Summary
Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.
Abstract
Studiare le proprietà fisiologiche di specifiche sinapsi nel cervello e come subiscono cambiamenti plastici è una sfida chiave nelle moderne neuroscienze. Le tradizionali tecniche elettrofisiologiche in vitro utilizzano la stimolazione elettrica per evocare la trasmissione sinaptica. Uno dei principali svantaggi di questo metodo è la sua natura non specifica; Tutti gli assoni nella regione dell'elettrodo stimolante saranno attivati, rendendo difficile attribuire un effetto a una particolare connessione afferente. Questo problema può essere superato sostituendo la stimolazione elettrica con la stimolazione basata sull'optogenetica. Descriviamo un metodo per combinare l'optogenetica con registrazioni di patch clamp in vitro . Questo è un potente strumento per lo studio sia della trasmissione sinaptica basale che della plasticità sinaptica di precise connessioni sinaptiche anatomicamente definite ed è applicabile a quasi tutti i percorsi nel cervello. Qui, descriviamo la preparazione e la gestione di un vettore virale che codifica la proteina channelrhodopsin per l'iniezione chirurgica in una regione pre-sinaptica di interesse (corteccia prefrontale mediale) nel cervello dei roditori e la produzione di fette acute di regioni bersaglio a valle (corteccia entorinale laterale). Viene inoltre presentata una procedura dettagliata per combinare le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica a breve e lungo termine. Discutiamo esempi di esperimenti che raggiungono la specificità del percorso e della cellula combinando l'optogenetica e l'etichettatura cellulare Cre-dipendente. Infine, viene descritta la conferma istologica della regione pre-sinaptica di interesse insieme alla marcatura della biocitina della cellula post-sinaptica, per consentire un'ulteriore identificazione della posizione precisa e del tipo di cellula.
Introduction
Comprendere la fisiologia delle sinapsi e come subiscono cambiamenti plastici è fondamentale per capire come funzionano le reti cerebrali nel cervello sano1 e come funzionano male nei disturbi cerebrali. L'uso di fette cerebrali acute ex vivo consente la registrazione dell'attività elettrica delle sinapsi da singoli neuroni con un elevato rapporto segnale-rumore utilizzando registrazioni patch-clamp a cellule intere. Il controllo del potenziale di membrana e la semplice manipolazione farmacologica consentono l'isolamento dei sottotipi recettoriali. Queste registrazioni possono essere fatte con squisita specificità per identificare il neurone post-sinaptico, compresa la posizione laminare e sub-regionale2, la morfologia cellulare3, la presenza di marcatori molecolari4, le sue proiezioni afferenti5, o anche se era recentemente attivo6.
Raggiungere la specificità degli input pre-sinaptici è, tuttavia, un po 'più impegnativo. Il metodo convenzionale ha utilizzato elettrodi di stimolazione per eccitare gli assoni che corrono in una particolare lamina. Un esempio di questo è nell'ippocampo dove la stimolazione locale nello strato radiato attiva sinapsi che proiettano dal CA3 al sottocampo CA17. In questo caso, la specificità presinaptica è raggiunta in quanto l'input CA3 rappresenta l'unico input eccitatorio situato all'interno dello strato radiato che proietta alle cellule piramidali CA18. Questo elevato grado di specificità di input ottenibile con l'attivazione presinaptica elettrica convenzionale degli assoni CA3-CA1 è, tuttavia, un'eccezione che si riflette nell'intenso studio a cui questa sinapsi è stata soggetta. In altre regioni del cervello, assoni provenienti da più vie afferenti coesistono nella stessa lamina, ad esempio nello strato 1 della neocorteccia9, rendendo così impossibile la stimolazione presinaptica specifica dell'input con elettrodi stimolanti convenzionali. Questo è problematico in quanto diversi input sinaptici possono avere proprietà fisiologiche divergenti; Pertanto, la loro co-stimolazione può portare a un'errata caratterizzazione della fisiologia sinaptica.
L'avvento dell'optogenetica, la codifica genetica delle proteine di membrana fotosensibili (opsine) come la channelrhodopsin-2 (ChR2), ha permesso una vasta espansione delle possibilità di studio delle proiezioni sinaptiche isolate tra le regioni cerebrali10,11. Qui descriviamo una soluzione generalizzabile e a basso costo per studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità. I costrutti optogenetici sono forniti in modo altamente specifico utilizzando vettori virali che consentono un controllo estremamente preciso della regione pre-sinaptica di interesse. Le proiezioni efferenti esprimeranno il canale attivato dalla luce consentendo l'attivazione di queste fibre in una regione target. Pertanto, possono essere studiati percorsi anatomicamente diffusi a lungo raggio che non possono essere attivati in modo indipendente dalla stimolazione elettrica tradizionale, non specifica.
Descriviamo, come percorso esemplificativo, la trasduzione della corteccia prefrontale mediale (mPFC) con virus adeno-associati (AAV) che codificano opsine eccitatorie dei canali cationici. Descriviamo quindi la preparazione di fette acute dalla corteccia entorinale laterale (LEC), registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce delle proiezioni glutammatergiche mPFC-LEC (Figura 1). Descriviamo anche la valutazione istologica del sito di iniezione per confermare la posizione della regione pre-sinaptica di interesse e l'identificazione della morfologia cellulare post-sinaptica.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con lo United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) e le linee guida associate, nonché le linee guida istituzionali locali.
1. Iniezione virale stereotassica
NOTA: Il protocollo attuale richiede una specificità anatomica, ma non di tipo cellulare post-sinaptico.
- Scegli l'animale appropriato. In questo protocollo sono stati utilizzati ratti incappucciati Lister selvatici maschi (300-350 g, circa 3 mesi).
- Scegli il costrutto virale appropriato. Ci sono diversi fattori da considerare (vedi Discussione). L'attuale protocollo utilizza un virus per esprimere il canale optogenetico ChETATC 12, per trasdurre neuroni eccitatori (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titolo: 3,3 x 10 13 genomi virali/ml).
