille skade på blodkar og kapillærer omkring livmoderhornene vil sandsynligvis resultere i kraftig blødning. Undgå derfor altid direkte håndtering af disse vaskulariserede områder.
  8. Skær livmodersækken op og fjern hvert embryo (figur 2D).
  9. Afliv hvert embryo umiddelbart efter ekstraktion via et faldende diagonalt snit, hvilket sikrer fuldstændig rygmarvstranssektion (figur 2E).
  10. Læg embryonerne i et 10 cm fad indeholdende HBSS-G på is.
    BEMÆRK: Halshugning af embryoet undgås for at forhindre DNA/Fast Green-blandingslækage fra hjernen og lette den nemme embryoplacering i holderen (se ex utero elektroporation, trin 5).
  11. Ofre moderen umiddelbart efter ekstraktion af embryoner ved at udføre cervikal dislokation.
    BEMÆRK: Her aflives moderen under anæstesi for at skåne den for yderligere smerter eller lidelser efter proceduren i overensstemmelse med protokollen godkendt af dyrevelfærdsloven fra North Rhein-Westphalia State Environmental Agency (LANUV).

5. Ex utero elektroporation (EUE)

  1. Pick up et embryo og læg det i holderen.
    BEMÆRK: En skåret 1 ml pipettespids fastgjort til enden af en celleskraber anvendes som embryoholder. Det er vigtigt at holde embryonernes arme uden for spidsen under proceduren for at forhindre dem i at glide ind i spidsen (figur 2F-I). Pipettespidsens diameter kan let justeres for at rumme embryoner i forskellige størrelser. Skær en anden spids i længden, hvor spidsens diameter svarer til embryostørrelsen, og brug den som en adapterindsats til ovennævnte holder.
  2. Indsæt forsigtigt DNA/Fast Green-fyldt glaskapillær gennem embryoets kranium i den laterale ventrikel og injicer 2-3 μL DNA-plasmidblanding (figur 1A,B; Tabel 1) ind i hver ventrikel (figur 2F).
    BEMÆRK: Brug lambdoidal og sagittal suturer som en vejledning til placeringen af DNA-injektion. De lambdoidale og sagittale suturer er fibrøse led, der forbinder kraniets knogleplade. Den førstnævnte forener parietalbenet med den occipitale knogle, og sidstnævnte slutter sig til de to parietale knogler.
  3. Hold embryoets hoved mellem platinpincetezerelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde (60 ° vinkel i dette tilfælde), med katoden vendt mod det område, hvor DNA-overførsel er beregnet (figur 2G-H).
  4. Påfør fem impulser ved 30 mV med et interval på 1 s og en varighed på 50 ms ved hjælp af en firkantet bølgepulsgenerator.
    BEMÆRK: Husk, at hjerner i EUE oplever et mere effektivt elektrisk felt end dem i IUE. Ved en given DNA-koncentration resulterer EUE derfor i højere effektivitet af DNA-overførsel end IUE, og DNA-koncentrationerne skal justeres i overensstemmelse hermed.
  5. Hvis bilateral elektroporation ønskes, gentages trin 5.3-5.4 med katoden og anoden, der afspejler den foregående position for at målrette mod den kontralaterale cortex.
    BEMÆRK: Da begge ventrikler blev injiceret med DNA, blev kortikater af begge halvkugler målrettet.
  6. Læg det elektroporerede embryo i et 6 cm fad indeholdende iskold HBSS-G. Gentag trin 5.1-5.6 for alle nødvendige embryoner.

6. In utero elektroporation (IUE)

  1. Injicer gravid mus med smertestillende middel; 50 μL buprenorphin (0,1 mg/kg) (se materialetabel) subkutant, 20 minutter før proceduren.
  2. Udfør trin 4.1-4.8 fra embryoekstraktionsafsnittet.
    BEMÆRK: Undgå at efterlade embryoner udsat unødigt ved at dække dem med sterilt gasbind gennemblødt i varmt saltvand.
  3. Brug fingerspidserne til forsigtigt at dreje embryoet inde i livmoderen, indtil lambdoidale og sagittale suturer er placeret (figur 2J). Indsæt forsigtigt DNA/Fast Green glaskapillær gennem livmodervæggen og embryoets kranium i den laterale ventrikel og injicer 2-3 μL DNA-plasmidblanding (figur 1A,C) i enten en eller begge ventrikler efter ønske (figur 2K-L).
    BEMÆRK: Overdreven fingertryk på livmoderhorn kan føre til fostervandssækkollaps.
  4. Hold embryoets hoved mellem platinpincetelektroder i den passende vinkel for at målrette mod det ønskede hjerneområde (60 ° vinkel i dette tilfælde), med katoden vendt mod det område, hvor DNA-overførslen er beregnet. Undgå at klemme livmoderen, da det kan forårsage sammenbrud af fostersækken (figur 2M).
  5. Påfør fem impulser ved 35 mV med et interval på 600 ms og en varighed på 50 ms ved hjælp af en firkantet bølgepulsgenerator.
  6. Hvis begge laterale ventrikler blev injiceret, gentag trin 6,5-6,6 med katoden og anoden, der afspejler den foregående position for at målrette mod den kontralaterale cortex.
  7. Gentag trin 6.3-6.6 for alle nødvendige embryoner.
  8. Når alle de nødvendige embryoner er blevet elektroporneret, skal du bruge en saltvandsgennemblødt vatpind til forsigtigt at placere livmoderhornene tilbage inde i bughulen.
    BEMÆRK: Tilsætning af saltopløsning i bughulen hjælper livmoderhornene med at glide tilbage på plads.
  9. Sutur muskel og hudsnit ved hjælp af 5-0 suturmateriale. Brug suturclips til at fastgøre såret og desinficere sutursåret ved at sprøjte det med betadin (figur 2N-P).
  10. Injicer musen med 200 μL 5% glucose subkutant.
  11. Injicer musen med et antibiotikum; 50 μL Enrofloxacin (5 mg/kg) subkutant (se materialetabel).
  12. Placer musen tilbage i genvindingsburet, og hold varmen ved hjælp af et fjerninfrarødt opvarmningslys eller varmepude i mindst 20 minutter efter proceduren (figur 2Q).
  13. Overvåg musen dagligt, og injicer meloxicam efter proceduren for smertelindring efter institutionelle og føderale retningslinjer.
  14. Uddrag embryoner 2 dage efter proceduren (dvs. E17.5) efter trin 4.

