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Neuroscience

सीटू में तीव्र पूर्व वीवो भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों में अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/63068
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Axon Growth and Regeneration, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE)

Summary

यह प्रोटोकॉल सीटू अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता में अध्ययन करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि को दर्शाता है। यह वर्णन करता है कि पूर्व विवो शारीरिक रूप से प्रासंगिक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस कैसे तैयार किया जाए और एक उपयोगकर्ता के अनुकूल विश्लेषण पाइपलाइन प्रदान करता है।

Abstract

न्यूरोनल विकास के दौरान, अक्षतंतु अपने अंतिम गंतव्यों तक पहुंचने और सिनैप्टिक कनेक्शन स्थापित करने के लिए कॉर्टिकल वातावरण को नेविगेट करते हैं। विकास शंकु - अक्षतंतुओं के विकास के दूरस्थ सुझावों पर स्थित संवेदी संरचनाएं - इस प्रक्रिया को निष्पादित करती हैं। विकास शंकु की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करना क्षैतिज विकास और आसपास के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के साथ बातचीत को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जो इसे तंत्रिका सर्किट बनाने में सक्षम बनाता है। मौलिक अनुसंधान और पूर्व-नैदानिक संदर्भों में चोट के बाद अक्षतंतुओं को तंत्रिका सर्किट में फिर से एकीकृत करने के तरीकों को तैयार करते समय यह आवश्यक है। इस प्रकार अब तक, विकास शंकु गतिशीलता की सामान्य समझ मुख्य रूप से दो आयामों (2 डी) में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के अध्ययन पर स्थापित की जाती है। यद्यपि निस्संदेह विकास शंकु संरचनात्मक गतिशीलता और उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया के वर्तमान ज्ञान के लिए मौलिक है, 2 डी अध्ययन बरकरार सीएनएस ऊतक में न्यूरोनल विकास शंकु द्वारा सामना किए गए शारीरिक तीन आयामी (3 डी) वातावरण को गलत तरीके से प्रस्तुत करते हैं। हाल ही में, कोलेजन जैल को इनमें से कुछ सीमाओं को दूर करने के लिए नियोजित किया गया था, जिससे 3 डी में न्यूरोनल विकास की जांच को सक्षम किया जा सके। हालांकि, सिंथेटिक 2 डी और 3 डी दोनों वातावरणों में सीएनएस ऊतक के भीतर सिग्नलिंग संकेतों की कमी होती है, जो अक्षतंतुओं के विकास के विस्तार और पथ खोज को निर्देशित करते हैं। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोटाइपिक मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अक्षतंतुओं और विकास शंकुओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जहां विकासशील अक्षतंतु शारीरिक रूप से प्रासंगिक भौतिक और रासायनिक संकेतों का सामना करते हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों को विरल रूप से वितरित करने के लिए गर्भाशय और पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में ठीक-ठाक संयोजन करके, यह प्रोटोकॉल अक्षतंतु और सीटू में विकास शंकु गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक पद्धतिगत पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, दीर्घकालिक और लाइव-सेल इमेजिंग डेटा के विश्लेषण का एक विस्तृत टूलकिट विवरण शामिल है।

Introduction

न्यूरॉन्स अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं जो तंत्रिका तंत्र में बुनियादी कम्प्यूटेशनल इकाई का प्रतिनिधित्व करती हैं। वे ऐसी जानकारी प्राप्त करते हैं और उत्सर्जित करते हैं जो इनपुट और आउटपुट साइटों के कंपार्टमेंटेशन पर निर्भर करती है: डेंड्राइट्स और अक्षतंतु, क्रमशः1। विकास के दौरान, अक्षतंतु अपने गंतव्य तक पहुंचने के लिए एक अविश्वसनीय जटिल वातावरण को नेविगेट करते हुए विस्तारित होते हैं। अक्षतंतु नेविगेशन विकास शंकु द्वारा निर्देशित होता है, जो विकासशील अक्षतंतु की नोक पर स्थित एक संवेदी संरचना है। विकास शंकु पर्यावरणीय संकेतों का पता लगाने और उन्हें अपने साइटोस्केलेटन 2,3 के गतिशील स्थानिक पुनर्गठन में अनुवाद करने के लिए जिम्मेदार है। परिणामी मोर्फो-यांत्रिक प्रतिक्रियाएं विकास शंकु को ट्रिगरिंग क्यू से विस्तारित या पीछे हटने का निर्देश देती हैं, जिससे विशिष्ट अक्षतंतु युद्धाभ्यास होता है।

अक्षतंतु विस्तार और विकास शंकु गतिशीलता की वर्तमान समझ दो आयामी (2 डी) सब्सट्रेट्स 2,4,5,6,7 पर अक्षतंतु विकास का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों से उपजी है। इन अग्रणी अध्ययनों ने विकास शंकु और विकास सब्सट्रेट के बीच परिष्कृत इंटरप्ले की पहचान की और सब्सट्रेट विशेषताओं जैसे कि चिपकने और कठोरता 8,9 पर निर्भर हड़ताली अंतरका खुलासा किया। इन अंतर्दृष्टि के नेतृत्व में, बाह्य कोशिकीय पर्यावरणीय संकेतों को अक्षतंतु विकास को निर्देशित करने के लिए परिकल्पना की गई थी, जिसमें विकास शंकु साइटोस्केलेटन ने इस विकासको 2,10,11,12 निष्पादित किया था। विशेष रूप से, न्यूरॉन्स गैर-चिपकने वाले सब्सट्रेट (जैसे, पॉली-लाइसिन, पॉली-ऑर्निथिन) में अक्षतंतुओं का विस्तार कर सकते हैं। इसके अलावा, सब्सट्रेट कठोरता सेल चिपकने वाले परिसरों से स्वतंत्र अक्षतंतु विकास दर को प्रभावित कर सकती है8। इसलिए, अकेले 2 डी सब्सट्रेट्स में विकास शंकु गतिशीलता का अध्ययन करना उन बलों के संतुलन को सटीक रूप से मॉडल नहीं कर सकता है जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक तीन-आयामी (3 डी) वातावरण के साथ अक्षीय विकास शंकु की बातचीत से उत्पन्न होते हैं, जैसे कि विवो में पाए जाने वाले।

2 डी assays की सीमाओं को दूर करने के लिए, अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता 3 डी matrices 8,9 में अध्ययन किया गया है। ये matrices अधिक शारीरिक संदर्भ अभी तक अक्षतंतु विकास के सेल-आंतरिक तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यह विभिन्न स्थितियों और औषधीयउपचारों की एक किस्म में एकल-सेल फैशन में विकास शंकु परीक्षा को सक्षम बनाता है। इस तरह के 3 डी वातावरण में, अक्षतंतुओं ने अलग-अलग साइटोस्केलेटल गतिशीलता प्रदर्शित की और 2 डी सुसंस्कृत न्यूरॉन्स9 में देखे गए लोगों की तुलना में तेजी से बढ़ी। इन सुरुचिपूर्ण अध्ययनों ने विकास शंकु साइटोस्केलेटन के पुनर्गठन पर एक अतिरिक्त आयाम के प्रभाव का प्रदर्शन किया और परिणामस्वरूप, इसके व्यवहार पर।

देशी-जैसे न्यूरोनल विकास और अक्षतंतु विकास का समर्थन करने में 2 डी सतहों पर 3 डी मैट्रिक्स द्वारा प्रस्तुत स्पष्ट लाभों के बावजूद, वे एक सरलीकृत सिंथेटिक पाड़ बने हुए हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ऊतक में देखी गई गतिशीलता की जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। यहां, पूर्व गर्भाशय और गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में रिपोर्टर प्लास्मिड के वितरण को मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस संस्कृति के साथ जोड़ा गया था और एक शारीरिक संदर्भ के भीतर विकास शंकु गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए सीटू लाइव सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में। यह पद्धति अक्षतंतुओं के विकास के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है, जबकि विवो वातावरण में 3-आयामीता और इसकी भौतिक-रासायनिक संरचना की जटिलता का अनुभव करती है। अंत में, आमतौर पर लाइसेंस प्राप्त और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता को मापने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।

Protocol

पशु प्रयोगों को प्रासंगिक संस्थागत और संघीय नियमों का पालन करना चाहिए। भ्रूण दिवस 15.5 और 12.5 (E15.5 और E12.5) गर्भवती महिला C57BL / 6JRj चूहों का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था। उत्तर Rhein-Westphalia राज्य पर्यावरण एजेंसी के पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार प्रयोग किए गए थे (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV))।

1. इंजेक्शन के लिए plasmids की तैयारी

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंडोटॉक्सिन-मुक्त मैक्सिप्रैप किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में डीएनए मिश्रण के वितरण की कल्पना करने के लिए वांछित एकाग्रता (तालिका 1) और 10% फास्ट ग्रीन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) पर चयनित डीएनए को मिलाएं।
    नोट: विशिष्ट प्लास्मिड का उपयोग कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (चित्रा 1 ए), फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) संरचनाओं के विरल लेबलिंग के लिए विकास शंकु (चित्रा 1 बी) में किया गया था, और एक ही कॉर्टेक्स (चित्रा 1 सी) के भीतर विकास शंकु के दोहरे लेबलिंग के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी प्लास्मिड (तालिका 1) को एडजीन में जमा किया गया है (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. निम्नलिखित कार्यक्रम के अनुसार एक केशिका इलेक्ट्रोड पुलर सेट का उपयोग करके ग्लास केशिकाएं तैयार करें: दबाव: 500, गर्मी: 800, पुल: 30, और वेग: 40।
  4. माइक्रो लोडर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके प्रत्येक ग्लास केशिका में डीएनए / फास्ट ग्रीन मिश्रण के 15 μL लोड करें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले प्रपत्र।
  5. डिश के व्यास में मॉडलिंग मिट्टी के एक टुकड़े के साथ 10 सेमी डिश में डीएनए से भरी केशिकाओं को स्टोर करें। केशिकाओं को लोड किया जा सकता है और प्रयोग से एक दिन पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सूखने को रोकने के लिए लचीली फिल्म के साथ केशिका के पिछले छोर को सील करें।

