Summary
Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.
Abstract
Tijdens neuronale ontwikkeling navigeren axonen door de corticale omgeving om hun eindbestemming te bereiken en synaptische verbindingen tot stand te brengen. Groeikegels - de sensorische structuren aan de distale uiteinden van zich ontwikkelende axonen - voeren dit proces uit. Het bestuderen van de structuur en dynamiek van de groeikegel is cruciaal voor het begrijpen van axonale ontwikkeling en de interacties met het omliggende centrale zenuwstelsel (CZS) die het mogelijk maken om neurale circuits te vormen. Dit is essentieel bij het bedenken van methoden om axonen te re-integreren in neurale circuits na letsel in fundamenteel onderzoek en preklinische contexten. Tot nu toe is het algemene begrip van groeikegeldynamiek voornamelijk gebaseerd op studies van neuronen gekweekt in twee dimensies (2D). Hoewel ongetwijfeld fundamenteel voor de huidige kennis van de structurele dynamiek van de groeikegel en de reactie op stimuli, geven 2D-studies een verkeerde voorstelling van de fysiologische driedimensionale (3D) omgeving die neuronale groeikegels tegenkomen in intact CZS-weefsel. Meer recent werden collageengels gebruikt om enkele van deze beperkingen te overwinnen, waardoor het onderzoek naar neuronale ontwikkeling in 3D mogelijk werd. Zowel synthetische 2D- als 3D-omgevingen missen echter signaalsignalen in CNS-weefsel, die de uitbreiding en pathfinding van ontwikkelende axonen sturen. Dit protocol biedt een methode voor het bestuderen van axonen en groeikegels met behulp van organotypische hersenplakken, waar zich ontwikkelende axonen fysiologisch relevante fysische en chemische signalen tegenkomen. Door fijn afgestemde in utero en ex utero elektroporatie te combineren om fluorescerende reporters spaarzaam te leveren, samen met superresolutiemicroscopie, presenteert dit protocol een methodologische pijplijn voor de visualisatie van axon- en groeikegeldynamica in situ. Verder is een gedetailleerde toolkit-beschrijving van de analyse van langetermijn- en live-cell imaging-gegevens opgenomen.
Introduction
Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen die de basis computationele eenheid in het zenuwstelsel vertegenwoordigen. Ze ontvangen en zenden informatie uit die afhankelijk is van compartimentering van invoer- en uitvoerlocaties: dendrieten en axonen, respectievelijk1. Tijdens de ontwikkeling breiden axonen zich uit terwijl ze door een ongelooflijk complexe omgeving navigeren om hun bestemming te bereiken. Axonnavigatie wordt geleid door de groeikegel, een sensorische structuur aan de punt van het zich ontwikkelende axon. De groeikegel is verantwoordelijk voor het detecteren van omgevingssignalen en deze te vertalen in de dynamische ruimtelijke reorganisatie van zijn cytoskelet 2,3. De resulterende morfo-mechanische reacties instrueren de groeikegel om zich uit te breiden of terug te trekken van de triggering cue, wat leidt tot specifieke axonmanoeuvres.
Het huidige begrip van axonuitbreiding en groeikegeldynamica komt voort uit studies die axongroei evalueren over tweedimensionale (2D) substraten 2,4,5,6,7. Deze baanbrekende studies identificeerden een geavanceerd samenspel tussen groeikegels en groeisubstraten en onthulden opvallende verschillen afhankelijk van substraatkenmerken zoals kleefkracht en stijfheid 8,9. Onder leiding van deze inzichten werden extracellulaire omgevingssignalen verondersteld axongroei te dicteren, waarbij het cytoskelet van de groeikegel deze groei uitvoerde 2,10,11,12. Met name neuronen kunnen axonen uitbreiden in niet-klevende substraten (bijv. Poly-lysine, poly-ornithine)13. Bovendien kan substraatstijfheid de axongroeisnelheid beïnvloeden, onafhankelijk van cellijmcomplexen8. Daarom kan het bestuderen van groeikegeldynamica in 2D-substraten alleen niet nauwkeurig de balans van krachten modelleren die voortvloeien uit de interactie van axonale groeikegels met fysiologisch relevante driedimensionale (3D) omgevingen, zoals die in vivo worden gevonden.
Om de beperkingen van de 2D-assays te overwinnen, zijn axongroei en groeikegeldynamica bestudeerd in 3D-matrices 8,9. Deze matrices vormen een meer fysiologische context, maar maken het mogelijk om cel-intrinsieke mechanismen van axongroei te bestuderen. Het maakt groeikegelonderzoek op een eencellige manier mogelijk in verschillende omstandigheden en farmacologische behandelingen9. In dergelijke 3D-omgevingen vertoonden axonen een duidelijke cytoskeletdynamiek en groeiden ze sneller dan die waargenomen in 2D-gekweekte neuronen9. Deze elegante studies toonden de invloed aan van een extra dimensie op de reorganisatie van het groeikegelcytoskelet en bijgevolg op het gedrag ervan.
Ondanks de schijnbare voordelen van 3D-matrices ten opzichte van 2D-oppervlakken bij het ondersteunen van native-achtige neuronale ontwikkeling en axongroei, blijven ze een vereenvoudigde synthetische steiger die de complexiteit van de dynamiek die wordt waargenomen in weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) niet kan weerspiegelen. Hier werd de levering van reporter plasmiden door ex utero en in utero elektroporatie gecombineerd met hersen organotypische slice cultuur en in situ live superresolutie beeldvorming om de dynamiek van de groeikegel binnen een fysiologische context te analyseren. Deze methodologie maakt visualisatie van ontwikkelende axonen mogelijk terwijl de 3-dimensionaliteit van in vivo omgevingen en de complexiteit van de fysisch-chemische samenstelling ervan worden ervaren. Ten slotte worden gebruiksvriendelijke procedures beschreven om axongroei en groeikegeldynamiek te meten met behulp van algemeen gelicentieerde en openbaar beschikbare software.
Protocol
Dierproeven moeten voldoen aan de relevante institutionele en federale regelgeving. Embryonale dag 15,5 en 12,5 (E15,5 en E12,5) zwangere vrouwelijke C57BL/6JRj muizen werden gebruikt in dit protocol. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de dierenwelzijnswet van het Landesamt für Natur (Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) van de deelstaat Noordrijn-Westfalen.
1. Bereiding van plasmiden voor injectie
- Isoleer DNA met behulp van endotoxinevrije Maxiprep-kit volgens het protocol van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
- Meng geselecteerd DNA in de gewenste concentratie (tabel 1) en 10% Fast Green-oplossing (zie tabel met materialen) om de afgifte van DNA-mengsel in hersenventrikels te visualiseren.
OPMERKING: Specifieke plasmiden werden gebruikt voor schaarse labeling van de corticale neuronen (figuur 1A), filamenteuze actine (F-actine) structuren in de groeikegel (figuur 1B) en dubbele labeling van de groeikegels binnen dezelfde cortex (figuur 1C). Alle plasmiden (tabel 1) die in dit protocol worden gebruikt, zijn gedeponeerd in Addgene (zie tabel met materialen). - Bereid glazen haarvaten voor met behulp van een capillaire elektrodetrekkerset volgens het volgende programma: druk: 500, warmte: 800, trek: 30 en snelheid: 40.
- Laad 15 μL DNA/Fast Green-mix in elk glazen capillair met behulp van pipetpunten van de microlader.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. - Bewaar met DNA gevulde haarvaten in een schaal van 10 cm met een stuk modelleerklei over de diameter van de schaal. Haarvaten kunnen de dag voor het experiment bij 4 °C worden geladen en bewaard. Sluit de achterkant van het capillair af met flexibele film om uitdroging te voorkomen.
2. Bereiding van oplossingen
- Bereid Hank's gebufferde zoutoplossing aangevuld met glucose (HBSS-G).
- Voeg 0,5% van 20% glucosevoorraad toe aan een fles 1x HBSS. Meng goed en bewaar tot 2 weken bij 4 °C. Voor de embryo-extractie, bel HBSS-G-oplossing met carbogen (95% O2 en 5% CO2) met behulp van borrelende steen kort voor embryoverzameling.
- Slice media-oplossing
- Bereid verse plakmedia met Neurobasal 1x, 5% paardenserum, 5% foetaal kalfsserum, B27 supplement 1:50, L-glutamin supplement 1:400, penicilline-streptomycine 1:200, en Neuropan-2 supplement 1:100 (bij pH = 7,3), onder steriele omstandigheden (zie Tabel met materialen).
- Bereid gerechten van 3 cm met elk 1 ml plakjes. Plaats in de incubator bij 35 °C met 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur vóór het experiment om de pH van de media in evenwicht te brengen door middel van gasuitwisseling.
OPMERKING: Media pH-equilibratie wordt veroorzaakt door verzuring van de media door de CO2 uit de incubator. Slice media kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
- Agaroseoplossing met laag smeltpunt (3%)
- Weeg de gewenste hoeveelheid agarosepoeder met laag smeltpunt af en los op in een geschikt volume van 1x HBSS-G in een glazen fles. Ongeveer 7 ml agarose-oplossing per hersenen is nodig.
- Plaats de fles gedurende 2-3 minuten in een magnetron, met de dop los geplaatst, en schud elke 10-20 s.
- Zodra het poeder volledig is opgelost, plaatst u de fles ten minste 1 uur vóór het experiment in een waterbad of kralenbad dat op 37 °C is ingesteld, zodat agarose kan afkoelen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de agarose tweemaal gedurende 15 minuten te verwarmen om ervoor te zorgen dat het agarosepoeder wordt opgelost. Dit is cruciaal voor de juiste hechting van agarose aan hersenweefsel. Een thermometer moet worden gebruikt om de temperatuur van de agarose-oplossing te meten terwijl de hersenen worden ingesloten, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat deze tussen 37-40 ° C ligt. Hersenen van verschillende oude dieren hebben verschillende stijfheid. Het wordt aanbevolen om een reeks agaroseconcentraties te testen om homogeniteit tussen weefsel en agarose te vinden. - Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,2% natriumazide (PBS-NaN3).
OPMERKING: Oplossingen beschreven in stappen 2.4-2.5 zijn voor gebruik in de latere immunohistochemische stap.
3. Voorbereiding van het operatiestation
- Reinig het operatiestation met 70%-96% ethanol en plaats de ondervloer op het oppervlak van het station.
- Steriliseer de operatie-instrumenten door te spoelen met 70% -96% ethanol, gevolgd door droge sterilisatie in een hete kralensterilisator.
- Reinig platina pincetelektroden (zie materiaaltabel) met 70%-96% ethanol voordat u deze aansluit op de pulsgenerator.
- Plaats een DNA/Fast Green-gevuld glazen capillair in de capillaire houder. Breek onmiddellijk voor gebruik de capillaire punt voorzichtig af met een fijne schaar en test de vloeistofstroom in een microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met voorverwarmde zoutoplossing of water.
OPMERKING: Figuur 2A,B toont de opstelling van het operatiestation en de hulpmiddelen die worden gebruikt voor ex utero-elektroporatie (EUE) en in utero-elektroporatie (IUE). - Voor IUE, warm zoutoplossing op tot 37 °C in een waterbad.
4. Embryo-extractie
- Plaats de zwangere muis in de anesthesie-inductorkamer met 5% isofluraan totdat de muis diep is verdoofd. Bevestig de anesthesie door de afwezigheid van pedaalontwenningsreflex.
- Breng de muis over naar een operatieonderlaag en houd isofluraan op 1,5% -2% door een neuskegel.
- Breng zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Scheer de buik van de muis en gebruik vervolgens 70% -96% met ethanol doordrenkt gaas om geschoren haar te verwijderen. Maak het gebied schoon met betadine.
- Maak met behulp van een steriele kleine chirurgische schaar een huidincisie van 2 cm langs de buikmiddenlijn, gevolgd door een spierincisie van 1,5 cm.
OPMERKING: De grootte van de incisie is afhankelijk van de grootte van het embryo. Inderdaad, grotere embryo's hebben een grotere incisie nodig om hun extractie te accommoderen. - Snijd een gat in het midden van het gaas dat breed genoeg is om in de huidincisie (~ 2 cm in diameter) te passen, week het met warme zoutoplossing en plaats het rond de buikopening.
- Trek beide baarmoederhoorns eruit met een wattenstaafje gedrenkt in warme zoutoplossing of met een tang, waarbij je voorzichtig de ruimtes tussen de embryo's vastpakt om ze eruit te trekken. Plaats embryo's op nat gaas (figuur 2C).
OPMERKING: Zelfs een kleine schade aan bloedvaten en haarvaten rond de baarmoederhoorns zal waarschijnlijk resulteren in overvloedige bloedingen. Vermijd daarom te allen tijde directe behandeling van deze gevasculariseerde gebieden. - Snijd de baarmoederzak open en verwijder elk embryo (figuur 2D).
- Euthanaseer elk embryo onmiddellijk na extractie via een dalende diagonale snede, waardoor een volledige dwarsdoorsnede van het ruggenmerg wordt gegarandeerd (figuur 2E).
- Leg de embryo's in een schaal van 10 cm met HBSS-G op ijs.
OPMERKING: Onthoofding van het embryo wordt vermeden om lekkage van DNA/Fast Green-mengsel uit de hersenen te voorkomen en een gemakkelijke plaatsing van het embryo in de houder te vergemakkelijken (zie ex utero-elektroporatie , stap 5). - Offer de moeder onmiddellijk na extractie van embryo's door cervicale dislocatie uit te voeren.
OPMERKING: Hier wordt de moeder onder narcose geëuthanaseerd om haar te behoeden voor verdere pijn of lijden na de procedure in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de dierenwelzijnswet van het Staatsmilieuagentschap van Noordrijn-Westfalen (LANUV).
5. Ex utero elektroporatie (EUE)
- Pak een embryo op en plaats het in de houder.
OPMERKING: Een gesneden pipetpunt van 1 ml die aan het uiteinde van een celschraper is bevestigd, wordt gebruikt als embryohouder. Het is essentieel om de armen van embryo's tijdens de procedure buiten de punt te houden om te voorkomen dat ze in de punt glijden (figuur 2F-I). De diameter van de pipetpunt is eenvoudig instelbaar voor embryo's van verschillende groottes. Knip een tweede punt op lengte waar de diameter van de punt overeenkomt met de grootte van het embryo en gebruik deze als adapterinzetstuk voor de hierboven genoemde houder. - Breng voorzichtig DNA / fast green-gevuld glazen capillair door de schedel van het embryo in de laterale ventrikel en injecteer 2-3 μL DNA-plasmidemengsel (figuur 1A, B; Tabel 1) in elke ventrikel (figuur 2F).
OPMERKING: Gebruik de lambdoïdale en sagittale hechtingen als leidraad voor de locatie van DNA-injectie. De lambdoïdale en sagittale hechtingen zijn vezelige gewrichten die de botplaat van de schedel verbinden. De eerste verbindt het pariëtale bot met het achterhoofdsbeen en de laatste verbindt de twee pariëtale botten. - Houd het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied (in dit geval 60° hoek) te richten, waarbij de kathode naar het gebied is gericht waar DNA-overdracht is bedoeld (figuur 2G-H).
- Breng vijf pulsen aan bij 30 mV met een interval van 1 s en een duur van 50 ms met behulp van een blokgolfpulsgenerator.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat hersenen in EUE een effectiever elektrisch veld ervaren dan die in IUE. Bij een bepaalde DNA-concentratie resulteert EUE dus in een hogere efficiëntie van DNA-overdracht dan IUE, en DNA-concentraties moeten dienovereenkomstig worden aangepast. - Als bilaterale elektroporatie gewenst is, herhaalt u stap 5.3-5.4 met de kathode en anode die de vorige positie spiegelen om de contralaterale cortex te richten.
OPMERKING: Aangezien beide ventrikels werden geïnjecteerd met DNA, werden cortices van beide hemisferen geviseerd. - Plaats het geëlektroporated embryo in een schaal van 6 cm met ijskoude HBSS-G. Herhaal stap 5.1-5.6 voor alle benodigde embryo's.
6. In utero elektroporatie (IUE)
- Injecteer zwangere muis met pijnstillend middel; 50 μL buprenorfine (0,1 mg/kg) (zie materiaaltabel) subcutaan, 20 minuten vóór de procedure.
- Voer stappen 4.1-4.8 uit vanaf de embryo-extractiesectie.
OPMERKING: Vermijd onnodig bloot te laten komen van embryo's door ze te bedekken met steriel gaas gedrenkt in warme zoutoplossing. - Draai met behulp van de vingertoppen het embryo voorzichtig in de baarmoeder totdat lambdoïdale en sagittale hechtingen zich bevinden (figuur 2J). Breng voorzichtig DNA /Fast Green glazen capillair door de baarmoederwand en de schedel van het embryo in de laterale ventrikel en injecteer 2-3 μL DNA-plasmidemix (figuur 1A, C) in een of beide ventrikels zoals gewenst (figuur 2K-L).
OPMERKING: Overmatige vingerdruk op baarmoederhoorns kan leiden tot instorting van de vruchtzak. - Houd het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied (in dit geval 60 ° hoek) te richten, waarbij de kathode naar het gebied is gericht waar de DNA-overdracht is bedoeld. Vermijd knijpen in de baarmoeder, omdat dit de ineenstorting van de vruchtzak kan veroorzaken (figuur 2M).
- Breng vijf pulsen aan bij 35 mV met een interval van 600 ms en een duur van 50 ms met behulp van een blokgolfpulsgenerator.
- Als beide laterale ventrikels werden geïnjecteerd, herhaalt u stap 6,5-6,6 met de kathode en anode die de vorige positie weerspiegelen om de contralaterale cortex te richten.
- Herhaal stap 6.3-6.6 voor alle benodigde embryo's.
- Zodra alle benodigde embryo's zijn geëlektropoteerd, gebruikt u een met zoutoplossing doordrenkt wattenstaafje om baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte te plaatsen.
OPMERKING: De toevoeging van zoutoplossing in de peritoneale holte zal helpen baarmoederhoorns terug in positie te glijden. - Hecht spier- en huidincisies met behulp van 5-0 hechtmateriaal. Gebruik hechtclips om de wond vast te zetten en desinfecteer de hechtwond door deze te besproeien met betadine (figuur 2N-P).
- Injecteer de muis subcutaan met 200 μL 5% glucose.
- Injecteer de muis met een antibioticum; 50 μL enrofloxacine (5 mg/kg) subcutaan (zie tabel met materialen).
- Plaats de muis terug in de herstelkooi en houd de warmte vast met behulp van een ver-infrarood verwarmingslampje of verwarmingskussen gedurende ten minste 20 minuten na de procedure (figuur 2Q).
- Controleer de muis dagelijks en injecteer meloxicam na de procedure voor pijnverlichting volgens institutionele en federale richtlijnen.
- Extraheer embryo's 2 dagen na de procedure (d.w.z. E17.5) na stap 4.
7. Hersenextractie en inbedding in agarose
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de volgende stappen uit te voeren onder een dissectiemicroscoop voor een betere precisie. Het vermijden van schade aan de hersenen is van cruciaal belang voor het succes van de procedure.
- Installeer afzuiggereedschappen in een steriele werkruimte onder een dissectiekap (figuur 3A).
- Scheid het hoofd van een embryo van de rest van het lichaam met behulp van een dissectieschaar.
- Bevestig het hoofd zoals weergegeven in figuur 3C en verwijder vervolgens de huid en schedel door langs de middellijn te snijden, beginnend vanaf de basis van het hoofd naar de neus (figuur 3D).
- Pel de huid en schedel zijdelings af en maak een voldoende grote opening (~ 1 cm) om de hersenen te verwijderen.
- Om de hersenen te verwijderen, plaatst u de gesloten punt van de steriele dissectieschaar, beginnend onder de reukbol die naar de hersenstam beweegt (figuur 3E).
- Snijd de hersenstam af en snijd eventuele losse stukjes hersenvliezen rond de hersenen af (figuur 3F).
OPMERKING: Losse hersenvliezen zorgen er vaak voor dat plakjes na het snijden aan het agaroseblok blijven zitten, wat leidt tot het losraken van weefsel van de agarose tijdens het verzamelen van plakjes. - Herhaal stap 7.1-7.6 voor alle embryo's en houd de hersenen op ijs (idealiter niet langer dan 30 minuten) tot de inbeddingsstap.
OPMERKING: De volgende stappen 7.7.1-7.7.4 hebben betrekking op hersenextractie van E12.5-hersenen.- Isoleer de bovenkant van het hoofd net onder het oog, zoals weergegeven in figuur 3G.
- Snijd de huid en schedel bovenop de hersenstam, volgens de stippellijn zoals weergegeven in figuur 3H, zonder de hersenstam te verwijderen.
- Maak een huid-schedelincisie van 2 mm aan de achterkant van het hoofd, zoals weergegeven in figuur 3I (zie tekeningen voor de duidelijkheid).
OPMERKING: Deze incisie biedt de eerste grijppunten om de huid- en schedellagen af te pellen. Meestal komen ze over als één laag. De typische incisiegrootte is 2 mm, wat overeenkomt met de lengte van de snijkant van de gebruikte microveerschaar. - Begin met het afpellen van huidschedellagen door de ene kant van de incisie vast te zetten en de andere voorzichtig te trekken. Voltooi met dezelfde zorg door de basis van het hoofd af te pellen totdat de hersenen worden bevrijd (figuur 3J).
OPMERKING: Dit moet met grote zorg worden gedaan, waarbij wordt waargenomen dat de hersenen niet langs de weefsellagen worden getrokken. Wissel de zijkanten af om het weefsel dat de hersenen bedekt te verwijderen.
- Giet warme agarose (bij 37-40 °C) in een schaal van 3 cm.
- Pak de hersenen op met een geperforeerde lepel en verwijder overtollige vloeistof door de onderkant van de lepel tegen droog tissuepapier te deppen. Plaats de hersenen in een agarose schaal.
OPMERKING: Het is essentieel om zoveel mogelijk vloeistof uit de hersenen te verwijderen om een betere hechting van agarose aan het weefsel mogelijk te maken. - Zet de schaal met vloeibare agarose op ijs. Gebruik een kleinere lepel en meng agarose gedurende 10 s voor gelijkmatige afkoeling. Manoeuvreer de hersenen naar het midden van het gerecht. Plaats de hersenen horizontaal in de schaal met de dorsale kant naar boven en zorg ervoor dat deze volledig bedekt is met agarose uit alle richtingen (figuur 3K).
OPMERKING: Hersenen zullen vaak naar de bodem van het gerecht zinken als ze eenmaal in agarose zijn geplaatst; til de hersenen op met een kleine lepel totdat een opening van 1-2 mm onder de hersenen is vastgesteld. - Herhaal stap 7.8-7.10 voor alle hersenen.
- Zodra agarose is gepolymeriseerd, voegt u 500 μL HBSS-G toe aan het agaroseblok om uitdroging te voorkomen. Bedek vervolgens het gerecht met ijs.
OPMERKING: Houd het monster gedurende 5 minuten op ijs voordat het wordt doorsneden, zodat de hersentemperatuur 4 °C kan bereiken.
8. Organotypische plakcultuur
OPMERKING: Reinig vibratome en omliggende oppervlakken met 70% -96% ethanol om verontreiniging van de plak te voorkomen. De opstelling van het vibratomewerkstation (zie Materiaaltabel) is weergegeven in figuur 3B.
- Vul de trilbufferbak met koude HBSS-G en de buitenste lade met ijs om de HBSS-G gedurende de hele procedure koud te houden.
- Continu HBSS-G in de bufferbak voorzien van carbogen met behulp van een borrelsteen.
- Maak met een vers mes een grote snede (~ 2 x 2 cm) rond de hersenen en verwijder een blok agarose met daarin de hersenen, met voldoende omringende agarose om de agarose in een klein rechthoekig blok te knippen.
OPMERKING: Met deze stap kunt u de hoek van het blok aanpassen zodat de sagittale as van de hersenen loodrecht staat op de vibratomeplaat en de coronale as evenwijdig aan het blad wordt uitgelijnd. Laat ongeveer 5 mm agarose aan de dorsale kant van de hersenen voor eenvoudige hantering van de plakjes. - Plaats een kleine druppel snelklevende oplosmiddelvrije secondelijm in het midden van de monsterhouder en verspreid over een gebied dat de bodem van het agaroseblok bedekt.
- Pak het agaroseblok voorzichtig op en droog de bodem door tegen tissuepapier te deppen. Plaats het blok op het gelijmde gebied van de monsterhouder, met de rostrale kant van de hersenen omhoog. Leg de monsterhouder op ijs en laat de lijm 1 min drogen.
- Zodra de lijm is opgedroogd, plaatst u de monsterhouder in de bufferbak.
- Snijd de hersenen in coronale plakjes onder een hoek van 15°.
OPMERKING: De dikte van de plakjes kan variëren afhankelijk van de toepassing. Hier werden hersenen gesneden met een dikte van 150 μm. Stel de trilsnelheid in op 1,0-1,5 mm/s voor het trimmen van overtollige agarose bovenop en het trimmen van olfactorische bollen. Verlaag de snijsnelheid tot 0,5 mm/s voor het verzamelen van corticale plakjes voor analyse. De meeste vibratomes kunnen worden gepauzeerd om elk plakje te verzamelen. Als verminderde kwaliteit van plakjes of het losmaken van weefsel van agarose wordt ervaren, kan het verminderen van de snijsnelheid of het vervangen van het vibratome-mes helpen. - Verzamel met behulp van schone spatels hersenplakken en plaats ze op polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan, geïmmobiliseerd in een 35 mm glazen schaal met paraffine (maximaal vijf hersenschijfjes / membraan) (figuur 3L-M).
OPMERKING: Bevestig het PTFE-membraan in een schaal met glazen bodem van 35 mm met was. Dit zal het membraan stabiliseren bij het toevoegen van de slice culture media en ook tijdens het afbeelden. - Verwijder met een pipet van 200 μL overtollige HBSS-G rond de plakjes op het PTFE-membraan en laat de plakjes halfdroog.
- Voeg 500 μL plakmedia (voorverwarmd tot 35 °C) rechtstreeks toe aan de ruimte onder het PTFE-membraan.
OPMERKING: Er mogen zich geen bubbels vormen onder het membraan bij het toevoegen van de media. Hierdoor blijven hele of gedeeltelijke segmenten over zonder media-uitwisseling. Vervang elke 2 dagen 200 μL media in cultuur of na elke beeldvormingssessie. - Incubeer de plakjes bij 35 °C met 5% CO2.
9. Immunohistochemie
- Plak plakjes vast met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA)-aangevuld met 4% sucrose per gerecht. Incubeer bij RT gedurende 30 min.
LET OP: Draag bij het hanteren van PFA een laboratoriumjas en handschoenen. Voer fixatiestappen uit onder een chemische kap en verwijder PFA-afval op de juiste manier. - Was de plakjes tweemaal met 300 μL PBS gedurende 5 minuten. Leg de plakjes op een bord met 24 putten.
OPMERKING: Het experiment kan in dit stadium worden gepauzeerd. Voeg PBS-NaN3 toe aan de plakjes en bewaar bij 4 °C. NaN3 is een giftige stof; draag bij het hanteren van oplossingen een laboratoriumjas en handschoenen. Stappen 9.3-9.10 moeten worden uitgevoerd in een orbitale shaker. - Blus de plakjes met 300 μL van 0,1 M glycine bij 4 °C gedurende de nacht.
- Spoel glycine uit met PBS op RT 3x gedurende 10 minuten.
- Permeabiliseer de plakjes met 300 μL PBS-T bij RT gedurende 2 uur.
- Blok met 10% geitenserum in PBS-T bij RT gedurende 2 uur.
- Voeg 300 μL primair antilichaam (anti-vimentine-antilichaam bij een verdunning van 1:200; zie Tabel met materialen) verdund in 10% geitenserum in PBS-T-oplossing bij 4 °C gedurende de nacht toe.
OPMERKING: In stappen 9.8-9.12 werden plakjes beschermd tegen licht om verlies van fluorescentie te voorkomen. - Was primair antilichaam met PBS op RT 3x gedurende 20 minuten.
OPMERKING: PBS werd gebruikt in plaats van PBS-T om Triton X-100 uit te spoelen. - Voeg 300 μL secundair antilichaam (Alexa Fluor 488 of 647 bij een verdunning van 1:400; zie Tabel met materialen) toe aan PBS bij RT gedurende 2 uur.
OPMERKING: DAPI wordt onmiddellijk na het verwijderen van het secundaire antilichaam toegevoegd bij een verdunning van 1:10.000 gedurende 5 minuten. - Was het secundaire antilichaam met PBS op RT 3x gedurende 20 minuten. Wassen met gedestilleerd water 2x gedurende 1 min.
- Breng de plakjes met een fijne borstel over op een glasplaat en droog ze vervolgens gedurende 20 minuten op 30 °C.
- Monteer de plakjes met behulp van een waterig bevestigingsmedium. Houd de dia's 's nachts bij RT zodat de montagemedia kunnen worden samengesteld.
10. Acquisitie van beeldvorming
OPMERKING: Ongeacht de DNA-toedieningsbenadering (IUE of EUE), werden plakjes geanalyseerd in dezelfde ontwikkelingsleeftijdscategorie (E17.5-E18.5). IUE stelt neuronale voorlopers in staat om zich te delen en zich nog twee dagen in vivo te ontwikkelen. EUE, aan de andere kant, maakt het mogelijk om vroege ontwikkelingsgebeurtenissen te volgen.
- Schakel de kamerincubator in en stel deze in op 35 °C met 5% CO2 - idealiter 4 uur vóór beeldvorming - zodat microscoopcomponenten bij 35 °C kunnen balanceren.
- Gebruik voor diepe beeldvorming van plakjes wateronderdompelingsdoelstellingen om de mismatch in brekingsindex tussen het weefsel en het objectief te verminderen.
OPMERKING: Hier werd de beeldmodus met superresolutie gebruikt. Beeldvorming door het PTFE-membraan vereist een objectief met een lange werkafstand (~ 1 mm). Als een lange werkafstandsdoelstelling niet beschikbaar is, kunnen plakjes worden overgebracht naar een 8-wells schotel met glazen bodem. Om plakjes over te brengen, voeg je 1 ml plakmedia toe aan de bovenkant van het membraan en gebruik je vervolgens een spatel om een plak op te tillen en over te brengen naar een put met 200 μL media. Verwijder overtollige media met een pipetpunt van 1 ml en laat de plakjes halfdroog. - Voor het afbeelden van axongroei, lokaliseer een gebied van de cortex met een lage tot gemiddelde celdichtheid. Voor het in beeld brengen van de dynamiek van de groeikegel, lokaliseer je een groeikegel in de tussenzone of subventriculaire zone van de cortex.
- Definieer een z-stackgrootte in de beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel). Voor axongroei in een grote z-stack stelt u een stapgrootte van 2 μm in. Voor groeikegels in een kleinere z-stack stelt u een stapgrootte van 1 μm in.
OPMERKING: Houd altijd rekening met de potentiële beweging van de groeikegel en het axon door de x-, y- en z-vlakken. Axonen groeien met een veel hogere snelheid in organotypische culturen dan in in vitro culturen. Hier was een z-stack van ongeveer 80 μm om axongroei in beeld te brengen voldoende. Voor groeikegeldynamica was een z-stack van ~6 μm voldoende. - Voor het in beeld brengen van axongroei van neuronen in een groter gebied, definieert u een tegelscan.
- Gebruik het laagst mogelijke laservermogen om de kans op blekende groeikegels tijdens de acquisitie te minimaliseren.
- Voor het afbeelden van axongroei, verwerf time-lapses gedurende 2 uur met een interval van 5 minuten. Voor het afbeelden van de groeikegeldynamiek, verwerf time-lapses gedurende 2-5 minuten met een interval van 2,5-3 s.
11. Data-analyse
- Meet de snelheid van axongroei met behulp van kymografen
- Open het afbeeldingsbestand in Fiji14 via Bestand > Openen en selecteer de afbeelding.
- Verkrijg de maximale intensiteitsprojectie van de time-lapse via Image > Stacks > Z-Projection > Maximum Intensity Projection.
- Doorloop de time-lapse en lokaliseer een groeiend axon.
- Eenmaal gelokaliseerd, trek je een lijn door het groeiende axon. Begin vanaf de punt van het axon in het eerste frame en volg het axon gedurende de hele time-lapse.
- Genereer een kymograaf met behulp van de plug-in KymoResliceWide.
- Stel de schaal van de kymograaf in door naar Afbeelding > eigenschappen te gaan. Stel de afstand in μm in Pixelbreedte in en stel de tijd in s of min in Pixelhoogte in.
- Ga naar > meting analyseren.
OPMERKING: Er wordt een hoek ten opzichte van de x-as gegeven. - Bereken de snelheid van axongroei door de hoek te vervangen in de volgende vergelijking: SIN(RADIANS(θ))/COS(RADIANS(θ)) in een spreadsheet.
- Meet het volume van de groeikegel met behulp van een beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen).
- Open het afbeeldingsbestand in de beeldanalysesoftware via Bestand > Openen en selecteer het gewenste bestand.
- Selecteer de wizard Nieuwe Surfaces toevoegen .
OPMERKING: Er verschijnt een gedeelte in de linkerbenedenhoek met zes stappen voor handmatig bewerken. - Selecteer in stap 1 - onder Algoritme-instellingen - Alleen een interessegebied segmenteren. Snijd in stap 2 het frame bij zodat de volledige groeikegel in alle frames past.
- Blijf drempels naar absolute intensiteit in stap 3 en zorg ervoor dat het hele groeikegelgebied in stap 4 wordt gedrempeld.
- Selecteer in stap 5 Aantal Voxels lmg = 1 onder Filtertype.
OPMERKING: In de laatste stap kunnen meerdere meetsets worden gemaakt. Hier werd slechts één meting gemaakt voor volume. - Selecteer de knop Uitvoeren om alle aanmaakstappen uit te voeren en beëindig de wizard Nieuwe Surfaces toevoegen.
- Selecteer op het tabblad Statistieken boven aan het wizardvenster de optie Specifieke waarden en volume op het tabblad Gedetailleerd .
Representative Results
Representatieve resultaten verkregen met de beschreven methodeworkflow worden weergegeven. E15.5-muizen werden gebruikt in de huidige demonstratie, hoewel dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan vrijwel alle embryonale leeftijden, variërend van E11 tot eind E17. In dit protocol worden ofwel ex utero elektroporatie (EUE; Figuur 2A, 2C-I) of in utero-elektroporatie (IUE; Figuur 2B, C en 2J-Q) werden gebruikt om plasmiden af te leveren in de voorloperneuronen die de laterale ventrikels bekleden. Deze voorlopers zijn de bron van toekomstige corticale projecterende neuronen (CPN)15,16. Plasmidemixen werden bereid om schaarse neuronspecifieke expressie van membraangericht (Lyn)-mNeonGreen (figuur 1A) of LifeAct-enhanced (E)GFP (figuur 1B) te stimuleren om respectievelijk het algehele gedrag en de actinedynamiek in groeikegels te evalueren. Verder werd een plasmidemix opgenomen die gericht was op het labelen van individuele neuronen met turbo(t)-RFP of zoanthus sp. (Zs) groen fluorescerend eiwit (ZsGreen) (Figuur 1C). Dit vergemakkelijkt de monitoring van groeikegelgedrag van onafhankelijke naburige neuronen.
Hersendissectie van geëlektroporated embryo's is een cruciale stap die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om plakjes van hoge kwaliteit te verkrijgen, met behoud van de inheemse hersenstructuur. Dissectie-instrumenten en vibratome werden vooraf bereid en zorgvuldig ethanol-gesteriliseerd (figuur 3A,B). Vervolgens werden de hoofden van geëlektroporated embryo's zorgvuldig ontleed en werden de hersenen geëxtraheerd. Hier wordt representatieve dissectie van hersenen van de embryo's die zijn onderworpen aan EUE op E15 (figuur 3C-F) en E12.5 (figuur 3G-J) weergegeven. Hersenen worden onmiddellijk ingepakt in een agarosematrix, gesneden en op PTFE-membraaninzetstukken in een onderste glazen schaal geplaatst voor incubatie (figuur 3K-M).
De gezondheidsstatus van hersenschijfjes is een belangrijk punt voor controle om betrouwbare resultaten te garanderen. Er werd dagelijks een visuele inspectie op eventuele verontreinigingen uitgevoerd. Bovendien, zodra de cultuur was voltooid, worden de hersenplakken gefixeerd en onderworpen aan immunohistochemie. Hier werd 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gebruikt om de algehele cellulaire organisatie en vimentinekleuring te beheersen om gliale organisatie te onthullen; met name radiale glia (RG) steiger. Typisch, succesvol gekweekte hersenplakken afgeleid van IUE of EUE vertonen een normale cellulaire verdeling zoals onthuld door DAPI en een enigszins georganiseerde reeks RG met apicale georiënteerde pial-contactprocessen17 (figuur 4A, B respectievelijk). Af en toe worden duidelijke verstoringen in de RG-steigers in gekweekte hersenplakken waargenomen, vooral bij die afgeleid van EUE-elektroporatie (figuur 4C). Hersenplakken met extreem ongeorganiseerde RG-steiger vertonen een verminderde neuronale migratie en defecte axongroei (niet getoond). Daarom is het besturen van de RG-steiger een eenvoudige postkweekmethode om de gegevens te sorteren die zijn verkregen uit betrouwbare hersensegmenten.
Hersenplakken afgeleid van IUE of EUE met Lyn-mNeonGreen-expressing plasmidemix resulteren in vergelijkbare schaarse neuronetikettering. Een representatieve piramidale CPN die Lyn-mNeonGreen en het dynamische gedrag van zijn groeikegel uitdrukt, wordt als voorbeeld getoond (figuur 5A en aanvullende video 1, linksboven). Bovendien werden neuronen gelabeld met behulp van een plasmide dat een actinesonde tot expressie brengt om de actinedynamiek van axonale groeikegels in situ te analyseren (figuur 5B en aanvullende video 1, linksonder). In situ experimenten werden ook uitgevoerd met een dual-Cre/Dre fluorofoor-expresserend plasmide ontwerp (Figuur 1C en Aanvullende Video 1, rechts). tRFP of ZsGreen fluoroforen in dit plasmide kunnen specifiek en individueel worden geactiveerd door respectievelijk Dre- of Cre-recombinases in naburige neuronen (figuur 5C). Deze experimentele opstelling maakt zij-aan-zij analyse mogelijk van groeikegels van controleneuronen met naburige gemodificeerde neuronen (elk gegeven verlies of winst van functie). Dit omzeilt de variabiliteit die voortvloeit uit het gebruik van verschillende segmenten om controle- en experimentele omstandigheden te testen.
Kymografen gegenereerd uit de opgenomen film werden geanalyseerd, waaruit dynamische groeiparameters zoals uitstekende activiteit in de loop van de tijd en groeilengte gemakkelijk kunnen worden verkregen (figuur 6A). Merk op dat een eenvoudige aanpassing in de temporele resolutie van de time-lapse het mogelijk maakt om de axon-reksnelheid gedurende 2 uur te meten (figuur 6A). Bovendien kan de variatie van het volume van de groeikegel in de loop van de tijd - een maat voor de dynamische activiteit van de algemene groeikegel - gemakkelijk worden verkregen, in dit geval met gelicentieerde software (figuur 6B en figuur 6E, F). Dit kan worden gebruikt om de snelheid van actine loopband en de balans van filopodia / lamellipodia tijdens groeikegel verkennen activiteit te evalueren.
Figuur 1: Schema's van de in het protocol gebruikte plasmiden. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevante informatie over plasmidecomponenten en de oorsprong van fluorofoor is te vinden in de dozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van ex utero en in utero elektroporatie van E15.5 muizen. (A) Oprichting van een operatiepost voor ex utero-elektroporatie. (B) Opzetten van een operatiestation voor elektroporatie in utero. (C) Baarmoederhoorns getrokken buiten de buikholte van de verdoofde muis. D) Extractie van een embryo uit de baarmoederzak. E) embryooffer door volledige dwarslaesie van het ruggenmerg via een diagonale incisie; merk op dat onthoofding werd vermeden. (F) Plaatsing van het embryo in de houder en geïnjecteerd met DNA/Fast Green-mengsel in de linker laterale ventrikel. (G,H) Plaats het hoofd van het embryo tussen platina pincet elektroden met de kathode (rode pijl) over de cortex in een hoek van 60°. I) Plaatsing van de armen van het embryo (zwarte pijlen) buiten de houder om te voorkomen dat het embryo tijdens de procedure glijdt. (J) Rotatie van het embryo in de baarmoederzak om het hoofd bloot te leggen. (K,L) Injectie van DNA / Fast Green-mengsel in de laterale ventrikels van het embryo via de baarmoederwand. (M) Plaats het hoofd van het embryo tussen platina pincet elektroden met een kathode (rode pijl) over de cortex in een hoek van 60°. (N) Gehechte spierincisie via lopende vergrendelingsnaad. (O) Gehechte huidincisie via een onderbroken hechting. (P) Vastzetten van de wond met behulp van chirurgische wondclips en desinfectie met betadine. (Q) Plaatsing van de muis in de herstelkooi met ver-infrarood verwarmend licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Extractie van E15.5 en E12.5 hersenen en organotypische slice culture procedure. (A) Hulpmiddelen die worden gebruikt voor de hersenextractieprocedure. (B) Oprichting van een organotypisch kweekstation. (C-F) Extractie van E15.5 hersenen. (G-J) Extractie van E12.5 hersenen. Stippellijnen markeren de locatie van incisies. Rode pijlen wijzen de richting aan van het trekken met een tang. (K) Inbedding van de hersenen in een schaal van 3 cm met 3% laagsmolt agarose, waardoor een afstandsspleet van 1-2 mm onder de hersenen achterblijft. (L) Verzameling van 150 μm hersenschijf. (M) Plaatsing van hersenplakken op PTFE-membraaninzetstukken geïmmobiliseerd in een 35 mm schaal met behulp van paraffinefilm (blauwe pijl). Rode stermarkering duidt op een bepaalde verzameling hersenplakken van vibratome (L) en de overdracht ervan naar PTFE-membraan (M). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Geconserveerde radiale gliacelstructuur in gezonde organotypische plakjes. Confocale beelden van E17.5 hersenplakken die RG-array (vimentine; groen) en algehele celorganisatie (DAPI; magenta) onthullen na IUE (A) en EUE (B, C). Let op de sterke verstoringen in de RG-array die af en toe het gevolg kunnen zijn van EUE (C). Vergrotingen komen overeen met de rode gestippelde kaders in de hoofdfiguur: schaalbalken, 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In situ visualisatie van de groeikegeldynamiek in acute organotypische plakjes. (A,B) Neuronen en hun bijbehorende groeikegels gelabeld met respectievelijk Lyn-mNeonGreen en LifeAct-GFP. Rode ster markeert groeikegel van Lyn-mNeonGreen die neuron tot expressie brengt. Blauw sterretje dat de groeikegel van LifeAct-GFP markeert en neuron tot expressie brengt. (C) Naburige neuronen gelabeld met het dubbele plasmidesysteem dat tRFP (magenta) en ZsGreen (groen) en hun overeenkomstige groeikegels bevat. De afgebeelde groeikegels (rechts) bevonden zich buiten het vastgelegde kader (links), verkregen kort na het verkrijgen van de time-lapse van de groeikegel; schaalbalken, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Analyse van axongroeisnelheid en groeikegelvolume. (A) Axontracering op een neuron dat Lyn-mNeonGreen (boven) tot expressie brengt en de bijbehorende kymograaf (onder) gegenereerd met behulp van ImageJ. (B) Reconstructie van z-stack video van groeikegel met behulp van de beeldanalysesoftware (boven) en dezelfde groeikegel gemarkeerd met behulp van het meetinstrument voor oppervlakken (hieronder). (C) Grafieken die veranderingen in groeisnelheid in de loop van de tijd voor verschillende axonen laten zien. (D) De gemiddelde groeisnelheid van axonen wordt gekwantificeerd in (C). (E) Grafiek met de veranderingen in het volume van de groeikegel in de loop van de tijd. (F) Het gemiddelde volume van de groeikegels wordt gekwantificeerd in (E); schaalbalk, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Radiale migratie en neuronale polarisatie van piramidale corticale neuronen. Diagram ter illustratie van de ontwikkeling van piramidale corticale neuronen (roze) die radiaal migreren van de kiemventrikelzone (VZ) naar het pia-oppervlak. Geleid door radiale gliaprocessen (grijs), stellen migrerende gepolariseerde neuronen een leidend proces, toekomstig dendriet en trailingproces, toekomstig axon, vast dat zich naar beneden blijft uitbreiden naar de tussenzone (IZ). Onderbroken rode vakken vertegenwoordigen de corticale gebieden waar groeikegels werden afgebeeld. Specifiek in de IZ, subventriculaire zone (SVZ), of verbindende axonbundels (groen). De illustratie is gemaakt met een webgebaseerde tool, BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Plasmide | Concentratie (μg/μL) | Beoogd gebruik |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGroen | 0.25 | Etikettering van membraandoeleiwit (Lyn) |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-iCre | 0.08 | |
| p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP | 0.125 | Etikettering van filamenteuze actine (F-actine) in groeikegels |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGroen | 1 | Onafhankelijke etikettering van twee populaties van naburige neuronen |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-iCre | 0.004 | |
| + | + | |
| p-Tub-alfa-1-Dre | 0.2 |
Tabel 1: Lijst van de in het protocol gebruikte plasmiden. Naam, concentratie en beoogd gebruik van elk gebruikt plasmide.
Aanvullende video 1: In situ visualisatie van de groeikegeldynamiek in acute organotypische plakjes. Dynamiek van groeikegels gelabeld met Lyn-mNeonGreen (linksboven) en LifeAct-GFP (linksonder). Naburige groeikegels zijn differentieel gelabeld met het dubbele plasmidesysteem met tRFP (magenta; rechtsboven) en ZsGreen (groen; rechtsonder). Beeldinterval, 2,5 s. Schaalbalken, 5 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hoe de groeikegels hun omgeving voelen en erop reageren om gelijktijdige axonuitbreiding en -geleiding te coördineren, is nog steeds een kwestie van discussie 3,18. Baanbrekende studies in 2D-substraten gaven een kijkje in de fundamentele moleculaire mechanismen die de krachten genereren die de groeikegeldynamiek aandrijven tijdens axonvorming, uitgroei en navigatie 2,10,11,12,19. Meer recent onthulden studies in 3D-matrices hoeveel invloed een derde dimensie heeft op het gedrag van de groeikegel en bijgevolg op axongroei 8,9. Niettemin moeten de ingewikkelde mechanismen die de dynamiek van de groeiconus in vivo instrueren, nog grondig worden onderzocht.
Bereiding van organotypische plakculturen uit IUE- of EUE-hersenen wordt op grote schaal gebruikt en goed gedocumenteerd. Het is een gouden standaard geworden waarmee wetenschappers inzicht kunnen krijgen in de ontwikkeling en het gedrag van neuronen in het levende hersenweefsel 20,21. Inderdaad, deze techniek is met succes gebruikt in combinatie met verschillende hoge resolutie beeldvormingstechnieken om specifieke moleculaire processen en morfologische gebeurtenissen in situ te visualiseren. Dergelijke studies omvatten, maar zijn niet beperkt tot axonvorming en -uitbreiding19,22, corticale neuronale migratie 19,22,23,24, centrosoomdynamica 25,26, microtubulidynamica27, evenals de functionele dynamica van pre- en postsynaptische compartimenten28,29.
Dit protocol pakt een kloof in de experimentele neurobiologie aan en visualiseert de groeikegeldynamiek van het ontwikkelen van corticale neuronen in situ, in ex vivo acute hersensegmentculturen en de hulpmiddelen om de verkregen gegevens te analyseren.
Acute brain slice culturen werden gebruikt om dit protocol vast te stellen omdat ze (1) met enige oefening, gemakkelijk te genereren zijn; (2) een toegankelijk systeem te presenteren voor het bestuderen van groeikegels die zijn ingebed in een quasi-volledig fysiologische omgeving, maar toch transparant genoeg om hoge-resolutie live-cell imaging mogelijk te maken; (3) kan worden uitgebreid voor het gebruik ervan met een groot aantal transgene muislijnen; (4) in combinatie met IUE of EUE bieden vrijwel onbeperkte mogelijkheden om moleculaire hulpmiddelen te leveren om de prestaties van groeikegels en axonen in vivo te evalueren onder verlies/ winst van functieregimes, samen met fluorescerende reporters en cytoskeletsondes.
Deze methodologie werd beschreven in de context van zowel EUE als IUE. Hoewel eue nog steeds een zeer betrouwbare methode is, resulteerde het in een verhoogde incidentie van hersenplakken met een ongeorganiseerd RG-netwerk in vergelijking met die verkregen met IUE als toedieningsmethode (figuur 4C). Verstoringen in de RG-array hebben een sterke invloed op neuronale migratie en het patroon van axon-elongatie30,31. Dit zijn belangrijke parameters die voorspellen waar axonen op een bepaald moment voor analyse kunnen worden gevonden en het type omgeving waarin ze navigeren. Hersenplakken met een aanzienlijk verstoord RG-netwerk hebben meestal een verminderde corticale neuronstratificatie. Dit produceert op zijn beurt axonen met chaotische trajecten. Daarom wordt sterk aanbevolen om de structurele integriteit van het RG-netwerk te controleren. Interessant is dat slechte structurele integriteit correleert met verhoogde leeftijd van de embryonale hersenen. Inderdaad, dergelijke effecten bij jongere E12.5-E13.5 embryo's werden meestal niet waargenomen19.
Het huidige protocol is grondig en eenvoudig. Toch zijn er een paar kritische stappen waarbij speciale zorg en aandacht moet worden besteed aan het verkrijgen van optimale resultaten. Deze zijn uitdrukkelijk vermeld in het protocol en omvatten (1) het afstemmen van de hoeveelheid DNA die in de elektroporatie wordt gebruikt om schaarse etikettering te krijgen; (2) het voorkomen van schade tijdens de extractie van hersenen; (3) het regelen van de temperatuur van de agarose tijdens het omhullen van de hersenen; (4) het oplossen van het ideale percentage agarose voor hersenen van een bepaalde leeftijd; en (5) selectie van fluoroforen, waarvan de ervaring volgt. Tijdens protocoloptimalisatie werden de prestaties van verschillende fluoroforen in live-cell in situ beeldvorming getest. Voor dit protocol is gekozen voor monomere GFP-varianten EGFP en NeonGreen voor de bereiding van de LifeAct- en Lyn-tagged plasmiden (figuur 5A,B). Daarnaast is de RFP-variant mScarlet getest en zeer geschikt bevonden voor deze opstelling (gegevens niet getoond). Multimeric tRFP (dimer) en ZsGreen (tetrameer) (Figuur 5C en Supplementary Video 1, rechts) werden ook getest. Deze snelvouwende superheldere fluoroforen worden aanbevolen wanneer de methode een snelle fluorescerende signaalgeneratie na DNA-afgifte vereist.
Een veel voorkomende praktijk bij het gebruik van plakculturen is om plakjes uit verschillende hersenen te gebruiken om controle en experimentele omstandigheden te testen. Dit is een inherente bron van ongewenste variabiliteit. Hier werd een expressiesysteem gebruikt dat onafhankelijke modificatie van naburige neuronen en de expressie van verslaggevers voor identificatie mogelijk maakt. Merk op dat er in deze demonstratie (figuur 5C) geen verschillen waren tussen neuronen die een van de fluoroforen tot expressie brachten. Een voorbeeld hiervan is echter dat een dergelijke plasmidemix in combinatie met een transgene muizenlijn met een Cre-gevoelig gen labelt met tRFP (Dre-gevoelige) neuronen die als wild type zijn gebleven. Daarentegen zal de ZsGreen (ook Cre-gevoelig) de gerecombineerde neuronen labelen. Vandaar dat groeikegels van de twee verschillende genotypen, en waarschijnlijk ook fenotypes, tegelijkertijd naast elkaar in hetzelfde hersensegment kunnen worden bestudeerd.
Lokalisatie van axonen en groeikegels voor analyse is een belangrijke overweging. Corticale neuronen polariseren terwijl ze radiaal migreren van de ventriculaire zone (VZ) naar de corticale plaat (CP). Tijdens dit proces vormen neuronen een leidend proces (een toekomstig dendriet) en een trailing-proces dat het axon zal worden, uiteindelijk samen met baanbrekende axonen in de tussenzone (IZ), waardoor axonkanalenworden gevormd 32. Daarom, om axonale groeikegels te vangen, werd beeldvorming gedaan op axonale vezels in de IZ, inclusief axonen die de CP verlaten en vroeg gegenereerde axonen die al geassocieerd zijn met axonale bundels; of uiteindelijk in vezels die de IZ doorkruisen en eronder uitstrekken (figuur 7).
Dit protocol maakt het mogelijk om superresolutiebeeldvorming uit te voeren van neuronen in organotypische plakjes. Historisch gezien was lichtverstrooiing een belangrijk probleem bij het afbeelden van dikke exemplaren. In de afgelopen twee decennia hebben uitgebreide ontwikkelingen in optische technologieën beeldvorming van dikke exemplaren mogelijk gemaakt. Hier werd een lange werkafstandsdoelstelling gebruikt om kleinere structuren beter te visualiseren, zoals groeikegels. Onvermijdelijk legt dit protocol geen meer gedetailleerde gebeurtenissen vast, zoals retrograde actinestroom of microtubulidynamica. De langeafstandsdoelstelling, die een lager numeriek diafragma (NA) vereist, bewaart informatie uit dikke plakken. Het was echter ook mogelijk om dit protocol aan te passen aan het gebruik met als doel een kortere werkafstand. Dit vereiste een soepele overdracht van plakjes naar een schaal met glazen bodem om de structurele integriteit te behouden. Het gebruik van deze methode resulteerde echter in een kortere overleving - ~ 15 uur - als gevolg van verlies van gasuitwisseling (gegevens niet weergegeven). In tegenstelling tot 2D-culturen bezetten groeikegels in 3D een groter volume en vereisen ze bewegingsartefactencompensatie in de z-as. Om de mogelijkheid om gedetailleerde gebeurtenissen in beeld te brengen te vergroten, moet moderne confocale technologie worden gebruikt. Daarom wordt aanbevolen om een snel scannende z-stack motor te gebruiken, zoals de z-Galvo die beschikbaar is op zeer gevoelige confocale microscopen33.
Van belang is dat dit protocol drie belangrijke beperkingen biedt. Ten eerste is het vaak een uitdaging om de expressieniveaus / het aantal tot expressie brengende cellen van een bepaald plasmide in vivo te controleren. Dit introduceert variabiliteit tussen alle plakjes, zelfs bij behoud van dezelfde plasmideconcentratie. Daarom moet de selectie van de regulerende elementen in de gebruikte expressievectoren met zorg worden bepaald. Ten tweede is het in beeld brengen van gedetailleerde gebeurtenissen met behulp van membraaninzetstukken momenteel niet haalbaar. Deze tweede beperking kan worden opgeheven met de methodologische actualiseringen die in de vorige alinea zijn voorgesteld. Ten slotte zijn groeikegels zeer lichtgevoelig en kunnen ze snel gefotobleekeerd raken. Daarom kan frequente beeldvorming van de groeikegels, gedurende slechts 5 minuten met behulp van laserscanmicroscopen, de groeikegels vaak instorten. In dit opzicht kunnen nieuwe ontwikkelingen in door lichtplaatmicroscopie gegenereerde apparaten worden aangepast voor langetermijnbeeldvorming van de hersenplakken34.
Protocollen van deze soort zijn bedoeld om nieuwe onderzoeksmogelijkheden te openen, waardoor een beter begrip mogelijk wordt van wat er nodig is voor een groeikegel om te lezen en te reageren op een complexe in vivo omgeving, en nog belangrijker, om de mechanica van dit geavanceerde samenspel te ontrafelen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Maria Eugenia Bernis bedanken voor het fotograferen van de procedures. We bedanken ook Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski en Sina Stern voor het lezen en bespreken van het manuscript. We zijn onze uitstekende technische assistenten, Jessica Gonyer, Blanca Randel en Anh-Tuan Pham dankbaar. We erkennen de waardevolle steun van de lichtmicroscoopfaciliteit en dierenfaciliteit van de DZNE. Dit werk werd ondersteund door Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), de International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) en Wings for Life (tot F.B). F.B. is lid van de excellentiecluster ImmunoSensation2, de SFBs 1089 en 1158, en is ontvanger van de Roger De Spoelberchprijs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
| Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Betadine | B. Braun | 3864154 | |
| Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
| Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
| DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
| Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
| Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
| Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
| FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
| Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
| Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
| Isoflurane | Virbac | NA | |
| Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
| Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
| LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
| Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
| Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
| Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
| Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
| Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
| Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
| p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
| p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
| pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
| pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
| Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
| QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
| Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
| Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
| Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
| Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
| Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
| Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
| Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |
References
- Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
- Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
- Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
- Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
- Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
- Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
- Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
- Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
- Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
- Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
- Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341 (2020).
- Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
- Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
- Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
- de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
- Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
- Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
- Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342 (2021).
- Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
- Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
- Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203 (2020).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
- Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ (2021).
- ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html (2021).