7. Hjerneekstraktion og indlejring i agarose

BEMÆRK: Det anbefales at udføre følgende trin under et dissektionsmikroskop for bedre præcision. Undgå skade på hjernen er afgørende for procedurens succes.

  1. Opsæt udsugningsværktøjer i et sterilt arbejdsområde under en dissektionshætte (figur 3A).
  2. Adskil hovedet på et embryo fra resten af kroppen ved hjælp af dissektionssaks.
  3. Fastgør hovedet som vist i figur 3C, og fjern derefter huden og kraniet ved at skære langs midterlinjen, startende fra bunden af hovedet mod næsen (figur 3D).
  4. Skræl huden og kraniet sideværts, hvilket gør et stort nok hul (~ 1 cm) til, at hjernen kan udskæres.
  5. For at fjerne hjernen skal du indsætte den lukkede spids af steril dissektionssaks, startende fra under den olfaktoriske pære, der bevæger sig mod hjernestammen (figur 3E).
  6. Skær hjernestammen af og trim eventuelle løse stykker af meninges omkring hjernen (figur 3F).
    BEMÆRK: Løse hjernehinger får ofte skiver til at forblive fastgjort til agaroseblokken efter skæring, hvilket fører til afskæring af væv fra agarose under skiveopsamling.
  7. Gentag trin 7.1-7.6 for alle embryoner og hold hjernen på is (ideelt set ikke længere end 30 min) indtil indlejringstrinnet.
    BEMÆRK: Følgende trin 7.7.1-7.7.4 henviser til hjerneekstraktion af E12.5-hjerner.
    1. Isoler toppen af hovedet lige under øjet, som vist i figur 3G.
    2. Skær huden og kraniet oven på hjernestammen efter den stiplede linje som vist i figur 3H uden at fjerne hjernestammen.
    3. Lav et 2 mm hud-kranie snit bag på hovedet, som vist i figur 3I (se tegninger for klarhed).
      BEMÆRK: Dette snit giver indledende gribepunkter til at skrælle lagene af hud og kranium. Typisk kommer de ud som et lag. Den typiske snitstørrelse er 2 mm, svarende til længden af skærekanten af den brugte mikrofjedersaks.
    4. Begynd at skrælle hud-kranielag af ved at fastgøre den ene side af snittet og trække den anden forsigtigt. Med samme omhu skal du afslutte ved at skrælle bunden af hovedet, indtil hjernen frigøres (figur 3J).
      BEMÆRK: Dette skal gøres med stor omhu, idet man observerer, at hjernen ikke trækkes langs vævslagene. Alternative sider for at fjerne vævet, der dækker hjernen.
  8. Hæld varm agarose (ved 37-40 °C) i et fad på 3 cm.
  9. Tag hjernen op ved hjælp af en perforeret ske og fjern overskydende væske ved at duppe bunden af skeen mod tørt silkepapir. Placer hjernen i en agaroseskål.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne så meget væske fra hele hjernen som muligt for at muliggøre bedre vedhæftning af agarose til vævet.
  10. Sæt fadet med flydende agarose på is. Brug en mindre ske til at blande agarose i 10 s for jævn afkøling. Manøvrer hjernen til midten af fadet. Placer hjernen vandret i fadet med den dorsale side op, og sikre, at den er helt dækket af agarose fra alle retninger (figur 3K).
    BEMÆRK: Hjerner vil ofte synke til bunden af fadet, når de er anbragt i agarose; løft hjernen ved hjælp af en lille ske, indtil der er etableret et hul på 1-2 mm under hjernen.
  11. Gentag trin 7,8-7,10 for alle hjerner.
  12. Når agarose er polymeriseret, tilsættes 500 μL HBSS-G oven på agaroseblokken for at forhindre tørring. Dæk derefter fadet med is.
    BEMÆRK: Opbevar prøven på is i 5 minutter før sektionering for at lade hjernetemperaturen nå 4 ° C.

8. Organotypisk skivekultur

BEMÆRK: Rengør vibratom og omgivende overflader med 70%-96% ethanol for at undgå skivekontaminering. Opsætningen af vibratomarbejdsstationen (se materialetabellen) er vist i figur 3B.