2. समाधान की तैयारी

  1. हैंक के बफ़र्ड नमक समाधान तैयार करें-ग्लूकोज (HBSS-G) के साथ पूरक।
    1. 1x HBSS की एक बोतल में 20% ग्लूकोज स्टॉक का 0.5% जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। भ्रूण निष्कर्षण के लिए, कार्बोजन (95% O 2 और 5% CO 2) के साथ बुलबुला HBSS-G समाधान भ्रूण संग्रह से कुछ समय पहले bubbling पत्थर का उपयोग कर।
  2. स्लाइस मीडिया समाधान
    1. Neurobasal 1x, 5% घोड़े सीरम, 5% भ्रूण बछड़ा सीरम, B27 पूरक 1: 50, एल-ग्लूटामिन पूरक 1: 400, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1: 200, और न्यूरोपैन -2 पूरक 1: 100 (पीएच = 7.3 पर) युक्त ताजा स्लाइस मीडिया तैयार करें, बाँझ स्थितियों के तहत ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. स्लाइस मीडिया के प्रत्येक के 1 मिलीलीटर के साथ 3 सेमी व्यंजन तैयार करें। गैस एक्सचेंज के माध्यम से मीडिया के पीएच को संतुलित करने के लिए प्रयोग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: मीडिया पीएच संतुलन इनक्यूबेटर से सीओ2 द्वारा मीडिया के अम्लीकरण के कारण होता है। स्लाइस मीडिया को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. कम गलनांक agarose समाधान (3%)
    1. कम पिघलने बिंदु agarose पाउडर की वांछित मात्रा का वजन और एक कांच की बोतल में 1x HBSS-जी की एक उपयुक्त मात्रा में भंग. प्रति मस्तिष्क लगभग 7 मिलीलीटर एगारोज़ समाधान की आवश्यकता होती है।
    2. बोतल को 2-3 मिनट के लिए माइक्रोवेव में रखें, जिसमें टोपी ढीली रखी गई है, और हर 10-20 सेकंड में हिलाएं।
    3. एक बार पाउडर पूरी तरह से भंग हो जाने के बाद, बोतल को पानी के स्नान या मनका स्नान में रखें जो प्रयोग से कम से कम 1 घंटे पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हो जाए ताकि एगारोज़ को ठंडा करने की अनुमति मिल सके।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए agarose पाउडर भंग हो गया है सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट से अधिक दो बार agarose गर्म करने की सिफारिश की है। यह मस्तिष्क के ऊतकों के लिए agarose के उचित आसंजन के लिए महत्वपूर्ण है। एक थर्मामीटर का उपयोग मस्तिष्क को एम्बेड करते समय एगारोज़ समाधान के तापमान को मापने के लिए किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह 37-40 डिग्री सेल्सियस के बीच है। विभिन्न वृद्ध जानवरों के दिमाग में अलग-अलग कठोरता होती है। ऊतक और एगारोज़ के बीच समरूपता खोजने के लिए एगारोज़ सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
    4. 0.3% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस-टी) के साथ फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन तैयार करें।
    5. 0.2% सोडियम Azide (PBS-NaN3) के साथ फॉस्फेट बफ़र्ड खारा तैयार करें।
      नोट:: चरण 2.4-2.5 में वर्णित समाधान बाद में immunohistochemistry चरण में उपयोग के लिए हैं।

3. सर्जरी स्टेशन की तैयारी

  1. 70% -96% इथेनॉल के साथ सर्जरी स्टेशन को साफ करें और स्टेशन की सतह पर ऑपरेशन अंडरले रखें।
  2. 70% -96% इथेनॉल के साथ कुल्ला करके सर्जरी उपकरणों को निष्फल करें, इसके बाद एक गर्म मनका नसबंदी में सूखी नसबंदी करें।
  3. पल्स जनरेटर से कनेक्ट होने से पहले 70% -96% इथेनॉल के साथ प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड ( सामग्री की तालिका देखें) को साफ करें।
  4. केशिका धारक में एक डीएनए / फास्ट ग्रीन से भरे ग्लास केशिका डालें। उपयोग करने से तुरंत पहले, धीरे-धीरे केशिका टिप को ठीक कैंची का उपयोग करके तोड़ दें और पूर्व-गर्म खारा या पानी से भरे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के अंदर परीक्षण समाधान प्रवाह करें।
    नोट: चित्रा 2A, बी सर्जरी स्टेशन सेट-अप और पूर्व गर्भाशय electroporation (EUE) और गर्भाशय electroporation (IUE) में के लिए इस्तेमाल किया उपकरण दिखाएँ।
  5. IUE के लिए, पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए वार्म-अप खारा समाधान।

4. भ्रूण निष्कर्षण

  1. गर्भवती माउस को 5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण प्रेरक कक्ष में रखें जब तक कि माउस गहराई से एनेस्थेटिक न हो जाए। पेडल वापसी पलटा की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  2. माउस को एक ऑपरेशन अंडरले में स्थानांतरित करें और नाक शंकु के माध्यम से 1.5% -2% पर आइसोफ्लुरेन बनाए रखें।
  3. कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर मरहम लागू करें।
  4. माउस के पेट को शेव करें, और फिर शेव किए गए बालों को हटाने के लिए 70% -96% इथेनॉल-भिगोए हुए धुंध का उपयोग करें। बीटाडीन के साथ क्षेत्र को साफ करें।
  5. बाँझ छोटे सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, पेट की मध्यरेखा के साथ 2 सेमी त्वचा चीरा बनाएं, इसके बाद 1.5 सेमी मांसपेशी चीरा लगाएं।
    नोट: चीरा आकार भ्रूण के आकार पर निर्भर करता है। दरअसल, बड़े भ्रूण को अपने निष्कर्षण को समायोजित करने के लिए एक बड़े चीरा की आवश्यकता होगी।
  6. त्वचा चीरा (~ 2 सेमी व्यास) को फिट करने के लिए धुंध के बीच में एक छेद काटें, इसे गर्म खारा के साथ भिगोएं, और इसे पेट के उद्घाटन के चारों ओर रखें।
  7. गर्म खारा में भिगोए गए कपास की कली का उपयोग करके या संदंश का उपयोग करके दोनों गर्भाशय सींगों को बाहर निकालें, उन्हें बाहर निकालने के लिए भ्रूण के बीच रिक्त स्थान को सावधानीपूर्वक हथियाएं। गीले धुंध पर भ्रूण रखें (चित्रा 2 सी)।
    नोट: गर्भाशय के सींगों के आसपास रक्त वाहिकाओं और केशिकाओं को एक छोटी सी क्षति के परिणामस्वरूप अत्यधिक रक्तस्राव होने की संभावना होगी। इसलिए, हर समय इन संवहनी क्षेत्रों के प्रत्यक्ष हैंडलिंग से बचें।
  8. गर्भाशय की बोरी को काटें और प्रत्येक भ्रूण को हटा दें (चित्रा 2 डी)।
  9. एक अवरोही विकर्ण कट के माध्यम से निष्कर्षण के तुरंत बाद प्रत्येक भ्रूण euthanize, पूर्ण रीढ़ की हड्डी transection सुनिश्चित (चित्रा 2E).
  10. बर्फ पर HBSS-G युक्त एक 10 सेमी पकवान में भ्रूण रखें।
    नोट: भ्रूण का सिर कलम करने से मस्तिष्क से डीएनए / फास्ट ग्रीन मिश्रण रिसाव को रोकने और धारक में आसान भ्रूण स्थिति की सुविधा के लिए टाला जाता है ( पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन, चरण 5 देखें)।
  11. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन करके भ्रूण के निष्कर्षण के तुरंत बाद मां की बलि दें।
    नोट: यहां, मां को संज्ञाहरण के तहत euthanized किया जाता है ताकि इसे किसी भी आगे की प्रक्रिया के दर्द से बचाया जा सके या उत्तरी रेन-वेस्टफेलिया राज्य पर्यावरण एजेंसी (LANUV) के पशु कल्याण अधिनियम द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में पीड़ा हो सके।

5. पूर्व गर्भाशय electroporation (EUE)

  1. एक भ्रूण उठाओ और इसे धारक में रखें।
    नोट: सेल स्क्रैपर के अंत से जुड़ी एक कट 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग भ्रूण धारक के रूप में किया जाता है। प्रक्रिया के दौरान टिप के बाहर भ्रूण के हथियारों को रखना आवश्यक है ताकि उन्हें टिप में फिसलने से रोका जा सके (चित्रा 2 एफ-आई)। पिपेट टिप का व्यास विभिन्न आकारों के भ्रूण को समायोजित करने के लिए आसानी से समायोज्य है। लंबाई में एक दूसरी टिप काटें जहां टिप का व्यास भ्रूण के आकार से मेल खाता है और इसे ऊपर उल्लिखित धारक के लिए एडाप्टर डालने के रूप में उपयोग करें।
  2. ध्यान से डीएनए / फास्ट ग्रीन से भरे ग्लास केशिका को भ्रूण की खोपड़ी के माध्यम से पार्श्व वेंट्रिकल में डालें और डीएनए प्लास्मिड मिश्रण के 2-3 μL इंजेक्ट करें (चित्रा 1 ए, बी; तालिका 1) प्रत्येक वेंट्रिकल में (चित्रा 2 एफ)।
    नोट: डीएनए इंजेक्शन के स्थान के लिए एक गाइड के रूप में लैम्ब्डोइडल और सैगिटल टांके का उपयोग करें। लैम्बडोइडल और सैगिटल टांके रेशेदार जोड़ होते हैं जो खोपड़ी की हड्डी की प्लेट को जोड़ते हैं। पूर्व पश्चकपाल हड्डी के साथ पार्श्विका हड्डी को जोड़ता है, और बाद वाला दो पार्श्विका हड्डियों में शामिल हो जाता है।
  3. वांछित मस्तिष्क क्षेत्र (इस मामले में 60 डिग्री कोण) को लक्षित करने के लिए उपयुक्त कोण पर प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को पकड़ो, कैथोड के साथ उस क्षेत्र का सामना करना पड़ रहा है जहां डीएनए हस्तांतरण का इरादा है (चित्रा 2 जी-एच)।
  4. 1 s के अंतराल और एक वर्ग तरंग पल्स जनरेटर का उपयोग करके 50 ms की अवधि के साथ 30 mV पर पांच दालों को लागू करें।
    नोट: ध्यान रखें कि EUE में दिमाग IUE में उन लोगों की तुलना में अधिक प्रभावी विद्युत क्षेत्र का अनुभव करते हैं। इसलिए, किसी दिए गए डीएनए एकाग्रता पर, ईयूई के परिणामस्वरूप आईयूई की तुलना में डीएनए हस्तांतरण की उच्च दक्षता होती है, और डीएनए सांद्रता को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है।
  5. यदि द्विपक्षीय इलेक्ट्रोपोरेशन वांछित है, तो कैथोड के साथ चरण 5.3-5.4 दोहराएं और एनोड contralateral प्रांतस्था को लक्षित करने के लिए पिछली स्थिति को प्रतिबिंबित करता है।
    नोट: चूंकि दोनों वेंट्रिकल्स को डीएनए के साथ इंजेक्ट किया गया था, इसलिए दोनों गोलार्धों के cortices को लक्षित किया गया था।
  6. electroporated भ्रूण को बर्फ-ठंडे HBSS-G युक्त 6 सेमी डिश में रखें। आवश्यक सभी भ्रूणों के लिए चरण 5.1-5.6 को दोहराएं।

