Summary
Detta protokoll visar en enkel och robust metod för att studera in situ axontillväxt och tillväxtkondynamik. Den beskriver hur man förbereder ex vivo fysiologiskt relevanta akuta hjärnskivor och ger en användarvänlig analyspipeline.
Abstract
Under neuronal utveckling navigerar axoner i den kortikala miljön för att nå sina slutdestinationer och upprätta synaptiska anslutningar. Tillväxtkottar - de sensoriska strukturerna som ligger vid de distala spetsarna för att utveckla axoner - utför denna process. Att studera strukturen och dynamiken i tillväxtkonen är avgörande för att förstå axonal utveckling och interaktionerna med det omgivande centrala nervsystemet (CNS) som gör det möjligt att bilda neurala kretsar. Detta är viktigt när man utformar metoder för att återintegrera axoner i neurala kretsar efter skada i grundforskning och prekliniska sammanhang. Hittills är den allmänna förståelsen av tillväxtkondynamik främst grundad på studier av neuroner odlade i två dimensioner (2D). Även om det utan tvekan är grundläggande för den nuvarande kunskapen om tillväxtkonstrukturell dynamik och svar på stimuli, ger 2D-studier en felaktig bild av den fysiologiska tredimensionella (3D) miljön som neuronala tillväxtkottar möter i intakt CNS-vävnad. På senare tid användes kollagengeler för att övervinna några av dessa begränsningar, vilket möjliggjorde undersökning av neuronal utveckling i 3D. Både syntetiska 2D- och 3D-miljöer saknar emellertid signalsignaler i CNS-vävnad, vilket styr förlängningen och vägvisningen av utvecklande axoner. Detta protokoll ger en metod för att studera axoner och tillväxtkottar med hjälp av organotypiska hjärnskivor, där utvecklande axoner möter fysiologiskt relevanta fysiska och kemiska signaler. Genom att kombinera finjusterad in utero och ex utero elektroporation för att sparsamt leverera fluorescerande reportrar tillsammans med superupplösningsmikroskopi, presenterar detta protokoll en metodologisk pipeline för visualisering av axon- och tillväxtkondynamik in situ. Dessutom ingår en detaljerad verktygslåda beskrivning av analysen av långsiktiga och levande cellavbildningsdata.
Introduction
Neuroner är mycket polariserade celler som representerar den grundläggande beräkningsenheten i nervsystemet. De tar emot och avger information som bygger på uppdelning av ingångs- och utgångsplatser: dendriter respektive axoner1. Under utvecklingen sträcker sig axoner samtidigt som de navigerar i en otroligt komplex miljö för att nå sin destination. Axonnavigering styrs av tillväxtkonen, en sensorisk struktur belägen vid spetsen av den utvecklande axonen. Tillväxtkonen är ansvarig för att detektera miljösignaler och översätta dem till den dynamiska rumsliga omorganisationen av dess cytoskelett 2,3. De resulterande morfomekaniska reaktionerna instruerar tillväxtkonen att förlänga eller dra sig tillbaka från utlösningssignalen, vilket leder till specifika axonmanövrar.
Den nuvarande förståelsen av axonförlängning och tillväxtkondynamik härrör från studier som utvärderar axontillväxt över tvådimensionella (2D) substrat 2,4,5,6,7. Dessa banbrytande studier identifierade sofistikerat samspel mellan tillväxtkottar och tillväxtsubstrat och avslöjade slående skillnader beroende på substrategenskaper som vidhäftning och styvhet 8,9. Ledda av dessa insikter antogs extracellulära miljösignaler diktera axontillväxt, med tillväxtkoncytoskelettet som utförde denna tillväxt 2,10,11,12. I synnerhet kan neuroner förlänga axoner i icke-vidhäftande substrat (t.ex. polylysin, polyornitin)13. Dessutom kan substratstyvhet påverka axontillväxthastigheten oberoende av celllimkomplex8. Därför kan studier av tillväxtkondynamik i 2D-substrat ensamma inte exakt modellera kraftbalansen som uppstår genom interaktionen mellan axonala tillväxtkottar med fysiologiskt relevanta tredimensionella (3D) miljöer, såsom de som finns i vivo.
För att övervinna begränsningarna i 2D-analyserna har axontillväxt och tillväxtkondynamik studerats i 3D-matriser 8,9. Dessa matriser utgör mer fysiologiskt sammanhang men tillåter ändå att studera cell-inneboende mekanismer för axontillväxt. Det möjliggör tillväxtkonundersökning på ett encelligt sätt under olika förhållanden och farmakologiska behandlingar9. I sådana 3D-miljöer visade axoner distinkt cytoskelettdynamik och växte snabbare än de som observerades i 2D-odlade neuroner9. Dessa eleganta studier visade påverkan av en extra dimension på omorganisationen av tillväxtkoncytoskelettet och följaktligen på dess beteende.
Trots uppenbara fördelar som presenteras av 3D-matriser över 2D-ytor för att stödja infödd neuronal utveckling och axontillväxt, förblir de en förenklad syntetisk ställning som inte kan återspegla komplexiteten i dynamiken som observerats i centrala nervsystemet (CNS) vävnad. Här kombinerades leverans av reporterplasmider av ex utero och in utero elektroporation med hjärnorganotypisk skivkultur och in situ live superupplösningsavbildning för att analysera tillväxtkondynamiken inom ett fysiologiskt sammanhang. Denna metod möjliggör visualisering av utvecklande axoner samtidigt som man upplever 3-dimensionaliteten hos in vivo-miljöer och komplexiteten i dess fysikalisk-kemiska sammansättning. Slutligen beskrivs användarvänliga förfaranden för att mäta axontillväxt och tillväxtkondynamik med hjälp av allmänt licensierad och allmänt tillgänglig programvara.
Protocol
Djurförsök måste överensstämma med relevanta institutionella och federala bestämmelser. Embryonal dag 15.5 och 12.5 (E15.5 och E12.5) gravida kvinnliga C57BL/6JRj-möss användes i detta protokoll. Försöken utfördes i enlighet med djurskyddslagen i Nordren-Westfalens statliga miljöbyrå (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).
1. Beredning av plasmider för injektion
- Isolera DNA med endotoxinfritt Maxiprep-kit enligt tillverkarens protokoll (se Materialtabell).
- Blanda valt DNA i önskad koncentration (tabell 1) och 10% fast grön lösning (se materialtabell) för att visualisera leveransen av DNA-blandning i hjärnventriklar.