  1. Fyld vibratombufferbakken med kold HBSS-G og den ydre bakke med is for at opretholde HBSS-G-kulden under hele proceduren.
  2. Kontinuerligt forsyne HBSS-G i bufferbakken med carbogen ved hjælp af en boblende sten.
  3. Brug et nyt blad til at lave et stort snit (~ 2 x 2 cm) rundt om hjernen og fjerne en blok af agarose, der indeholder hjernen, med nok omgivende agarose til at trimme agarose i en lille rektangelblok.
    BEMÆRK: Dette trin gør det muligt at justere blokkens vinkel, så hjernens sagittale akse er vinkelret på vibratompladen, og koronaaksen justeres parallelt med bladet. Efterlad omkring 5 mm agarose i den dorsale side af hjernen for nem håndtering af skiverne.
  4. Anbring en lille dråbe hurtigklæbende opløsningsmiddelfri superlim midt i prøveholderen og spred den til et område, der dækker bunden af agaroseblokken.
  5. Tag forsigtigt agaroseblokken op og tør bunden ved at duppe mod silkepapir. Placer blokken på det limede område af prøveholderen med den rostrale side af hjernen op. Sæt prøveholderen på is og lad limen tørre i 1 min.
  6. Når limen er tørret, anbringes prøveholderen i bufferbakken.
  7. Skær hjernen i koronale skiver i en vinkel på 15°.
    BEMÆRK: Tykkelsen af skiverne kan variere afhængigt af applikationen. Her blev hjerner skåret i en tykkelse på 150 μm. Indstil vibratomhastigheden til 1,0-1,5 mm/s for at trimme overskydende agarose ovenpå og trimme olfaktoriske pærer. Reducer skærehastigheden til 0,5 mm/s til opsamling af kortikale skiver til analyse. De fleste vibratomer kan sættes på pause for at samle hver skive. Hvis der opleves nedsat kvalitet af skiver eller afskæring af væv fra agarose, kan det hjælpe at reducere skærehastigheden eller udskifte vibratombladet.
  8. Brug rene spatler til at samle hjerneskiver og placere dem på Polytetrafluorethylen (PTFE) membran, immobiliseret i en 35 mm glasbundet skål ved hjælp af paraffin (op til fem hjerneskiver / membran) (figur 3L-M).
    BEMÆRK: Fastgør PTFE-membranen inde i et 35 mm glasbundet fad ved hjælp af voks. Dette vil stabilisere membranen, når der tilsættes skivekulturmediet og også under billeddannelse.
  9. Brug en 200 μL pipette til at fjerne overskydende HBSS-G fra omkring skiverne på PTFE-membranen, hvilket efterlader skiverne halvtøre.
  10. Der tilsættes 500 μL skivemedier (forvarmet til 35 °C) direkte til rummet under PTFE-membranen.
    BEMÆRK: Der må ikke dannes bobler under membranen, når mediet tilsættes. Dette vil efterlade hele eller delvise skiver uden medieudveksling. Udskift 200 μL medier hver anden dag i kultur eller efter hver billedbehandling.
  11. Inkuber skiverne ved 35 °C med 5 % CO2.

9. Immunohistokemi

  1. Fastgør skiver med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) - suppleret med 4% saccharose pr. Skål. Inkuber ved RT i 30 min.
    FORSIGTIG: Ved håndtering af PFA skal du bære laboratoriefrakke og handsker. Udfør fikseringstrin under en kemisk hætte, og bortskaf PFA-affald korrekt.
  2. Vask skiverne to gange med 300 μL PBS i 5 min. Overfør skiverne til en tallerken med 24 brønde.
    BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette stadium. Tilsæt PBS-NaN3 til skiverne og opbevar ved 4 °C. NaN3 er en giftig forbindelse; Når du håndterer løsninger med det, skal du bære en laboratoriefrakke og handsker. Trin 9.3-9.10 skal udføres i en orbital ryster.
  3. Slukning af skiverne med 300 μL 0,1 M glycin ved 4 °C natten over.
  4. Vask glycin ud med PBS ved RT 3x i 10 min.
  5. Permeabilisere skiverne med 300 μL PBS-T ved RT i 2 timer.
  6. Bloker ved hjælp af 10% gedeserum i PBS-T ved RT i 2 timer.
  7. Der tilsættes 300 μL primært antistof (anti-vimentinantistof ved en fortynding på 1:200; se materialetabellen) fortyndet i 10 % gedeserum i PBS-T-opløsning ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: I trin 9.8-9.12 blev skiver lysbeskyttet for at forhindre tab af fluorescens.
  8. Vask primært antistof med PBS ved RT 3x i 20 min.
    BEMÆRK: PBS blev brugt i stedet for PBS-T til at vaske Triton X-100 ud.
  9. Tilsæt 300 μL sekundært antistof (enten Alexa Fluor 488 eller 647 ved en fortynding på 1:400; se tabel over materialer) i PBS ved RT i 2 timer.
    BEMÆRK: DAPI tilsættes umiddelbart efter fjernelse af det sekundære antistof ved en fortynding på 1:10.000 i 5 minutter.
  10. Vask det sekundære antistof med PBS ved RT 3x i 20 min. Vask med destilleret vand 2x i 1 min.
  11. Overfør skiverne til et glasglas med en fin børste, og tør derefter ved 30 °C i 20 minutter.
  12. Monter skiverne ved hjælp af et vandigt monteringsmedium. Opbevar lysbillederne på RT natten over, så monteringsmediet kan kuratere.

10. Erhvervelse af billedbehandling

BEMÆRK: Uanset DNA-leveringsmetoden (IUE eller EUE) blev skiver analyseret i samme udviklingsmæssige aldersgruppe (E17.5-E18.5). IUE gør det muligt for neuronale forfædre at opdele og udvikle sig i yderligere to dage in vivo. EUE giver derimod mulighed for sporing af tidlige udviklingsbegivenheder.

  1. Tænd for kammerinkubatoren, og indstil den til 35 °C med 5 % CO2 - ideelt set 4 timer før billeddannelse - så mikroskopkomponenter kan udligne ved 35 °C.
  2. Til dyb billeddannelse af skiver skal du bruge vandnedsænkningsmål til at reducere misforholdet i brydningsindekset mellem vævet og målet.
    BEMÆRK: Her blev der brugt superopløsningsbilleddannelsestilstand. Billeddannelse gennem PTFE-membranen kræver et mål med en lang arbejdsafstand (~ 1 mm). Hvis et mål om lang arbejdsafstand ikke er tilgængeligt, kan skiver overføres til et 8-brønds glasbundet fad. For at overføre skiver tilsættes 1 ml skivemedie til toppen af membranen, og brug derefter en spatel til at løfte et stykke og overføre det til en brønd, der indeholder 200 μL medier. Fjern overskydende medier ved hjælp af en 1 ml pipettespids, der efterlader skiverne halvtøre.
  3. Til billeddannelse af axonvækst skal du lokalisere et område af cortex med lav til medium celletæthed. Til billeddannelse af vækstkegledynamik skal du finde en vækstkegle i cortexens mellemzone eller subventrikulære zone.
  4. Definer en z-stack-størrelse i billedbehandlingssoftwaren (se Tabel over materialer). For axonvækst i en stor z-stak skal du indstille en trinstørrelse på 2 μm. For vækstkegler i en mindre z-stak skal du indstille en trinstørrelse på 1 μm.
    BEMÆRK: Redegør altid for potentiel bevægelse af vækstkeglen og axonen gennem x-, y- og z-planerne. Axoner vokser med en meget højere hastighed i organotypiske kulturer end i in vitro-kulturer . Her var en z-stak på omkring 80 μm til at afbilde axonvækst tilstrækkelig. Til vækstkegledynamik var en z-stak på ~ 6 μm tilstrækkelig.
  5. Til billeddannelse af axonvækst af neuroner i et større område skal du definere en flisescanning.
  6. Brug den lavest mulige lasereffekt for at minimere chancerne for blegning af vækstkegler under erhvervelsen.
  7. Til billeddannelse af axonvækst erhverves tidsforløb i 2 timer med et interval på 5 minutter. Til billeddannelse af vækstkegledynamik skal du erhverve tidsforløb i 2-5 minutter med et interval på 2,5-3 s.

11. Analyse af data

  1. Mål hastigheden af axonvækst ved hjælp af kymografer
    1. Åbn billedfilen i Fiji14 via File > Åbn , og vælg billedet.
    2. Opnå den maksimale intensitetsprojektion af tidsforløbet gennem Image > Stacks > Z-Projection > Maximum Intensity Projection.
    3. Gå gennem time-lapse og find en voksende axon.
    4. Når du er placeret, skal du tegne en linje gennem den voksende axon. Start fra spidsen af axonen i det første billede, og følg axonen gennem hele tidsforløbet.
    5. Generer en kymograf ved hjælp af pluginet KymoResliceWide.
    6. Indstil kymografens skala ved at gå til Egenskaber for > billede. Indstil afstanden i μm i Pixelbredde, og indstil tiden i s eller min i Pixelhøjde.
    7. Gå til Analysér > måling.
      BEMÆRK: Der vil blive givet en vinkel i forhold til x-aksen.
    8. Beregn hastigheden af axonvækst ved at erstatte vinklen i følgende ligning: SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) i et regneark.
  2. Mål volumenet af vækstkeglen ved hjælp af en billedanalysesoftware (se Tabel over materialer).
    1. Åbn billedfilen i billedanalysesoftwaren via File > Åbn , og vælg den fil, der er af interesse.
    2. Vælg guiden Tilføj nye overflader .
      BEMÆRK: Et afsnit i nederste venstre hjørne vises med seks trin til manuel redigering.
    3. I trin 1 - under Algoritmeindstillinger - skal du vælge Segmenter kun et område af interesse. I trin 2 skal du beskære rammen, så den passer til hele vækstkeglen i alle rammer.
    4. Hold tærsklen til Absolut intensitet i trin 3, og sørg for, at hele vækstkegleområdet er tærskel i trin 4.
    5. I trin 5 skal du vælge Antal Voxels lmg = 1 under Filtertype.
      BEMÆRK: I det sidste trin kan der oprettes flere målesæt. Her blev der kun oprettet en måling for volumen.
    6. Vælg knappen Udfør for at udføre alle oprettelsestrinnene og afslutte guiden Tilføj nye overflader.
    7. Under fanen Statistik øverst i guidevinduet skal du vælge Specifikke værdier og volumen under fanen Detaljeret .

Representative Results

Repræsentative resultater opnået med den beskrevne metode arbejdsgang vises. E15.5-mus blev brugt i den nuværende demonstration, selvom denne protokol let kan tilpasses stort set alle embryonale aldre, der spænder fra E11 til sen E17. I denne protokol er enten ex utero elektroporation (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller i utero elektroporation (IUE; Figur 2B, C og 2J-Q) blev brugt til at levere plasmider ind i stamcelleneuronerne, der forer de laterale ventrikler. Disse forfædre er kilden til fremtidige kortikale projicerende neuroner (CPN) 15,16. Plasmidblandinger blev forberedt til at drive sparsom neuronspecifik ekspression af enten membranmålrettet (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-forbedret (E) GFP (figur 1B) for at evaluere henholdsvis den overordnede adfærd og actindynamik i vækstkegler. Desuden blev en plasmidblanding med det formål at mærke individuelle neuroner med enten turbo (t) -RFP eller zoanthus sp. (Zs) grønt fluorescerende protein (ZsGreen) (figur 1C) inkluderet. Dette letter overvågningen af vækstkegleadfærd fra uafhængige naboneuroner.

Hjernedissektion fra elektroporerede embryoner er et afgørende skridt, der skal udføres omhyggeligt for at opnå skiver af høj kvalitet, der bevarer den oprindelige hjernestruktur. Dissektionsinstrumenter og vibratom blev forberedt på forhånd og omhyggeligt ethanolsteriliseret (figur 3A,B). Dernæst blev hovederne af elektroprerede embryoner omhyggeligt dissekeret, og hjernerne blev ekstraheret. Her vises repræsentativ dissektion af hjerner fra de embryoner, der udsættes for EUE ved E15 (figur 3C-F) og E12.5 (figur 3G-J). Hjerner indkapsles straks i en agarosematrix, skæres i skiver og placeres på PTFE-membranindsatser i en bundglasskål til inkubation (figur 3K-M).