- Stabilire le coordinate e il volume dell'iniezione utilizzando un atlante cerebrale come descritto in precedenza35.
- Iniezione stereotassica del preparato virale
NOTA: Devono essere seguite tutte le linee guida nazionali e istituzionali pertinenti per l'uso e la cura degli animali. I vettori virali vengono iniettati stereotassicamente come descritto in precedenza13 con le seguenti modifiche.- Mantenere la preparazione virale sul ghiaccio durante l'anestetizzazione e la preparazione dell'animale.
- Indurre l'anestesia in una camera di induzione anestetica con isoflurano al 4%. Monitorare il livello di anestesia indicato da una frequenza respiratoria regolare più lenta (1 Hz) e dall'assenza di riflessi del pedale e corneali (test pizzicando le dita dei piedi e toccando leggermente l'angolo dell'occhio, rispettivamente; nessuna risposta dovrebbe essere rilevata).
- Somministrare analgesici pre-operatori come meloxicam almeno 30 minuti prima della procedura invasiva.
- Quando l'animale è completamente anestetizzato, utilizzare le tosatrici per rimuovere la pelliccia dal cuoio capelluto. Commutare il flusso di isoflurano sul cono del naso del telaio stereotassico e montare il ratto nel telaio. Applicare un gel occhi lubrificante sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.
- L'intervento chirurgico deve essere eseguito in condizioni asettiche. Utilizzare guanti e strumenti sterili durante tutta la procedura. Applicare unguento alla lidocaina (5% p/p) prima di disinfettare il cuoio capelluto con una soluzione di clorexidina al 4% p/v, quindi coprire il corpo con un drappeggio sterile. Usando un bisturi, fare un'incisione longitudinale di circa 15 mm di lunghezza sul cuoio capelluto per esporre il bregma.
- Caricare una siringa Hamilton in una pompa a siringa a microiniezione collegata a un braccio mobile montato sul telaio stereotassico.
- Porre un'aliquota di 5 μL del virus in una provetta da 0,2 mL e ruotare per alcuni secondi fino a quando tutto il volume è sul fondo della provetta. Pipettare 2 μL del preparato virale nel coperchio del tubo.
- Riempire la siringa con il preparato virale visualizzando prima la punta dell'ago con un microscopio chirurgico, quindi posizionare manualmente il bolo del virus sulla punta dell'ago e ritirare lo stantuffo della siringa utilizzando i controlli della pompa.
- Impostare il volume di iniezione della pompa su 300 nL e la portata su 100 nL/min. Eseguire la pompa e confermare il flusso corretto osservando la goccia del virus sulla punta dell'ago. Assorbire il virus su un batuffolo di cotone e pulire delicatamente l'ago con etanolo al 70%.
- Utilizzando le viti di regolazione sul telaio stereotassico, si sposta la punta dell'ago verso il bregma (il punto sul cranio in cui si incontrano le suture coronale e sagittale) e prendere nota delle misurazioni stereotassiche osservate sulle tre scale di vernier sul telaio. Le coordinate relative al bregma del ratto mPFC sono antero-posteriore + 3,1 mm, mediolaterale ± 0,7 mm, dorsoventrale - 4,5 mm; Aggiungere/sottrarre (come indicato) queste distanze dalle coordinate Bregma, quindi far navigare l'ago verso le coordinate antero-posteriore e mediolaterale e abbassare delicatamente l'ago sulla superficie del cranio.
NOTA: Le coordinate mPFC sopra riportate sono appropriate per ratti maschi con cappuccio di 300-350 g; cambiamenti nel ceppo di ratto, le dimensioni possono richiedere modifiche a queste coordinate (vedi Discussione). - Sollevare l'ago dalla superficie del cranio e segnare questo punto con un pennarello permanente a punta fine. Fai un foro di bava a questo punto usando un micro trapano montato sul braccio stereotassico.
- Inserire l'ago nel cervello alla coordinata dorsoventrale predeterminata e infondere un volume predeterminato (per mPFC: 300 nL). Lasciare l'ago in situ per 10 minuti per consentire la diffusione del bolo. Dopo aver rimosso l'ago, far funzionare la pompa per assicurarsi che l'ago non sia bloccato.
NOTA: Inserire e rimuovere lentamente l'ago (~3 mm/min) per ridurre al minimo il danno al tessuto cerebrale e il riflusso del virus nel tratto dell'ago. - Somministrare 2,5 ml di soluzione riscaldata di cloruro di sodio (0,9% p/v) e glucosio (5% p/v) per via sottocutanea per mantenere l'idratazione.
- Ripetere il passaggio 1.4.12. per il secondo emisfero.
- Suturare l'incisione del cuoio capelluto e, al termine della procedura, somministrare 2,5 ml di soluzione di cloruro di sodio e glucosio e un analgesico appropriato, istituzionalmente raccomandato, per la gestione del dolore, ad esempio buprenorfina o meloxicam. Non lasciare l'animale incustodito mentre è incosciente. Metti il ratto in una scatola di recupero riscaldata fino a quando non riprende completamente conoscenza. Tornare alla gabbia di casa con altri animali solo una volta completamente recuperati.
- Seguire le linee guida istituzionali per le cure post-operatorie e le procedure abitative per i roditori trasfettati da virus. Attendere almeno 2 settimane affinché il transgene opsina si esprima adeguatamente prima di iniziare l'esperimento.
NOTA: Il tempo necessario per la trasduzione dipende dalla distanza e dalla forza della connessione tra le regioni pre e post-sinaptiche. Per mPFC a LEC, sono necessarie 4-6 settimane.
2. Preparazione di fette di cervello acute
NOTA: Qui descriviamo un metodo semplice per la preparazione di fette di cervello che nelle nostre mani è sufficiente per ottenere fette corticali, ippocampali e talamiche di alta qualità da topi e ratti adulti.
- Preparare le soluzioni per la dissezione.
- Riempire un becher da 250 mL con ~200 mL di soluzione di taglio di saccarosio ghiacciato (189 mM di saccarosio, 26 mM di NaHCO 3, 10 mM di D-glucosio, 5 mM di MgSO 4,3 mM di KCl, 1,25 mM di NaH 2 PO4 e 0,2 mM di CaCl 2 in acqua ultrapura (UPW) con resistività di 18,2 MΩ cm a 25 °C) o un volume sufficiente per riempire la camera del tessuto vibratomo. Bollire con carbogeno (95% O 2, 5% CO2) e mantenere in ghiaccio.
- Riempire una camera di raccolta delle fette con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucosio,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 e 1 mM MgSO4 prodotto in UPW) a temperatura ambiente, bollire con carbogeno. La camera di raccolta delle fette14 è realizzata su misura da un rack per tubi di microcentrifuga incollato su un foglio di rete di nylon e posto in un becher in cui è immerso in aCSF (Figura 2A).
- Riempire un tubo da 50 mL con paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O e 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
ATTENZIONE: PFA è tossico. Utilizzare in cappa aspirante.
- Dissezione del cervello.
- Anestetizzare il ratto in una camera di induzione usando isoflurano al 5% fino a quando la respirazione è lenta e regolare (~1 Hz). Per garantire un livello sufficiente di test di anestesia per l'assenza di pedale e riflessi corneali.
- Decapitare l'animale usando una ghigliottina.
- Sezionare rapidamente l'intero cervello come descritto in precedenza15 e trasferirlo in soluzione di taglio di saccarosio. Completa il passaggio entro 90 secondi dalla decapitazione per una buona qualità della fetta e una corretta registrazione dell'intera cellula.
- Usando un cucchiaino di metallo, raccogli il cervello, scarta la soluzione di taglio in eccesso e posizionala su un pezzo di carta da filtro sul banco.
- Usando un bisturi o una lama di rasoio, rimuovere rapidamente il cervelletto e tagliare il cervello nel piano coronale circa a metà della sua lunghezza; la metà posteriore è il blocco di tessuto LEC. Assicurati di includere del tessuto in eccesso oltre alla regione da affettare per i passaggi successivi. Restituire sia questo blocco di tessuto che il resto del cervello alla soluzione di taglio di saccarosio.
- Posizionare una goccia di colla cianoacrilica su uno stadio di tessuto vibratomo. Stenderlo in uno strato sottile con un'area leggermente più grande del blocco di tessuto creato nel passaggio precedente.
- Raccogliere il blocco di tessuto LEC usando un cucchiaino, eliminare la soluzione in eccesso e trasferirlo sul cerotto di colla in modo che il taglio coronale anteriore abbia aderito.
- Installare il palco nella camera del tessuto vibratomo e versare rapidamente una quantità sufficiente di soluzione di taglio di saccarosio per immergere il tessuto; Bolle questa soluzione con carbogen. Orientare il blocco di tessuto LEC con la superficie ventrale verso la lama. Mentre l'illuminazione ambientale della stanza è insufficiente per attivare l'opsina, evitare di utilizzare fonti di luce aggiuntive che potrebbero essere presenti sul vibratomo.
- Tagliare fette di spessore 350 μm da ventrale a dorsale utilizzando un'elevata velocità di oscillazione della lama (100 Hz) e una velocità di avanzamento lenta della lama (0,06 mm/s). Tipicamente, è possibile ottenere sette fette LEC per emisfero.
- Trasferire le fette nella camera di raccolta delle fette. Al termine della raccolta delle fette, trasferire la camera di raccolta a bagnomaria a 34 °C per 1 ora prima di tornare a temperatura ambiente. Bolla con carbogen continuamente. Le fette saranno sufficientemente sane per la registrazione per almeno 6 ore.
- Mettere il resto del cervello in PFA per 48 ore per l'esame post-hoc del sito di iniezione (vedere paragrafo 4).
3. Elettrofisiologia e stimolazione optogenetica
- Identificazione della cellula bersaglio.
- Porre la fetta in una camera di registrazione sommersa a 34 °C perfusa con aCSF ad una velocità di 2 mL/min da una pompa peristaltica. Immobilizzate la fetta utilizzando un ancoraggio di seziona.
- Sotto l'obiettivo a basso ingrandimento (4x) di un microscopio a campo largo che utilizza l'illuminazione obliqua a infrarossi, passare allo strato LEC 5. Misurare la distanza dalla superficie pial allo strato richiesto.
NOTA: L'illuminazione obliqua a infrarossi è stata ottenuta posizionando un LED vicino all'infrarosso a circa 3 mm sotto il coprivetrino della camera di registrazione con un angolo di ~55° rispetto al piano del coprivetrino (Figura 2B). Il contrasto di interferenza differenziale è una tecnica di imaging alternativa e comunemente usata per l'elettrofisiologia delle fette. - Passare a un obiettivo di immersione in acqua ad alto ingrandimento (40x) e identificare i neuroni piramidali. Contrassegnare la posizione della cella sul monitor del computer con del nastro.
NOTA: I neuroni piramidali hanno una morfologia approssimativamente triangolare con dendriti apicali prominenti che si proiettano verso la superficie piale della fetta (Figura 3A). La salute delle cellule può essere valutata dall'assenza di un nucleo condensato e visibile e dall'ispezione della membrana plasmatica che dovrebbe apparire liscia. È improbabile che una chiara marcatura fluorescente degli assoni da parte della proteina di fusione opsina-fluoroforo sia visibile quando si utilizza un microscopio a fluorescenza a campo largo. Per visualizzare le proiezioni assonali, eseguire l'immunoistochimica post-hoc utilizzando un anticorpo primario contro il fluoroforo dell'opsina e amplificare con un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo della stessa lunghezza d'onda o simile.
- Formazione di patch-clamp a cellule intere.