6. गर्भाशय electroporation (IUE) में

  1. एनाल्जेसिक के साथ गर्भवती माउस इंजेक्ट करें; buprenorphine के 50 μL (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) ( सामग्री की तालिका देखें) चमड़े के नीचे, प्रक्रिया से 20 मिनट पहले।
  2. भ्रूण निष्कर्षण अनुभाग से चरण 4.1-4.8 निष्पादित करें।
    नोट: गर्म खारा में भिगोए गए बाँझ धुंध के साथ उन्हें कवर करके अनावश्यक रूप से उजागर किए गए भ्रूण को छोड़ने से बचें।
  3. उंगलियों का उपयोग करते हुए, धीरे से गर्भाशय के अंदर भ्रूण को घुमाएं जब तक कि लैम्बडोइडल और सैगिटल टांके स्थित न हों (चित्रा 2 जे)। गर्भाशय की दीवार और भ्रूण की खोपड़ी के माध्यम से डीएनए / फास्ट ग्रीन ग्लास केशिका को पार्श्व वेंट्रिकल में सावधानीपूर्वक डालें और डीएनए प्लास्मिड मिश्रण (चित्रा 1 ए, सी) के 2-3 μL को वांछित के रूप में एक या दोनों वेंट्रिकल्स में इंजेक्ट करें (चित्रा 2K-L)।
    नोट: गर्भाशय सींगों पर अत्यधिक उंगली दबाव एमनियोटिक बोरी पतन का कारण बन सकता है।
  4. वांछित मस्तिष्क क्षेत्र (इस मामले में 60 डिग्री कोण) को लक्षित करने के लिए उपयुक्त कोण पर प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को पकड़ो, कैथोड के साथ उस क्षेत्र का सामना करना पड़ रहा है जहां डीएनए हस्तांतरण का इरादा है। गर्भाशय को निचोड़ने से बचें क्योंकि यह एमनियोटिक बोरी के पतन का कारण बन सकता है (चित्रा 2 एम)।
  5. 600 एमएस के अंतराल और एक वर्ग तरंग पल्स जनरेटर का उपयोग करके 50 एमएस की अवधि के साथ 35 एमवी पर पांच दालों को लागू करें।
  6. यदि दोनों पार्श्व वेंट्रिकल इंजेक्ट किए गए थे, तो कैथोड और एनोड के साथ 6.5-6.6 चरणों को दोहराएं जो contralateral कॉर्टेक्स को लक्षित करने के लिए पिछली स्थिति को प्रतिबिंबित करते हैं।
  7. आवश्यक सभी भ्रूणों के लिए चरण 6.3-6.6 को दोहराएँ।
  8. एक बार जब सभी आवश्यक भ्रूणों को इलेक्ट्रोपोरेट कर दिया जाता है, तो गर्भाशय के सींगों को धीरे-धीरे पेट की गुहा के अंदर वापस रखने के लिए एक खारा-भिगोया हुआ कपास की कली का उपयोग करें।
    नोट: पेरिटोनियल गुहा में खारा समाधान के अलावा गर्भाशय सींग ों को स्थिति में वापस स्लाइड करने में मदद मिलेगी।
  9. सिवनी मांसपेशी और त्वचा चीरों 5-0 सीवन सामग्री का उपयोग कर. घाव को सुरक्षित करने के लिए सीवन क्लिप का उपयोग करें और इसे बीटाडीन (चित्रा 2 एन-पी) के साथ छिड़काव करके टांका घाव को कीटाणुरहित करें।
  10. 5% ग्लूकोज चमड़े के नीचे के 200 μL के साथ माउस इंजेक्ट करें।
  11. एक एंटीबायोटिक के साथ माउस इंजेक्ट करें; एनरोफ्लोक्सासिन (5 मिलीग्राम / किग्रा) के 50 μL चमड़े के नीचे ( सामग्री की तालिका देखें)।
  12. माउस को पुनर्प्राप्ति पिंजरे में वापस रखें और कम से कम 20 मिनट की प्रक्रिया के बाद (चित्रा 2क्यू) के लिए एक दूर-अवरक्त वार्मिंग प्रकाश या हीटिंग पैड का उपयोग करके गर्मी बनाए रखें।
  13. माउस की दैनिक निगरानी करें, और संस्थागत और संघीय दिशानिर्देशों का पालन करते हुए दर्द से राहत की प्रक्रिया के बाद मेलोक्सिकैम इंजेक्ट करें।
  14. चरण 4 के बाद प्रक्रिया (यानी, E17.5) के 2 दिन बाद भ्रूण निकालें।

7. मस्तिष्क निष्कर्षण और agarose में एम्बेडिंग

नोट:: यह बेहतर परिशुद्धता के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत निम्नलिखित चरणों को पूरा करने के लिए अनुशंसित है। मस्तिष्क को नुकसान से बचना प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. एक विच्छेदन हुड (चित्रा 3A) के तहत एक बाँझ काम करने की जगह में निष्कर्षण उपकरण सेट अप करें।
  2. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके शरीर के बाकी हिस्सों से भ्रूण के सिर को अलग करें।
  3. सिर को ठीक करें जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, और फिर मध्यरेखा के साथ काटकर त्वचा और खोपड़ी को हटा दें, जो सिर के आधार से नाक की ओर शुरू होता है (चित्रा 3 डी)।
  4. त्वचा और खोपड़ी को पार्श्व रूप से छील लें, जिससे मस्तिष्क को उत्पादित करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त अंतर (~ 1 सेमी) हो जाए।
  5. मस्तिष्क को हटाने के लिए, बाँझ विच्छेदन कैंची की बंद नोक डालें, जो मस्तिष्क स्टेम (चित्रा 3 ई) की ओर बढ़ने वाले घ्राण बल्ब के नीचे से शुरू होती है।
  6. मस्तिष्क स्टेम को काट लें और मस्तिष्क के चारों ओर मेनिंग्स के किसी भी ढीले टुकड़े को ट्रिम करें (चित्रा 3 एफ)।
    नोट: ढीले meninges अक्सर स्लाइस काटने के बाद agarose ब्लॉक से जुड़े रहने के लिए कारण है, स्लाइस संग्रह के दौरान agarose से ऊतक के अलग करने के लिए अग्रणी।
  7. सभी भ्रूणों के लिए चरण 7.1-7.6 को दोहराएं और एम्बेडिंग चरण तक मस्तिष्क को बर्फ पर रखें (आदर्श रूप से 30 मिनट से अधिक नहीं)।
    नोट: निम्न चरण7.7.1-7.7.4 E12.5 मस्तिष्क के मस्तिष्क निष्कर्षण को संदर्भित करते हैं।
    1. आंख के ठीक नीचे सिर के शीर्ष को अलग करें, जैसा कि चित्र 3 जी में दिखाया गया है।
    2. ब्रेनस्टेम के शीर्ष पर त्वचा और खोपड़ी को काटें, जैसा कि चित्रा 3 एच में दिखाया गया है, ब्रेनस्टेम को हटाने के बिना डैश की गई रेखा का पालन करें।
    3. सिर के पीछे एक 2 मिमी त्वचा-खोपड़ी चीरा बनाएं, जैसा कि चित्र 3I में दिखाया गया है (स्पष्टता के लिए चित्र देखें)।
      नोट: यह चीरा त्वचा और खोपड़ी की परतों को छीलने के लिए प्रारंभिक मनोरंजक बिंदु प्रदान करता है। आमतौर पर, वे एक परत के रूप में आते हैं। ठेठ चीरा आकार 2 मिमी है, जो उपयोग किए गए माइक्रो स्प्रिंग कैंची के अत्याधुनिक किनारे की लंबाई के अनुरूप है।
    4. चीरा के एक तरफ सुरक्षित करके और दूसरे को ध्यान से खींचकर त्वचा-खोपड़ी की परतों को छीलना शुरू करें। उसी देखभाल के साथ, मस्तिष्क को मुक्त करने तक सिर के आधार को छीलकर अंतिम रूप दें (चित्रा 3 जे)।
      नोट: यह बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए, यह देखते हुए कि मस्तिष्क को ऊतक परतों के साथ नहीं खींचा जा रहा है। मस्तिष्क को कवर करने वाले ऊतक को हटाने के लिए वैकल्पिक पक्ष।
  8. एक 3 सेमी पकवान में गर्म agarose (37-40 डिग्री सेल्सियस पर) डालो.
  9. एक छिद्रित चम्मच का उपयोग करके मस्तिष्क को उठाएं और सूखे टिशू पेपर के खिलाफ चम्मच के निचले हिस्से को डब करके अतिरिक्त तरल को हटा दें। मस्तिष्क को एक agarose पकवान में रखें।
    नोट: ऊतक के लिए agarose के बेहतर आसंजन के लिए अनुमति देने के लिए संभव के रूप में मस्तिष्क के चारों ओर से अधिक तरल को हटाने के लिए आवश्यक है।
  10. तरल agarose के साथ पकवान बर्फ पर रखो. एक छोटे चम्मच का उपयोग करते हुए, यहां तक कि ठंडा करने के लिए 10 s के लिए agarose मिश्रण। पकवान के बीच में मस्तिष्क पैंतरेबाज़ी. पृष्ठीय पक्ष के साथ पकवान में क्षैतिज रूप से मस्तिष्क को रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से सभी दिशाओं (चित्रा 3K) से एगारोज़ के साथ कवर किया गया है।
    नोट: दिमाग अक्सर एक बार अगरोज़ में रखे जाने के बाद डिश के नीचे डूब जाएगा; एक छोटे चम्मच का उपयोग करके मस्तिष्क को तब तक उठाएं जब तक कि मस्तिष्क के नीचे 1-2 मिमी का अंतर स्थापित न हो जाए।
  11. सभी दिमागों के लिए चरण 7.8-7.10 दोहराएं।
  12. एक बार agarose polymerized है, सूखने को रोकने के लिए agarose ब्लॉक के शीर्ष पर HBSS-G के 500 μL जोड़ें। फिर, पकवान को बर्फ से ढंक दें।
    नोट: मस्तिष्क के तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए अनुभाग से पहले नमूने को 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।

8. Organotypic टुकड़ा संस्कृति

नोट: स्लाइस संदूषण से बचने के लिए 70% -96% इथेनॉल के साथ साफ वाइब्रेटोम और आसपास की सतहों। वाइब्रेटोम वर्कस्टेशन का सेट-अप ( सामग्री की तालिका देखें) चित्र 3 B में दिखाया गया है।

  1. ठंड HBSS-जी के साथ vibratome बफर ट्रे भरें और बाहरी ट्रे बर्फ के साथ HBSS-जी प्रक्रिया के दौरान ठंडा बनाए रखने के लिए.
  2. लगातार एक bubbling पत्थर का उपयोग कर carbogen के साथ बफर ट्रे में HBSS-जी की आपूर्ति.
  3. एक ताजा ब्लेड का उपयोग करते हुए, मस्तिष्क के चारों ओर एक बड़ा कट (~ 2 x 2 सेमी) बनाएं और मस्तिष्क वाले एगारोज़ के एक ब्लॉक को हटा दें, जिसमें एक छोटे से आयत ब्लॉक में एगारोज़ को ट्रिम करने के लिए पर्याप्त आसपास का एगारोज़ हो।
    नोट: यह चरण ब्लॉक के कोण को समायोजित करने की अनुमति देता है ताकि मस्तिष्क की सैगिटल अक्ष वाइब्रेटोम प्लेट के लंबवत हो और कोरोनल अक्ष ब्लेड के समानांतर संरेखित हो। स्लाइस के आसान हैंडलिंग के लिए मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष में लगभग 5 मिमी agarose छोड़ दें।
  4. नमूना धारक के बीच में तेजी से चिपकने वाले विलायक-मुक्त सुपरग्लू की एक छोटी सी बूंद रखें और एक ऐसे क्षेत्र में फैल जाएं जो एगारोज़ ब्लॉक के तल को कवर करेगा।
  5. धीरे से agarose ब्लॉक उठाओ और ऊतक कागज के खिलाफ dabbing द्वारा नीचे सूखी. नमूना धारक के चिपके हुए क्षेत्र पर ब्लॉक रखें, मस्तिष्क के रोस्ट्रल पक्ष के साथ। नमूना धारक को बर्फ पर रखें और गोंद को 1 मिनट के लिए सूखने दें।
  6. एक बार गोंद सूख जाने के बाद, नमूना धारक को बफर ट्रे में रखें।
  7. मस्तिष्क को कोरोनल स्लाइस में 15 डिग्री के कोण पर काटें।
    नोट:: स्लाइस की मोटाई अनुप्रयोग के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यहां, मस्तिष्क को 150 μm की मोटाई पर कटा हुआ था। शीर्ष पर अतिरिक्त agarose trimming और घ्राण बल्ब trimming के लिए 1.0-1.5 मिमी / सेकंड के लिए वाइब्रेमोटम गति सेट करें। विश्लेषण के लिए कॉर्टिकल स्लाइस एकत्र करने के लिए काटने की गति को 0.5 मिमी / सेकंड तक कम करें। अधिकांश वाइब्रेटोम को प्रत्येक स्लाइस को इकट्ठा करने के लिए रोका जा सकता है। यदि स्लाइस की कम गुणवत्ता या एगरोज से ऊतक को अलग करने का अनुभव किया जाता है, तो काटने की गति को कम करने या वाइब्रेटोम ब्लेड को बदलने से मदद मिल सकती है।
  8. साफ स्पैटुला का उपयोग करके, मस्तिष्क स्लाइस एकत्र करें और उन्हें पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) झिल्ली पर रखें, पैराफिन (पांच मस्तिष्क स्लाइस / झिल्ली तक) का उपयोग करके 35 मिमी ग्लास-बॉटम वाले पकवान में स्थिर किया गया (चित्रा 3 एल-एम)।
    नोट: मोम का उपयोग करके 35 मिमी ग्लास-बॉटम वाले पकवान के अंदर PTFE झिल्ली को ठीक करें। यह स्लाइस संस्कृति मीडिया को जोड़ते समय झिल्ली को स्थिर करेगा और इमेजिंग के दौरान भी।
  9. एक 200 μL पिपेट का उपयोग करते हुए, PTFE झिल्ली पर स्लाइस के चारों ओर से अतिरिक्त HBSS-G को हटा दें, जिससे स्लाइस अर्ध-शुष्क हो जाते हैं।
  10. पीटीएफई झिल्ली के नीचे अंतरिक्ष में सीधे स्लाइस मीडिया के 500 μL जोड़ें (35 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म) ।
    नोट:: मीडिया को जोड़ते समय झिल्ली के नीचे कोई बुलबुले नहीं बनना चाहिए। यह बिना किसी मीडिया एक्सचेंज के पूरे या आंशिक स्लाइस छोड़ देगा। संस्कृति में या हर इमेजिंग सत्र के बाद हर 2 दिनों में मीडिया के 200 μL को बदलें।
  11. 5% CO2 के साथ 35 °C पर स्लाइस को इनक्यूबेट करें।

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 1 मिलीलीटर के साथ स्लाइस को ठीक करें - 4% सुक्रोज-प्रति डिश के साथ पूरक। 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: पीएफए को संभालते समय, एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें। एक रासायनिक हुड के तहत निर्धारण चरणों का प्रदर्शन करें, और पीएफए अपशिष्ट का उचित रूप से निपटान करें।
  2. स्लाइस को 5 मिनट के लिए 300 μL PBS के साथ दो बार धोएं। स्लाइस को 24-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रयोग इस चरण में रोका जा सकता है। स्लाइस में PBS-NaN3 जोड़ें और 4 °C पर स्टोर करें। NaN3 एक विषाक्त यौगिक है; इसके साथ समाधान को संभालते समय, एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें। चरण 9.3-9.10 एक कक्षीय शेकर में किया जाना है।
  3. 0.1 एम ग्लाइसिन के 300 μL के साथ स्लाइस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बुझाएं।
  4. 10 मिनट के लिए आरटी 3x पर पीबीएस के साथ ग्लाइसिन को धोएं।
  5. 2 ज के लिए आरटी पर पीबीएस-टी के 300 μL के साथ स्लाइस permeabilise.
  6. 2 घंटे के लिए आरटी पर पीबीएस-टी में 10% बकरी सीरम का उपयोग कर ब्लॉक।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी के 300 μL जोड़ें (1: 200 के कमजोर पड़ने पर एंटी-विमेंटिन एंटीबॉडी; सामग्री की तालिका देखें) पीबीएस-टी समाधान में 10% बकरी सीरम में पतला 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में।
    नोट:: चरण 9.8-9.12 में, प्रतिदीप्ति के नुकसान को रोकने के लिए स्लाइस प्रकाश-सुरक्षित थे।
  8. 20 मिनट के लिए आरटी 3x पर पीबीएस के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी धोएं।
    नोट: पीबीएस का उपयोग पीबीएस-टी के बजाय ट्राइटन एक्स -100 को धोने के लिए किया गया था।
  9. 2 घंटे के लिए RT पर PBS में द्वितीयक एंटीबॉडी के 300 μL जोड़ें (या तो Alexa Fluor 488 या 647 1:400 के कमजोर पड़ने पर; सामग्री की तालिका देखें) 2 घंटे के लिए RT पर।
    नोट: DAPI को 5 मिनट के लिए 1:10,000 के कमजोर पड़ने पर द्वितीयक एंटीबॉडी को हटाने के तुरंत बाद जोड़ा जाता है।
  10. 20 मिनट के लिए RT 3x पर PBS के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी धोएं। आसुत पानी से 1 मिनट के लिए 2x धोएं।
  11. एक ठीक ब्रश का उपयोग करके स्लाइस को कांच की स्लाइड में स्थानांतरित करें, और फिर 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सूख जाएं।
  12. एक जलीय बढ़ते माध्यम का उपयोग करके स्लाइस माउंट करें। बढ़ते मीडिया को क्यूरेट करने के लिए रात भर आरटी पर स्लाइड रखें।

10. इमेजिंग अधिग्रहण

नोट: डीएनए वितरण दृष्टिकोण (IUE या EUE) के बावजूद, स्लाइस का विश्लेषण एक ही विकासात्मक आयु सीमा (E17.5-E18.5) पर किया गया था। IUE न्यूरोनल पूर्वजों को विवो में दो और दिनों के लिए विभाजित करने और विकसित करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, ईयूई, प्रारंभिक विकास की घटनाओं की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है।

  1. चैंबर इनक्यूबेटर पर स्विच करें और इसे इमेजिंग से पहले 5% सीओ2-आदर्श रूप से 4 घंटे के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें- माइक्रोस्कोप घटकों को 35 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने की अनुमति देने के लिए।
  2. स्लाइस की गहरी इमेजिंग के लिए, ऊतक और उद्देश्य के बीच अपवर्तक सूचकांक में बेमेल को कम करने के लिए जल-विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग करें।
    नोट:: यहाँ, सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मोड का उपयोग किया गया था। पीटीएफई झिल्ली के माध्यम से इमेजिंग को एक लंबी काम करने की दूरी (~ 1 मिमी) के साथ एक उद्देश्य की आवश्यकता होती है। यदि एक लंबी काम करने वाली दूरी का उद्देश्य अनुपलब्ध है, तो स्लाइस को 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम वाले पकवान में स्थानांतरित किया जा सकता है। स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए, झिल्ली के शीर्ष पर 1 एमएल स्लाइस मीडिया जोड़ें, और फिर एक स्लाइस उठाने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें और इसे 200 μL मीडिया वाले एक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। स्लाइस को अर्ध-सूखा छोड़ने के लिए 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
  3. इमेजिंग अक्षतंतु वृद्धि के लिए, कम से मध्यम सेल घनत्व के साथ कॉर्टेक्स के एक क्षेत्र का पता लगाएं। इमेजिंग विकास शंकु गतिशीलता के लिए, कॉर्टेक्स के मध्यवर्ती क्षेत्र या सबवेंट्रिकुलर क्षेत्र में एक विकास शंकु का पता लगाएं।
  4. छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में एक z-स्टैक आकार निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें). एक बड़े z-स्टैक में अक्षतंतु वृद्धि के लिए, 2 μm का एक चरण आकार सेट करें। एक छोटे z-स्टैक में विकास शंकु के लिए, 1 μm का एक चरण आकार सेट करें।
    नोट: हमेशा x, y, और z विमानों के माध्यम से विकास शंकु और अक्षतंतु के संभावित आंदोलन के लिए खाते। अक्षतंतु इन विट्रो संस्कृतियों की तुलना में ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों में बहुत अधिक दर से बढ़ते हैं। यहां, छवि अक्षतंतु वृद्धि के लिए लगभग 80 μm का एक z-स्टैक पर्याप्त था। विकास शंकु गतिशीलता के लिए, ~ 6 μm का एक z-स्टैक पर्याप्त था।
  5. एक बड़े क्षेत्र में न्यूरॉन्स के इमेजिंग अक्षतंतु विकास के लिए, एक टाइल स्कैन को परिभाषित करें।
  6. अधिग्रहण के दौरान विरंजन विकास शंकु की संभावना को कम करने के लिए संभव सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग करें।
  7. इमेजिंग अक्षतंतु वृद्धि के लिए, 5 मिनट के अंतराल के साथ 2 घंटे के लिए समय-अंतराल प्राप्त करें। इमेजिंग विकास शंकु गतिशीलता के लिए, 2.5-3 सेकंड के अंतराल के साथ 2-5 मिनट के लिए समय-अंतराल प्राप्त करें।

11. डेटा विश्लेषण

  1. kymographs का उपयोग करके अक्षतंतु विकास की गति को मापें
    1. फ़ाइल > खोलें के माध्यम से फिजी14 में छवि फ़ाइल खोलें और छवि का चयन करें।
    2. अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के > Z-प्रोजेक्शन > स्टैक > छवि > स्टैक के माध्यम से समय-अंतराल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्राप्त करें।
    3. समय-अंतराल के माध्यम से जाओ और एक बढ़ते अक्षतंतु का पता लगाएं।
    4. एक बार स्थित होने के बाद, बढ़ते अक्षतंतु के माध्यम से एक रेखा खींचें। पहले फ्रेम में अक्षतंतु की नोक से शुरू करें, और पूरे समय-अंतराल के माध्यम से अक्षतंतु का पालन करें।
    5. प्लगइन KymoResliceWide का उपयोग कर एक kymograph उत्पन्न करें.
    6. छवि > गुण पर जाकर kymograph के पैमाने सेट करें। पिक्सेल चौड़ाई में μm में दूरी सेट करें और पिक्सेल ऊँचाई में s या मिनट में समय सेट करें.
    7. > उपाय का विश्लेषण करने के लिए जाओ।
      नोट: x-अक्ष के सापेक्ष एक कोण दिया जाएगा।
    8. निम्नलिखित समीकरण में कोण को प्रतिस्थापित करके अक्षतंतु वृद्धि की गति की गणना कीजिये: एक स्प्रेडशीट में SIN(RADIANS(π))/COS(RADIANS(π))
  2. एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके विकास शंकु की मात्रा को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. फ़ाइल > खोलें के माध्यम से छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में छवि फ़ाइल खोलें और रुचि की फ़ाइल का चयन करें।
    2. नई सतहें जोड़ें विज़ार्ड का चयन करें।
      नोट:: निचले-बाएँ कोने पर एक अनुभाग मैन्युअल संपादन के लिए छह चरणों के साथ दिखाई देगा।
    3. चरण 1 में - एल्गोरिथ्म सेटिंग्स के तहत- सेगमेंट केवल रुचि का एक क्षेत्र चुनें। चरण 2 में, सभी फ़्रेमों में संपूर्ण विकास शंकु को फिट करने के लिए फ़्रेम को क्रॉप करें।
    4. चरण 3 में निरपेक्ष तीव्रता के लिए थ्रेशोल्डिंग रखें, और सुनिश्चित करें कि संपूर्ण विकास शंकु क्षेत्र चरण 4 में थ्रेशोल्ड है।
    5. चरण 5 में, फ़िल्टर प्रकार के अंतर्गत Voxels lmg = 1 की संख्या का चयन करें।
      नोट:: अंतिम चरण में, एकाधिक माप सेट बनाए जा सकते हैं। यहां, वॉल्यूम के लिए केवल एक माप बनाया गया था।
    6. सभी निर्माण चरणों को निष्पादित करने के लिए निष्पादन बटन का चयन करें और नई सतहें जोड़ें विज़ार्ड समाप्त करें।
    7. विज़ार्ड विंडो के शीर्ष पर स्थित आँकड़े टैब में, विस्तृत टैब के अंतर्गत विशिष्ट मान और वॉल्यूम का चयन करें.

Representative Results

वर्णित विधि वर्कफ़्लो के साथ प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं. E15.5 चूहों का उपयोग वर्तमान प्रदर्शन में किया गया था, हालांकि यह प्रोटोकॉल E11 से लेकर देर से E17 तक के लगभग सभी भ्रूणीय उम्र के लिए आसानी से अनुकूलित है। इस प्रोटोकॉल में, या तो पूर्व गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन (ईयूई; चित्रा 2A, 2C-I) या गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन (IUE) में; चित्रा 2B, C, और 2J-Q) का उपयोग पार्श्व वेंट्रिकल्स को अस्तर करने वाले पूर्वज न्यूरॉन्स में प्लास्मिड वितरित करने के लिए किया गया था। ये पूर्वज भविष्य के कॉर्टिकल प्रोजेक्टिंग न्यूरॉन्स (सीपीएन) 15,16 का स्रोत हैं। प्लास्मिड मिश्रणों को या तो झिल्ली-लक्षित (लिन) -mNeonGreen (चित्रा 1A) या LifeAct-enhanced (E) GFP (चित्रा 1B) की विरल न्यूरॉन-विशिष्ट अभिव्यक्ति को चलाने के लिए तैयार किया गया था ताकि क्रमशः विकास शंकु में समग्र व्यवहार और एक्टिन गतिशीलता का मूल्यांकन किया जा सके। इसके अलावा, एक प्लास्मिड मिश्रण का उद्देश्य अलग-अलग न्यूरॉन्स को या तो टर्बो (टी) -आरएफपी या ज़ोएंथस एसपी (जेडएस) ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जेडएसग्रीन) (चित्रा 1 सी) के साथ लेबल करना था। यह स्वतंत्र पड़ोसी न्यूरॉन्स से विकास शंकु व्यवहार की निगरानी की सुविधा प्रदान करता है।

इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण से मस्तिष्क विच्छेदन एक महत्वपूर्ण कदम है जिसे उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, जो देशी मस्तिष्क संरचना को संरक्षित करता है। विच्छेदन उपकरणों और वाइब्रेटोम को पहले से तैयार किया गया था और सावधानीसे इथेनॉल-निष्फल (चित्रा 3 ए, बी)। इसके बाद, इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण के सिर को सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया गया था और मस्तिष्क को निकाला गया था। यहां, E15 (चित्रा 3C-F) और E12.5 (चित्रा 3G-J) पर EUE के अधीन भ्रूण से मस्तिष्क के प्रतिनिधि विच्छेदन को दिखाया गया है। मस्तिष्क को तुरंत एक एगारोज़ मैट्रिक्स में संलग्न किया जाता है, कटा हुआ, और इनक्यूबेशन के लिए नीचे-ग्लास डिश के भीतर पीटीएफई झिल्ली आवेषण पर रखा जाता है (चित्रा 3K-M)।

मस्तिष्क स्लाइस की स्वास्थ्य स्थिति विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है। किसी भी संदूषण के लिए एक दृश्य निरीक्षण दैनिक प्रदर्शन किया गया था। इसके अतिरिक्त, एक बार संस्कृति को अंतिम रूप देने के बाद, मस्तिष्क के स्लाइस को तय किया जाता है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के अधीन किया जाता है। यहाँ, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) का उपयोग समग्र सेलुलर संगठन को नियंत्रित करने के लिए किया गया था और ग्लियाल संगठन को प्रकट करने के लिए विमेंटिन धुंधला; विशेष रूप से, रेडियल ग्लिया (आरजी) पाड़। आमतौर पर, सफलतापूर्वक आईयूई या ईयूई से व्युत्पन्न सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस सामान्य सेलुलर वितरण दिखाते हैं जैसा कि डीएपीआई द्वारा पता चला है और एपिकली उन्मुख पियाल-संपर्क प्रक्रियाओं के साथ आरजी की कुछ हद तक संगठित सरणी17 (चित्रा 4 ए, बी क्रमशः)। कभी-कभी, सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइस में आरजी मचान में चिह्नित गड़बड़ी देखी जाती है, विशेष रूप से ईयूई इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 4 सी) से व्युत्पन्न लोगों में। अत्यंत अव्यवस्थित आरजी पाड़ के साथ मस्तिष्क स्लाइस बिगड़ा न्यूरोनल माइग्रेशन और दोषपूर्ण अक्षतंतु विकास (नहीं दिखाया गया है) दिखाते हैं। इसलिए, आरजी पाड़ को नियंत्रित करना विश्वसनीय मस्तिष्क स्लाइस से प्राप्त डेटा को क्रमबद्ध करने के लिए एक आसान पोस्ट-कल्चर विधि है।

Lyn-mNeonGreen-व्यक्त प्लास्मिड मिश्रण के साथ या तो IUE या EUE से व्युत्पन्न मस्तिष्क स्लाइस समान विरल न्यूरॉन लेबलिंग में परिणाम देते हैं। एक प्रतिनिधि पिरामिड CPN Lyn-mNeonGreen और इसके विकास शंकु के गतिशील व्यवहार को व्यक्त करते हुए एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है (चित्रा 5A और पूरक वीडियो 1, ऊपर बाईं ओर)। इसके अलावा, न्यूरॉन्स को एक प्लास्मिड का उपयोग करके लेबल किया गया था, जो सीटू में अक्षीय विकास शंकु की एक्टिन गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक एक्टिन जांच को व्यक्त करता है (चित्रा 5 बी और पूरक वीडियो 1, नीचे बाएं)। सीटू प्रयोगों में भी एक दोहरी-Cre / Dre fluorophore-व्यक्त प्लास्मिड डिजाइन (चित्रा 1 C और पूरक वीडियो 1, सही) के साथ प्रदर्शन किया गया था। इस प्लास्मिड में tRFP या ZsGreen fluorophores विशेष रूप से और व्यक्तिगत रूप से या तो ड्रे या क्रे recombinases द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, क्रमशः, पड़ोसी न्यूरॉन्स (चित्रा 5 C) में। यह प्रयोगात्मक लाइन-अप पड़ोसी संशोधित न्यूरॉन्स (किसी भी दिए गए नुकसान या फ़ंक्शन के लाभ) के साथ नियंत्रण न्यूरॉन्स से विकास शंकु के साथ-साथ विश्लेषण की अनुमति देता है। यह नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थितियों का परीक्षण करने के लिए विभिन्न स्लाइस के उपयोग से उत्पन्न परिवर्तनशीलता को दरकिनार करता है।

रिकॉर्ड की गई फिल्म से उत्पन्न Kymographs का विश्लेषण किया गया था, जिसमें से गतिशील विकास पैरामीटर जैसे कि समय और विकास की लंबाई के साथ protrusive गतिविधि को आसानी से प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 6 ए)। ध्यान दें कि समय-अंतराल के अस्थायी संकल्प में एक साधारण समायोजन 2 घंटे (चित्रा 6 ए) के लिए अक्षतंतु बढ़ाव गति के माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, समय के साथ विकास शंकु की मात्रा की भिन्नता- सामान्य विकास शंकु गतिशील गतिविधि का एक उपाय- आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, इस मामले में लाइसेंस प्राप्त सॉफ़्टवेयर (चित्रा 6 बी और चित्रा 6 ई, एफ) के साथ। इसका उपयोग एक्टिन ट्रेडमिलिंग की गति और विकास शंकु की खोज गतिविधि के दौरान फिलोपोडिया / लैमेलिपोडिया के संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की योजनाएं। (ए) पीसीएजी-लोक्स-स्टॉप-लोक्स-लिन-एमनग्रीन। (बी) पी-टब-अल्फा-1-लाइफएक्ट-जीएफपी। (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pa-lox-ZsGreen-pa. प्लास्मिड घटकों और फ्लोरोफोर की उत्पत्ति के बारे में प्रासंगिक जानकारी बक्से में पाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व गर्भाशय का वर्कफ़्लो और E15.5 चूहों के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में। (ए) एक्स यूटेरो इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए सर्जरी स्टेशन की स्थापना। (बी) गर्भाशय विद्युतीकरण के लिए सर्जरी स्टेशन की स्थापना। (C) गर्भाशय के सींग anesthetized माउस के उदर गुहा के बाहर खींचे गए। (d) गर्भाशय की बोरी से एक भ्रूण का निष्कर्षण। (ई) एक विकर्ण चीरा के माध्यम से पूर्ण रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन द्वारा भ्रूण बलिदान; ध्यान दें कि सिर कलम करने से बचा गया था। (च) धारक में भ्रूण का स्थान और डीएनए/फास्ट ग्रीन मिश्रण के साथ बाएं पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है। (G,H) प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को 60 डिग्री के कोण पर कॉर्टेक्स पर कैथोड (लाल तीर) के साथ रखें। (i) प्रक्रिया के दौरान भ्रूण के फिसलने को रोकने के लिए धारक के बाहर भ्रूण की बाहों (काले तीर) का प्लेसमेंट। (जे) सिर को उजागर करने के लिए गर्भाशय की बोरी के अंदर भ्रूण का रोटेशन। (K,L) गर्भाशय की दीवार के माध्यम से भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल्स में डीएनए / फास्ट ग्रीन मिश्रण का इंजेक्शन। (एम) प्लैटिनम चिमटी इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण के सिर को 60 डिग्री के कोण पर कॉर्टेक्स पर कैथोड (लाल तीर) के साथ रखें। (एन) लॉकिंग सीवन चलाने के माध्यम से टांका मांसपेशी चीरा। (ओ) एक बाधित टांका के माध्यम से टांका त्वचा चीरा. (पी) सर्जिकल घाव क्लिप और betadine का उपयोग कर कीटाणुशोधन का उपयोग कर घाव की सुरक्षा. (क्यू) दूर अवरक्त वार्मिंग प्रकाश के साथ वसूली पिंजरे में माउस की नियुक्ति. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: E15.5 और E12.5 दिमाग और organotypic टुकड़ा संस्कृति प्रक्रिया के निष्कर्षण. (ए) मस्तिष्क निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण। (ख) ऑर्गेनोटाइपिक कल्चर स्टेशन की स्थापना। (C-F) E15.5 मस्तिष्क का निष्कर्षण। (G-J) E12.5 मस्तिष्क का निष्कर्षण। बिंदीदार रेखाएं चीरों के स्थान को उजागर करती हैं। लाल तीर संदंश द्वारा खींचने की दिशा को इंगित कर रहे हैं। (के) मस्तिष्क को 3 सेमी डिश में एम्बेड करना जिसमें 3% कम पिघला हुआ एगारोज़ होता है, जिससे मस्तिष्क के नीचे 1-2 मिमी एगारोज़ स्पेसिंग गैप हो जाता है। (एल) 150 μm मस्तिष्क टुकड़ा का संग्रह. (एम) पीटीएफई झिल्ली पर मस्तिष्क स्लाइस का प्लेसमेंट पैराफिन फिल्म (नीले तीर) का उपयोग करके 35 मिमी डिश में स्थिर हो जाता है। लाल स्टार मार्किंग वाइब्रेटोम (एल) से दिए गए मस्तिष्क स्लाइस संग्रह और पीटीएफई झिल्ली (एम) में इसके हस्तांतरण को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्वस्थ organotypic स्लाइस में संरक्षित रेडियल ग्लियाल सेल संरचना। E17.5 मस्तिष्क स्लाइस की कॉन्फोकल छवियां आरजी सरणी (विमेंटिन; ग्रीन) और समग्र सेल संगठन (डीएपीआई; मैजेंटा) को आईयूई (ए) और ईयूई (बी, सी) के बाद प्रकट करती हैं। RG सरणी में मजबूत गड़बड़ी जो कभी-कभी EUE (C) से परिणाम हो सकता है नोट करें। आवर्धन मुख्य चित्र में लाल बिंदीदार फ़्रेम के अनुरूप हैं: स्केल बार, 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: तीव्र organotypic स्लाइस में विकास शंकु गतिशीलता के सीटू विज़ुअलाइज़ेशन में. (A, B) न्यूरॉन्स और उनके संबंधित विकास शंकु क्रमशः लिन-एम नियोनग्रीन और लाइफएक्ट-जीएफपी के साथ लेबल किए गए हैं। लिन-एमनग्रीन के लाल तारे के विकास शंकु को चिह्नित करने वाले न्यूरॉन को व्यक्त करते हैं। Blue तारांकन LifeAct-GFP न्यूरॉन व्यक्त के विकास शंकु को चिह्नित करता है। (सी) पड़ोसी न्यूरॉन्स को दोहरी प्लास्मिड प्रणाली के साथ लेबल किया जाता है जिसमें टीआरएफपी (मैजेंटा) और जेडएसग्रीन (हरा) और उनके संबंधित विकास शंकु होते हैं। विकास शंकु (दाएं) कैप्चर किए गए फ्रेम (बाएं) के बाहर थे, जो विकास शंकु समय-अंतराल प्राप्त करने के तुरंत बाद प्राप्त किए गए थे; स्केल बार, 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: अक्षतंतु वृद्धि की गति और वृद्धि शंकु आयतन का विश्लेषण। (A) एक न्यूरॉन पर अक्षतंतु अनुरेखण Lyn-mNeonGreen (शीर्ष) और इसके संबंधित kymograph (नीचे) को व्यक्त करता है जो ImageJ का उपयोग करके उत्पन्न होता है। (बी) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (शीर्ष) का उपयोग करके विकास शंकु के जेड-स्टैक वीडियो का पुनर्निर्माण और सतहों के माप उपकरण (नीचे) का उपयोग करके हाइलाइट किए गए एक ही विकास शंकु। (c) कई अक्षतंतुओं के लिए समय के साथ विकास की गति में परिवर्तन दिखाने वाले ग्राफ। (d) अक्षतंतुओं की औसत वृद्धि गति (C) में निर्धारित की जाती है। (ई) समय के साथ वृद्धि शंकु आयतन में परिवर्तन को दर्शाने वाला ग्राफ। (च) वृद्धि शंकुओं की औसत मात्रा (ई) में निर्धारित की जाती है; स्केल बार, 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: रेडियल माइग्रेशन और पिरामिड कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का न्यूरोनल ध्रुवीकरण। पिरामिड कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (गुलाबी) के विकास को दर्शाने वाला आरेख जो जर्मिनल वेंट्रिकुलर ज़ोन (वीजेड) से पिया सतह की ओर रेडियल रूप से माइग्रेट करता है। रेडियल ग्लिया प्रक्रियाओं (ग्रे) द्वारा निर्देशित, ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स को माइग्रेट करना एक प्रमुख प्रक्रिया, भविष्य के डेंड्राइट, और अनुगामी प्रक्रिया, भविष्य के अक्षतंतु को स्थापित करता है, जो मध्यवर्ती क्षेत्र (आईजेड) की ओर नीचे की ओर विस्तारकरना जारी रखता है। धराशायी लाल बक्से कॉर्टिकल क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां विकास शंकु को चित्रित किया गया था। विशेष रूप से आईजेड, सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) में, या अक्षतंतु बंडलों (हरे रंग) में शामिल होना। चित्रण एक वेब-आधारित उपकरण के साथ बनाया गया था, BioRender.com। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लास्मिड एकाग्रता (μg/μL) इच्छित उपयोग
पीसीएजी-लोक्स-स्टॉप-लोक्स-लिन-एमनग्रीन 0.25 झिल्ली लक्षित प्रोटीन का लेबलिंग (लिन)
+ +
p-Tub-alpha-1-iCre 0.08
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP 0.125 फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) विकास शंकु में लेबलिंग
pCAG-lox-rox-stop-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen 1 पड़ोसी न्यूरॉन्स की दो आबादी का स्वतंत्र लेबलिंग
+ +
p-Tub-alpha-1-iCre 0.004
+ +
p-Tub-alpha-1-Dre 0.2

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड की सूची। नाम, एकाग्रता, और प्रत्येक उपयोग किए गए प्लास्मिड का इच्छित उपयोग।

अनुपूरक वीडियो 1: तीव्र organotypic स्लाइस में विकास शंकु गतिशीलता के सीटू विज़ुअलाइज़ेशन में. Lyn-mNeonGreen (ऊपर बाईं ओर) और LifeAct-GFP (नीचे बाएं) के साथ लेबल किए गए विकास शंकु की गतिशीलता। पड़ोसी विकास शंकु को दोहरी प्लास्मिड प्रणाली के साथ अलग-अलग लेबल किया जाता है जिसमें टीआरएफपी (मैजेंटा; शीर्ष दाएं) और जेडएसग्रीन (हरा; नीचे दाएं) होता है। इमेजिंग अंतराल, 2.5 सेकंड। स्केल सलाखों, 5 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

विकास शंकु एक साथ अक्षतंतु विस्तार और मार्गदर्शन का समन्वय करने के लिए अपने आसपास के वातावरण को कैसे समझते हैं और प्रतिक्रिया करते हैं, यह अभी भी बहस का विषय है 3,18। 2 डी सब्सट्रेट्स में अग्रणी अध्ययनों ने मौलिक आणविक तंत्र में एक झलक प्रदान की जो अक्षतंतु गठन, आउटग्रोथ और नेविगेशन 2,10,11,12,19 के दौरान विकास शंकु गतिशीलता को चलाने वाली ताकतों को उत्पन्न करती है। हाल ही में, 3 डी आव्यूहों में अध्ययन से पता चला है कि विकास शंकु के व्यवहार में तीसरे आयाम का कितना प्रभाव पड़ता है और परिणामस्वरूप अक्षतंतु विकास 8,9 में होता है। फिर भी, विवो में विकास शंकु गतिशीलता को निर्देश देने वाले जटिल तंत्रों की पूरी तरह से जांच की जानी बाकी है।

IUE या EUE दिमाग से organotypic स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और अच्छी तरह से प्रलेखित है। यह एक सुनहरा मानक बन गया है जो वैज्ञानिकों को जीवित मस्तिष्क ऊतक20,21 में न्यूरॉन्स के विकास और व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति देता है। दरअसल, इस तकनीक का सफलतापूर्वक विभिन्न उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों के साथ संयोजन में उपयोग किया गया है ताकि सीटू में विशिष्ट आणविक प्रक्रियाओं और रूपात्मक घटनाओं की कल्पना की जा सके। इस तरह के अध्ययनों में शामिल हैं, लेकिन अक्षतंतु गठन और विस्तार19,22, कॉर्टिकल न्यूरोनल माइग्रेशन 19,22,23,24, सेंट्रोसोम गतिशीलता25,26, सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता 27, साथ ही साथ पूर्व-और पोस्टसिनेप्टिक डिब्बों की कार्यात्मक गतिशीलता28,29 तक सीमित नहीं हैं।

यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक न्यूरोबायोलॉजी में एक अंतर को संबोधित करता है, जो सीटू में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के विकास की विकास शंकु गतिशीलता को विज़ुअलाइज़ करता है, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों में, और प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपकरण।

इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग किया गया था क्योंकि वे (1) कुछ अभ्यास के साथ, उत्पन्न करना आसान है; (2) एक अर्ध-पूरी तरह से शारीरिक वातावरण में एम्बेडेड विकास शंकु का अध्ययन करने के लिए एक सुलभ प्रणाली प्रस्तुत करें, फिर भी उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देने के लिए पर्याप्त पारदर्शी; (3) ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के असंख्य के साथ इसके उपयोग के लिए विस्तारित किया जा सकता है; (4) या तो IUE या EUE के साथ संयुक्त, फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों और साइटोस्केलेटन जांच के साथ-साथ फ़ंक्शन शासनों के नुकसान / लाभ के तहत विवो में विकास शंकु और अक्षतंतुओं के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए आणविक उपकरण प्रदान करने के लिए लगभग असीमित क्षमता प्रदान करते हैं।

इस पद्धति को EUE और IUE दोनों के संदर्भ में वर्णित किया गया था। हालांकि अभी भी एक अत्यधिक विश्वसनीय विधि है, ईयूई के परिणामस्वरूप मस्तिष्क स्लाइस की एक बढ़ी हुई घटना एक वितरण विधि (चित्रा 4 सी) के रूप में आईयूई के साथ प्राप्त लोगों की तुलना में एक अव्यवस्थित आरजी नेटवर्क दिखा रही है। आरजी सरणी में गड़बड़ी न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु बढ़ाव30,31 के पैटर्न को दृढ़ता से प्रभावित करती है। ये प्रमुख पैरामीटर हैं जो भविष्यवाणी करते हैं कि किसी दिए गए समय में विश्लेषण के लिए अक्षतंतु कहां खोजने हैं और वे किस प्रकार के वातावरण को नेविगेट कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण रूप से बाधित आरजी नेटवर्क के साथ मस्तिष्क स्लाइस में आमतौर पर बिगड़ा हुआ कॉर्टिकल न्यूरॉन स्तरीकरण होता है। यह, बदले में, अराजक प्रक्षेपवक्र के साथ अक्षतंतु का उत्पादन करता है। इसलिए, यह दृढ़ता से RG नेटवर्क की संरचनात्मक अखंडता के लिए नियंत्रण करने के लिए अनुशंसित है। दिलचस्प बात यह है कि खराब संरचनात्मक अखंडता भ्रूण मस्तिष्क की बढ़ती उम्र के साथ संबंधित है। दरअसल, छोटे E12.5-E13.5 भ्रूण में इस तरह के प्रभाव आमतौर पर19 नहीं देखे गए थे।

वर्तमान प्रोटोकॉल पूरी तरह से और सीधा है। फिर भी, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जहां इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए विशेष देखभाल और ध्यान दिया जाना चाहिए। इन्हें प्रोटोकॉल में स्पष्ट रूप से नोट किया गया है और इसमें शामिल हैं (1) विरल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन में उपयोग किए जाने वाले डीएनए की मात्रा को ट्यूनिंग करना; (2) मस्तिष्क के निष्कर्षण के दौरान क्षति से बचना; (3) मस्तिष्क आवरण के दौरान agarose के तापमान को नियंत्रित; (4) किसी दिए गए उम्र के दिमाग के लिए एगारोज़ के आदर्श प्रतिशत का समस्या निवारण; और (5) fluorophores का चयन, जिसका अनुभव इस प्रकार है। प्रोटोकॉल अनुकूलन के दौरान, सीटू इमेजिंग में लाइव-सेल में कई फ्लोरोफोर के प्रदर्शन का परीक्षण किया गया था। LifeAct की तैयारी के लिए मोनोमेरिक GFP वेरिएंट EGFP और नियॉनग्रीन- और लिन-टैग किए गए प्लास्मिड को इस प्रोटोकॉल (चित्रा 5A, B) के लिए चुना गया था। इसके अतिरिक्त, RFP संस्करण mScarlet का परीक्षण किया गया था और इस सेट-अप (डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए अत्यधिक उपयुक्त पाया गया था। Multimeric tRFP (dimer) और ZsGreen (tetramer) (चित्रा 5C और पूरक वीडियो 1, दाएं) का भी परीक्षण किया गया था। इन तेजी से तह सुपर उज्ज्वल fluorophores की सिफारिश की जाती है जब विधि को डीएनए वितरण के बाद तेजी से फ्लोरोसेंट सिग्नल पीढ़ी की आवश्यकता होती है।

स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग करने में एक आम अभ्यास नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थितियों का परीक्षण करने के लिए विभिन्न दिमागों से स्लाइस का उपयोग करना है। यह अवांछित परिवर्तनशीलता के एक अंतर्निहित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, एक अभिव्यक्ति प्रणाली जो पहचान के लिए पड़ोसी न्यूरॉन्स और पत्रकारों की अभिव्यक्ति के स्वतंत्र संशोधन को सक्षम बनाती है, का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि इस प्रदर्शन (चित्रा 5 सी) में, न्यूरॉन्स के बीच कोई अंतर नहीं था जो फ्लोरोफोर्स में से किसी को भी व्यक्त करता है। हालांकि, एक उदाहरण के रूप में, इस तरह के एक प्लास्मिड मिश्रण को एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के साथ जोड़ा जाता है जो एक क्रे-संवेदनशील जीन को आश्रय देता है, टीआरएफपी (ड्रे-संवेदनशील) न्यूरॉन्स के साथ लेबल करेगा जो जंगली प्रकार के रूप में बने रहे। इसके विपरीत, ZsGreen (भी Cre-sensitive) recombined न्यूरॉन्स लेबल करेगा। इसलिए, दो अलग-अलग जीनोटाइप के विकास शंकु, और संभवतः फेनोटाइप्स, एक ही मस्तिष्क स्लाइस में एक साथ-साथ अध्ययन किया जा सकता है।

विश्लेषण के लिए अक्षतंतुओं और विकास शंकुओं का स्थानीयकरण एक महत्वपूर्ण विचार है। कॉर्टिकल न्यूरॉन्स ध्रुवीकृत होते हैं जबकि रेडियल रूप से वेंट्रिकुलर ज़ोन (वीजेड) से कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) की ओर पलायन करते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, न्यूरॉन्स एक प्रमुख प्रक्रिया (एक भविष्य के डेंड्राइट) और एक अनुगामी प्रक्रिया बनाते हैं जो अक्षतंतु बन जाएगा, अंततः मध्यवर्ती क्षेत्र (आईजेड) में अग्रणी अक्षतंतुओं में शामिल हो जाएगा, अक्षतंतु ट्रैक्ट32 की स्थापना करता है। इसलिए, अक्षीय विकास शंकु को पकड़ने के लिए, इमेजिंग आईजेड में चेताक्षीय फाइबर पर किया गया था, जिसमें सीपी से बाहर निकलने वाले अक्षतंतु और पहले से ही अक्षीय बंडलों से जुड़े शुरुआती उत्पन्न अक्षतंतु शामिल थे; या अंततः, फाइबर में जो आईजेड को अनुप्रस्थ करते हैं और इसके नीचे विस्तारित होते हैं (चित्रा 7)।

यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस के भीतर न्यूरॉन्स के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को निष्पादित करना संभव बनाता है। ऐतिहासिक रूप से, मोटे नमूनों की इमेजिंग करते समय प्रकाश प्रकीर्णन एक महत्वपूर्ण समस्या का सामना करना पड़ा। पिछले दो दशकों में, ऑप्टिकल प्रौद्योगिकियों में व्यापक प्रगति ने मोटे नमूनों की इमेजिंग को संभव बना दिया। यहां, एक लंबी काम करने वाली दूरी के उद्देश्य का उपयोग छोटी संरचनाओं को बेहतर ढंग से देखने के लिए किया गया था, जैसे कि विकास शंकु। अपरिहार्य रूप से, यह प्रोटोकॉल प्रतिगामी एक्टिन प्रवाह या सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता जैसी अधिक विस्तृत घटनाओं को कैप्चर नहीं करता है। लंबी दूरी का उद्देश्य, जिसके लिए कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) की आवश्यकता होती है, मोटी स्लाइस से जानकारी को संरक्षित करता है। हालांकि, कम काम करने की दूरी के उद्देश्यों के साथ उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना भी संभव था। इसके लिए संरचनात्मक अखंडता को संरक्षित करने के लिए ग्लास-बॉटम वाले पकवान में स्लाइस के चिकनी हस्तांतरण की आवश्यकता थी। हालांकि, इस विधि का उपयोग करने के परिणामस्वरूप गैस विनिमय के नुकसान के कारण कम उत्तरजीविता-~ 15 एच-(डेटा नहीं दिखाया गया है)। 2 डी संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी में विकास शंकु एक बड़ी मात्रा पर कब्जा कर लेते हैं और जेड-अक्ष में आंदोलन-आर्टिफैक्ट मुआवजे की आवश्यकता होती है। विस्तृत घटनाओं की छवि बनाने की क्षमता बढ़ाने के लिए, आधुनिक confocal प्रौद्योगिकी का उपयोग किया जाना चाहिए। इसलिए, एक तेजी से स्कैनिंग z-स्टैक मोटर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि अत्यधिक संवेदनशील कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप33 पर उपलब्ध z-Galvo।

ध्यान दें, यह प्रोटोकॉल तीन मुख्य सीमाओं को प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, विवो में किसी भी दिए गए प्लास्मिड की अभिव्यक्ति / व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के स्तर को नियंत्रित करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। यह एक ही प्लास्मिड एकाग्रता को बनाए रखते हुए भी सभी स्लाइस के बीच परिवर्तनशीलता का परिचय देता है। इसलिए, उपयोग किए गए अभिव्यक्ति वैक्टर में नियामक तत्वों का चयन देखभाल के साथ पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए। दूसरा, झिल्ली आवेषण का उपयोग करके विस्तृत घटनाओं की इमेजिंग वर्तमान में संभव नहीं है। इस दूसरी सीमा को पिछले पैराग्राफ में प्रस्तावित पद्धतिगत अपडेट के साथ दूर किया जा सकता है। अंत में, विकास शंकु अत्यधिक फोटोसेंसिटिव होते हैं और जल्दी से फोटोब्लीच हो सकते हैं। इसलिए, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 5 मिनट के रूप में कम से कम विकास शंकु की लगातार इमेजिंग अक्सर विकास शंकु को ध्वस्त कर सकती है। इस संबंध में, प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी उत्पन्न उपकरणों में नई प्रगति को मस्तिष्क स्लाइस34 की दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस तरह के प्रोटोकॉल को नए शोध मार्गों को खोलने के लिए कल्पना की जाती है, जिससे विकास शंकु को विवो वातावरण में एक जटिल की ओर पढ़ने और प्रतिक्रिया करने के लिए क्या होता है, और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परिष्कृत इंटरप्ले के यांत्रिकी को उजागर करने के लिए बेहतर समझ मिलती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रक्रियाओं की तस्वीर लेने के लिए मारिया यूजेनिया बर्निस को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम एमिली बर्नसाइड, एमिली हैंडली, थोरबेन पिएट्रेला, मैक्स शेल्स्की और सीना स्टर्न को पांडुलिपि को पढ़ने और चर्चा करने के लिए भी धन्यवाद देते हैं। हम अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायकों, जेसिका गोनर, ब्लांका रैंडेल और Anh-Tuan Pham के आभारी हैं। हम DZNE की प्रकाश माइक्रोस्कोप सुविधा और पशु सुविधा के मूल्यवान समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस काम को ड्यूश Forschungsgesellschaft (DFG), पैराप्लेजिया (IRP) में अनुसंधान के लिए अंतर्राष्ट्रीय फाउंडेशन, और जीवन के लिए पंख (F.B के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। एफ.B उत्कृष्टता क्लस्टर ImmunoSensation2, SFBs 1089 और 1158 का एक सदस्य है, और रोजर डी Spoelberch पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin antibody sigma-Aldrich V2258-.2ML Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044
Betadine B. Braun 3864154
Biozym Sieve GP Agarose Biozyme 850080
Braunol, Sprühflasche B. Braun 3864073
Buprenorphine (Temgesic) GEHE Pharma 345928
DAPI sigma-Aldrich D9542
DMZ unevirsal electrode puller Zeitz NA
Electric razor Andes NA ProClip UltraEdge Super 2-Speed model
Enrofloxacin (Baytril) Bayer 3543238 2,5% (wt/vol)
Eppendorf microloader pipette tips FischerScientific 10289651
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Dye content ≥ 85 %
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10500064
Fiji 2.1.0 NIH NA https://imagej.net/software/fiji/downloads
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09 ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD5040-100
Fluoromount Aqueous Mounting Medium sigma-Aldrich F4680-25ML
Glucose MedPex 3705391 5%
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Glycine Sigma-Aldrich G8898
HBSS Life Technologies 14025092 calcium, magnesium, no phenol red
Horse serum Pan-Biotech P30-0711
Imaris 9.7.2 Bitplane NA https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
Isoflurane Virbac NA
Isotonic saline solution B. Braun 8609261 0.90%
Leica VT1200 S vibratome Leica 14048142066
LSM 880 with Airyscan Zeiss NA
Metacam Venusberg Apotheke 8890217 5 mg/ml
Mice Janvier Labs NA C57BL/6JRj
Micro-Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210  16.16.27
Microsoft Excel Microsoft NA https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture Insert EMD Millipore PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm
Moria Perforated Spoons Fine Science Tools 10370-18
Moria Spoon Fine Science Tools 10321-08
Neurobasal Medium, minus phenol red ThermoFisher Scientific 12348017
Neuropan-2 supplement Pan-Biotech P07-11010
Normal goat serum Abcam ab138478
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors Fine Science Tools 12002-12
p-Tub-alpha-1-Dre Addgene 133925
p-Tub-alpha-1-iCre Addgene 133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP Addgene 175437
Parafilm VWR 52858-000
Paraformaldehyde sigma-Aldrich P6148
PBS Sigma-Aldrich P3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen Addgene 175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen Addgene 175257
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
PicoNozzle Kit v2 World Precision Instruments 5430-ALL
Platinum Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0487 1 mm / 3 mm
QIAGEN Maxi kit QIAGEN 12162
Reflex wound closure Clip World Precision Instruments 500344-10 7 mm
Sekundenkleber Pattex Mini Trio Lyreco 4722659
Square wave electroporation system ECM830 Harvard Apparatus W3 45-0052
Sterile gauze Braun Askina 9031216
Sterile lubricant eye ointment Bayer Vital PZN1578675
Sterile surgical gloves Sempermed 14C0451
Sucrose Roth 4621.2
Supramid 5-0 surgical silk sutures B. Braun NA
Thin-wall glass capillaries World Precision Instruments TW100-4
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-03
µ-Slide 8 Well Glass Bottom Ibidi 80827

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तंत्रिका विज्ञान अंक 176
<em>सीटू में</em> तीव्र <em>पूर्व वीवो</em> भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों में अक्षतंतु विकास और विकास शंकु गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन
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Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S.… More

Alfadil, E., Bradke, F., Dupraz, S. In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures. J. Vis. Exp. (176), e63068, doi:10.3791/63068 (2021).

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