Sundhedsstatus for hjerneskiver er et vigtigt punkt for kontrol for at sikre pålidelige resultater. En visuel inspektion for enhver forurening blev udført dagligt. Derudover, når kulturen var afsluttet, fastgøres hjerneskiverne og udsættes for immunhistokemi. Her blev 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) brugt til at kontrollere den overordnede cellulære organisation og vimentinfarvning for at afsløre glial organisation; især radial glia (RG) stillads. Typisk viser succesfuldt dyrkede hjerneskiver afledt af enten IUE eller EUE normal cellulær fordeling som afsløret af DAPI og et noget organiseret array af RG med apikalt orienterede pial-kontaktprocesser17 (henholdsvis figur 4A, B). Lejlighedsvis observeres markante forstyrrelser i RG-stilladset i dyrkede hjerneskiver, især hos dem, der stammer fra EUE-elektroporation (figur 4C). Hjerneskiver med ekstremt uorganiseret RG-stillads viser nedsat neuronal migration og defekt axonvækst (ikke vist). Derfor er styring af RG-stilladset en nem postkulturmetode til at sortere de data, der er opnået fra pålidelige hjerneskiver.

Hjerneskiver afledt af enten IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-ekspressiv plasmidblanding resulterer i lignende sparsom neuronmærkning. Et repræsentativt pyramideformet CPN, der udtrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske opførsel af dens vækstkegle, vises som et eksempel (figur 5A og supplerende video 1, øverst til venstre). Derudover blev neuroner mærket ved hjælp af et plasmid, der udtrykte en actinsonde til at analysere actindynamikken af aksonale vækstkegler in situ (figur 5B og supplerende video 1, nederst til venstre). In situ-eksperimenter blev også udført med et dual-Cre/Dre fluorophore-ekspressor-ekspressorisk plasmiddesign (figur 1C og supplerende video 1, til højre). tRFP eller ZsGreen fluoroforer i dette plasmid kunne specifikt og individuelt aktiveres af henholdsvis Dre eller Cre rekombinerer i naboneuroner (figur 5C). Denne eksperimentelle line-up tillader side om side analyse af vækstkegler fra kontrolneuroner med nærliggende modificerede neuroner (ethvert givet tab eller gevinst af funktion). Dette omgår variabilitet som følge af brugen af forskellige skiver til testkontrol og eksperimentelle forhold.

Kymografer genereret fra den optagede film blev analyseret, hvorfra dynamiske vækstparametre som fremspringende aktivitet over tid og vækstlængde let kan opnås (figur 6A). Bemærk, at en simpel justering i den tidsmæssige opløsning af time-lapse muliggør måling af axonforlængelseshastigheden i 2 timer (figur 6A). Desuden kan variationen i vækstkeglevolumen over tid - et mål for generel vækstkegledynamisk aktivitet - let opnås, i dette tilfælde med licenseret software (figur 6B og figur 6E,F). Dette kan bruges til at evaluere hastigheden af actin løbebånd og balancen af filopodia / lamellipodia under vækstkegle udforske aktivitet.