- Fabbricare una micropipetta in vetro borosilicato utilizzando un estrattore di pipette e riempire con una soluzione di registrazione intracellulare filtrata (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA e 0,25% biocitina prodotta in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Posizionare la micropipetta riempita nel supporto dell'elettrodo sul frontale dell'amplificatore patch-clamp assicurandosi che il filo dell'elettrodo sia a contatto con la soluzione intracellulare.
- Applicare una pressione positiva per bocca soffiando forte in un boccaglio (come una siringa da 1 mL con lo stantuffo rimosso) collegato tramite tubo alla porta laterale del supporto dell'elettrodo e mantenere la pressione chiudendo una valvola a tre vie in linea. Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo tale che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio.
- Aprire la finestra Seal Test in WinLTP16 (o altro software di acquisizione/oscilloscopio) e con l'amplificatore in modalità tension-clamp, applicare un impulso quadrato di 5 mV per determinare se la resistenza della pipetta è 3-6 MΩ.
- Avvicinarsi e toccare la cella identificata con la punta della pipetta; ciò dovrebbe comportare una rientranza nella membrana cellulare (Figura 3A; pannello di destra) e un piccolo aumento della resistenza delle pipette (0,1 MΩ).
- Rilasciare la pressione positiva e applicare una pressione negativa applicando un'aspirazione moderata al boccaglio; ciò dovrebbe comportare un notevole aumento della resistenza delle pipette (>1000 MΩ). La pressione può ora essere lasciata neutra. Applicare una pressione negativa in una rampa gradualmente crescente fino a quando la membrana cellulare non si rompe con conseguente transitori di capacità dell'intera cellula.
- Registrare eventi sinaptici evocati optogeneticamente .
- Immettere la configurazione del morsetto di corrente.
NOTA: Nella maggior parte dei casi la trasmissione sinaptica a lungo raggio è glutammatergica, quindi la registrazione a potenziali di membrana vicini al potenziale di inversione del cloruro isolerà al meglio la trasmissione mediata dal recettore AMPA (AMPAR) e ridurrà al minimo la misurazione di qualsiasi inibizione feed-forward (FFI) evocata. L'inversione del cloruro dipende dalla composizione della soluzione di registrazione intracellulare e dell'aCSF e può essere calcolata utilizzando l'equazione di Goldman-Hodgkin-Katz; per le soluzioni di cui sopra, questo era -61,3 mV. I neuroni piramidali LEC di livello 5 avevano un potenziale medio di membrana a riposo di -62 mV e, ove necessario, sono stati mantenuti a questo potenziale mediante iniezione di corrente costante. In alternativa, le celle possono essere bloccate in tensione al potenziale desiderato. Per registrare proiezioni inibitorie a lungo raggio16 o per registrare FFI, tension-clamp al potenziale di inversione cationica per isolare la conduttanza del cloruro GABAergico. Quando i neuroni di bloccaggio della tensione a potenziali di membrana al di sopra della soglia del potenziale d'azione, viene utilizzata una soluzione intracellulare a base di cesio contenente bloccanti dei canali del sodio voltaggio-dipendenti per migliorare il tension-clamp e prevenire l'inizio di potenziali d'azione (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloruro,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocitina prodotta in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - Utilizzando il software di acquisizione dati, inviare segnali TTL (transistor-transistor logic) a un driver LED per attivare un LED da 470 nm montato. Il LED montato viene diretto nel percorso luminoso del microscopio utilizzando cubi filtranti e ottiche appropriate (Figura 2B) per applicare impulsi luminosi alla fetta attraverso l'obiettivo 40x per evocare potenziali post-sinaptici eccitatori optogenetici (oEPSP).
NOTA: Gli impulsi luminosi possono essere applicati perisomaticamente/sopra i dendriti, il che comporterà l'attivazione delle opsine negli assoni e nel bouton presinaptico, oppure lo sperimentatore può spostare l'obiettivo sugli assoni lontano dalla cellula registrata per evitare la stimolazione eccessiva del bouton (vedi Discussione). L'ampiezza massima dell'EPSP dipende dalla forza della proiezione sinaptica, dall'efficacia delle iniezioni virali e dall'opsina utilizzata. gli EPSP possono essere titolati all'ampiezza desiderata variando l'intensità e/o la durata della luce18; variando la durata degli impulsi luminosi (durata tipica tra 0,2-5 ms alla massima potenza di uscita del LED, che si traduce in una densità luminosa di 4,4 mW/mm19) si ottengono ampiezze oEPSP più coerenti rispetto all'alterazione della potenza di uscita del LED. - Studiare le proprietà di rilascio presinaptico (variazione di tensione) erogando treni di impulsi luminosi multipli con diversi intervalli di inter-stimolo (Figura 3E); Bisogna prestare attenzione nell'interpretare la trasmissione evocata optogeneticamente (vedi Discussione).
- Studiare la plasticità a lungo termine evocando ripetutamente gli EPSP19 o l'applicazione di ligandi. Monitorare l'ampiezza dell'EPSP per 5-10 minuti per garantire la stabilità prima dell'induzione della plasticità, quindi monitorare fino a raggiungere un'ampiezza stabile (in genere 30-40 minuti).
NOTA: La maggior parte delle opsine attuali non sono in grado di evocare in modo affidabile molteplici potenziali d'azione ad alte frequenze, ad esempio 100 stimoli erogati a 100 Hz, come viene tipicamente utilizzato per indurre LTP. - Per confermare che gli oEPSP sono monosinaptici, eseguire l'attivazione over-bouton della via trasdotta posizionando l'obiettivo sopra il pergolato dendritico e stimolando in presenza di 0,5 μM di tetrodotossina e 100 μM di aminopiridina. L'applicazione di tetrodotossina abolirà la trasmissione se le risposte sono dipendenti dal potenziale d'azione e la successiva inclusione di aminopiridina ripristinerà parzialmente la trasmissione se gli oEPSP sono generati monosinapticamente19,20.
- Per consentire alla biocitina di riempire il neurone, attendere almeno 15 minuti dopo aver inserito la configurazione dell'intera cellula. In tensione-morsetto, monitorare la capacità della membrana e la resistenza di ingresso.
- Prelevare lentamente la pipetta lungo l'angolo di attacco lontano dal soma della cella, osservando la lenta scomparsa dei transitori di capacità e la corrente di membrana che indica la risigillatura della membrana cellulare e la formazione di un cerotto esterno-esterno sulla punta della pipetta. Osservate l'orientamento della sezione e la posizione delle celle all'interno della sezione. Mettere la fetta in PFA in una piastra a 24 pozzetti e incubare per una notte a 4 °C, quindi trasferire a 0,1 M PB.
NOTA: Le fette possono essere conservate fino a una settimana. Se è necessaria una conservazione più lunga, cambiare regolarmente il PB o utilizzare PB contenente azoturo di sodio (0,02% -0,2% di azoturo di sodio).
- Immettere la configurazione del morsetto di corrente.
4. Istologia
- Sito di iniezione di affettatura
- Dopo la fissazione, crioproteggere il tessuto in saccarosio al 30% (p/v) in PB fino a quando non affonda (inizialmente galleggerà nella soluzione di saccarosio), di solito durante la notte a temperatura ambiente o 24-48 ore a 4 °C.
- Utilizzando il mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT), collegare un blocco di tessuto al disco del campione di criostato. Congelare il blocco di tessuto seguendo i punti da 4.1.3 a 4.1.4.
- Mettere l'isopentano in un contenitore appropriato. Immergere solo il disco del campione, assicurandosi che il tessuto sia al di sopra del livello dell'isopentano. Abbassare il contenitore di isopentano in azoto liquido (o ghiaccio secco) e lasciare congelare il tessuto.
- Una volta completamente congelato (l'intero blocco di tessuto diventa pallido e duro), lasciare il blocco di tessuto nella camera del criostato a -20 °C per 30 minuti per consentire alla temperatura del blocco di equilibrarsi.
- Tagliare sezioni spesse 40 μm nel criostato a -20 °C. Utilizzare un pennello fine per guidare le sezioni dalla lama. Far aderire le sezioni congelate a temperatura ambiente, rivestite di poli-L-lisina, vetrino da microscopio toccando il vetrino alle sezioni.
- Aggiungere circa 150 μL di supporto a ciascuna slitta e coprire con un vetrino; Rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente sul vetrino di copertina. Coprire i vetrini per proteggerli dal fotosbiancamento e asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno 12 ore (o durante la notte). Utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare la posizione del sito di iniezione virale.
- Protocollo di colorazione della biocitina
NOTA: questo protocollo può essere applicato a sezioni spesse; Le fette non devono essere risezionate.- Lavare le fette di cervello con soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e 1,8 mM KH2PO4) sei volte per 10 minutiper lavaggio. Utilizzare una pipetta di trasferimento per svuotare i pozzetti dopo ogni passaggio.
- Incubare le fette in 3% H 2O2 (w / v) in PBS per 30 minuti per bloccare qualsiasi attività endogena perossidasi. Questo genera bolle di ossigeno.
- Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio o fino a quando non sono visibili ulteriori bolle di ossigeno. Incubare le fette di cervello in una soluzione di complesso HRP avidino-biotinilato (ABC) all'1% (v/v) in PBS contenente Triton X-100 allo 0,1% (v/v) a temperatura ambiente per 3 ore.
- Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio.
- Incubare ogni fetta in soluzione di 3,3′-diaminobenzidina (DAB) per alcuni minuti fino a quando la colorazione biocitina delle strutture neuronali diventa visibile (richiede circa 5-10 minuti).
ATTENZIONE: DAB è tossico. Utilizzare in cappa aspirante.
NOTA: i tempi di incubazione del DAB possono essere imprevedibili, monitorare attentamente il tessuto man mano che il colore si sviluppa. - Interrompere la reazione trasferendo le fette a PBS freddo (4 °C). Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio. Utilizzare un pennello per montare le fette di cervello su vetrini da microscopio rivestiti di poli-L-lisina.
- Rimuovere tutto il PBS in eccesso con un fazzoletto pulito. Coprire ogni fetta con circa 200 μL di mezzo di montaggio; Coprire con dei coprivetrini e premere delicatamente sul coprislip per spingere fuori le bolle d'aria. Asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno 12 ore (o durante la notte). Utilizzando un microscopio ottico, esaminare la posizione e i dettagli morfologici delle cellule.
NOTA: La biocitina può essere visualizzata in alternativa utilizzando streptavidina coniugata con fluorofori; Tuttavia, l'imaging può richiedere la resezione o l'uso di un microscopio confocale21.
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Representative Results
In questo protocollo, descriviamo come studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità utilizzando la consegna virale di costrutti optogenetici. Il protocollo può essere facilmente adattato allo studio di quasi tutte le connessioni a lungo raggio nel cervello. Ad esempio, descriviamo l'iniezione di AAV che codifica un'opsina in mPFC di ratto, la preparazione di fette acute da LEC, registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce dei terminali mPFC in LEC (Figura 1).
Una cellula piramidale sana è stata localizzata e rattoppata (ad esempio, Figura 3A). Nel presente esempio da mPFC a LEC, le cellule post-sinaptiche non sono state marcate; se è richiesta l'identificazione della cellula post-sinaptica, una cellula che esprime il marcatore fluorescente deve essere localizzata usando ottiche a campo largo (ad esempio, Figura 3B). La salute della cellula dovrebbe essere valutata mediante ottica a infrarossi prima della sperimentazione. Per attivare gli assoni mPFC nella LEC, un LED è stato posizionato direttamente sopra il soma cellulare dello strato 5 e sui dendriti prossimali tramite l'obiettivo del microscopio (Figura 1), singoli impulsi luminosi di 2 ms hanno portato a semplici forme d'onda oEPSP (Figura 3C); è possibile misurare l'ampiezza del picco dell'oEPSP. Per esaminare la plasticità a breve termine della sinapsi, sono stati applicati treni di stimolazione luminosa a 5, 10 e 20 Hz (Figura 3E). Per studiare la plasticità a lungo termine, dopo aver monitorato l'ampiezza basale dell'EPSP per 10 minuti, l'agonista colinergico, il carbacolo, è stato aggiunto all'aCSF circolante per 10 minuti. Ciò ha causato una depressione a lungo termine che era ancora evidente 40 minuti dopo la rimozione del ligando (Figura 3D).
A seguito di esperimenti di registrazione elettrofisiologica, il tessuto cerebrale contenente il sito di iniezione virale è stato sezionato ed è stata esaminata la lunghezza del sito di iniezione (Figura 4A). Il reporter fluorescente, mCherry, è localizzato negli strati più profondi della corteccia prelimbica e infralimbica (regioni costituenti della mPFC dei roditori). Questi strati sono stati presi di mira poiché è stato dimostrato che la proiezione al LEC proviene prevalentemente dagli strati corticali più profondi22. Le fibre mCherry positive possono anche essere viste unirsi al tratto di sostanza bianca. In un esperimento pilota per ottimizzare il posizionamento dell'iniezione virale, sono state prelevate ed esaminate sezioni di LEC da 40 μm; Le fibre mCherry positive possono essere viste nello strato 5 di LEC (Figura 4B). Infine, la cellula riempita di biocitina è stata colorata, consentendo di confermarne la posizione e la morfologia (Figura 4C,D).
Figura 1: Panoramica sperimentale. (A) Schema dell'iniezione del vettore virale nella corteccia prefrontale mediale (mPFC), della trasduzione delle cellule mPFC con costrutto optogenetico e del trasporto del costrutto ai terminali nella corteccia entorinale laterale (LEC). (B) Rappresentazione schematica della registrazione di intere cellule da neuroni piramidali di livello 5 in una fetta LEC acuta e attivazione della luce dei terminali mPFC tramite obiettivo microscopio. Abbreviazioni: CA = cornu ammonis; PERI = corteccia peririnale; TR = regione di transizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Camera di raccolta delle fette e configurazione ottica per registrazioni di cellule intere visualizzate, eccitazione optogenetica e identificazione di neuroni tdTomato positivi. (A) La camera di raccolta delle fette14 è realizzata su misura da un rack per tubi di microcentrifuga incollato su un foglio di rete di nylon e inserito in un becher in cui è immerso in un CSF (B ) I LED per l'eccitazione di ChR2 (470 nm) e tdTomato (565 nm) sono diretti attraverso una lente asferica del condensatore per collimare la luce, la luce a 565 nm viene irradiata attraverso un filtro passa-banda per ottenere la separazione spettrale degli spettri di eccitazione ed emissione tdTomato. Questi sono combinati con uno specchio dicroico a passaggio lungo e diretti verso la fetta con un secondo specchio dicroico a passaggio lungo di una lunghezza d'onda più lunga. La luce viene quindi focalizzata sulla fetta tramite la lente dell'obiettivo. Negli esperimenti in cui sono presenti neuroni marcati con tdTomato, la luce fluorescente emessa passa attraverso lo specchio dicroico e il filtro di emissione e viene focalizzata sul sensore della fotocamera da una lente acromatica. Le caratteristiche non fluorescenti della fetta sono visualizzate dalla luce obliqua rifratta vicino all'infrarosso (NIR) applicata da sotto la camera della fetta; questa luce passa l'ottica alla fotocamera annullando così la necessità di cambiare i cubi di filtro tra l'imaging fluorescente e NIR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione di neuroni sotto NIR/imaging fluorescente ed esempi rappresentativi di oEPSP. (A) A sinistra: Esempio di neurone con morfologia piramidale visualizzato con luce NIR. A destra: stesso neurone con la formazione di fossetta concava causata dalla pressione positiva della pipetta patch. (B) Espressione cre-recombinasi dipendente di tdTomato in un singolo neurone. (C) Rappresentativo dell'EPSP dello strato 5 di LEC nella cellula piramidale. (D) Esempio di esperimento di plasticità a lungo termine che monitora l'EPSP nel tempo dopo l'aggiunta di 10 μm di carbacholo (CCh). La linea tratteggiata indica l'ampiezza media dell'EPSP durante il periodo basale prima dell'aggiunta del farmaco. (E) Tracce rappresentative di treni di stimolazione a 5, 10 e 20 Hz. Le frecce blu indicano l'attivazione della luce. Barre della scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Verifica istologica del sito di iniezione e recupero della cellula riempita di biocitina . (A) Fotomicrografia coronale che mostra il sito di iniezione virale in mPFC, +3,00 mm dal bregma. (B) Sezione coronale sottile di LEC che illustra le fibre mCherry+. (C) Immagine a bassa potenza di fetta acuta spessa 350 μm, -6,2 mm da bregma, con cellula piramidale riempita di biocitina in LEC. La casella tratteggiata è mostrata a un ingrandimento maggiore in D. (D) LEC cella piramidale; La dendrite apicale può essere vista sulla destra dell'immagine in direzione dello strato 1. Le linee tratteggiate indicano i confini regionali. Abbreviazioni: IL = corteccia infralimbica; PL = corteccia prelimbica; wm = sostanza bianca. Barre di scala = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per esplorare proiezioni sinaptiche a lungo raggio altamente specifiche utilizzando una combinazione di chirurgia stereotassica per fornire AAV che codificano costrutti optogenetici ed elettrofisiologia in fette di cervello acute (Figura 1). Insieme, queste tecniche offrono strumenti per caratterizzare la fisiologia e la plasticità dei circuiti cerebrali con alta precisione in percorsi a lungo raggio e anatomicamente diffusi che in precedenza erano inaccessibili utilizzando la stimolazione elettrica tradizionale, non specifica. La combinazione con marcatori molecolari cellula-specifici consente la caratterizzazione delle proiezioni da una regione del cervello a diverse popolazioni cellulari definite in un'altra regione23.
Per sfruttare appieno la natura altamente precisa di questa tecnica, è essenziale verificare la specificità del percorso. Questo viene fatto in diversi passaggi; Durante la registrazione, assicurarsi che la sinapsi in esame sia monosinaptica (passaggio 3.3.5). Successivamente, esaminare istologicamente il sito di iniezione per assicurarsi che il virus sia confinato nella regione pre-sinaptica di interesse prevista e valutare la posizione e la morfologia della cellula post-sinaptica colorata con biocitina per assicurarsi che sia come previsto.
Selezione dei virus e raggiungimento della specificità cellulare
La tecnica è altamente adattabile e adatta per l'uso sia nei topi che nei ratti. Gli esperimenti che richiedono specificità anatomica possono essere eseguiti con roditori wild-type. Gli esperimenti che richiedono la specificità del tipo di cellula post-sinaptica possono richiedere un ceppo di roditore geneticamente modificato se le cellule non sono identificabili in base alla morfologia o alla posizione. Ad esempio, per colpire gli interneuroni che esprimono parvalbumina (PV), potrebbe essere utilizzata una linea di topi transgenici knock-in PV-Cre in cui la Cre-ricombinasi è espressa nei neuroni che esprimono PV. Per visualizzare queste cellule, la linea PV-Cre può essere incrociata con una linea di topo reporter per esprimere una proteina fluorescente dopo la ricombinazione mediata da Cre. In alternativa, un gene reporter fluorescente Cre-dipendente può essere introdotto viralmente. Le proteine di fusione ChR2-fluoroforo sono limitate alla membrana cellulare e possono apparire come un contorno del neurone se viste con microscopia a campo largo in fette acute, rendendo l'identificazione delle cellule per la registrazione dell'intera cellula più difficile rispetto all'uso di fluorofori citosolici. Se ChR2 viene utilizzato per identificare le cellule, la separazione di ChR2 e fluoroforo può essere ottenuta utilizzando vettori bicitronici24. Se si utilizza un reporter fluorescente per identificare i neuroni bersaglio per la registrazione di intere cellule, la sua lunghezza d'onda di eccitazione non dovrebbe idealmente sovrapporsi alla lunghezza d'onda di attivazione dell'opsina; Ciò eviterà l'attivazione prolungata delle afferenze trasdotte durante la ricerca di neuroni da cui registrare. Allo stesso modo, i reporter pre e post-sinaptici dovrebbero essere spettralmente separati. I reporter comuni sono mCherry, la proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina fluorescente gialla potenziata (eYFP).
Il costrutto virale utilizzato ha diverse componenti, ognuna può influire sul successo dell'esperimento e quindi è necessario prendere in considerazione ogni elemento. Primaria importanza dovrebbe essere data alla scelta dell'opsina. Per l'attivazione presinaptica, l'opsina ideale ha grandi fotocorrenti (per portare in modo affidabile gli assoni alla soglia del potenziale d'azione), una rapida cinetica on e off e un lento tasso di desensibilizzazione per consentire una stimolazione ripetuta ad alta frequenza. Di norma, la cinetica rapida spesso avviene al costo di fotocorrenti più piccole25; Tuttavia, lo screening molecolare e l'ingegneria hanno fornito alle opsine grandi fotocorrenti. Il protocollo attuale utilizza ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, tuttavia sono adatti anche Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 e ChRmine29. Inoltre, esistono opsine eccitatorie con lunghezze d'onda di attivazione spostate verso il rosso (ChrimsonR)26 o verso il viola (CheRiff), che possono essere richieste per evitare sovrapposizioni con spettri di eccitazione dei fluorofori utilizzati per l'identificazione cellulare (vedi sopra).
Il sierotipo degli AAV può influenzare la capacità del vettore di trasdurre diverse regioni cerebrali e tipi di cellule, nonché l'estensione del trasporto assonale in entrambe le direzioni anterograda e retrograda30. I sierotipi comunemente usati per la trasduzione neuronale sono 1, 2, 5, 8 e 9. Una ricerca bibliografica può dare un'indicazione di quale sierotipo è stato utilizzato con successo in una determinata regione. Ad esempio, AAV9 è stato raccomandato per la trasduzione dei neuroni corticali31.
Il promotore consente di specificare il tipo di cellula in cui verrà espressa l'opsina. I promotori rientrano in diverse classi. I promotori generali, ad esempio CAG o EF1a, provocano l'espressione nella maggior parte dei tipi di cellule. I promotori neuron-specifici, ad esempio la sinapsina, generano espressione in tutti i tipi di neuroni. CaMKIIa è comunemente usato per limitare l'espressione ai neuroni eccitatori, anche se è stato dimostrato che perde - alcune espressioni sono state osservate negli interneuroni32. L'elemento enhancer mDlx limita l'espressione agli interneuroni GABAergici33. La specificità del tipo di cellula pre-sinaptica può essere ottenuta usando una linea Cre-mouse (come descritto sopra per la cellula post-sinaptica). In questo caso, sarà necessario un costrutto genetico Cre-dipendente per limitare l'espressione dell'opsina alle cellule che esprimono Cre.
Il titolo è il numero di particelle virali nella preparazione virale. Ancora una volta, una ricerca bibliografica può dare un'indicazione di un titolo che ha generato una trasduzione sufficiente in una particolare regione. Quando si utilizza un sistema Cre-dipendente, il titolo può essere particolarmente importante in quanto titoli virali elevati possono trasdurre l'espressione in cellule non che esprimono Cre34.
Ottimizzazione della distribuzione dei virus
La consegna virale precisa nella regione di interesse è di fondamentale importanza per questo approccio. Le coordinate di iniezione della regione pre-sinaptica possono essere stimate consultando la letteratura e/o un atlante cerebrale per la specie appropriata35,36. Lo sperimentatore dovrebbe quindi impiegare del tempo per ottimizzare e perfezionare le coordinate precise dell'iniezione e il volume utilizzati per garantire che l'iniezione virale sia limitata alla regione presinaptica di interesse. Ciò è particolarmente critico quando anche le regioni limitrofe proiettano sul sito di registrazione. Si consiglia di utilizzare piccoli volumi del virus come metodo efficace per farlo. Se è necessario un sito di iniezione particolarmente piccolo, l'uso di micropipette di vetro al posto della siringa e dell'ago può essere vantaggioso13. Lasciare l'ago per iniezione in situ per un periodo adeguato e il ritiro lento dell'ago per iniezione è fondamentale per evitare che il virus fuoriesca nel tratto dell'ago. Per confermare l'accuratezza delle iniezioni, è buona norma verificare istologicamente il sito di iniezione di ciascun animale utilizzato attraverso l'elettrofisiologia, ove possibile, ed escludere i dati in cui la trasduzione virale è fuori bersaglio. Nelle nostre mani, il protocollo sopra descritto ha dimostrato di essere generalizzabile a molte diverse connessioni a lungo raggio, comprese le proiezioni dai nuclei talamici della linea mediana ventrale, ippocampo, talamo mediodorsale e LEC a PFC; proiezioni da PFC a LEC e talamo mediodorsale; proiezioni da LEC e nuclei talamici della linea mediana ventrale all'ippocampo (Zafar Bashir lab, Università di Bristol, osservazioni non pubblicate19). La marcatura optogenetica di questi diversi percorsi ha semplicemente richiesto il perfezionamento delle coordinate e dei volumi di iniezione.
Limitazioni del protocollo
La rapida dissezione del cervello e un'attenta separazione sono di fondamentale importanza per il successo di questi esperimenti. Il protocollo di affettatura qui descritto produce fette acute sane senza adattamento per le diverse regioni del cervello; Tuttavia, è stata riportata una variazione nella temperatura di incubazione del mezzo di affettamento e post-affettatura descritta altrove28 per migliorare ulteriormente la salute delle fette. Inoltre, siamo stati anche in grado di prelevare fette acute da due regioni del cervello in seguito alla trasduzione virale di una singola area, riducendo così il numero di animali utilizzati. Abbiamo scoperto che in percorsi anatomicamente densi, periodi brevi come 7 giorni tra la trasduzione virale e la registrazione sono sufficienti per evocare robusti oEPSP di entità adeguata per le registrazioni patch-clamp di intere cellule. In proiezioni a lungo raggio o più scarse, ritardi più lunghi sono vantaggiosi.
Si deve prestare attenzione nell'interpretazione dei risultati dell'attività evocata optogeneticamente , in particolare per quanto riguarda la plasticità a breve termine. Risultati precedenti hanno dimostrato che la trasmissione evocata optogeneticamente può subire una depressione sinaptica più pronunciata dopo stimolazione ripetuta rispetto alla stimolazione elettrica, che può insorgere a causa di una serie di fattori. In primo luogo, la desensibilizzazione opsina25 può portare a un numero ridotto di assoni presinaptici, portando a una riduzione delle risposte postsinaptiche. La cinetica dei canali migliorata delle opsine scoperte di recente e di quelle sottoposte a ingegneria molecolare (vedi sopra) ha contribuito notevolmente a mitigare gli effetti della desensibilizzazione; tuttavia, la stimolazione a 100 Hz rimane fuori dalla portata di molte opsine, il che può impedire l'uso di alcuni protocolli di induzione della plasticità a lungo termine (anche se vedi37). In secondo luogo, la lenta cinetica delle opsine può ampliare i potenziali d'azione18 portando a un prolungato rilascio del trasmettitore e alla deplezione vescicolare; Ciò può anche derivare dalla permeabilità al calcio delle opsine eccitatorie11; Questi problemi possono essere mitigati evitando l'iper-riattivazione di Bouton38. In terzo luogo, la trasduzione dei neuroni utilizzando vettori AAV può anche portare ad alterate proprietà di rilascio presinaptico in alcune sinapsi; tuttavia, questo può essere mitigato utilizzando il sierotipo38 AAV9. Nonostante queste limitazioni, con un uso attento, l'attivazione optogenetica può imitare la stimolazione elettrica19,38 ed è, quindi, uno strumento inestimabile nello studio della fisiologia delle vie sinaptiche non studiate. Notiamo inoltre che i dati mostrati in Figura 3E valutano la plasticità a breve termine nel morsetto di corrente ed è, quindi, soggetto all'interazione dei potenziali sinaptici e delle proprietà intrinseche della membrana, questo può essere evitato eseguendo esperimenti equivalenti nel morsetto di tensione.
Direzioni future
La cassetta degli attrezzi optogenetica in continua espansione ha sollevato la possibilità di applicare questa tecnologia in due percorsi sinaptici nella stessa preparazione, utilizzando una coppia di opsine con spettri di eccitazione divergenti. Ciò è reso possibile dall'uso di un opsin ChrimsonR26, che, a differenza di ChR2, è fotoattivato dalla luce a lunghezza d'onda rossa. ChrimsonR mantiene una bassa sensibilità alla luce blu, quindi per evitare l'attivazione del percorso incrociato può essere utilizzato in combinazione con opsine insensibili al rosso, che sono spostate in viola (CheRiff 27) e / o hanno ordini di grandezza più sensibilità alla luce blu (Chronos26). Ciò consente l'uso di stimoli luminosi blu/viola troppo deboli per attivare significativamente ChrimsonR e quindi consentire l'attivazione di due percorsi39,40, che possono aumentare il throughput sperimentale, consentire l'esame delle interazioni di pathway convergenti e consentire il rilascio di neuromodulatori da fonti endogene 41.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione Wellcome 206401/Z/17/Z. Vorremmo ringraziare Zafar Bashir per il suo tutoraggio esperto e il Dr. Clair Booth per l'assistenza tecnica e i commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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