OBS: Specifika plasmider användes för gles märkning av kortikala neuroner (figur 1A), trådformiga aktinstrukturer (F-aktin) i tillväxtkonen (figur 1B) och dubbel märkning av tillväxtkottarna inom samma cortex (figur 1C). Alla plasmider (tabell 1) som används i detta protokoll har deponerats i Addgene (se Materialtabell). - Förbered glaskapillärer med en kapillärelektrodavdragare inställd enligt följande program: tryck: 500, värme: 800, drag: 30 och hastighet: 40.
- Ladda 15 μL DNA / Fast Green-blandning i varje glaskapillär med hjälp av mikrolastarpipettspetsar.
OBS: Se till att inga bubblor bildas. - Förvara DNA-fyllda kapillärer i en 10 cm skål med en bit modelleringslera över skålens diameter. Kapillärer kan laddas och förvaras vid 4 °C dagen före experimentet. Försegla kapillärens bakre ände med flexibel film för att förhindra torkning.
2. Framställning av lösningar
- Förbered Hanks buffrade saltlösning kompletterad med glukos (HBSS-G).
- Tillsätt 0,5% av 20% glukoslager till en flaska 1x HBSS. Blanda väl och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor. För embryoextraktion, bubbla HBSS-G-lösning med karbogen (95%O2 och 5% CO2) med bubbling sten strax före embryouppsamling.
- Lösning för skiva media
- Förbered färska skivmedier som innehåller Neurobasal 1x, 5% hästserum, 5% fosterkalvserum, B27-tillägg 1:50, L-glutamintillskott 1:400, penicillin-streptomycin 1:200 och Neuropan-2-tillägg 1:100 (vid pH = 7,3), under sterila förhållanden (se materialtabell).
- Förbered 3 cm diskar med 1 ml skivmedia vardera. Placera i inkubatorn vid 35 ° C med 5% CO2 i minst 1 timme före experimentet för att balansera mediets pH genom gasutbyte.
OBS: Media pH-jämvikt orsakas av försurning av mediet av CO2 från inkubatorn. Skivmedia kan lagras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Agaroslösning med låg smältpunkt (3%)
- Väg önskad mängd agarospulver med låg smältpunkt och lös upp i en lämplig volym av 1x HBSS-G i en glasflaska. Cirka 7 ml agaroslösning per hjärna behövs.
- Placera flaskan i en mikrovågsugn i 2-3 minuter, med locket löst placerat och skaka var 10-20: e sekund.
- När pulvret har lösts upp helt, placera flaskan i ett vattenbad eller pärlbad som är inställt på 37 ° C minst 1 timme före experimentet så att agaros kan svalna.
OBS: Det rekommenderas att värma agarosen två gånger under 15 minuter för att säkerställa att agarospulvret är upplöst. Detta är avgörande för korrekt vidhäftning av agaros till hjärnvävnad. En termometer bör användas för att mäta temperaturen på agaroslösningen medan du bäddar in hjärnor och ser till att den är mellan 37-40 ° C. Hjärnor från olika åldrade djur har olika styvhet. Det rekommenderas att testa en rad agaroskoncentrationer för att hitta homogeni mellan vävnad och agaros. - Förbered fosfatbuffrad saltlösning med 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning med 0,2% natriumazid (PBS-NaN3).
OBS: Lösningar som beskrivs i steg 2.4-2.5 är för användning i det senare immunohistokemisteget.
3. Förberedelse av operationsstationen
- Rengör operationsstationen med 70%-96% etanol och lägg operationsunderlag på stationsytan.
- Sterilisera operationsinstrumenten genom att skölja med 70% -96% etanol, följt av torrsterilisering i en varm pärlsterilisator.
- Rengör platinapincettelektroder (se Materialtabell) med 70% -96% etanol innan du ansluter till pulsgeneratorn.
- För in en DNA/Fast Green-fylld glaskapillär i kapillärhållaren. Omedelbart före användning, bryt försiktigt av kapillärspetsen med fin sax och testlösningsflödet inuti ett 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllt med förvärmd saltlösning eller vatten.
OBS: Figur 2A, B visar kirurgistationsuppsättning och verktyg som används för ex utero elektroporation (EUE) och in utero elektroporation (IUE). - För IUE, uppvärmning av saltlösning till 37 ° C i ett vattenbad.
4. Embryoextraktion
- Placera gravid mus i anestesiinduceringskammaren med 5% isofluran tills musen är djupt sövd. Bekräfta anestesi genom frånvaro av pedaluttagsreflex.
- Överför musen till ett operationsunderlag och behåll isofluran vid 1,5% -2% genom en näskon.
- Applicera salva på båda ögonen för att förhindra torkning av hornhinnan.
- Raka musens buk och använd sedan 70% -96% etanolindränkt gasväv för att ta bort rakat hår. Rengör området med betadin.
- Använd steril liten kirurgisk sax och gör ett 2 cm hudsnitt längs bukens mittlinje, följt av ett 1,5 cm muskelsnitt.
OBS: Snittstorleken beror på embryostorleken. Faktum är att större embryon kommer att kräva ett större snitt för att rymma deras extraktion. - Skär ett hål i mitten av gasbindningen som är tillräckligt bred för att passa hudsnittet (~ 2 cm i diameter), blötlägg det med varm saltlösning och placera det runt buköppningen.
- Dra ut båda livmoderhornen med en bomullsknopp som blötläggs i varm saltlösning eller använd pincett, ta försiktigt tag i utrymmena mellan embryon för att dra ut dem. Placera embryon på våt gasbindning (Figur 2C).
OBS: Även en liten skada på blodkärl och kapillärer runt livmoderhornen kommer sannolikt att leda till riklig blödning. Undvik därför direkt hantering av dessa vaskulariserade områden hela tiden. - Skär upp livmodersäcken och ta bort varje embryo (Figur 2D).
- Avliva varje embryo omedelbart efter extraktion via ett nedåtgående diagonalt snitt, vilket säkerställer fullständig ryggmärgstranssektion (figur 2E).
- Lägg embryona i en 10 cm skål som innehåller HBSS-G på is.
OBS: Halshuggning av embryot undviks för att förhindra DNA/Fast Green-blandningsläckage från hjärnan och underlätta enkel embryopositionering i hållaren (se ex utero elektroporation, steg 5). - Offra moderen omedelbart efter extraktion av embryon genom att utföra cervikal dislokation.
OBS: Här avlivas mamman under anestesi för att skona den från ytterligare smärta eller lidande efter proceduren i enlighet med protokollet som godkänts av Djurskyddslagen i North Rhein-Westphalia State Environmental Agency (LANUV).
5. Ex utero elektroporation (EUE)
- Plocka upp ett embryo och placera det i hållaren.
OBS: En skuren 1 ml pipettspets fäst vid änden av en cellskrapa används som embryohållare. Det är viktigt att hålla embryons armar utanför spetsen under proceduren för att förhindra att de glider in i spetsen (figur 2F-I). Pipettspetsens diameter är lätt justerbar för att rymma embryon av olika storlekar. Klipp en andra spets i längd där spetsens diameter matchar embryostorleken och använd den som en adapterinsats till hållaren som nämns ovan. - För försiktigt in DNA/Fast Grönfylld glaskapillär genom embryots skalle i den laterala ventrikeln och injicera 2-3 μL DNA-plasmidblandning (Figur 1A,B; Tabell 1) i varje kammare (figur 2F).
OBS: Använd lambdoidala och sagittala suturer som en guide för platsen för DNA-injektion. De lambdoidala och sagittala suturerna är fibrösa leder som förbinder skallens benplatta. Den förra förenar parietalbenet med det occipitala benet, och det senare förenar de två parietala benen. - Håll embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på önskat hjärnområde (60 ° vinkel i detta fall), med katoden vänd mot det område där DNA-överföring är avsedd (figur 2G-H).
- Applicera fem pulser vid 30 mV med ett intervall på 1 s och en varaktighet på 50 ms med hjälp av en kvadratvågspulsgenerator.
OBS: Tänk på att hjärnor i EUE upplever ett mer effektivt elektriskt fält än de i IUE. Vid en given DNA-koncentration resulterar EUE därför i högre effektivitet av DNA-överföring än IUE, och DNA-koncentrationer måste justeras i enlighet därmed. - Om bilateral elektroporering önskas, upprepa steg 5.3-5.4 med katoden och anoden som speglar den tidigare positionen för att rikta in sig på den kontralaterala cortexen.
OBS: Eftersom båda ventriklerna injicerades med DNA riktades kortisar på båda halvkloten. - Placera det elektroporated embryot i en 6 cm skål som innehåller iskall HBSS-G. Upprepa steg 5.1-5.6 för alla embryon som krävs.
6. In utero elektroporation (IUE)
- Injicera gravid mus med smärtstillande medel; 50 μL buprenorfin (0,1 mg/kg) (se materialförteckningen) subkutant, 20 min före ingreppet.
- Utför steg 4.1-4.8 från embryoextraktionssektionen.
OBS: Undvik att lämna embryon exponerade i onödan genom att täcka dem med steril gasväv blöt i varm saltlösning. - Rotera försiktigt embryot inuti livmodern med fingertopparna tills lambdoidala och sagittala suturer är belägna (Figur 2J). För försiktigt in DNA/Fast Green-glaskapillär genom livmoderväggen och embryots skalle i den laterala ventrikeln och injicera 2-3 μL DNA-plasmidblandning (figur 1A,C) i antingen en eller båda ventriklarna efter önskemål (Figur 2K-L).
OBS: Överdriven fingertryck på livmoderhorn kan leda till fostersäckkollaps. - Håll embryots huvud mellan platinapincettelektroder i lämplig vinkel för att rikta in sig på önskat hjärnområde (60 ° vinkel i detta fall), med katoden vänd mot det område där DNA-överföringen är avsedd. Undvik att klämma på livmodern eftersom det kan orsaka kollaps av fostersäcken (Figur 2M).
- Applicera fem pulser vid 35 mV med ett intervall på 600 ms och en varaktighet på 50 ms med hjälp av en kvadratvågspulsgenerator.
- Om båda laterala ventriklarna injicerades, upprepa steg 6.5-6.6 med katoden och anoden som speglar den tidigare positionen för att rikta in sig på den kontralaterala cortexen.
- Upprepa steg 6.3-6.6 för alla embryon som krävs.
- När alla nödvändiga embryon har elektroporats, använd en saltlösningsindränkt bomullsknopp för att placera livmoderhorn tillbaka inuti bukhålan försiktigt.
OBS: Tillsatsen av saltlösning i bukhålan hjälper livmoderhornen att glida tillbaka till position. - Suturmuskel- och hudsnitt med 5-0 suturmaterial. Använd suturklämmor för att säkra såret och desinficera sutursåret genom att spruta det med betadin (Figur 2N-P).
- Injicera musen med 200 μL 5% glukos subkutant.
- Injicera musen med ett antibiotikum; 50 μL Enrofloxacin (5 mg/kg) subkutant (se Materialtabell).
- Placera musen tillbaka i återhämtningsburen och behåll värmen med hjälp av ett långt infrarött värmeljus eller värmedyna i minst 20 minuter efter proceduren (figur 2Q).
- Övervaka musen dagligen och injicera meloxicam efter proceduren för smärtlindring enligt institutionella och federala riktlinjer.
- Extrahera embryon 2 dagar efter ingreppet (dvs. E17.5) efter steg 4.
7. Hjärnextraktion och inbäddning i agaros
OBS: Det rekommenderas att utföra följande steg under ett dissektionsmikroskop för bättre precision. Att undvika skador på hjärnan är avgörande för att proceduren ska lyckas.
- Ställ in extraktionsverktyg i ett sterilt arbetsutrymme under en dissektionshuva (figur 3A).
- Separera huvudet på ett embryo från resten av kroppen med hjälp av dissektionssax.
- Fäst huvudet som visas i figur 3C och ta sedan bort huden och skallen genom att skära längs mittlinjen, från huvudets botten mot näsan (figur 3D).
- Skala huden och skallen i sidled, vilket gör ett tillräckligt stort gap (~ 1 cm) för att hjärnan ska skäras ut.
- För att ta bort hjärnan, sätt in den slutna spetsen av steril dissektionssax, med början under luktlampan som rör sig mot hjärnstammen (Figur 3E).
- Klipp av hjärnstammen och trimma eventuella lösa bitar av hjärnhinnor runt hjärnan (Figur 3F).
OBS: Lösa hjärnhinnor orsakar ofta att skivor förblir fästa vid agarosblocket efter skärning, vilket leder till att vävnad lossnar från agarosen under skivuppsamlingen. - Upprepa steg 7.1-7.6 för alla embryon och håll hjärnorna på is (helst inte längre än 30 min) tills inbäddningssteget.
OBS: Följande steg 7.7.1-7.7.4 avser hjärnextraktion av E12.5-hjärnor.- Isolera toppen av huvudet strax under ögat, som visas i figur 3G.
- Skär huden och skallen ovanpå hjärnstammen, följ den streckade linjen som visas i figur 3H, utan att ta bort hjärnstammen.
- Gör ett snitt på 2 mm skalle på baksidan av huvudet, som visas i figur 3I (se ritningar för tydlighet).
OBS: Detta snitt ger initiala grepppunkter för att avlägsna skikten av hud och skalle. Vanligtvis kommer de ut som ett lager. Den typiska snittstorleken är 2 mm, vilket motsvarar längden på skäreggen på den använda mikrofjädersaxen. - Börja skala av hudskalleskikt genom att säkra ena sidan av snittet och dra den andra försiktigt. Med samma omsorg, slutför genom att skala av huvudets botten tills du frigör hjärnan (Figur 3J).
OBS: Detta måste göras med stor försiktighet och observera att hjärnan inte dras längs vävnadsskikten. Alternativa sidor för att ta bort vävnaden som täcker hjärnan.
- Häll varm agaros (vid 37-40 ° C) i en 3 cm skål.
- Plocka upp hjärnan med en perforerad sked och ta bort överflödig vätska genom att dutta botten av skeden mot torrt silkespapper. Placera hjärnan i en agarosrätt.
OBS: Det är viktigt att ta bort så mycket vätska från hela hjärnan som möjligt för att möjliggöra bättre vidhäftning av agaros till vävnaden. - Lägg skålen med flytande agaros på is. Blanda agaros i 10 s med en mindre sked för jämn kylning. Manövrera hjärnan till mitten av skålen. Placera hjärnan horisontellt i skålen med ryggsidan uppåt, så att den är helt täckt med agaros från alla håll (Figur 3K).
OBS: Hjärnor sjunker ofta till botten av skålen när de placeras i agaros; lyft hjärnan med en liten sked tills ett mellanrum på 1-2 mm under hjärnan är etablerat. - Upprepa steg 7.8-7.10 för alla hjärnor.
- När agaros har polymeriserats, tillsätt 500 μL HBSS-G ovanpå agarosblocket för att förhindra torkning. Täck sedan skålen med is.
OBS: Håll provet på is i 5 minuter före sektionering så att hjärntemperaturen kan nå 4 ° C.
8. Organotypisk skivkultur
OBS: Rengör vibratom och omgivande ytor med 70% -96% etanol för att undvika skivkontaminering. Vibratomarbetsstationens uppbyggnad (se materialförteckningen) visas i figur 3B.
- Fyll vibratombuffertbrickan med kall HBSS-G och ytterbrickan med is för att bibehålla HBSS-G-kylan under hela proceduren.
- Leverera kontinuerligt HBSS-G i buffertbrickan med karbogen med hjälp av en bubblande sten.
- Använd ett nytt blad, gör ett stort snitt (~ 2 x 2 cm) runt hjärnan och ta bort ett block av agaros som innehåller hjärnan, med tillräckligt med omgivande agaros för att trimma agarosen i ett litet rektangelblock.
OBS: Detta steg gör det möjligt att justera blockets vinkel så att hjärnans sagittala axel är vinkelrät mot vibratomplattan och koronalaxeln justeras parallellt med bladet. Lämna cirka 5 mm agaros vid hjärnans dorsala sida för enkel hantering av skivorna. - Placera en liten droppe snabbhäftande lösningsmedelsfritt superlim i mitten av provhållaren och sprid till ett område som täcker botten av agarosblocket.
- Plocka försiktigt upp agarosblocket och torka botten genom att dutta mot silkespapper. Placera blocket på det limmade området på provhållaren, med den rostrala sidan av hjärnan uppåt. Lägg provhållaren på is och låt limet torka i 1 min.
- När limet har torkat placerar du provhållaren i buffertbrickan.
- Skär hjärnan i koronala skivor i en vinkel på 15°.
OBS: Skivans tjocklek kan variera beroende på applikation. Här skivades hjärnor med en tjocklek av 150 μm. Ställ in vibratomhastigheten på 1,0-1,5 mm/s för att trimma överflödig agaros ovanpå och trimma luktlökar. Sänk skärhastigheten till 0,5 mm/s för uppsamling av kortikala skivor för analys. De flesta vibratomer kan pausas för att samla varje skiva. Om minskad kvalitet på skivor eller lossning av vävnad från agaros upplevs, kan det hjälpa till att minska skärhastigheten eller byta ut vibratombladet. - Använd rena spatlar, samla hjärnskivor och placera dem på Polytetrafluoretylen (PTFE) membran, immobiliserat i en 35 mm glasbottnad skål med paraffin (upp till fem hjärnskivor / membran) (Figur 3L-M).
OBS: Fixera PTFE-membranet inuti en 35 mm glasbottnad skål med vax. Detta kommer att stabilisera membranet vid tillsats av skivodlingsmediet och även under avbildning. - Använd en 200 μL pipett, ta bort överskott av HBSS-G från runt skivorna på PTFE-membranet och lämna skivorna halvtorra.
- Tillsätt 500 μL skivmedia (förvärmt till 35 °C) direkt i utrymmet under PTFE-membranet.
OBS: Inga bubblor får bildas under membranet när du tillsätter mediet. Detta kommer att lämna hela eller delar av skivor utan medieutbyte. Byt ut 200 μL media varannan dag i kulturen eller efter varje bildbehandling. - Inkubera skivorna vid 35 °C med 5 % CO2.
9. Immunohistokemi
- Fixa skivor med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) - kompletterad med 4% sackaros per maträtt. Inkubera vid RT i 30 min.
VARNING: Använd en labbrock och handskar vid hantering av PFA. Utför fixeringssteg under en kemisk huva och kassera PFA-avfall på lämpligt sätt. - Tvätta skivorna två gånger med 300 μL PBS i 5 min. Överför skivorna till en 24-brunnsplatta.
OBS: Experimentet kan pausas i detta skede. Tillsätt PBS-NaN3 i skivorna och förvara vid 4 °C. NaN3 är en giftig förening; När du hanterar lösningar med den, använd en labbrock och handskar. Steg 9.3-9.10 ska utföras i en orbital shaker. - Släck skivorna med 300 μL 0,1 M glycin vid 4 °C över natten.
- Tvätta glycin med PBS vid RT 3x i 10 min.
- Permeabilisera skivorna med 300 μL PBS-T vid RT i 2 timmar.
- Blockera med 10% getserum i PBS-T vid RT i 2 timmar.
- Tillsätt 300 μL primär antikropp (anti-vimentinantikropp vid en spädning av 1:200; se materialförteckningen) utspädd i 10 % getserum i PBS-T-lösning vid 4 °C över natten.
OBS: I steg 9.8-9.12 var skivorna ljusskyddade för att förhindra förlust av fluorescens. - Tvätta primär antikropp med PBS vid RT 3x i 20 min.
OBS: PBS användes istället för PBS-T för att tvätta ut Triton X-100. - Tillsätt 300 μL sekundär antikropp (antingen Alexa Fluor 488 eller 647 vid en utspädning av 1:400; se materialtabell) i PBS vid RT i 2 timmar.
OBS: DAPI tillsätts omedelbart efter avlägsnande av den sekundära antikroppen vid en utspädning av 1:10 000 i 5 min. - Tvätta den sekundära antikroppen med PBS vid RT 3x i 20 min. Tvätta med destillerat vatten 2x i 1 min.
- Överför skivorna till en glasskiva med en fin borste och torka sedan vid 30 °C i 20 min.
- Montera skivorna med ett vattenhaltigt monteringsmedium. Förvara bilderna på RT över natten så att monteringsmediet kan kurera.
10. Förvärv av bildbehandling
OBS: Oavsett DNA-leveransmetod (IUE eller EUE) analyserades skivor i samma utvecklingsåldersintervall (E17.5-E18.5). IUE tillåter neuronala förfäder att dela och utvecklas i ytterligare två dagar in vivo. EUE, å andra sidan, möjliggör spårning av tidiga utvecklingshändelser.
- Slå på kammarinkubatorn och ställ in den på 35 °C med 5 %CO2 – helst 4 timmar före avbildning – så att mikroskopkomponenterna kan balansera vid 35 °C.
- För djup avbildning av skivor, använd vattennedsänkningsmål för att minska obalansen i brytningsindex mellan vävnaden och målet.
OBS: Här användes superupplösningsbildläge. Avbildning genom PTFE-membranet kräver ett mål med ett långt arbetsavstånd (~ 1 mm). Om ett mål för lång arbetsavstånd inte är tillgängligt kan skivor överföras till en 8-brunns glasbottnad skål. För att överföra skivor, tillsätt 1 ml skivmedia till toppen av membranet och använd sedan en spatel för att lyfta en skiva och överföra den till en brunn som innehåller 200 μL media. Ta bort överflödigt media med en 1 ml pipettspets och lämna skivorna halvtorra. - För avbildning av axontillväxt, lokalisera en region i cortex med låg till medium celldensitet. För avbildning av tillväxtkondynamik, lokalisera en tillväxtkon i cortexens mellanliggande zon eller subventrikulära zon.
- Definiera en z-stackstorlek i bildbehandlingsprogrammet (se Materialtabell). För axontillväxt i en stor z-stack, ställ in en stegstorlek på 2 μm. För tillväxtkottar i en mindre z-stack, ställ in en stegstorlek på 1 μm.
OBS: Redogör alltid för potentiell rörelse av tillväxtkonen och axonen genom x-, y- och z-planen. Axoner växer i mycket högre takt i organotypiska kulturer än i in vitro-kulturer . Här var en z-stack på cirka 80 μm för att avbilda axontillväxt tillräcklig. För tillväxtkondynamik var en z-stack på ~ 6 μm tillräcklig. - För avbildning av axontillväxt av neuroner i ett större område, definiera en kakelskanning.
- Använd lägsta möjliga lasereffekt för att minimera risken för blekning av tillväxtkottar under förvärvet.
- För avbildning av axontillväxt, förvärva tidsfördröjningar i 2 timmar med ett intervall på 5 min. För avbildning av tillväxtkondynamik, skaffa tidsfördröjningar i 2-5 minuter med ett intervall på 2,5-3 s.
11. Analys av data
- Mät hastigheten på axontillväxten med kymografer
- Öppna bildfilen i Fiji14 till File > Open och välj bilden.
- Få maximal intensitetsprojektion av time-lapse genom Image > Stacks > Z-Projection > Maximum Intensity Projection.
- Gå igenom time-lapse och hitta en växande axon.
- När du väl har lokaliserat, rita en linje genom den växande axonen. Börja från axonens spets i den första ramen och följ axonen genom hela tidsfördröjningen.
- Generera en kymograf med plugin-programmet KymoResliceWide.
- Ställ in kymografens skala genom att gå till Bild > Egenskaper. Ställ in avståndet i μm i Pixelbredd och ställ in tiden i s eller min i Pixelhöjd.
- Gå till Analysera > mått.
OBS: En vinkel i förhållande till x-axeln kommer att ges. - Beräkna hastigheten på axontillväxten genom att ersätta vinkeln i följande ekvation: SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) i ett kalkylblad.
- Mät volymen på tillväxtkonen med hjälp av en bildanalysprogramvara (se Materialtabell).
- Öppna bildfilen i bildanalysprogramvaran via File > Open och välj den fil som är av intresse.
- Välj guiden Lägg till nya ytor .
OBS: Ett avsnitt i det nedre vänstra hörnet visas med sex steg för manuell redigering. - I steg 1 – under Algoritminställningar – väljer du Segmentera endast en region av intresse. I steg 2 beskär du ramen så att den passar hela tillväxtkonen i alla ramar.
- Fortsätt att tröskela till absolut intensitet i steg 3 och se till att hela tillväxtkonregionen är tröskel i steg 4.
- I steg 5 väljer du Antal Voxels lmg = 1 under Filtertyp.
OBS: I det sista steget kan flera mätuppsättningar skapas. Här skapades endast en mätning för volym. - Välj knappen Kör för att utföra alla skapandesteg och avsluta guiden Lägg till nya ytor.
- På fliken Statistik överst i guidefönstret väljer du Specifika värden och volym under fliken Detaljerad .
Representative Results
Representativa resultat som erhållits med det beskrivna metodarbetsflödet visas. E15.5-möss användes i den aktuella demonstrationen, även om detta protokoll lätt kan anpassas till praktiskt taget alla embryonala åldrar som sträcker sig från E11 till sen E17. I detta protokoll, antingen ex utero elektroporation (EUE; Figur 2A, 2C-I) eller in utero elektroporation (IUE; Figur 2B, C och 2J-Q) användes för att leverera plasmider i stamcellerna som kantar de laterala ventriklerna. Dessa förfäder är källan till framtida kortikala projicerande neuroner (CPN)15,16. Plasmidblandningar bereddes för att driva glest neuronspecifikt uttryck av antingen membraninriktat (Lyn)-mNeonGreen (figur 1A) eller LifeAct-förstärkt (E)GFP (figur 1B) för att utvärdera det övergripande beteendet respektive aktindynamiken i tillväxtkottar. Vidare inkluderades en plasmidblandning som syftade till att märka enskilda neuroner med antingen turbo (t) -RFP eller zoanthus sp. (Zs) grönt fluorescerande protein (ZsGreen) (Figur 1C). Detta underlättar övervakningen av tillväxtkonbeteende från oberoende närliggande neuroner.
Hjärndissektion från elektroporated embryon är ett viktigt steg som måste utföras noggrant för att få högkvalitativa skivor, vilket bevarar den ursprungliga hjärnstrukturen. Dissektionsinstrument och vibratom framställdes i förväg och noggrant etanosteriliserades (figur 3A,B). Därefter dissekerades huvudet på elektroporated embryon noggrant och hjärnorna extraherades. Här visas representativ dissektion av hjärnor från embryon som utsätts för EUE vid E15 (figur 3C-F) och E12.5 (figur 3G-J). Hjärnor innesluts omedelbart i en agarosmatris, skivas och placeras på PTFE-membraninsatser i en bottenglasskål för inkubation (figur 3K-M).
Hälsotillståndet för hjärnskivor är en viktig punkt för kontroll för att säkerställa tillförlitliga resultat. En visuell inspektion för eventuell kontaminering utfördes dagligen. Dessutom, när kulturen var färdigställd, fixeras hjärnskivorna och utsätts för immunohistokemi. Här,4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) användes för att kontrollera den övergripande cellulära organisationen och vimentinfärgning för att avslöja glial organisation; särskilt radial glia (RG) ställning. Vanligtvis visar framgångsrikt odlade hjärnskivor härledda från antingen IUE eller EUE normal cellulär fördelning som avslöjas av DAPI och en något organiserad uppsättning RG med apiskt orienterade pialkontaktprocesser17 (Figur 4A, B respektive). Ibland observeras markanta störningar i RG-byggnadsställningarna i odlade hjärnskivor, särskilt hos dem som härrör från EUE-elektroporering (figur 4C). Hjärnskivor med extremt oorganiserad RG-ställning visar nedsatt neuronal migration och defekt axontillväxt (visas inte). Därför är kontroll av RG-ställningen en enkel postkulturmetod för att sortera data som erhållits från tillförlitliga hjärnskivor.
Hjärnskivor härledda från antingen IUE eller EUE med Lyn-mNeonGreen-uttryckande plasmidblandning resulterar i liknande gles neuronmärkning. En representativ pyramidal CPN som uttrycker Lyn-mNeonGreen och det dynamiska beteendet hos dess tillväxtkon visas som ett exempel (Figur 5A och kompletterande video 1, uppe till vänster). Dessutom märktes neuroner med hjälp av en plasmid som uttryckte en aktinsond för att analysera aktindynamiken hos axonala tillväxtkottar in situ (Figur 5B och kompletterande video 1, längst ner till vänster). In situ-experiment utfördes också med en dual-Cre / Dre fluorofor-uttryckande plasmiddesign (figur 1C och kompletterande video 1, till höger). tRFP eller ZsGreen fluoroforer i denna plasmid kan specifikt och individuellt aktiveras av antingen Dre respektive Cre recombinases i närliggande neuroner (Figur 5C). Denna experimentella line-up möjliggör sida vid sida analys av tillväxtkottar från kontrollneuroner med närliggande modifierade neuroner (varje given förlust eller vinst av funktion). Detta kringgår variationer som uppstår vid användning av olika skivor för att testa kontroll och experimentella förhållanden.
Kymografer genererade från den inspelade filmen analyserades, från vilka dynamiska tillväxtparametrar som utskjutande aktivitet över tid och tillväxtlängd lätt kan erhållas (Figur 6A). Observera att en enkel justering av tidsfördröjningens tidsmässiga upplösning möjliggör mätning av axonförlängningshastigheten i 2 timmar (figur 6A). Dessutom kan variationen av tillväxtkonvolymen över tiden - ett mått på allmän tillväxtkondynamisk aktivitet - enkelt erhållas, i detta fall med licensierad programvara (figur 6B och figur 6E,F). Detta kan användas för att utvärdera hastigheten på aktin löpband och balansen mellan filopodia / lamellipodia under tillväxt kon utforska aktivitet.
Figur 1: Scheman för de plasmider som används i protokollet. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevant information om plasmidkomponenter och fluoroforens ursprung finns i lådorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Arbetsflöde för ex utero och in utero elektroporation av E15.5 möss. (A) Inrätta en kirurgisk station för ex utero elektroporering. (B) Inrätta en kirurgisk station för in utero elektroporering. (C) Livmoderhorn dras utanför bukhålan hos den sövda musen. D) Extraktion av ett embryo ur livmodersäcken. E) Embryooffer genom fullständig ryggmärgstranssektion via ett diagonalt snitt. Observera att halshuggning undvikits. F) Placering av embryo i hållaren och injicerad med DNA/Fast Green-blandning i vänster lateral ventrikel. (G,H) Placera embryots huvud mellan platinapincettelektroder med katoden (röd pil) över cortex i 60 ° vinkel. I) Placering av embryots armar (svarta pilar) utanför hållaren för att förhindra att embryot glider under ingreppet. J) Embryots rotation inuti livmodersäcken för att exponera huvudet. (K,L) Injektion av DNA / Fast Green-blandning i embryots laterala ventriklar genom livmoderväggen. (M) Placera embryots huvud mellan platinapincettelektroder med en katod (röd pil) över cortex i 60 ° vinkel. (N) Suturerat muskelsnitt via löpande låssutur. (O) Suturerat hudsnitt via en avbruten sutur. (P) Säkring av såret med kirurgiska sårklämmor och desinfektion med betadin. (Q) Placering av musen i återhämtningsburen med långt infrarött värmeljus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Extraktion av E15.5 och E12.5 hjärnor och organotypisk skivodlingsprocedur. (A) Verktyg som används för hjärnans extraktion. (B) Inrätta en organotypisk odlingsstation. (C-F) Extraktion av E15.5 hjärna. (G-J) Extraktion av E12.5 hjärna. Prickade linjer markerar placeringen av snitt. Röda pilar pekar ut riktningen för att dra med pincett. (K) Bädda in hjärnan i en 3 cm skål som innehåller 3% låg smältagaros, vilket lämnar ett 1-2 mm agarosavstånd under hjärnan. (L) Insamling av 150 μm hjärnskiva. (M) Placering av hjärnskivor på PTFE-membraninsatser immobiliserade i en 35 mm skål med paraffinfilm (blå pil). Röd stjärnmarkering indikerar en given hjärnskiva från vibratom (L) och dess överföring till PTFE-membran (M). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bevarad radiell gliacellstruktur i friska organotypiska skivor. Konfokala bilder av E17.5 hjärnskivor som avslöjar RG-array (vimentin; grön) och övergripande cellorganisation (DAPI; magenta) efter IUE (A) och EUE (B,C). Observera de starka störningar i RG-matrisen som ibland kan bero på EUE (C). Förstoringar motsvarar de röda prickade ramarna i huvudfiguren: skalstänger, 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: In situ-visualisering av tillväxtkondynamiken i akuta organotypiska skivor. (A,B) Neuroner och deras motsvarande tillväxtkottar märkta med Lyn-mNeonGreen respektive LifeAct-GFP. Röd stjärna som markerar tillväxtkon av Lyn-mNeonGreen som uttrycker neuron. Blå asterisk som markerar tillväxtkon av LifeAct-GFP som uttrycker neuron. (C) Angränsande neuroner märkta med det dubbla plasmidsystemet som innehåller tRFP (magenta) och ZsGreen (grön) och deras motsvarande tillväxtkottar. Tillväxtkottar avbildade (höger) var utanför den fångade ramen (vänster), erhållen strax efter förvärv av tillväxtkonens tidsfördröjning; skalstänger, 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Analys av axontillväxthastighet och tillväxtkonvolym. (A) Axonspårning på en neuron som uttrycker Lyn-mNeonGreen (överst) och dess motsvarande kymograf (nedan) genererad med hjälp av ImageJ. (B) Rekonstruktion av z-stack video av tillväxtkon med hjälp av bildanalysprogramvaran (överst) och samma tillväxtkon markerad med hjälp av ytmätningsverktyget (nedan). (C) Diagram som visar förändringar i tillväxthastighet över tid för flera axoner. (D) Axonernas genomsnittliga tillväxthastighet kvantifieras i punkt C. (E) Diagram som visar förändringarna i tillväxtkonvolymen över tiden. F) Den genomsnittliga volymen tillväxtkoner kvantifieras i punkt E. skala bar, 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Radiell migration och neuronal polarisering av pyramidala kortikala neuroner. Diagram som illustrerar att utveckla pyramidala kortikala neuroner (rosa) som migrerar radiellt från den germinala ventrikulära zonen (VZ) mot pia-ytan. Styrd av radiella gliaprocesser (grå) etablerar migrerande polariserade neuroner en ledande process, framtida dendrit och efterföljande process, framtida axon, som fortsätter att sträcka sig nedåt mot mellanzonen (IZ). Streckade röda rutor representerar de kortikala områdena där tillväxtkottar avbildades. Specifikt i IZ, subventrikulär zon (SVZ) eller sammanfogning av axonbuntar (grön). Illustrationen skapades med ett webbaserat verktyg, BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Plasmid | Koncentration (μg/μL) | Avsedd användning |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | 0.25 | Märkning av membraninriktat protein (Lyn) |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-iCre | 0.08 | |
| p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP | 0.125 | Märkning av filamentöst aktin (F-aktin) i tillväxtkottar |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | 1 | Oberoende märkning av två populationer av närliggande neuroner |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-iCre | 0.004 | |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-Dre | 0.2 |
Tabell 1: Förteckning över plasmider som används i protokollet. Namn, koncentration och avsedd användning av varje använd plasmid.
Kompletterande video 1: In situ-visualisering av tillväxtkondynamiken i akuta organotypiska skivor. Dynamik i tillväxtkoner märkta med Lyn-mNeonGreen (uppe till vänster) och LifeAct-GFP (nere till vänster). Angränsande tillväxtkottar är differentiellt märkta med det dubbla plasmidsystemet som innehåller tRFP (magenta; uppe till höger) och ZsGreen (grönt; längst ner till höger). Bildintervall, 2,5 s. Skala staplar, 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Hur tillväxtkonerna känner av och reagerar på sin omgivande miljö för att samordna samtidig axonförlängning och vägledning är fortfarande en fråga om debatt 3,18. Banbrytande studier i 2D-substrat gav en inblick i de grundläggande molekylära mekanismerna som genererar de krafter som driver tillväxtkondynamik under axonbildning, utväxt och navigering 2,10,11,12,19. Mer nyligen avslöjade studier i 3D-matriser hur mycket inflytande en tredje dimension har i tillväxtkonens beteende och följaktligen i axontillväxt 8,9. Ändå återstår de invecklade mekanismerna som instruerar tillväxtkondynamik in vivo att undersökas grundligt.
Beredning av organotypiska skivkulturer från IUE- eller EUE-hjärnor används allmänt och är väldokumenterad. Det har blivit en gyllene standard som gör det möjligt för forskare att få insikt i utvecklingen och beteendet hos neuroner i den levande hjärnvävnaden20,21. Faktum är att denna teknik framgångsrikt har använts i kombination med olika högupplösta bildtekniker för att visualisera specifika molekylära processer och morfologiska händelser på plats. Sådana studier inkluderar, men är inte begränsade till axonbildning och förlängning 19,22, kortikal neuronal migration 19,22,23,24, centrosomdynamik25,26, mikrotubulidynamik27, samt den funktionella dynamiken i pre- och postsynaptiska fack 28,29.
Detta protokoll adresserar ett gap i experimentell neurobiologi, visualiserar tillväxtkondynamiken för att utveckla kortikala neuroner in situ, i ex vivo akuta hjärnskivkulturer och verktygen för att analysera de erhållna data.
Akuta hjärnsnittskulturer användes för att upprätta detta protokoll eftersom de (1) med viss övning är lätta att generera; (2) presentera ett tillgängligt system för att studera tillväxtkoner inbäddade i en kvasi-helt fysiologisk miljö, men ändå tillräckligt transparent för att möjliggöra högupplöst live-cellavbildning; (3) kan utökas för dess användning med en myriad av transgena muslinjer; (4) i kombination med antingen IUE eller EUE, ge praktiskt taget obegränsad potential att leverera molekylära verktyg för att utvärdera prestandan hos tillväxtkottar och axoner in vivo under förlust/förstärkning av funktionsregimer, tillsammans med fluorescerande rapportörer och cytoskelettsonder.
Denna metod beskrevs i samband med både EUE och IUE. Även om det fortfarande är en mycket tillförlitlig metod resulterade EUE i en ökad förekomst av hjärnskivor som visade ett oorganiserat RG-nätverk jämfört med de som erhölls med IUE som leveransmetod (Figur 4C). Störningar i RG-matrisen påverkar starkt neuronal migration och mönstret för axonförlängning30,31. Det här är viktiga parametrar som förutsäger var man kan hitta axoner för analys vid en viss tidpunkt och vilken typ av miljö de navigerar. Hjärnskivor med ett signifikant stört RG-nätverk har vanligtvis nedsatt kortikal neuronstratifiering. Detta producerar i sin tur axoner med kaotiska banor. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera för RG-nätverkets strukturella integritet. Intressant nog korrelerar dålig strukturell integritet med ökad ålder hos den embryonala hjärnan. Faktum är att sådana effekter hos yngre E12.5-E13.5-embryon vanligtvis inte observerades19.
Det nuvarande protokollet är grundligt och enkelt. Ändå finns det några kritiska steg där särskild försiktighet och uppmärksamhet måste vidtas för att uppnå optimala resultat. Dessa har uttryckligen noterats i protokollet och inkluderar (1) inställning av mängden DNA som används i elektroporationen för att få gles märkning; (2) undvika skador vid extraktion av hjärnor; (3) kontroll av agarosens temperatur under hjärnhöljet; (4) felsökning av den ideala procentandelen agaros för hjärnor i en viss ålder; och (5) urval av fluoroforer, vars erfarenhet följer. Under protokolloptimering testades prestandan hos flera fluoroforer i live-cell in situ-avbildning. Monomera GFP-varianter EGFP och NeonGreen för beredning av LifeAct- och Lyn-märkta plasmider valdes för detta protokoll (figur 5A,B). Dessutom testades RFP-varianten mScarlet och befanns vara mycket lämplig för denna uppsättning (data visas inte). Multimeric tRFP (dimer) och ZsGreen (tetramer) (Figur 5C och Supplementary Video 1, till höger) testades också. Dessa snabbvikande superljusa fluoroforer rekommenderas när metoden kräver snabb fluorescerande signalgenerering efter DNA-leverans.
En vanlig praxis vid användning av skivkulturer är att använda skivor från olika hjärnor för att testa kontroll och experimentella förhållanden. Detta representerar en inneboende källa till oönskad variation. Här användes ett uttryckssystem som möjliggör oberoende modifiering av närliggande nervceller och reportrars uttryck för identifiering. Observera att i denna demonstration (figur 5C) fanns det inga skillnader mellan neuroner som uttryckte någon av fluoroforerna. Men som ett exempel kommer en sådan plasmidblandning i kombination med en transgen muslinje som rymmer en Cre-känslig gen att märka med tRFP (Dre-känsliga) neuroner som förblev som vild typ. Däremot kommer ZsGreen (även Cre-känslig) att märka de rekombinerade neuronerna. Därför kan tillväxtkottar av de två olika genotyperna, och sannolikt även fenotyper, studeras sida vid sida samtidigt i samma hjärnskiva.
Lokalisering av axoner och tillväxtkottar för analys är ett viktigt övervägande. Kortikala neuroner polariseras medan de radiellt migrerar från den ventrikulära zonen (VZ) mot kortikala plattan (CP). Under denna process bildar neuroner en ledande process (en framtida dendrit) och en efterföljande process som kommer att bli axonen, så småningom ansluta sig till banbrytande axoner i mellanzonen (IZ) och etablera axonkanaler32. För att fånga axonala tillväxtkottar gjordes därför avbildning på axonala fibrer i IZ, inklusive axoner som lämnar CP och tidigt genererade axoner som redan är associerade med axonbuntar; eller så småningom, i fibrer som tvärs över IZ och sträcker sig under den (Figur 7).
Detta protokoll gör det möjligt att utföra superupplösningsavbildning av neuroner inom organotypiska skivor. Historiskt sett var ljusspridning ett betydande problem vid avbildning av tjocka exemplar. Under de senaste två decennierna har omfattande framsteg inom optisk teknik gjort avbildning av tjocka exemplar möjlig. Här användes ett långdistansmål för att visualisera mindre strukturer bättre, till exempel tillväxtkoner. Oundvikligen fångar detta protokoll inte mer detaljerade händelser som retrograd aktinflöde eller mikrotubuli dynamik. Målet för långt arbetsavstånd, som kräver en lägre numerisk bländare (NA), bevarar information från tjocka skivor. Det var emellertid också möjligt att anpassa detta protokoll till användning med mål om kortare arbetsavstånd. Detta krävde en smidig överföring av skivor till en glasbottnad skål för att bevara strukturell integritet. Användning av denna metod resulterade emellertid i kortare överlevnad - ~ 15 h - på grund av förlust av gasutbyte (data visas inte). Till skillnad från 2D-kulturer upptar tillväxtkottar i 3D en större volym och kräver rörelseartefaktkompensation i z-axeln. För att öka möjligheten att avbilda detaljerade händelser måste modern konfokalteknik utnyttjas. Därför rekommenderas att du använder en snabbskanningsmotor med z-stack, till exempel z-Galvo som finns på mycket känsliga konfokalmikroskop33.
Observera att detta protokoll presenterar tre huvudbegränsningar. För det första är det ofta utmanande att kontrollera nivåer av uttryck / antal uttryckande celler av en given plasmid in vivo. Detta introducerar variation mellan alla skivor även när samma plasmidkoncentration bibehålls. Därför måste valet av regleringselementen i de använda uttrycksvektorerna vara förutbestämt med försiktighet. För det andra är det för närvarande inte möjligt att avbilda detaljerade händelser med membraninsatser. Denna andra begränsning kan övervinnas med de metoduppdateringar som föreslås i föregående stycke. Slutligen är tillväxtkottar mycket ljuskänsliga och kan snabbt bli fotoblekta. Därför kan frekvent avbildning av tillväxtkottarna, i så lite som 5 minuter med laserskanningsmikroskop, ofta kollapsa tillväxtkottarna. I detta avseende kan nya framsteg inom ljusarkmikroskopigenererade enheter anpassas för långsiktig avbildning av hjärnskivorna34.
Protokoll av detta liknande är tänkta att öppna nya forskningsvägar, vilket möjliggör en bättre förståelse för vad som krävs för att en tillväxtkon ska läsa och reagera mot en komplex in vivo-miljö , och ännu viktigare, att riva upp mekaniken i detta sofistikerade samspel.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Maria Eugenia Bernis för att hon fotograferade procedurerna. Vi tackar också Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski och Sina Stern för att ha läst och diskuterat manuskriptet. Vi är tacksamma för våra enastående tekniska assistenter, Jessica Gonyer, Blanca Randel och Anh-Tuan Pham. Vi erkänner det värdefulla stödet från DZNE: s ljusmikroskopanläggning och djuranläggning. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) och Wings for Life (till F.B). F.B. är medlem i excellensklustret ImmunoSensation2, SBB 1089 och 1158, och är mottagare av Roger De Spoelberch-priset.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
| Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Betadine | B. Braun | 3864154 | |
| Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
| Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
| DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
| Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
| Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
| FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
| Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
| Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
| Isoflurane | Virbac | NA | |
| Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
| Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
| LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
| Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
| Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
| Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
| Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
| Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
| Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
| p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
| p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
| Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
| QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
| Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
| Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
| Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
| Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
| Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
| Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
| Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |
References
- Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
- Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
- Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
- Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
- Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
- Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
- Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
- Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
- Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
- Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
- Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).
- Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
- Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
- Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
- de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
- Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
- Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
- Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).
- Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
- Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
- Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
- Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ (2021).
- ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html (2021).