Figure 1
Figur 1: Skemaer over de plasmider, der anvendes i protokollen. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevante oplysninger om plasmidkomponenter og fluorofors oprindelse findes i æskerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang af ex utero og in utero elektroporation af E15.5 mus. (A) Opsætning af operationsstation til ex utero elektroporation. (B) Opsætning af operationsstation for in utero elektroporation. (C) Livmoderhorn trukket uden for bughulen i den auteste mus. D) Ekstraktion af et embryon fra livmodersækken. (E) Embryoofring ved fuldstændig rygmarvstranssektion via et diagonalt snit; Bemærk, at halshugning blev undgået. F) Placering af embryo i holderen og injiceret med DNA/Fast Green-blanding i venstre laterale ventrikel. (G,H) Placer embryoets hoved mellem platinpincetelektroder med katoden (rød pil) over cortex i en 60 ° vinkel. I) Placering af embryoets arme (sorte pile) uden for holderen for at forhindre, at embryoet glider under indgrebet. (J) Rotation af embryoet inde i livmodersækken for at udsætte hovedet. (K,L) Injektion af DNA/Fast Green-blanding i embryoets laterale ventrikler gennem livmodervæggen. (M) Placer embryoets hoved mellem platinpincetelektroder med en katode (rød pil) over cortex i en vinkel på 60°. (N) Sutureret muskelsnit via løbende låsesutur. (O) Sutureret hudsnit via en afbrudt sutur. P) Sikring af såret ved hjælp af kirurgiske sårclips og desinfektion ved hjælp af betadin. (Q) Placering af musen i genopretningsburet med langt infrarødt opvarmningslys. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ekstraktion af E15.5 og E12.5 hjerner og organotypisk skivekulturprocedure. (A) Værktøjer, der anvendes til hjerneekstraktionsproceduren. (B) Opsætning af organotypisk kulturstation. (C-F) Ekstraktion af E15.5 hjerne. (G-J) Ekstraktion af E12.5 hjerne. Prikkede linjer fremhæver placeringen af snit. Røde pile peger i retning af at trække med tang. (K) Indlejring af hjernen i en 3 cm skål indeholdende 3% lavsmeltet agarose, hvilket efterlader et hul på 1-2 mm agaroseafstand under hjernen. (L) Indsamling af 150 μm hjerneskive. (M) Placering af hjerneskiver på PTFE-membranindsatser immobiliseret i et 35 mm fad ved hjælp af paraffinfilm (blå pil). Rød stjernemærkning angiver en given hjerneskiveopsamling fra vibratom (L) og dens overførsel til PTFE-membran (M). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Bevaret radial glialcellestruktur i sunde organotypiske skiver. Konfokale billeder af E17.5 hjerneskiver, der afslører RG-array (vimentin; grøn) og den samlede celleorganisation (DAPI; magenta) efter IUE (A) og EUE (B,C). Bemærk de kraftige forstyrrelser i RG-arrayet, der lejlighedsvis kan skyldes EUE (C). Forstørrelser svarer til de røde prikkede rammer i hovedfiguren: skalabjælker, 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In situ visualisering af vækstkegledynamikken i akutte organotypiske skiver. (A,B) Neuroner og deres tilsvarende vækstkegler mærket med henholdsvis Lyn-mNeonGreen og LifeAct-GFP. Rød stjerne, der markerer vækstkegle af Lyn-mNeonGreen, der udtrykker neuron. Blå stjerne, der markerer vækstkegle af LifeAct-GFP, der udtrykker neuron. (C) Naboneuroner mærket med det dobbelte plasmidsystem, der indeholder tRFP (magenta) og ZsGreen (grøn) og deres tilsvarende vækstkegler. Vækstkegler afbildet (højre) var uden for den fangede ramme (venstre), opnået kort efter erhvervelsen af vækstkeglens time-lapse; skalabjælker, 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Analyse af axonvæksthastighed og vækstkeglevolumen. (A) Axonsporing på en neuron, der udtrykker Lyn-mNeonGreen (øverst) og dens tilsvarende kymograf (nedenfor) genereret ved hjælp af ImageJ. (B) Rekonstruktion af z-stack-video af vækstkegle ved hjælp af billedanalysesoftwaren (øverst) og den samme vækstkegle fremhævet ved hjælp af overflademålingsværktøjet (nedenfor). (C) Grafer, der viser ændringer i væksthastigheden over tid for flere axoner. D) Axonernes gennemsnitlige væksthastighed kvantificeres i (C). (E) Graf, der viser ændringerne i vækstkeglevolumen over tid. F) Det gennemsnitlige volumen af vækstkegler kvantificeres i (E); skalabjælke, 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Radial migration og neuronal polarisering af pyramidale kortikale neuroner. Diagram, der illustrerer udviklingen af pyramideformede kortikale neuroner (pink), der migrerer radialt fra den germinale ventrikulære zone (VZ) mod pia-overfladen. Styret af radiale glia-processer (grå) etablerer migrerende polariserede neuroner en førende proces, fremtidig dendrit og efterfølgende proces, fremtidig axon, der fortsætter med at strække sig nedad mod den mellemliggende zone (IZ). Stiplede røde felter repræsenterer de kortikale områder, hvor vækstkegler blev afbildet. Specifikt i IZ, subventrikulær zone (SVZ) eller sammenføjning af axonbundter (grøn). Illustrationen blev oprettet med et webbaseret værktøj, BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Plasmid Koncentration (μg/μL) Tilsigtet anvendelse
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen 0.25 Mærkning af membranmålrettet protein (Lyn)
+ +
p-Tub-alpha-1-iCre 0.08
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP 0.125 Filamentøs actin (F-actin) mærkning i vækstkegler
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen 1 Uafhængig mærkning af to populationer af naboneuroner
+ +
p-Tub-alpha-1-iCre 0.004
+ +
p-Tub-alpha-1-Dre 0.2

Tabel 1: Liste over plasmider, der anvendes i protokollen. Navn, koncentration og tilsigtet anvendelse af hvert udnyttet plasmid.

Supplerende video 1: In situ visualisering af vækstkegledynamikken i akutte organotypiske skiver. Dynamikken i vækstkegler mærket med Lyn-mNeonGreen (øverst til venstre) og LifeAct-GFP (nederst til venstre). Nærliggende vækstkegler er forskelligt mærket med det dobbelte plasmidsystem, der indeholder tRFP (magenta; øverst til højre) og ZsGreen (grøn; nederst til højre). Billedinterval, 2,5 s. Skalabjælker, 5 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Hvordan vækstkeglerne sanser og reagerer på deres omgivende miljø for at koordinere samtidig axonudvidelse og vejledning er stadig et spørgsmål om debat 3,18. Banebrydende undersøgelser i 2D-substrater gav et glimt af de grundlæggende molekylære mekanismer, der genererer de kræfter, der driver vækstkegledynamik under axondannelse, udvækst og navigation 2,10,11,12,19. For nylig afslørede undersøgelser i 3D-matricer, hvor stor indflydelse en tredje dimension har på vækstkeglens opførsel og følgelig i axonvækst 8,9. Ikke desto mindre mangler de indviklede mekanismer, der instruerer vækstkegledynamik in vivo, at blive grundigt undersøgt.

Forberedelse af organotypiske skivekulturer fra IUE- eller EUE-hjerner er meget udbredt og veldokumenteret. Det er blevet en gylden standard, der giver forskere mulighed for at få indsigt i udviklingen og adfærden af neuroner i det levende hjernevæv20,21. Faktisk er denne teknik blevet anvendt med succes i kombination med forskellige billeddannelsesteknikker i høj opløsning til at visualisere specifikke molekylære processer og morfologiske begivenheder in situ. Sådanne undersøgelser omfatter, men er ikke begrænset til, axondannelse og forlængelse19,22, kortikal neuronal migration 19,22,23,24, centrosomdynamik 25,26, mikrotubulidynamik27 samt den funktionelle dynamik i præ- og postsynaptiske rum28,29.

Denne protokol adresserer et hul i eksperimentel neurobiologi, visualiserer vækstkegledynamikken ved udvikling af kortikale neuroner in situ, in ex vivo akutte hjerneskivekulturer og værktøjerne til at analysere de opnåede data.

Akutte hjerneskivekulturer blev brugt til at etablere denne protokol, fordi de (1) med en vis praksis er lette at generere; 2) præsentere et tilgængeligt system til undersøgelse af vækstkegler, der er indlejret i et kvasi-fuldt fysiologisk miljø, men alligevel gennemsigtigt nok til at muliggøre levende cellebilleddannelse i høj opløsning (3) kan udvides til dets anvendelse med et utal af transgene muselinjer; (4) kombineret med enten IUE eller EUE giver praktisk talt ubegrænset potentiale til at levere molekylære værktøjer til evaluering af vækstkeglers og axoners ydeevne in vivo under tab/forstærkning af funktionsregimer sammen med fluorescerende indberettere og cytoskeletprober.

Denne metode blev beskrevet i forbindelse med både EUE og IUE. Selvom det stadig er en meget pålidelig metode, resulterede EUE i en øget forekomst af hjerneskiver, der viste et uorganiseret RG-netværk sammenlignet med dem, der blev opnået med IUE som leveringsmetode (figur 4C). Forstyrrelser i RG-arrayet påvirker stærkt neuronal migration og mønsteret af axonforlængelse30,31. Dette er nøgleparametre, der forudsiger, hvor man kan finde axoner til analyse på et givet tidspunkt, og hvilken type miljø de navigerer i. Hjerneskiver med et signifikant forstyrret RG-netværk har typisk nedsat kortikal neuronstratificering. Dette producerer igen axoner med kaotiske baner. Derfor anbefales det kraftigt at kontrollere for RG-netværkets strukturelle integritet. Interessant nok korrelerer dårlig strukturel integritet med øget alder af den embryonale hjerne. Faktisk blev sådanne virkninger hos yngre E12,5-E13,5 embryoner typisk ikke observeret19.

Den nuværende protokol er grundig og ligetil. Ikke desto mindre er der et par kritiske trin, hvor der skal udvises særlig omhu og opmærksomhed for at opnå optimale resultater. Disse er udtrykkeligt nævnt i protokollen og inkluderer (1) tuning af mængden af DNA, der anvendes i elektroporationen for at få sparsom mærkning; 2) undgå skader under udtrækning af hjerner 3) kontrol af agarosetemperaturen under hjernehuset (4) fejlfinding af den ideelle procentdel af agarose for hjerner i en given alder; og (5) udvælgelse af fluoroforer, hvis erfaring følger. Under protokoloptimering blev ydeevnen for flere fluoroforer i live-cell in situ-billeddannelse testet. Monomere GFP-varianter EGFP og NeonGreen til fremstilling af LifeAct- og Lyn-mærkede plasmider blev valgt til denne protokol (figur 5A,B). Derudover blev RFP-varianten mScarlet testet og fundet yderst egnet til denne opsætning (data ikke vist). Multimere tRFP (dimer) og ZsGreen (tetramer) (figur 5C og supplerende video 1, til højre) blev også testet. Disse hurtigt foldbare superlyse fluoroforer anbefales, når metoden kræver hurtig fluorescerende signalgenerering efter DNA-levering.

En almindelig praksis i at bruge skivekulturer er at bruge skiver fra forskellige hjerner til at teste kontrol og eksperimentelle forhold. Dette repræsenterer en iboende kilde til uønsket variabilitet. Her blev der anvendt et ekspressionssystem, der muliggør uafhængig modifikation af naboneuroner og journalisters udtryk for identifikation. Bemærk, at der i denne demonstration (figur 5C) ikke var nogen forskelle mellem neuroner, der udtrykte nogen af fluoroforerne. Men som et eksempel vil en sådan plasmidblanding kombineret med en transgen muselinje, der huser et Cre-følsomt gen, mærke med tRFP (Dre-følsomme) neuroner, der forblev som vildtype. I modsætning hertil vil ZsGreen (også Cre-følsom) mærke de rekombinerede neuroner. Derfor kunne vækstkegler af de to forskellige genotyper, og sandsynligvis også fænotyper, studeres side om side samtidigt i samme hjerneskive.

Lokalisering af axoner og vækstkegler til analyse er en vigtig overvejelse. Kortikale neuroner polariserer, mens de radialt migrerer fra den ventrikulære zone (VZ) mod den kortikale plade (CP). Under denne proces danner neuroner en førende proces (en fremtidig dendrit) og en efterfølgende proces, der bliver axonen, der til sidst slutter sig til banebrydende axoner i den mellemliggende zone (IZ) og etablerer axonkanaler32. For at fange aksonale vækstkegler blev der derfor foretaget billeddannelse på aksonale fibre i IZ, herunder axoner, der forlader CP og tidligt genererede axoner, der allerede er forbundet med aksonale bundter; eller til sidst i fibre, der krydser IZ og strækker sig under den (figur 7).

Denne protokol gør det muligt at udføre superopløsningsbilleddannelse af neuroner inden for organotypiske skiver. Historisk set var lysspredning et væsentligt problem, der blev konfronteret med billeddannelse af tykke prøver. I løbet af de sidste to årtier har omfattende fremskridt inden for optiske teknologier gjort billeddannelse af tykke prøver mulig. Her blev et langt arbejdsafstandsmål brugt til at visualisere mindre strukturer bedre, såsom vækstkegler. Uundgåeligt fanger denne protokol ikke mere detaljerede begivenheder såsom retrograd actinflow eller mikrotubuli dynamik. Målet om langdistance, som kræver en lavere numerisk blænde (NA), bevarer information fra tykke skiver. Det var dog også muligt at tilpasse denne protokol til brug med henblik på kortere arbejdsafstand. Dette krævede en jævn overførsel af skiver til en glasbundet skål for at bevare strukturel integritet. Brug af denne metode resulterede imidlertid i kortere overlevelse - ~ 15 h - på grund af tab af gasudveksling (data ikke vist). I modsætning til 2D-kulturer optager vækstkegler i 3D et større volumen og kræver bevægelsesartefaktkompensation i z-aksen. For at øge evnen til at afbilde detaljerede begivenheder skal moderne konfokal teknologi anvendes. Derfor anbefales det at bruge en hurtigscannings z-stack-motor, såsom z-Galvo, der er tilgængelig på meget følsomme konfokale mikroskoper33.

Bemærk, at denne protokol præsenterer tre hovedbegrænsninger. For det første er det ofte udfordrende at kontrollere niveauer af ekspression /antal ekspressionsceller af et givet plasmid in vivo. Dette introducerer variabilitet mellem alle skiver, selv når den samme plasmidkoncentration opretholdes. Derfor skal udvælgelsen af reguleringselementerne i de anvendte ekspressionsvektorer forudbestemmes med omhu. For det andet er det i øjeblikket ikke muligt at afbilde detaljerede hændelser ved hjælp af membranindsatser. Denne anden begrænsning kan overvindes med de metodologiske ajourføringer, der foreslås i det foregående stykke. Endelig er vækstkegler meget lysfølsomme og kan hurtigt blive fotoblegerede. Derfor kan hyppig billeddannelse af vækstkeglerne i så lidt som 5 minutter ved hjælp af laserscanningsmikroskoper ofte kollapse vækstkeglerne. I denne henseende kan nye fremskridt inden for lysarkmikroskopigenererede enheder tilpasses til langsigtet billeddannelse af hjerneskiverne34.

Protokoller af denne slags er planlagt til at åbne nye forskningsveje, hvilket giver en bedre forståelse af, hvad der kræves for en vækstkegle at læse og reagere på et komplekst in vivo-miljø , og endnu vigtigere, at optrævle mekanikken i dette sofistikerede samspil.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Maria Eugenia Bernis for at fotografere procedurerne. Vi takker også Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski og Sina Stern for at have læst og diskuteret manuskriptet. Vi er taknemmelige for vores fremragende tekniske assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel og Anh-Tuan Pham. Vi anerkender den værdifulde støtte fra DZNE's lysmikroskopanlæg og dyreanlæg. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) og Wings for Life (til F.B). F.B. er medlem af excellence-klyngen ImmunoSensation2, SFB'erne 1089 og 1158, og er modtager af Roger De Spoelberch-prisen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin antibody sigma-Aldrich V2258-.2ML Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044
Betadine B. Braun 3864154
Biozym Sieve GP Agarose Biozyme 850080
Braunol, Sprühflasche B. Braun 3864073
Buprenorphine (Temgesic) GEHE Pharma 345928
DAPI sigma-Aldrich D9542
DMZ unevirsal electrode puller Zeitz NA
Electric razor Andes NA ProClip UltraEdge Super 2-Speed model
Enrofloxacin (Baytril) Bayer 3543238 2,5% (wt/vol)
Eppendorf microloader pipette tips FischerScientific 10289651
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Dye content ≥ 85 %
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10500064
Fiji 2.1.0 NIH NA https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09 ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD5040-100
Fluoromount Aqueous Mounting Medium sigma-Aldrich F4680-25ML
Glucose MedPex 3705391 5%
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Glycine Sigma-Aldrich G8898
HBSS Life Technologies 14025092 calcium, magnesium, no phenol red
Horse serum Pan-Biotech P30-0711
Imaris 9.7.2 Bitplane NA https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
Isoflurane Virbac NA
Isotonic saline solution B. Braun 8609261 0.90%
Leica VT1200 S vibratome Leica 14048142066
LSM 880 with Airyscan Zeiss NA
Metacam Venusberg Apotheke 8890217 5 mg/ml
Mice Janvier Labs NA C57BL/6JRj
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210  16.16.27
Microsoft Excel Microsoft NA https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture Insert EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm
Moria Perforated Spoons Fine Science Tools 10370-18
Moria Spoon Fine Science Tools 10321-08
Neurobasal Medium, minus phenol red ThermoFisher Scientific 12348017
Neuropan-2 supplement Pan-Biotech P07-11010
Normal goat serum Abcam ab138478
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors Fine Science Tools 12002-12
p-Tub-alpha-1-Dre Addgene 133925
p-Tub-alpha-1-iCre Addgene 133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP Addgene 175437
Parafilm VWR 52858-000
Paraformaldehyde sigma-Aldrich P6148
PBS Sigma-Aldrich P3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen Addgene 175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen Addgene 175257
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
PicoNozzle Kit v2 World Precision Instruments 5430-ALL
Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0487 1 mm / 3 mm
QIAGEN Maxi kit QIAGEN 12162
Reflex wound closure Clip World Precision Instruments 500344-10 7 mm
Sekundenkleber Pattex Mini Trio Lyreco 4722659
Square wave electroporation system ECM830 Harvard Apparatus W3 45-0052
Sterile gauze Braun Askina 9031216
Sterile lubricant eye ointment Bayer Vital PZN1578675
Sterile surgical gloves Sempermed 14C0451
Sucrose Roth 4621.2
Supramid 5-0 surgical silk sutures B. Braun NA
Thin-wall glass capillaries World Precision Instruments TW100-4
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-03
µ-Slide 8 Well Glass Bottom Ibidi 80827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
  2. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  3. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
  4. Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
  5. Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
  6. Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
  7. Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
  8. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  9. Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).
  10. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
  11. Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
  12. Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
  13. Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).
  18. Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
  19. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
  20. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  21. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  22. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  23. Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
  24. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
  25. de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
  26. Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
  27. Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
  28. Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).
  29. Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
  30. Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
  31. Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).
  32. Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
  33. Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ (2021).
  34. ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html (2021).

Tags

Neurovidenskab udgave 176
<em>In Situ</em> Visualisering af axonvækst og vækstkegledynamik i akutte <em>ex vivo embryonale</em> hjerneskivekulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S.… More

Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S. In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures. J. Vis. Exp. (176), e63068, doi:10.3791/63068 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter