Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In situ Visualisering av Axon vekst og vekst kjegledynamikk i akutte Ex Vivo embryonale hjerneskivekulturer

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/63068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Axon Growth and Regeneration, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE)

Summary

Denne protokollen viser en enkel og robust metode for å studere in situ axon vekst og vekst kjegle dynamikken. Den beskriver hvordan man tilbereder eks vivo fysiologisk relevante akutte hjerneskiver og gir en brukervennlig analyserørledning.

Abstract

Under nevronutvikling navigerer axoner i det kortikale miljøet for å nå sine endelige destinasjoner og etablere synaptiske forbindelser. Vekstkjegler - de sensoriske strukturene som ligger på de distale spissene for å utvikle axoner - utfør denne prosessen. Å studere strukturen og dynamikken i vekstkjeglen er avgjørende for å forstå axonal utvikling og samspillet med det omkringliggende sentralnervesystemet (CNS) som gjør det mulig å danne nevrale kretser. Dette er viktig ved utarbeidelse av metoder for å reintegrere aksoner i nevrale kretser etter skade i grunnleggende forskning og prekliniske sammenhenger. Så langt er den generelle forståelsen av vekstkjegledynamikk først og fremst basert på studier av nevroner dyrket i to dimensjoner (2D). Selv om det utvilsomt er grunnleggende for den nåværende kunnskapen om vekstkjeglestrukturelle dynamikker og respons på stimuli, fremstiller 2D-studier feilaktig det fysiologiske tredimensjonale (3D) miljøet som oppstår av nevronale vekstkjegler i intakt CNS-vev. Mer nylig ble kollagengeler brukt for å overvinne noen av disse begrensningene, noe som muliggjør undersøkelse av nevronutvikling i 3D. Imidlertid mangler både syntetiske 2D- og 3D-miljøer signalsignaler i CNS-vev, som styrer forlengelsen og pathfinding av å utvikle axoner. Denne protokollen gir en metode for å studere axoner og vekstkjegler ved hjelp av organotypiske hjerneskiver, der utviklende axoner møter fysiologisk relevante fysiske og kjemiske signaler. Ved å kombinere finjustert i utero og ex utero elektroporasjon for å sparsomt levere fluorescerende reportere sammen med superoppløselig mikroskopi, presenterer denne protokollen en metodisk rørledning for visualisering av axon- og vekstkjegledynamikk in situ. Videre er en detaljert verktøykassebeskrivelse av analysen av langsiktige og live-celle bildedata inkludert.

Introduction

Nevroner er svært polariserte celler som representerer den grunnleggende beregningsenheten i nervesystemet. De mottar og avgir informasjon som er avhengig av oppdeling av inngangs- og utgangssteder: henholdsvis dendritter og aksoner. Under utviklingen strekker axonene seg mens de navigerer i et utrolig komplekst miljø for å nå destinasjonen. Axon-navigasjon styres av vekstkjeglen, en sensorisk struktur plassert på spissen av den utviklende axonen. Vekstkjeglen er ansvarlig for å oppdage miljøsignaler og oversette dem til den dynamiske romlige omorganiseringen av cytoskjelettet 2,3. De resulterende morfo-mekaniske reaksjonene instruerer vekstkjeglen til å strekke seg eller trekke seg tilbake fra utløsersignalet, noe som fører til spesifikke axonmanøvrer.

Den nåværende forståelsen av axonforlengelse og vekstkjegledynamikk stammer fra studier som evaluerer axonvekst over todimensjonale (2D) substrater 2,4,5,6,7. Disse banebrytende studiene identifiserte sofistikert samspill mellom vekstkjegler og vekstsubstrater og avslørte slående forskjeller avhengig av substrategenskaper som lim og stivhet 8,9. Anført av denne innsikten ble ekstracellulære miljøsignaler hypoteset for å diktere axonvekst, med vekstkjeglen cytoskjelett som utførte denne veksten 2,10,11,12. Spesielt kan nevroner forlenge aksoner i ikke-klebende substrater (f.eks. polyly lysin, poly-ornitin)13. Videre kan substratstivitet påvirke axonvekstraten uavhengig av cellelimkomplekser8. Derfor kan det å studere vekstkjegledynamikk i 2D-substrater alene ikke nøyaktig modellere balansen mellom krefter som oppstår ved samspillet mellom axonale vekstkjegler med fysiologisk relevante tredimensjonale (3D) miljøer, for eksempel de som finnes in vivo.

For å overvinne begrensningene i 2D-analysene har axonvekst og vekstkegledynamikk blitt studert i 3D-matriser 8,9. Disse matrisene utgjør mer fysiologisk kontekst, men tillater likevel å studere celleintrinsiske mekanismer for axonvekst. Det muliggjør vekstkegleundersøkelse på en encellet måte under en rekke forhold og farmakologiske behandlinger9. I slike 3D-miljøer viste axoner distinkt cytoskeletal dynamikk og vokste raskere enn de som ble observert i 2D-dyrkede nevroner9. Disse elegante studiene demonstrerte påvirkningen av en ekstra dimensjon på omorganiseringen av vekstkjeglen cytoskjelett og følgelig på dens oppførsel.

Til tross for tilsynelatende fordeler presentert av 3D-matriser over 2D-overflater for å støtte innfødt nevronutvikling og axonvekst, forblir de et forenklet syntetisk stillas som ikke kan gjenspeile kompleksiteten i dynamikken observert i sentralnervesystemet (CNS) vev. Her ble levering av reporterplasmider av ex utero og i utero-elektroporasjon kombinert med hjernens organotypiske skivekultur og in situ live superoppløsningsavbildning for å analysere vekstkjegledynamikk i en fysiologisk kontekst. Denne metodikken tillater visualisering av å utvikle axoner mens du opplever 3-dimensjonaliteten til in vivo-miljøer og kompleksiteten i dens fysisk-kjemiske sammensetning. Til slutt beskrives brukervennlige prosedyrer for å måle axonvekst og vekstkjegledynamikk ved hjelp av vanlig lisensiert og offentlig tilgjengelig programvare.

Protocol

Dyreforsøk må overholde relevante institusjonelle og føderale forskrifter. Embryonal dag 15,5 og 12,5 (E15,5 og E12,5) gravid kvinne C57BL/6JRj mus ble brukt i denne protokollen. Eksperimenter ble utført i samsvar med dyrevelferdsloven til North Rhein-Westfalen State Environmental Agency (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).

1. Tilberedning av plasmider til injeksjon

  1. Isoler DNA ved hjelp av endotoksinfritt Maxiprep-sett i henhold til produsentens protokoll (se Materialfortegnelse).
  2. Bland valgt DNA ved ønsket konsentrasjon (tabell 1) og 10% fast grønn løsning (se materialtabell) for å visualisere levering av DNA-blanding i hjerne ventrikler.
    MERK: Spesifikke plasmider ble brukt til sparsommerking av kortikale nevroner (figur 1A), filamentøse aktinstrukturer (F-aktin) i vekstkjeglen (figur 1B) og dobbeltmerking av vekstkjeglene i samme cortex (figur 1C). Alle plasmider (tabell 1) som brukes i denne protokollen er deponert i Addgene (se Materialfortegnelser).
  3. Forbered glasskapillærer ved hjelp av et kapillær elektrodetrekkersett i henhold til følgende program: trykk: 500, varme: 800, trekk: 30 og hastighet: 40.
  4. Last 15 μL DNA/Fast Green-blanding i hver glasskapillær ved hjelp av pipettespisser for mikrolaster.
    MERK: Pass på at det ikke dannes bobler.
  5. Oppbevar DNA-fylte kapillærer i en 10 cm tallerken med et stykke modelleringsleire over diameteren på parabolen. Kapillærer kan lastes og lagres ved 4 °C dagen før eksperimentet. Forsegle bakenden av kapillæren med fleksibel film for å forhindre tørking.

2. Utarbeidelse av løsninger

  1. Forbered Hanks bufrede saltløsning supplert med glukose (HBSS-G).
    1. Tilsett 0,5% av 20% glukoselager til en flaske 1x HBSS. Bland godt og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker. For embryoutvinning, boble HBSS-G løsning med karbogen (95% O2 og 5% CO2) ved hjelp av boblestein kort tid før embryo samling.
  2. Løsning for stykkemedier
    1. Forbered ferske stykkemedier som inneholder Neurobasal 1x, 5% hesteserum, 5% fosterkalvserum, B27 supplement 1:50, L-glutamin supplement 1:400, penicillin-streptomycin 1:200 og Neuropan-2 supplement 1:100 (ved pH = 7,3), under sterile forhold (se Tabell over materialer).
    2. Forbered 3 cm retter med 1 ml skivemedier hver. Plasser i inkubatoren ved 35 °C med 5 % CO2 i minst 1 time før eksperimentet for å likevekte medienes pH gjennom gassutveksling.
      MERK: Media pH-likevekt er forårsaket av forsuring av media av CO2 fra inkubatoren. Skiver medier kan lagres ved 4 °C i opptil 1 uke.
  3. Lav smeltepunkt agarose løsning (3%)
    1. Vei ønsket mengde lavt smeltepunkt agarose pulver og oppløs i et passende volum på 1x HBSS-G i en glassflaske. Omtrent 7 ml agaroseoppløsning per hjerne er nødvendig.
    2. Legg flasken i en mikrobølgeovn i 2-3 min, med hetten løst plassert, og rist hver 10-20 s.
    3. Når pulveret er helt oppløst, plasser flasken i et vannbad eller perlebad satt til 37 °C minst 1 time før eksperimentet for å la agarose avkjøles.
      MERK: Det anbefales å varme opp agarose to ganger over 15 min for å sikre at agarosepulveret er oppløst. Dette er avgjørende for riktig vedheft av agarose til hjernevev. Et termometer bør brukes til å måle temperaturen på agaroseoppløsningen mens du legger inn hjerner, og sørg for at den er mellom 37-40 °C. Hjerner fra forskjellige eldre dyr har forskjellig stivhet. Det anbefales å teste en rekke agarosekonsentrasjoner for å finne homogeni mellom vev og agarose.
    4. Forbered fosfatbufret saltvann med 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
    5. Forbered fosfatbufret saltvann med 0,2% natriumazid (PBS-NaN3).
      MERK: Løsninger beskrevet i trinn 2.4-2.5 skal brukes i det senere immunhiistokjemitrinnet.

3. Forberedelse av operasjonsstasjonen

  1. Rengjør operasjonsstasjonen med 70% -96% etanol og plasser operasjonsunderlaget på stasjonsoverflaten.
  2. Steriliser operasjonsinstrumentene ved å skylle med 70% -96% etanol, etterfulgt av tørr sterilisering i en varm perlesterilisator.
  3. Rengjør pinsettelektroder (se Materialtabell) med 70%-96% etanol før du kobler til pulsgeneratoren.
  4. Sett inn en DNA/Fast Green-fylt glasskapillær i kapillærholderen. Umiddelbart før bruk, bryt forsiktig av kapillærspissen ved hjelp av fin saks og testløsningsstrøm inne i et 1,5 ml mikrosenterrør fylt med forvarmet saltvann eller vann.
    MERK: Figur 2A,B viser oppsett av operasjonsstasjon og verktøy som brukes til eks-utero-elektroporasjon (EUE) og i utero-elektroporasjon (IUE).
  5. For IUE, oppvarming saltløsning til 37 °C i et vannbad.

4. Embryoutvinning

  1. Plasser gravid mus i anestesi induser kammer med 5% isofluran til musen er dypt bedøvet. Bekreft anestesi ved fravær av pedaluttaksrefleks.
  2. Overfør musen til et operasjonsunderlag og oppretthold isofluran ved 1,5%-2% gjennom en nesekegle.
  3. Påfør salve på begge øynene for å forhindre hornhinnetørking.
  4. Barber musens underliv, og bruk deretter 70% -96% etanol-gjennomvåt gasbind for å fjerne barbert hår. Rengjør området med betadin.
  5. Ved hjelp av steril liten kirurgisk saks, gjør en 2 cm hud snitt langs abdominal midline, etterfulgt av en 1,5 cm muskel snitt.
    MERK: Snittstørrelsen avhenger av embryostørrelsen. Faktisk vil større embryoer kreve et større snitt for å imøtekomme utvinningen.
  6. Klipp et hull i midten av gasbindet tilstrekkelig bredt til å passe hudsnittet (~ 2 cm i diameter), suge det med varm saltvann og plasser det rundt bukåpningen.
  7. Trekk ut begge livmorhornene ved hjelp av en bomullsknopp gjennomvåt i varm saltvann eller bruk tang, forsiktig gripe mellomrommene mellom embryoer for å trekke dem ut. Plasser embryoer på våt gasbind (figur 2C).
    MERK: Selv en liten skade på blodårene og kapillærene rundt livmorhornene vil sannsynligvis føre til kraftig blødning. Unngå derfor direkte håndtering av disse vaskulære områdene til enhver tid.
  8. Klipp opp livmorsekken og fjern hvert embryo (figur 2D).
  9. Avlive hvert embryo umiddelbart etter ekstraksjon via et synkende diagonalt kutt, noe som sikrer fullstendig ryggmargstranseksjon (figur 2E).
  10. Legg embryoene i en 10 cm tallerken som inneholder HBSS-G på is.
    MERK: Halshugging av embryoet unngås for å forhindre DNA/Fast Green-blandingslekkasje fra hjernen og lette enkel embryoposisjonering i holderen (se ex utero-elektroporasjon , trinn 5).
  11. Ofre moren umiddelbart etter utvinning av embryoer ved å utføre cervical dislokasjon.
    MERK: Her er moren euthanized under anestesi for å spare det fra ytterligere smerter etter prosedyren eller lidelse i samsvar med protokollen godkjent av Animal Welfare Act of North Rhein-Westphalia State Environmental Agency (LANUV).

5. Ex utero elektroporasjon (EUE)

  1. Plukk opp et embryo og legg det i holderen.
    MERK: En kuttet 1 ml pipettespiss festet til enden av en celleskraper brukes som embryoholder. Det er viktig å holde armer av embryoer utenfor spissen under prosedyren for å forhindre at de glir inn i spissen (figur 2F-I). Diameteren på pipettespissen er lett justerbar for å imøtekomme embryoer av forskjellige størrelser. Klipp en annen spiss i lengden der spissens diameter samsvarer med embryostørrelsen og bruk den som en adapterinnsats til holderen nevnt ovenfor.
  2. Sett forsiktig DNA /Fast Green-fylt glasskapillær gjennom embryoets skalle inn i lateral ventrikelen og injiser 2-3 μL DNA-plasmidblanding (figur 1A,B; tabell 1) inn i hver ventrikel (figur 2F).
    MERK: Bruk lambdoidale og sagittale suturer som en veiledning for plassering av DNA-injeksjon. De lambdoidale og sagittale suturene er fibrøse ledd som forbinder beinplaten på skallen. Førstnevnte slutter seg til parietalbenet med oksipitalbenet, og sistnevnte slutter seg til de to parietalbenene.
  3. Hold embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette ønsket hjerneområde (60° vinkel i dette tilfellet), med katoden vendt mot området der DNA-overføring er beregnet (figur 2G-H).
  4. Påfør fem pulser ved 30 mV med et intervall på 1 s og en varighet på 50 ms ved hjelp av en firkantet bølgepulsgenerator.
    MERK: Husk at hjerner i EUE opplever et mer effektivt elektrisk felt enn i IUE. Ved en gitt DNA-konsentrasjon resulterer EUE derfor i høyere effektivitet av DNA-overføring enn IUE, og DNA-konsentrasjoner må justeres tilsvarende.
  5. Hvis bilateral elektroporasjon er ønsket, gjenta trinn 5.3-5.4 med katoden og anode speiling den forrige posisjonen for å målrette mot kontralateral cortex.
    MERK: Siden begge ventriklene ble injisert med DNA, ble kortikaler av begge halvkule målrettet.
  6. Legg det elektroporerte embryoet i en 6 cm tallerken som inneholder iskald HBSS-G. Gjenta trinn 5.1-5.6 for alle embryoer som kreves.

6. I utero-elektroporasjon (IUE)

  1. Injiser gravid mus med smertestillende; 50 μL buprenorfin (0,1 mg/kg) (se Materialfortegnelser) subkutant, 20 min før prosedyren.
  2. Utfør trinn 4.1-4.8 fra embryoutvinningsdelen.
    MERK: Unngå å la embryoer bli eksponert unødvendig ved å dekke dem med steril gasbind gjennomvåt i varm saltvann.
  3. Roter embryoet forsiktig inne i livmoren med fingertupper til lammede og sagittale suturer er plassert (figur 2J). Sett forsiktig DNA/Fast Green glasskapillær gjennom livmorveggen og embryoets hodeskalle inn i lateral ventrikelen og injiser 2-3 μL DNA-plasmidblanding (figur 1A,C) i enten en eller begge ventriklene etter ønske (figur 2K-L).
    MERK: Overdreven fingertrykk på livmorhorn kan føre til fostersekkkollaps.
  4. Hold embryoets hode mellom platina pinsettelektroder i riktig vinkel for å målrette ønsket hjerneområde (60° vinkel i dette tilfellet), med katoden vendt mot området der DNA-overføringen er ment. Unngå å klemme livmoren siden det kan føre til sammenbrudd av fostersekken (figur 2M).
  5. Påfør fem pulser på 35 mV med et intervall på 600 ms og en varighet på 50 ms ved hjelp av en firkantet bølgepulsgenerator.
  6. Hvis begge laterale ventriklene ble injisert, gjentar du trinn 6,5-6,6 med katoden og anoden som speiler den forrige posisjonen for å målrette mot den kontralaterale cortexen.
  7. Gjenta trinn 6.3-6.6 for alle embryoer som kreves.
  8. Når alle nødvendige embryoer er elektroporated, bruk en saltvanns-gjennomvåt bomullspinne for å plassere livmorhorn tilbake inne i bukhulen forsiktig.
    MERK: Tilsetningen av saltoppløsningen i bukhulen vil hjelpe livmorhornene til å gli tilbake på plass.
  9. Suturmuskulatur og hud snitt ved hjelp av 5-0 sutur materiale. Bruk suturklemmer til å feste såret og desinfiser sutursåret ved å sprøyte det med betadin (figur 2N-P).
  10. Injiser musen med 200 μL 5% glukose subkutant.
  11. Injiser musen med et antibiotika; 50 μL Enrofloxacin (5 mg/kg) subkutant (se materialtabellen).
  12. Plasser musen tilbake i gjenopprettingsburet og oppretthold varmen ved hjelp av et fjernt infrarødt varmelys eller varmepute i minst 20 minutter etter prosedyren (figur 2Q).
  13. Overvåk musen daglig, og injiser meloksikam etter prosedyren for smertelindring etter institusjonelle og føderale retningslinjer.
  14. Trekk ut embryoer 2 dager etter inngrepet (dvs. E17.5) etter trinn 4.

7. Hjerneutvinning og innebygging i agarose

MERK: Det anbefales å utføre følgende trinn under et disseksjonsmikroskop for bedre presisjon. Å unngå skade på hjernen er avgjørende for at prosedyren skal lykkes.

  1. Sett opp ekstraksjonsverktøy i et sterilt arbeidsområde under en disseksjonshette (figur 3A).
  2. Skill hodet på et embryo fra resten av kroppen ved hjelp av disseksjonssaks.
  3. Fest hodet som vist i figur 3C, og fjern deretter huden og skallen ved å skjære langs midtlinjen, fra bunnen av hodet mot nesen (figur 3D).
  4. Skrell huden og skallen sidelengs, noe som gjør et stort nok gap (~ 1 cm) til at hjernen kan utskilles.
  5. For å fjerne hjernen, sett inn den lukkede spissen av steril disseksjonssaks, fra under den olfaktoriske pæren som beveger seg mot hjernestammen (figur 3E).
  6. Klipp av hjernestammen og trim eventuelle løse biter av meninger rundt hjernen (figur 3F).
    MERK: Løse meninger fører ofte til at skiver forblir festet til agaroseblokken etter kutting, noe som fører til løsrivelse av vev fra agarose under skiveoppsamling.
  7. Gjenta trinn 7.1-7.6 for alle embryoer og hold hjernen på is (ideelt sett ikke lenger enn 30 min) til innebyggingstrinnet.
    MERK: Følgende trinn 7.7.1-7.7.4 viser til hjerneutvinning av E12.5 hjerner.
    1. Isoler toppen av hodet like under øyet, som vist i figur 3G.
    2. Klipp huden og skallen på toppen av hjernestammen, følg den stiplede linjen som vist i figur 3H, uten å fjerne hjernestammen.
    3. Lag et 2 mm hudskallesnitt på baksiden av hodet, som vist i figur 3I (se tegninger for klarhet).
      MERK: Dette snittet gir innledende gripepunkter for å skrelle av lagene av hud og hodeskalle. Vanligvis kommer de av som ett lag. Den typiske snittstørrelsen er 2 mm, som tilsvarer lengden på skjærekanten av den brukte mikrofjærsaksen.
    4. Begynn å skrelle av hudskallelag ved å sikre den ene siden av snittet og trekke den andre forsiktig. Med samme forsiktighet, fullfør ved å skrelle av bunnen av hodet til du frigjør hjernen (figur 3J).
      MERK: Dette må gjøres med stor forsiktighet, og observere at hjernen ikke blir trukket langs vevslagene. Alternative sider for å fjerne vevet som dekker hjernen.
  8. Hell varm agarose (ved 37-40 °C) i en 3 cm tallerken.
  9. Plukk opp hjernen ved hjelp av en perforert skje og fjern overflødig væske ved å dabbe bunnen av skjeen mot tørt vevspapir. Legg hjernen i en agarose tallerken.
    MERK: Det er viktig å fjerne så mye væske fra rundt hjernen som mulig for å gi bedre vedheft av agarose til vevet.
  10. Sett fatet med flytende agarose på is. Bruk en mindre skje, bland agarose i 10 s for jevn kjøling. Manøvrer hjernen til midten av parabolen. Plasser hjernen horisontalt i parabolen med dorsalsiden opp, og sørg for at den er helt dekket med agarose fra alle retninger (figur 3K).
    MERK: Hjernen vil ofte synke til bunnen av parabolen når den er plassert i agarose; løft hjernen ved hjelp av en liten skje til et gap på 1-2 mm under hjernen er etablert.
  11. Gjenta trinn 7.8-7.10 for alle hjerner.
  12. Når agarose har polymerisert, tilsett 500 μL HBSS-G på toppen av agaroseblokken for å forhindre tørking. Dekk deretter parabolen med is.
    MERK: Oppbevar prøven på is i 5 minutter før du seksjonerer for å la hjernetemperaturen nå 4 °C.

8. Organotypisk skivekultur

MERK: Rengjør vibratome og omkringliggende overflater med 70%-96% etanol for å unngå skiveforurensning. Oppsettet av vibratom arbeidsstasjonen (se Materialfortegnelse) er vist i figur 3B.

  1. Fyll vibratombufferbrettet med kald HBSS-G og ytterbrettet med is for å opprettholde HBSS-G-kulden gjennom hele prosedyren.
  2. Tilførsel av HBSS-G kontinuerlig i bufferbrettet med karbogen ved hjelp av en boblende stein.
  3. Bruk et nytt blad, lag et stort kutt (~ 2 x 2 cm) rundt hjernen og fjern en blokk med agarose som inneholder hjernen, med nok omkringliggende agarose til å trimme agarose i en liten rektangelblokk.
    MERK: Dette trinnet gjør det mulig å justere blokkens vinkel slik at hjernens sagittale akse er vinkelrett på vibratomplaten og koronalaksen justeres parallelt med bladet. La det være rundt 5 mm agarose på dorsalsiden av hjernen for enkel håndtering av skivene.
  4. Plasser en liten dråpe hurtigklebende løsemiddelfri superlim midt på prøveholderen og spred til et område som vil dekke bunnen av agaroseblokken.
  5. Løft forsiktig opp agaroseblokken og tørk bunnen ved å dabbe mot vevpapir. Plasser blokken på det limte området av prøveholderen, med rostralsiden av hjernen opp. Sett prøveholderen på is og la limet tørke i 1 min.
  6. Når limet er tørket, plasserer du prøveholderen i bufferbrettet.
  7. Klipp hjernen i koronalskiver i en vinkel på 15°.
    MERK: Tykkelsen på skivene kan variere avhengig av bruksområdet. Her ble hjernen kuttet med en tykkelse på 150 μm. Sett vibratomhastigheten til 1,0-1,5 mm/s for trimming av overflødig agarose på toppen og trimming av olfaktoriske pærer. Reduser skjærehastigheten til 0,5 mm/s for innsamling av kortikale skiver for analyse. De fleste vibratomer kan settes på pause for å samle hver skive. Hvis redusert kvalitet på skiver eller løsrivelse av vev fra agarose oppleves, kan det hjelpe å redusere skjærehastigheten eller erstatte vibratombladet.
  8. Bruk rene spateler, samle hjerneskiver og legg dem på Polytetrafluoreetylenmembran (PTFE), immobilisert i en 35 mm glassbunnet tallerken ved hjelp av parafin (opptil fem hjerneskiver/ membran) (figur 3L-M).
    MERK: Fest PTFE-membranen inne i en 35 mm glassbunnet tallerken med voks. Dette vil stabilisere membranen når du legger til stykkekulturmediene og også under avbildning.
  9. Bruk en 200 μL pipette, fjern overflødig HBSS-G fra rundt skivene på PTFE-membranen, og la skivene være halvtørre.
  10. Tilsett 500 μL skivemedier (forvarmet til 35 °C) direkte i rommet under PTFE-membranen.
    MERK: Det må ikke dannes bobler under membranen når du legger til mediet. Dette vil etterlate hele eller delvise stykker uten medieutveksling. Erstatt 200 μL medier annenhver dag i kultur eller etter hver bildeøkt.
  11. Inkuber skivene ved 35 °C med 5 % CO2.

9. Immunohistokjemi

  1. Fest skiver med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA)-supplert med 4% sukrose-per tallerken. Inkuber på RT i 30 min.
    FORSIKTIG: Når du håndterer PFA, bruk labjakke og hansker. Utfør fikseringstrinn under en kjemisk hette, og kast PFA-avfall på riktig måte.
  2. Vask skivene to ganger med 300 μL PBS i 5 minutter. Overfør skivene til en 24-brønns plate.
    MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette stadiet. Tilsett PBS-NaN3 i skivene og oppbevar ved 4 °C. NaN3 er en giftig forbindelse; Når du håndterer løsninger med den, bruk labjakke og hansker. Trinn 9.3-9.10 skal utføres i en orbital shaker.
  3. Slukk skivene med 300 μL 0,1 M glycin ved 4 °C over natten.
  4. Vask ut glycin med PBS ved RT 3x i 10 min.
  5. Permeabiliser skivene med 300 μL PBS-T ved RT i 2 timer.
  6. Blokker med 10% geitserum i PBS-T ved RT i 2 timer.
  7. Tilsett 300 μL primært antistoff (anti-vimentin antistoff ved en fortynning på 1:200; se Materialtabellen) fortynnet i 10% geitserum i PBS-T-oppløsning ved 4 °C over natten.
    MERK: I trinn 9.8-9.12 var skiver lysbeskyttet for å forhindre tap av fluorescens.
  8. Vask primært antistoff med PBS ved RT 3x i 20 min.
    MERK: PBS ble brukt i stedet for PBS-T for å vaske ut Triton X-100.
  9. Tilsett 300 μL sekundært antistoff (enten Alexa Fluor 488 eller 647 ved en fortynning på 1:400; se Materialtabellen) i PBS ved RT i 2 timer.
    MERK: DAPI tilsetts umiddelbart etter fjerning av sekundært antistoff ved en fortynning på 1:10.000 i 5 min.
  10. Vask det sekundære antistoffet med PBS ved RT 3x i 20 min. Vask med destillert vann 2x i 1 min.
  11. Overfør skivene til en glasssklie med en fin børste, og tørk deretter ved 30 °C i 20 minutter.
  12. Monter skivene med et vandig monteringsmedium. Hold lysbildene på RT over natten slik at monteringsmediene kan kuratere.

10. Imaging oppkjøp

MERK: Uavhengig av DNA-leveringstilnærmingen (IUE eller EUE) ble skiver analysert i samme utviklingsaldersområde (E17,5-E18,5). IUE tillater nevronale forfedre å dele og utvikle seg i to dager in vivo. EUE åpner derimot for sporing av tidlige utviklingshendelser.

  1. Slå på kammerinkubatoren og sett den til 35 °C med 5 % CO2-ideelt 4 timer før avbildning – slik at mikroskopkomponenter kan likevekte ved 35 °C.
  2. For dyp avbildning av skiver, bruk vann-nedsenkning mål for å redusere uoverensstemmelsen i brytningsindeks mellom vevet og målet.
    MERK: Her ble bildemodus med superoppløsning brukt. Avbildning gjennom PTFE-membranen krever et mål med lang arbeidsavstand (~1 mm). Hvis et langt mål for avstand ikke er tilgjengelig, kan skiver overføres til en 8-brønns glassbunnet tallerken. For å overføre skiver, legg til 1 ml skivemedier til toppen av membranen, og bruk deretter en slikkepott til å løfte en skive og overføre den til en brønn som inneholder 200 μL medier. Fjern overflødige medier ved hjelp av en 1 ml pipettespiss som etterlater skivene halvtørre.
  3. For avbildning axon vekst, finn en region av cortex med lav til middels celle tetthet. For bildevekstkjegledynamikk, finn en vekstkegle i cortexens mellomliggende sone eller subventrikulær sone.
  4. Definer en z-stack-størrelse i bildebehandlingsprogramvaren (se Tabell over materialer). For axonvekst i en stor z-stabel, sett en trinnstørrelse på 2 μm. For vekstkjegler i en mindre z-stabel, angi en trinnstørrelse på 1 μm.
    MERK: Ta alltid høyde for potensiell bevegelse av vekstkjeglen og axon gjennom x-, y- og z-flyene. Axoner vokser mye høyere i organotypiske kulturer enn i in vitro-kulturer . Her var en z-stabel på rundt 80 μm til bildeaksonvekst tilstrekkelig. For vekstkjegledynamikk var en z-stabel på ~ 6 μm tilstrekkelig.
  5. For avbildning av axonvekst av nevroner i et større område, definer en flisskanning.
  6. Bruk den laveste laserkraften som er mulig for å minimere sjansene for bleking vekst kjegler under oppkjøpet.
  7. For avbildning axon vekst, skaffe tidsforløp for 2 timer med et intervall på 5 min. For bildevekstkjegledynamikk, skaff deg tidsforløp i 2-5 min med et intervall på 2,5-3 s.

11. Dataanalyse

  1. Mål hastigheten på axonvekst ved hjelp av kymografer
    1. Åpne bildefilen i Fiji14 til Fil > Åpne og velg bildet.
    2. Få maksimal intensitetsprojeksjon av tidsforløpet gjennom Image > Stacks > Z-Projection > Maksimal intensitetsprojeksjon.
    3. Gå gjennom tidsforløpet og finn en voksende axon.
    4. Når du er lokalisert, tegner du en linje gjennom den voksende axonen. Start fra spissen av axonen i den første rammen, og følg axonen gjennom hele tidsforløpet.
    5. Generer en kymografi ved hjelp av plugin KymoResliceWide.
    6. Angi skalaen til kymografien ved å gå til Image > Properties. Angi avstanden i μm i Pikselbredde, og angi klokkeslettet i s eller min i Pikselhøyde.
    7. Gå til Analysere > mål.
      MERK: En vinkel i forhold til x-aksen vil bli gitt.
    8. Beregn hastigheten på axonvekst ved å erstatte vinkelen i følgende ligning: SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) i et regneark.
  2. Mål volumet på vekstkjeglen ved hjelp av en programvare for bildeanalyse (se Materialfortegnelser).
    1. Åpne bildefilen i bildeanalyseprogramvaren gjennom File > Open og velg filen av interesse.
    2. Velg veiviseren Legg til nye overflater .
      MERK: En seksjon nederst til venstre vises med seks trinn for manuell redigering.
    3. I trinn 1 - under Algoritmeinnstillinger - velg Segment Bare et interesseområde. I trinn 2 beskjærer du rammen slik at den passer til hele vekstkjeglen i alle rammer.
    4. Hold terskelverdien til Absolutt intensitet i trinn 3, og sørg for at hele vekstkjegleområdet er terskelsgrenset i trinn 4.
    5. I trinn 5 velger du Antall Voxels lmg = 1 under Filtertype.
      MERK: I det siste trinnet kan det opprettes flere målesett. Her ble bare ett mål opprettet for volum.
    6. Velg Utfør for å utføre alle opprettingstrinnene og avslutte veiviseren for nye overflater.
    7. Velg Bestemte verdier og volum i kategorien Statistikk øverst i veiviservinduet.

Representative Results

Representative resultater oppnådd med den beskrevne metodearbeidsflyten vises. E15,5 mus ble brukt i den nåværende demonstrasjonen, selv om denne protokollen lett kan tilpasses nesten alle embryonale aldre fra E11 til slutten av E17. I denne protokollen, enten ex utero elektroporasjon (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller i utero-elektroporasjon (IUE; Figur 2B,C og 2J-Q) ble brukt til å levere plasmider inn i stamcellene som fôret de laterale ventriklene. Disse forfedrene er kilden til fremtidige kortikale projiserende nevroner (CPN) 15,16. Plasmidblandinger ble forberedt på å drive sparsomt nevronspesifikk uttrykk for enten membran-målrettet (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-forbedret (E)GFP (figur 1B) for å evaluere henholdsvis den generelle oppførselen og aktindynamikken i vekstkjegler. Videre ble en plasmidblanding med sikte på å merke individuelle nevroner med enten turbo(t)-RFP eller zoanthus sp. (Zs) grønt fluorescerende protein (ZsGreen) (figur 1C) inkludert. Dette letter overvåkingen av vekstkjegleadferd fra uavhengige nærliggende nevroner.

Hjerne disseksjon fra elektroporerte embryoer er et avgjørende skritt som må utføres nøye for å oppnå skiver av høy kvalitet, og bevare den opprinnelige hjernestrukturen. Disseksjonsinstrumenter og vibratom ble tilberedt på forhånd og nøye etanolsterilisert (figur 3A,B). Deretter ble hodene til elektroporerte embryoer forsiktig dissekert og hjernene ble ekstrahert. Her vises representativ disseksjon av hjerner fra embryoene utsatt for EUE på E15 (figur 3C-F) og E12.5 (figur 3G-J). Hjernene er umiddelbart innkapslet i en agarosematrise, skiver og plassert på PTFE membraninnlegg i en bunnglassfat for inkubasjon (figur 3K-M).

Helsestatusen til hjerneskiver er et viktig poeng for kontroll for å sikre pålitelige resultater. En visuell inspeksjon for eventuell forurensning ble utført daglig. I tillegg, når kulturen ble ferdigstilt, blir hjerneskivene festet og utsatt for immunhiistokjemi. Her ble 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) brukt til å kontrollere den generelle cellulære organisasjonen og vimentinfargingen for å avsløre glial organisering; spesielt radial glia (RG) stillas. Vanligvis viser vellykket dyrkede hjerneskiver avledet fra enten IUE eller EUE normal cellulær distribusjon som avslørt av DAPI og et noe organisert utvalg av RG med apically-orienterte pial-kontaktende prosesser17 (figur 4A, B henholdsvis). Av og til observeres merkede forstyrrelser i RG-stillaset i dyrkede hjerneskiver, spesielt hos de som er avledet fra EUE-elektroporasjon (figur 4C). Hjerneskiver med ekstremt uorganisert RG stillas viser nedsatt nevronmigrasjon og defekt axonvekst (ikke vist). Derfor er kontroll av RG-stillaset en enkel postkulturmetode for å sortere dataene hentet fra pålitelige hjerneskiver.

Hjerneskiver avledet fra enten IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-uttrykkende plasmidblanding resulterer i lignende sparsom nevronmerking. En representativ pyramidal CPN som uttrykker Lyn-mNeonGreen og den dynamiske oppførselen til vekstkjeglen, vises som et eksempel (figur 5A og tilleggsvideo 1 øverst til venstre). I tillegg ble nevroner merket ved hjelp av en plasmid som uttrykte en aktinsonde for å analysere aktindynamikk av axonal vekstkjegler in situ (figur 5B og supplerende video 1 nederst til venstre). In situ eksperimenter ble også utført med en dual-Cre / Dre fluorophore-uttrykkende plasmid design (figur 1C og supplerende video 1, høyre). tRFP- eller ZsGreen-fluoroforer i denne plasmiden kan aktiveres spesifikt og individuelt av henholdsvis Dre- eller Cre-rekombininaer i nærliggende nevroner (figur 5C). Denne eksperimentelle line-up tillater side-ved-side analyse av vekst kjegler fra kontroll nevroner med nærliggende modifiserte nevroner (et gitt tap eller gevinst av funksjon). Dette omgår variasjoner som oppstår ved bruk av forskjellige skiver for å teste kontroll og eksperimentelle forhold.

Kymografier generert fra den innspilte filmen ble analysert, hvorfra dynamiske vekstparametere som fremspringende aktivitet over tid og vekstlengde lett kan oppnås (figur 6A). Vær oppmerksom på at en enkel justering i tidsoppløsningen til tidsforløpet tillater måling av axonforlengelseshastighet i 2 timer (figur 6A). Videre kan variasjonen av vekstkjeglevolum over tid-et mål på generell vekst kjegle dynamisk aktivitet-lett oppnås, i dette tilfellet med lisensiert programvare (Figur 6B og Figur 6E, F). Dette kan brukes til å evaluere hastigheten på aktin tredemølle og balansen mellom filopodia / lamellipodia under vekstkjegle utforske aktivitet.

Figure 1
Figur 1: Ordninger av plasmidene som brukes i protokollen. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevant informasjon om plasmidkomponenter og fluoroforens opprinnelse finnes i boksene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt av ex utero og i utero-elektroporasjon av E15,5 mus. (A) Oppsett av kirurgistasjon for eks utero-elektroporasjon. (B) Oppsett av kirurgistasjon for i utero-elektroporasjon. (C) Livmorhorn trukket utenfor bukhulen til den bedøvede musen. (D) Utvinning av et embryo fra livmorsekken. (E) Embryooffer ved fullstendig ryggmargstranseksjon via et diagonalt snitt; vær oppmerksom på at halshugging ble unngått. (F) Plassering av embryo i holderen og injisert med DNA/Fast Green-blanding i venstre lateral ventrikel. (G,H) Plasser embryoets hode mellom platina pinsettelektroder med katoden (rød pil) over cortexen i en 60° vinkel. (I) Plassering av embryoets armer (svarte piler) utenfor holderen for å forhindre glidning av embryoet under prosedyren. (J) Rotasjon av embryoet inne i livmorsekken for å eksponere hodet. (K,L) Injeksjon av DNA/Fast Green-blanding i embryoets laterale ventrikler gjennom livmorveggen. (M) Plasser embryoets hode mellom platina pinsettelektroder med en katode (rød pil) over cortexen i en 60° vinkel. (N) Suturert muskel snitt via løping låse sutur. (O) Suturert hudinnsnitt via en avbrutt sutur. (P) Sikring av såret ved hjelp av kirurgiske sårklemmer og desinfeksjon ved hjelp av betadin. (Q) Plassering av musen i gjenopprettingsburet med langt infrarødt varmelys. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ekstraksjon av E15,5 og E12,5 hjerner og organotypisk skivekulturprosedyre. (A) Verktøy som brukes til hjernens ekstraksjonsprosedyre. (B) Oppsett av organotypisk kulturstasjon. (C-F) Ekstraksjon av E15,5 hjerne. (G-J) Ekstraksjon av E12.5 hjerne. Prikkede linjer uthever plasseringen av snitt. Røde piler peker på retningen for å trekke med tang. (K) Legge inn hjernen i en 3 cm tallerken som inneholder 3% lav smelte agarose, slik at en 1-2 mm agarose avstand gap under hjernen. (L) Innsamling av 150 μm hjerneskive. (M) Plassering av hjerneskiver på PTFE membraninnlegg immobilisert i en 35 mm tallerken ved hjelp av parafinfilm (blå pil). Rød stjernemarkering indikerer en gitt hjerneskivesamling fra vibratom (L) og overføringen til PTFE-membranen (M). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Konservert radial glialcellestruktur i sunne organotypiske skiver. Konfokale bilder av E17,5 hjerneskiver som avslører RG-matrise (vimentin, grønn) og generell celleorganisasjon (DAPI, magenta) etter IUE (A) og EUE (B, C). Legg merke til de sterke forstyrrelsene i RG-rekken som av og til kan skyldes EUE (C). Forstørrelser tilsvarer de røde stiplede rammene i hovedfiguren: skalastenger, 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: In situ visualisering av vekstkjegledynamikken i akutte organotypiske skiver. (A,B) Nevroner og deres tilsvarende vekstkjegler merket med henholdsvis Lyn-mNeonGreen og LifeAct-GFP. Rød stjerne markerer vekstkjegle av Lyn-mNeonGreen som uttrykker nevron. Blå stjerne som markerer vekstkjegle av LifeAct-GFP som uttrykker nevron. (C) Nærliggende nevroner merket med det doble plasmidsystemet som inneholder tRFP (magenta) og ZsGreen (grønn) og deres tilsvarende vekstkjegler. Vekstkjegler avbildet (høyre) var utenfor den fangede rammen (venstre), oppnådd kort tid etter å ha oppnådd vekstkjeglen tidsforløp; skalastenger, 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Analyse av axonveksthastighet og vekstkeglevolum. (A) Axon-sporing på en nevron som uttrykker Lyn-mNeonGreen (øverst) og den tilsvarende kymografen (nedenfor) generert ved hjelp av ImageJ. (B) Rekonstruksjon av z-stack video av vekstkjegle ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren (øverst) og den samme vekstkjeglen uthevet ved hjelp av overflatemålingsverktøyet (nedenfor). (C) Grafer som viser endringer i veksthastighet over tid for flere aksoner. (D) Gjennomsnittlig veksthastighet for aksoner kvantifiseres i (C). (E) Graf som viser endringene i vekstkjeglevolumet over tid. (F) Gjennomsnittlig volum av vekstkjegler kvantifiseres i (E); skala bar, 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Radial migrasjon og nevronal polarisering av pyramidale kortikale nevroner. Diagram som illustrerer utvikling av pyramidale kortikale nevroner (rosa) som migrerer radialt fra den germinale ventrikulære sonen (VZ) mot piaoverflaten. Styrt av radiale gliaprosesser (grå), migrerende polariserte nevroner etablerer en ledende prosess, fremtidig dendrit og etterfølgende prosess, fremtidig axon, som fortsetter å strekke seg nedover mot mellomsonen (IZ). Stiplede røde bokser representerer de kortikale områdene der vekstkjegler ble avbildet. Spesielt i IZ, subventricular sone (SVZ), eller sammenføyning axon bunter (grønn). Illustrasjonen ble laget med et nettbasert verktøy, BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Plasmid Konsentrasjon (μg/μL) Tiltenkt bruk
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen 0.25 Merking av membran målrettet protein (Lyn)
+ +
p-Tub-alfa-1-iCre 0.08
p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP 0.125 Filamentøs aktin (F-aktin) merking i vekstkjegler
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen 1 Uavhengig merking av to populasjoner av nærliggende nevroner
+ +
p-Tub-alfa-1-iCre 0.004
+ +
p-Kar-alfa-1-Dre 0.2

Tabell 1: Liste over plasmider som brukes i protokollen. Navn, konsentrasjon og tiltenkt bruk av hver brukte plasmid.

Supplerende video 1: In situ visualisering av vekstkjegledynamikken i akutte organotypiske skiver. Dynamikken i vekstkjegler merket med Lyn-mNeonGreen (øverst til venstre) og LifeAct-GFP (nederst til venstre). Nærliggende vekstkjegler er differensialt merket med det doble plasmidsystemet som inneholder tRFP (magenta, øverst til høyre) og ZsGreen (grønn; nederst til høyre). Bildeintervall, 2,5 s. Skalalinjer, 5 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Hvordan vekstkjeglene sanser og reagerer på omgivelsene for å koordinere samtidig aksonforlengelse og veiledning, er fortsatt et spørsmål om debatt 3,18. Banebrytende studier i 2D-substrater ga et glimt inn i de grunnleggende molekylære mekanismene som genererte kreftene som driver vekstkjegledynamikken under axondannelse, utvekst og navigasjon 2,10,11,12,19. Mer nylig viste studier i 3D-matriser hvor mye innflytelse en tredje dimensjon har i oppførselen til vekstkjeglen og følgelig i axonvekst 8,9. Likevel gjenstår de intrikate mekanismene som instruerer vekstkjegledynamikken in vivo å bli grundig undersøkt.

Forberedelse av organotypiske skivekulturer fra IUE- eller EUE-hjerner er mye brukt og godt dokumentert. Det har blitt en gylden standard som gjør det mulig for forskere å få innsikt i utviklingen og oppførselen til nevroner i det levende hjernevevet20,21. Faktisk har denne teknikken blitt brukt i kombinasjon med ulike høyoppløselige avbildningsteknikker for å visualisere spesifikke molekylære prosesser og morfologiske hendelser in situ. Slike studier inkluderer, men er ikke begrenset til axondannelse og forlengelse19,22, kortikale nevronale migrasjon 19,22,23,24, sentrosomdynamikk 25,26, mikrotubuldynamikk27, samt funksjonell dynamikk i før- og postsynaptiske rom28,29.

Denne protokollen tar for seg et gap i eksperimentell nevrobiologi, visualiserer vekstkjegledynamikken ved å utvikle kortikale nevroner in situ, i ex vivo akutte hjerneskivekulturer, og verktøyene for å analysere de oppnådde dataene.

Akutte hjerneskivekulturer ble brukt til å etablere denne protokollen fordi de (1) med litt praksis er enkle å generere; (2) presentere et tilgjengelig system for å studere vekstkjegler innebygd i et kvasi-fullt fysiologisk miljø, men gjennomsiktig nok til å tillate høyoppløselig levende celleavbildning; (3) kan utvides for bruk med et utall transgene muselinjer; (4) kombinert med enten IUE eller EUE, gir praktisk talt ubegrenset potensial til å levere molekylære verktøy for å evaluere ytelsen til vekstkjegler og aksoner in vivo under tap / gevinst av funksjonsregimer, sammen med fluorescerende reportere og cytoskeleton sonder.

Denne metodikken ble beskrevet i sammenheng med både EUE og IUE. Selv om EUE fortsatt var en svært pålitelig metode, resulterte det i en økt forekomst av hjerneskiver som viste et uorganisert RG-nettverk sammenlignet med de som ble oppnådd med IUE som leveringsmetode (figur 4C). Forstyrrelser i RG-rekken påvirker sterkt nevronmigrasjon og mønsteret av axonforlengelse30,31. Dette er nøkkelparametere som forutsier hvor du finner axoner for analyse på et gitt tidspunkt og hvilken type miljø de navigerer i. Hjerneskiver med et betydelig forstyrret RG-nettverk har vanligvis svekket kortikale nevronstratifisering. Dette produserer i sin tur axoner med kaotiske baner. Derfor anbefales det sterkt å kontrollere for RG-nettverkets strukturelle integritet. Interessant nok korrelerer dårlig strukturell integritet med økt alder av den embryonale hjernen. Faktisk ble slike effekter hos yngre E12.5-E13.5 embryoer vanligvis ikke observert19.

Den nåværende protokollen er grundig og grei. Likevel er det noen få kritiske trinn der spesiell forsiktighet og oppmerksomhet må tas for å oppnå optimale resultater. Disse har blitt uttrykkelig notert i protokollen og inkluderer (1) tuning mengden DNA som brukes i elektroporasjonen for å få sparsommerking; (2) unngå skade under utvinning av hjerner; (3) kontrollere temperaturen på agarose under hjernehus; (4) feilsøke den ideelle prosentandelen av agarose for hjerner i en gitt alder; og (5) utvalg av fluoroforer, hvis erfaring følger. Under protokolloptimalisering ble ytelsen til flere fluoroforer i levende celle in situ avbildning testet. Monomeriske GFP-varianter EGFP og NeonGreen for fremstilling av LifeAct- og Lyn-merkede plasmider ble valgt for denne protokollen (figur 5A,B). I tillegg ble RFP-varianten mScarlet testet og funnet svært egnet for dette oppsettet (data ikke vist). Multimerisk tRFP (dimer) og ZsGreen (tetramer) (figur 5C og tilleggsvideo 1, høyre) ble også testet. Disse raskt sammenleggbare super-lyse fluoroforene anbefales når metoden krever rask fluorescerende signalgenerering etter DNA-levering.

En vanlig praksis med å bruke skivekulturer er å bruke skiver fra forskjellige hjerner for å teste kontroll og eksperimentelle forhold. Dette representerer en iboende kilde til uønsket variasjon. Her ble det brukt et uttrykkssystem som muliggjør uavhengig modifikasjon av nærliggende nevroner og reporteres uttrykk for identifikasjon. Merk at i denne demonstrasjonen (figur 5C) var det ingen forskjeller mellom nevroner som uttrykte noen av fluoroforene. Men som et eksempel vil en slik plasmidblanding kombinert med en transgen muselinje som skjuler et Cre-sensitivt gen, merke med tRFP (Dre-sensitive) nevroner som forble som vill type. I kontrast vil ZsGreen (også Cre-sensitive) merke de rekombinerte nevronene. Derfor kan vekstkjegler av de to forskjellige genotypene, og sannsynligvis også fenotyper, studeres side om side samtidig i samme hjerneskive.

Lokalisering av aksoner og vekstkjegler for analyse er et viktig hensyn. Kortikale nevroner polariserer mens de radialt migrerer fra ventrikkelsonen (VZ) mot kortikale platen (CP). I løpet av denne prosessen danner nevroner en ledende prosess (en fremtidig dendrit) og en etterfølgende prosess som vil bli axon, og til slutt bli med banebrytende axoner i mellomsonen (IZ), etablere aksonkanaler32. Derfor, for å fange axonal vekst kjegler, ble avbildning gjort på axonale fibre i IZ, inkludert axoner som forlater CP og tidlig genererte aksoner som allerede er forbundet med axonale bunter; eller til slutt, i fibre som krysser IZ og strekker seg under den (figur 7).

Denne protokollen gjør det mulig å utføre superoppløsningsavbildning av nevroner i organotypiske skiver. Historisk sett var lysspredning et betydelig problem som oppstod ved avbildning av tykke prøver. I løpet av de siste to tiårene har omfattende fremskritt innen optisk teknologi gjort avbildning av tykke prøver mulig. Her ble et langt mål for arbeidsavstand brukt til å visualisere mindre strukturer bedre, for eksempel vekstkjegler. Uunngåelig fanger ikke denne protokollen opp mer detaljerte hendelser som retrograd actin flow eller mikrotubuldynamikk. Langdistansemålet, som krever en lavere numerisk blenderåpning (NA), bevarer informasjon fra tykke skiver. Det var imidlertid også mulig å tilpasse denne protokollen til bruk med mål om kortere arbeidsavstand. Dette krevde en jevn overføring av skiver til en glassbunnet tallerken for å bevare strukturell integritet. Bruk av denne metoden resulterte imidlertid i kortere overlevelse - ~ 15 h - på grunn av tap av gassutveksling (data ikke vist). I motsetning til 2D-kulturer opptar vekstkjegler i 3D et større volum og krever bevegelsesartefaktkompensasjon i z-aksen. For å øke muligheten til å bildevise detaljerte hendelser, må moderne konfektteknologi benyttes. Derfor anbefales det å bruke en hurtigskanning z-stack motor, for eksempel z-Galvo tilgjengelig på svært følsomme konfokale mikroskoper33.

Vær oppmerksom på at denne protokollen presenterer tre hovedbegrensninger. For det første er det ofte utfordrende å kontrollere nivåer av uttrykk / antall uttrykkende celler av en gitt plasmid in vivo. Dette introduserer variasjon mellom alle skiver selv når du opprettholder samme plasmidkonsentrasjon. Derfor må valget av reguleringselementene i uttrykksvektorene som brukes, forhåndsbestemmes med forsiktighet. For det andre er det for øyeblikket ikke mulig å forestille seg detaljerte hendelser ved hjelp av membraninnlegg. Denne andre begrensningen kan overvinnes med de metodologiske oppdateringene som ble foreslått i forrige avsnitt. Til slutt er vekstkjegler svært lysfølsomme og kan raskt bli fotobleached. Derfor kan hyppig avbildning av vekstkjegler, i så lite som 5 minutter ved hjelp av laserskanningsmikroskoper ofte kollapse vekstkjeglene. I denne forbindelse kan ny fremgang i lysarkmikroskopigenererte enheter tilpasses for langsiktig avbildning av hjerneskivene34.

Protokoller av dette som er tenkt å åpne nye forskningsveier, slik at en bedre forståelse av hva som skal til for at en vekstkjegle skal lese og reagere mot et komplekst in vivo-miljø , og enda viktigere, å avdekke mekanikken i dette sofistikerte samspillet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke Maria Eugenia Bernis for å ha fotografert prosedyrene. Vi takker også Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski og Sina Stern for å ha lest og diskutert manuskriptet. Vi er takknemlige for våre fremragende tekniske assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel og Anh-Tuan Pham. Vi anerkjenner den verdifulle støtten til DZNE's lysmikroskopanlegg og dyreanlegg. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) og Wings for Life (til F.B). F.B. er medlem av excellence-klyngen ImmunoSensation2, SFB-ene 1089 og 1158, og er mottaker av Roger De Spoelberch-prisen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin antibody sigma-Aldrich V2258-.2ML Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044
Betadine B. Braun 3864154
Biozym Sieve GP Agarose Biozyme 850080
Braunol, Sprühflasche B. Braun 3864073
Buprenorphine (Temgesic) GEHE Pharma 345928
DAPI sigma-Aldrich D9542
DMZ unevirsal electrode puller Zeitz NA
Electric razor Andes NA ProClip UltraEdge Super 2-Speed model
Enrofloxacin (Baytril) Bayer 3543238 2,5% (wt/vol)
Eppendorf microloader pipette tips FischerScientific 10289651
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Dye content ≥ 85 %
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10500064
Fiji 2.1.0 NIH NA https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09 ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD5040-100
Fluoromount Aqueous Mounting Medium sigma-Aldrich F4680-25ML
Glucose MedPex 3705391 5%
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Glycine Sigma-Aldrich G8898
HBSS Life Technologies 14025092 calcium, magnesium, no phenol red
Horse serum Pan-Biotech P30-0711
Imaris 9.7.2 Bitplane NA https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
Isoflurane Virbac NA
Isotonic saline solution B. Braun 8609261 0.90%
Leica VT1200 S vibratome Leica 14048142066
LSM 880 with Airyscan Zeiss NA
Metacam Venusberg Apotheke 8890217 5 mg/ml
Mice Janvier Labs NA C57BL/6JRj
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210  16.16.27
Microsoft Excel Microsoft NA https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture Insert EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm
Moria Perforated Spoons Fine Science Tools 10370-18
Moria Spoon Fine Science Tools 10321-08
Neurobasal Medium, minus phenol red ThermoFisher Scientific 12348017
Neuropan-2 supplement Pan-Biotech P07-11010
Normal goat serum Abcam ab138478
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors Fine Science Tools 12002-12
p-Tub-alpha-1-Dre Addgene 133925
p-Tub-alpha-1-iCre Addgene 133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP Addgene 175437
Parafilm VWR 52858-000
Paraformaldehyde sigma-Aldrich P6148
PBS Sigma-Aldrich P3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen Addgene 175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen Addgene 175257
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
PicoNozzle Kit v2 World Precision Instruments 5430-ALL
Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0487 1 mm / 3 mm
QIAGEN Maxi kit QIAGEN 12162
Reflex wound closure Clip World Precision Instruments 500344-10 7 mm
Sekundenkleber Pattex Mini Trio Lyreco 4722659
Square wave electroporation system ECM830 Harvard Apparatus W3 45-0052
Sterile gauze Braun Askina 9031216
Sterile lubricant eye ointment Bayer Vital PZN1578675
Sterile surgical gloves Sempermed 14C0451
Sucrose Roth 4621.2
Supramid 5-0 surgical silk sutures B. Braun NA
Thin-wall glass capillaries World Precision Instruments TW100-4
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-03
µ-Slide 8 Well Glass Bottom Ibidi 80827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
  2. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  3. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
  4. Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
  5. Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
  6. Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
  7. Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
  8. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  9. Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).
  10. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
  11. Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
  12. Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
  13. Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).
  18. Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
  19. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
  20. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  21. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  22. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  23. Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
  24. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
  25. de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
  26. Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
  27. Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
  28. Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).
  29. Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
  30. Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
  31. Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).
  32. Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
  33. Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ (2021).
  34. ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html (2021).

Tags

Nevrovitenskap utgave 176
<em>In situ</em> Visualisering av Axon vekst og vekst kjegledynamikk i <em>akutte Ex Vivo</em> embryonale hjerneskivekulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S.… More

Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S. In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures. J. Vis. Exp. (176), e63068, doi:10.3791/63068 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter