Detta protokoll visar en enkel och robust metod för att studera in situ axontillväxt och tillväxtkondynamik. Den beskriver hur man förbereder ex vivo fysiologiskt relevanta akuta hjärnskivor och ger en användarvänlig analyspipeline.
Under neuronal utveckling navigerar axoner i den kortikala miljön för att nå sina slutdestinationer och upprätta synaptiska anslutningar. Tillväxtkottar – de sensoriska strukturerna som ligger vid de distala spetsarna för att utveckla axoner – utför denna process. Att studera strukturen och dynamiken i tillväxtkonen är avgörande för att förstå axonal utveckling och interaktionerna med det omgivande centrala nervsystemet (CNS) som gör det möjligt att bilda neurala kretsar. Detta är viktigt när man utformar metoder för att återintegrera axoner i neurala kretsar efter skada i grundforskning och prekliniska sammanhang. Hittills är den allmänna förståelsen av tillväxtkondynamik främst grundad på studier av neuroner odlade i två dimensioner (2D). Även om det utan tvekan är grundläggande för den nuvarande kunskapen om tillväxtkonstrukturell dynamik och svar på stimuli, ger 2D-studier en felaktig bild av den fysiologiska tredimensionella (3D) miljön som neuronala tillväxtkottar möter i intakt CNS-vävnad. På senare tid användes kollagengeler för att övervinna några av dessa begränsningar, vilket möjliggjorde undersökning av neuronal utveckling i 3D. Både syntetiska 2D- och 3D-miljöer saknar emellertid signalsignaler i CNS-vävnad, vilket styr förlängningen och vägvisningen av utvecklande axoner. Detta protokoll ger en metod för att studera axoner och tillväxtkottar med hjälp av organotypiska hjärnskivor, där utvecklande axoner möter fysiologiskt relevanta fysiska och kemiska signaler. Genom att kombinera finjusterad in utero och ex utero elektroporation för att sparsamt leverera fluorescerande reportrar tillsammans med superupplösningsmikroskopi, presenterar detta protokoll en metodologisk pipeline för visualisering av axon- och tillväxtkondynamik in situ. Dessutom ingår en detaljerad verktygslåda beskrivning av analysen av långsiktiga och levande cellavbildningsdata.
Neuroner är mycket polariserade celler som representerar den grundläggande beräkningsenheten i nervsystemet. De tar emot och avger information som bygger på uppdelning av ingångs- och utgångsplatser: dendriter respektive axoner1. Under utvecklingen sträcker sig axoner samtidigt som de navigerar i en otroligt komplex miljö för att nå sin destination. Axonnavigering styrs av tillväxtkonen, en sensorisk struktur belägen vid spetsen av den utvecklande axonen. Tillväxtkonen är ansvarig för att detektera miljösignaler och översätta dem till den dynamiska rumsliga omorganisationen av dess cytoskelett 2,3. De resulterande morfomekaniska reaktionerna instruerar tillväxtkonen att förlänga eller dra sig tillbaka från utlösningssignalen, vilket leder till specifika axonmanövrar.
Den nuvarande förståelsen av axonförlängning och tillväxtkondynamik härrör från studier som utvärderar axontillväxt över tvådimensionella (2D) substrat 2,4,5,6,7. Dessa banbrytande studier identifierade sofistikerat samspel mellan tillväxtkottar och tillväxtsubstrat och avslöjade slående skillnader beroende på substrategenskaper som vidhäftning och styvhet 8,9. Ledda av dessa insikter antogs extracellulära miljösignaler diktera axontillväxt, med tillväxtkoncytoskelettet som utförde denna tillväxt 2,10,11,12. I synnerhet kan neuroner förlänga axoner i icke-vidhäftande substrat (t.ex. polylysin, polyornitin)13. Dessutom kan substratstyvhet påverka axontillväxthastigheten oberoende av celllimkomplex8. Därför kan studier av tillväxtkondynamik i 2D-substrat ensamma inte exakt modellera kraftbalansen som uppstår genom interaktionen mellan axonala tillväxtkottar med fysiologiskt relevanta tredimensionella (3D) miljöer, såsom de som finns i vivo.
För att övervinna begränsningarna i 2D-analyserna har axontillväxt och tillväxtkondynamik studerats i 3D-matriser 8,9. Dessa matriser utgör mer fysiologiskt sammanhang men tillåter ändå att studera cell-inneboende mekanismer för axontillväxt. Det möjliggör tillväxtkonundersökning på ett encelligt sätt under olika förhållanden och farmakologiska behandlingar9. I sådana 3D-miljöer visade axoner distinkt cytoskelettdynamik och växte snabbare än de som observerades i 2D-odlade neuroner9. Dessa eleganta studier visade påverkan av en extra dimension på omorganisationen av tillväxtkoncytoskelettet och följaktligen på dess beteende.
Trots uppenbara fördelar som presenteras av 3D-matriser över 2D-ytor för att stödja infödd neuronal utveckling och axontillväxt, förblir de en förenklad syntetisk ställning som inte kan återspegla komplexiteten i dynamiken som observerats i centrala nervsystemet (CNS) vävnad. Här kombinerades leverans av reporterplasmider av ex utero och in utero elektroporation med hjärnorganotypisk skivkultur och in situ live superupplösningsavbildning för att analysera tillväxtkondynamiken inom ett fysiologiskt sammanhang. Denna metod möjliggör visualisering av utvecklande axoner samtidigt som man upplever 3-dimensionaliteten hos in vivo-miljöer och komplexiteten i dess fysikalisk-kemiska sammansättning. Slutligen beskrivs användarvänliga förfaranden för att mäta axontillväxt och tillväxtkondynamik med hjälp av allmänt licensierad och allmänt tillgänglig programvara.
Hur tillväxtkonerna känner av och reagerar på sin omgivande miljö för att samordna samtidig axonförlängning och vägledning är fortfarande en fråga om debatt 3,18. Banbrytande studier i 2D-substrat gav en inblick i de grundläggande molekylära mekanismerna som genererar de krafter som driver tillväxtkondynamik under axonbildning, utväxt och navigering 2,10,11,12,19. Mer nyligen avslöjade studier i 3D-matriser hur mycket inflytande en tredje dimension har i tillväxtkonens beteende och följaktligen i axontillväxt 8,9. Ändå återstår de invecklade mekanismerna som instruerar tillväxtkondynamik in vivo att undersökas grundligt.
Beredning av organotypiska skivkulturer från IUE- eller EUE-hjärnor används allmänt och är väldokumenterad. Det har blivit en gyllene standard som gör det möjligt för forskare att få insikt i utvecklingen och beteendet hos neuroner i den levande hjärnvävnaden20,21. Faktum är att denna teknik framgångsrikt har använts i kombination med olika högupplösta bildtekniker för att visualisera specifika molekylära processer och morfologiska händelser på plats. Sådana studier inkluderar, men är inte begränsade till axonbildning och förlängning 19,22, kortikal neuronal migration 19,22,23,24, centrosomdynamik25,26, mikrotubulidynamik27, samt den funktionella dynamiken i pre- och postsynaptiska fack 28,29.
Detta protokoll adresserar ett gap i experimentell neurobiologi, visualiserar tillväxtkondynamiken för att utveckla kortikala neuroner in situ, i ex vivo akuta hjärnskivkulturer och verktygen för att analysera de erhållna data.
Akuta hjärnsnittskulturer användes för att upprätta detta protokoll eftersom de (1) med viss övning är lätta att generera; (2) presentera ett tillgängligt system för att studera tillväxtkoner inbäddade i en kvasi-helt fysiologisk miljö, men ändå tillräckligt transparent för att möjliggöra högupplöst live-cellavbildning; (3) kan utökas för dess användning med en myriad av transgena muslinjer; (4) i kombination med antingen IUE eller EUE, ge praktiskt taget obegränsad potential att leverera molekylära verktyg för att utvärdera prestandan hos tillväxtkottar och axoner in vivo under förlust/förstärkning av funktionsregimer, tillsammans med fluorescerande rapportörer och cytoskelettsonder.
Denna metod beskrevs i samband med både EUE och IUE. Även om det fortfarande är en mycket tillförlitlig metod resulterade EUE i en ökad förekomst av hjärnskivor som visade ett oorganiserat RG-nätverk jämfört med de som erhölls med IUE som leveransmetod (Figur 4C). Störningar i RG-matrisen påverkar starkt neuronal migration och mönstret för axonförlängning30,31. Det här är viktiga parametrar som förutsäger var man kan hitta axoner för analys vid en viss tidpunkt och vilken typ av miljö de navigerar. Hjärnskivor med ett signifikant stört RG-nätverk har vanligtvis nedsatt kortikal neuronstratifiering. Detta producerar i sin tur axoner med kaotiska banor. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera för RG-nätverkets strukturella integritet. Intressant nog korrelerar dålig strukturell integritet med ökad ålder hos den embryonala hjärnan. Faktum är att sådana effekter hos yngre E12.5-E13.5-embryon vanligtvis inte observerades19.
Det nuvarande protokollet är grundligt och enkelt. Ändå finns det några kritiska steg där särskild försiktighet och uppmärksamhet måste vidtas för att uppnå optimala resultat. Dessa har uttryckligen noterats i protokollet och inkluderar (1) inställning av mängden DNA som används i elektroporationen för att få gles märkning; (2) undvika skador vid extraktion av hjärnor; (3) kontroll av agarosens temperatur under hjärnhöljet; (4) felsökning av den ideala procentandelen agaros för hjärnor i en viss ålder; och (5) urval av fluoroforer, vars erfarenhet följer. Under protokolloptimering testades prestandan hos flera fluoroforer i live-cell in situ-avbildning. Monomera GFP-varianter EGFP och NeonGreen för beredning av LifeAct- och Lyn-märkta plasmider valdes för detta protokoll (figur 5A,B). Dessutom testades RFP-varianten mScarlet och befanns vara mycket lämplig för denna uppsättning (data visas inte). Multimeric tRFP (dimer) och ZsGreen (tetramer) (Figur 5C och Supplementary Video 1, till höger) testades också. Dessa snabbvikande superljusa fluoroforer rekommenderas när metoden kräver snabb fluorescerande signalgenerering efter DNA-leverans.
En vanlig praxis vid användning av skivkulturer är att använda skivor från olika hjärnor för att testa kontroll och experimentella förhållanden. Detta representerar en inneboende källa till oönskad variation. Här användes ett uttryckssystem som möjliggör oberoende modifiering av närliggande nervceller och reportrars uttryck för identifiering. Observera att i denna demonstration (figur 5C) fanns det inga skillnader mellan neuroner som uttryckte någon av fluoroforerna. Men som ett exempel kommer en sådan plasmidblandning i kombination med en transgen muslinje som rymmer en Cre-känslig gen att märka med tRFP (Dre-känsliga) neuroner som förblev som vild typ. Däremot kommer ZsGreen (även Cre-känslig) att märka de rekombinerade neuronerna. Därför kan tillväxtkottar av de två olika genotyperna, och sannolikt även fenotyper, studeras sida vid sida samtidigt i samma hjärnskiva.
Lokalisering av axoner och tillväxtkottar för analys är ett viktigt övervägande. Kortikala neuroner polariseras medan de radiellt migrerar från den ventrikulära zonen (VZ) mot kortikala plattan (CP). Under denna process bildar neuroner en ledande process (en framtida dendrit) och en efterföljande process som kommer att bli axonen, så småningom ansluta sig till banbrytande axoner i mellanzonen (IZ) och etablera axonkanaler32. För att fånga axonala tillväxtkottar gjordes därför avbildning på axonala fibrer i IZ, inklusive axoner som lämnar CP och tidigt genererade axoner som redan är associerade med axonbuntar; eller så småningom, i fibrer som tvärs över IZ och sträcker sig under den (Figur 7).
Detta protokoll gör det möjligt att utföra superupplösningsavbildning av neuroner inom organotypiska skivor. Historiskt sett var ljusspridning ett betydande problem vid avbildning av tjocka exemplar. Under de senaste två decennierna har omfattande framsteg inom optisk teknik gjort avbildning av tjocka exemplar möjlig. Här användes ett långdistansmål för att visualisera mindre strukturer bättre, till exempel tillväxtkoner. Oundvikligen fångar detta protokoll inte mer detaljerade händelser som retrograd aktinflöde eller mikrotubuli dynamik. Målet för långt arbetsavstånd, som kräver en lägre numerisk bländare (NA), bevarar information från tjocka skivor. Det var emellertid också möjligt att anpassa detta protokoll till användning med mål om kortare arbetsavstånd. Detta krävde en smidig överföring av skivor till en glasbottnad skål för att bevara strukturell integritet. Användning av denna metod resulterade emellertid i kortare överlevnad – ~ 15 h – på grund av förlust av gasutbyte (data visas inte). Till skillnad från 2D-kulturer upptar tillväxtkottar i 3D en större volym och kräver rörelseartefaktkompensation i z-axeln. För att öka möjligheten att avbilda detaljerade händelser måste modern konfokalteknik utnyttjas. Därför rekommenderas att du använder en snabbskanningsmotor med z-stack, till exempel z-Galvo som finns på mycket känsliga konfokalmikroskop33.
Observera att detta protokoll presenterar tre huvudbegränsningar. För det första är det ofta utmanande att kontrollera nivåer av uttryck / antal uttryckande celler av en given plasmid in vivo. Detta introducerar variation mellan alla skivor även när samma plasmidkoncentration bibehålls. Därför måste valet av regleringselementen i de använda uttrycksvektorerna vara förutbestämt med försiktighet. För det andra är det för närvarande inte möjligt att avbilda detaljerade händelser med membraninsatser. Denna andra begränsning kan övervinnas med de metoduppdateringar som föreslås i föregående stycke. Slutligen är tillväxtkottar mycket ljuskänsliga och kan snabbt bli fotoblekta. Därför kan frekvent avbildning av tillväxtkottarna, i så lite som 5 minuter med laserskanningsmikroskop, ofta kollapsa tillväxtkottarna. I detta avseende kan nya framsteg inom ljusarkmikroskopigenererade enheter anpassas för långsiktig avbildning av hjärnskivorna34.
Protokoll av detta liknande är tänkta att öppna nya forskningsvägar, vilket möjliggör en bättre förståelse för vad som krävs för att en tillväxtkon ska läsa och reagera mot en komplex in vivo-miljö , och ännu viktigare, att riva upp mekaniken i detta sofistikerade samspel.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Maria Eugenia Bernis för att hon fotograferade procedurerna. Vi tackar också Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski och Sina Stern för att ha läst och diskuterat manuskriptet. Vi är tacksamma för våra enastående tekniska assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel och Anh-Tuan Pham. Vi erkänner det värdefulla stödet från DZNE: s ljusmikroskopanläggning och djuranläggning. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) och Wings for Life (till F.B). F.B. är medlem i excellensklustret ImmunoSensation2, SBB 1089 och 1158, och är mottagare av Roger De Spoelberch-priset.
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Betadine | B. Braun | 3864154 | |
Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
Isoflurane | Virbac | NA | |
Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
Sucrose | Roth | 4621.2 | |
Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |