Summary
在这里,我们提出了一种协议,描述了具有光遗传学构建体的离散大脑区域的病毒转导,以允许在急性啮齿动物脑切片中进行突触特异性电生理表征。
Abstract
研究大脑中特定突触的生理特性,以及它们如何经历可塑性变化,是现代神经科学的一个关键挑战。传统的 体外 电生理技术使用电刺激来唤起突触传递。这种方法的一个主要缺点是其非特异性;刺激电极区域的所有轴突都将被激活,因此很难将效应归因于特定的传入连接。这个问题可以通过用基于光遗传学的刺激代替电刺激来克服。我们描述了一种将光遗传学与 体外 膜片钳记录相结合的方法。这是研究精确解剖学定义的突触连接的基底突触传递和突触可塑性的有力工具,几乎适用于大脑中的任何通路。在这里,我们描述了编码通道视紫红质蛋白的病毒载体的制备和处理,用于手术注射到啮齿动物大脑中感兴趣的突触前区域(内侧前额叶皮层),并制作下游靶区域的急性切片(外嗅皮层)。还介绍了将膜片钳记录与光刺激突触激活相结合以研究短期和长期突触可塑性的详细程序。我们讨论了通过结合光遗传学和Cre依赖性细胞标记来实现途径和细胞特异性的实验示例。最后,描述感兴趣的突触前区域的组织学确认以及突触后细胞的生物细胞素标记,以允许进一步识别精确位置和细胞类型。
Introduction
了解突触的生理学以及它们如何经历可塑性变化是了解大脑网络如何在健康大脑中发挥作用的基础1,以及它们如何在脑部疾病中出现故障。使用急性 离体 脑切片允许使用全细胞膜片钳记录以高信噪比记录来自单个神经元的突触的电活动。膜电位控制和直接的药理操作允许分离受体亚型。这些记录可以具有精确的特异性来识别突触后神经元,包括层状和亚区域位置2,细胞形态3,分子标记的存在4,其传入投影5,甚至最近是否活跃6。
然而,实现突触前输入的特异性更具挑战性。传统方法使用刺激电极来激发在特定薄片中运行的轴突。这方面的一个例子是在海马体中,辐射层中的局部刺激激活从CA3投射到CA1子场7的突触。在这种情况下,由于CA3输入代表位于投射到CA1锥体细胞8的辐射层内的唯一兴奋性输入,因此实现了突触前特异性。然而,CA3-CA1轴突的常规电突触前激活可实现的这种高度的输入特异性是一个例外,反映在该突触所受到的深入研究中。在其他大脑区域中,来自多个传入通路的轴突共存于同一层中,例如,在新皮层9的第1层中,因此使用传统的刺激电极无法进行特定于输入的突触前刺激。这是有问题的,因为不同的突触输入可能具有不同的生理特性;因此,它们的共刺激可能导致突触生理学的错误表征。
光遗传学的出现,即通道视紫红质-2(ChR2)等光敏膜蛋白(视蛋白)的遗传编码,为研究大脑区域之间的孤立突触投影提供了巨大的可能性10,11。在这里,我们描述了一种可推广且低成本的解决方案,用于研究长距离突触生理学和可塑性。光遗传学构建体使用病毒载体以高度特异性的方式传递,允许对感兴趣的突触前区域进行极其精确的控制。传出投影将表达光激活通道,允许在目标区域中激活这些纤维。因此,可以研究不能通过传统的非特异性电刺激独立激活的长距离解剖弥漫通路。
我们描述了作为示例途径,内侧前额叶皮层(mPFC)与编码兴奋性阳离子通道视蛋白的腺相关病毒(AAV)的转导。然后,我们描述了从外嗅皮层(LEC)制备急性切片,从第5层LEC锥体神经元的膜片钳记录以及谷氨酸能mPFC-LEC投影的光诱发激活(图1)。我们还描述了注射部位的组织学评估,以确认感兴趣的突触前区域的位置并识别突触后细胞形态。
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Protocol
所有动物程序均按照《英国动物科学程序法》(1986年)和相关指南以及当地机构指南进行。
1.立体定位病毒注射
注意:当前协议需要解剖学特异性,但不是突触后细胞类型。
- 选择合适的动物。在该协议中使用雄性野生型李斯特连帽大鼠(300-350g,约3个月大)。
- 选择合适的病毒构建体。有几个因素需要考虑(见讨论)。目前的协议使用病毒表达光遗传学通道ChETATC 12,以转导兴奋性神经元(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T / T159C) - mCherry;滴度:3.3 x10 13病毒基因组/ mL)。
- 如前所述,使用脑图谱建立注射的坐标和体积35。
- 病毒制剂的立体定向注射
注意:应遵循有关动物使用和护理的所有相关国家和机构指南。如前所述,立体定向注射病毒载体13 进行以下修改。- 在麻醉和制备动物期间将病毒制剂保持在冰上。
- 在含有4%异氟醚的麻醉诱导室中诱导麻醉。监测由较慢的常规呼吸频率(1 Hz)和没有踏板和角膜反射指示的麻醉水平(分别通过捏脚趾和轻轻触摸眼角进行测试;不应检测到任何反应)。
- 在侵入性手术前至少 30 分钟给予术前镇痛药,如美洛昔康。
- 当动物完全麻醉后,使用剪刀去除头皮上的皮毛。将异氟醚流切换到立体定位框架的鼻锥,并将大鼠安装在框架中。将润滑眼部凝胶涂抹在眼睛上,以防止在手术过程中干燥。
- 手术应在无菌条件下进行。在整个过程中使用无菌手套和器械。在用4%w / v氯己定溶液消毒头皮之前,涂抹利多卡因软膏(5% w / w),然后用无菌窗帘覆盖身体。使用手术刀在头皮上做一个长约 15 毫米的纵向切口,以露出前膛。
- 将汉密尔顿注射器装入微注射泵中,该注射泵连接到安装在立体定位框架上的可移动臂。
- 将 5 μL 等分试样的病毒放入 0.2 mL 管中并旋转几秒钟,直到所有体积都在管底部。将 2 μL 病毒制剂移液到管盖中。
- 首先用手术显微镜观察针尖,用病毒制剂填充注射器,然后手动将病毒推注在针尖,并使用泵控制撤回注射器柱塞。
- 将泵进样体积设置为 300 nL,将流速设置为 100 nL/min。运行泵并通过观察针尖处的病毒液滴来确认正常流动。在棉签上吸收病毒,并用70%乙醇轻轻清洁针头。
- 使用立体定位框架上的调节螺钉将针尖导航到前胛(颅骨上冠状缝合线和矢状面缝合线相交的点),并注意在框架上的三个游标尺度上观察到的立体定位测量值。相对于大鼠mPFC前后部的坐标为前后+ 3.1毫米,中外侧±0.7毫米,背腹 - 4.5毫米;从前膛坐标添加/减去(如所示)这些距离,然后将针导航到前后和中外侧坐标,并将针轻轻降低到颅骨表面。
注意:上面给出的mPFC坐标适用于300-350g的雄性李斯特罩大鼠;大鼠品系、大小的变化可能需要改变这些坐标(见 讨论)。 - 将针从颅骨表面抬起,并用细尖永久性记号笔标记该点。此时使用安装在立体定位臂上的微型钻头打一个毛刺孔。
- 将针头以预定的背腹坐标插入大脑并输注预定体积(对于mPFC:300nL)。将针头原位放置10分钟,以使推注扩散。取出针头后,运行泵以确保针头没有堵塞。
注意:缓慢插入和取出针头(~3毫米/分钟),以尽量减少对脑组织的损害和病毒回流到针道。 - 皮下注射 2.5 mL 温热的氯化钠 (0.9% w/v) 和葡萄糖 (5% w/v) 溶液以维持水合作用。
- 重复步骤 1.4.12。对于第二个半球。
- 缝合头皮切口,并在手术完成后,给予 2.5 mL 氯化钠和葡萄糖溶液以及适当的、机构推荐的止痛药用于疼痛管理,例如丁丙诺啡或美洛昔康。不要在动物失去知觉时无人看管。将大鼠放在加热的恢复盒中,直到它完全恢复意识。只有在完全康复后才能与其他动物一起返回笼子。
- 遵循病毒转染啮齿动物术后护理和住房程序的机构指南。等待至少2周,让视蛋白转基因充分表达,然后再开始实验。
注意:转导所需的时间取决于突触前和突触后区域之间的连接距离和强度。对于mPFC到LEC,需要4-6周。
2.急性脑切片的制备
注意:在这里,我们描述了一种制备脑切片的简单方法,该方法在我们手中足以从成年小鼠和大鼠中获得高质量的皮质,海马和丘脑切片。
- 准备解剖溶液。
- 用 ~200 mL 冰冷的蔗糖切割溶液(189 mM 蔗糖、26 mM NaHCO 3、10 mM D-葡萄糖、5 mM MgSO 4、3 mM KCl、1.25 mM NaH 2 PO4 和 0.2 mM CaCl 2 在超纯水 (UPW) 中填充 250 mL 烧杯,在 25 °C 下电阻率为 18.2 MΩ cm)或足够的体积以填充振动切片机组织室。用碳原(95% O 2,5% CO2)泡泡并保持在冰上。
- 在室温下用人造脑脊液(aCSF;124 mM NaCl、26 mM NaHCO 3、10 mM D-葡萄糖、3 mM KCl、2 mM CaCl 2、1.25 mM NaH2PO 4 和 1 mM MgSO4)填充切片收集室,用碳化物鼓泡。切片收集室14由粘在尼龙网片上的微量离心管架定制制成,并放入浸没在aCSF中的烧杯中(图2A)。
- 在磷酸盐缓冲液(PB;75.4 mM Na 2 HPO 4.7H 2 O和24.6 mM NaH2PO 4)中填充50 mL管。H2O)。
注意:PFA有毒。在通风橱中使用。
- 解剖大脑。
- 使用5%异氟醚在诱导室中麻醉大鼠,直到呼吸缓慢而规律(~1Hz)。确保有足够的麻醉测试水平,以消除踏板和角膜反射。
- 使用断头台将动物斩首。
- 如前所述快速解剖整个大脑15并转移到蔗糖切割溶液中。在斩首后 90 秒内完成该步骤,以获得良好的切片质量和成功的全细胞记录。
- 使用金属茶匙,拿起大脑,丢弃多余的切割溶液,然后将其放在台面上的一张滤纸上。
- 使用手术刀或剃须刀片,快速切除小脑,并在冠状平面中沿其长度约一半切开大脑;后半部分是LEC组织块。除了要切片的区域外,请务必包括一些多余的组织以进行下一步。将该组织块和大脑的其余部分返回到蔗糖切割溶液中。
- 将一滴氰基丙烯酸酯胶水滴在振动切片机组织载物台上。将其铺成薄层,其面积略大于上一步中创建的组织块。
- 用茶匙拿起LEC组织块,丢弃多余的溶液,然后转移到胶贴上,使前冠状切口粘附。
- 将载物台安装到振动切片机组织室中,并快速倒入足量的蔗糖切割溶液以浸没组织;用碳水化合物使该溶液起泡。将 LEC 组织块定向,腹面朝向刀片。虽然室内环境照明不足以激活视蛋白,但请避免使用振动切片机上可能存在的其他光源。
- 使用高叶片振荡速度 (100 Hz) 和缓慢的叶片前进速度 (0.06 mm/s) 从腹侧到背侧切割 350 μm 厚的切片。通常,每个半球可以获得七个LEC切片。
- 将切片转移到切片收集室。切片收集完成后,将收集室转移到34°C水浴中1小时,然后返回室温。用碳原连续起泡。切片将足够健康,可以记录至少 6 小时。
- 将大脑的其余部分置于PFA中48小时,以进行注射部位的事后检查(见第4节)。
3. 电生理学和光遗传学刺激
- 鉴定靶细胞。
- 将切片放入浸没的记录室中,在34°C下通过蠕动泵以2mL / min的速率注入aCSF。使用切片锚点固定切片。
- 在使用倾斜红外照明的宽场显微镜的低放大倍率(4x)物镜下,导航到LEC层5。测量从pial表面到所需层的距离。
注意:倾斜红外照明是通过将近红外LED放置在记录室盖玻片下方约3 mm处,与盖玻片平面成~55°角来实现的(图2B)。微分干涉对比是切片电生理学的另一种常用成像技术。 - 更换为高倍率水浸物镜(40x)并识别锥体神经元。用胶带标记计算机显示器上单元的位置。
注意:锥体神经元具有大致的三角形形态,突出的顶端树突向切片的pial表面突出(图3A)。细胞健康可以通过没有浓缩的可见细胞核和检查应该看起来光滑的质膜来评估。使用宽场荧光显微镜时,不太可能看到视蛋白-荧光团融合蛋白对轴突的清晰荧光标记。为了可视化轴突投影,使用针对视蛋白荧光团的一抗进行事后免疫组织化学,并使用与相同或相似波长的荧光团偶联的二抗扩增。
- 形成全细胞膜片钳。
- 使用移液器拉拔器制造硼硅酸盐玻璃微量移液器,并填充过滤的细胞内记录溶液(120 mM k-葡萄糖酸盐、40 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM NaCl、2 mM MgATP、1 mM MgCl、0.3 mM NaGTP、0.2 mM EGTA 和 0.25% 生物细胞素,在 UPW、pH 7.25、285-300 mOsm 中制造)。将填充的微量移液器放在膜片钳放大器头台上的电极支架中,确保电极丝与细胞内溶液接触。
- 通过用管子向电极支架侧端口连接的吹嘴(例如移除柱塞的 1 mL 注射器)用力吹气,通过口施加正压,并通过关闭在线三通阀来保持压力。抬起显微镜物镜,使弯月面形成,并将电极插入弯月面,直到可以在显微镜上看到。
- 在WinLTP16(或其他采集软件/示波器)中打开“密封测试”窗口,在放大器处于电压钳模式的情况下,施加5 mV方脉冲以确定移液器电阻是否为3-6 MΩ。
- 用移液器吸头接近并触摸识别的细胞;这应该会导致细胞膜压痕(图3A;右图)和移液器电阻的小幅增加(0.1 MΩ)。
- 释放正压,通过在吹嘴处施加适度的吸力来施加负压;这应该会导致移液器阻力(>1000 MΩ)大幅增加。压力现在可以保持中立。以逐渐增加的斜坡施加负压,直到细胞膜破裂导致全电池电容瞬变。
- 记录光遗传诱发的突触事件。
- 进入电流钳配置。
注意:在大多数情况下,长距离突触传递是谷氨酸能的,因此在接近氯化物逆转电位的膜电位下记录将最好地隔离AMPA受体(AMPAR)介导的传输,并最大限度地减少任何前馈抑制(FFI)的测量诱发。氯化物逆转取决于细胞内记录溶液和aCSF的组成,可以使用Goldman-Hodgkin-Katz方程计算;对于上述解决方案,为-61.3 mV。第 5 层 LEC 锥体神经元的平均静息膜电位为 -62 mV,并在必要时通过注入恒流维持在此电位。或者,可以将电池电压钳位到所需的电位。为了记录长程抑制预测16 或记录FFI,在阳离子反转电位处进行电压钳位以隔离GABA能氯电导。当膜电位高于动作电位阈值时,使用含有电压门控钠通道阻滞剂的铯基细胞内溶液来改善电压钳位并防止动作电位的启动(130 mM CsMeSO 4、10 mM HEPES、8 mM NaCl、5 mM QX 314 氯化物、4 mM MgATP、0.5 mM EGTA、0.3 mM NaGTP、0.25% 超纯水生物细胞素, pH 7.25,285-300 mOsm)。 - 使用数据采集软件,将晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 信号发送到 LED 驱动器,以激活已安装的 470 nm LED。安装的LED使用滤光片立方体和适当的光学元件(图2B)引导到显微镜光路中,通过40倍物镜 将 光脉冲施加到切片上,以唤起光遗传学兴奋性突触后电位(oEPSP)。
注意:光脉冲可以在周围/树突上施加,这将导致轴突和突触前布顿中视蛋白的激活,或者研究者可以将物镜移动到轴突上,远离记录的细胞以避免过度的布顿刺激(见 讨论)。最大 oEPSP 振幅取决于突触投射的强度、病毒注射的功效和使用的视蛋白。oEPSP可以通过改变光强度和/或持续时间滴定至所需振幅18;改变光脉冲的持续时间(最大LED功率输出时的典型持续时间在0.2-5 ms之间,导致4.4 mW/mm光密度19)比改变LED的功率输出提供更一致的oEPSP幅度。 - 通过传递具有不同刺激间隔的多个光脉冲序列来研究突触前释放特性(电压变化)(图 3E);在解释光遗传诱发传播时应小心( 讨论)。
- 通过反复唤起oEPSPS19 或配体的应用来研究长期可塑性。监测oEPSP振幅5-10分钟以确保在诱导塑性之前稳定性,然后监测直到达到稳定的振幅(通常为30-40分钟)。
注意:大多数当前的视蛋白不能可靠地在高频下唤起多个动作电位,例如,以100 Hz传递100个刺激,通常用于诱导LTP。 - 为了确认oEPSP是单突触的,通过将物镜定位在树突状乔木上并在0.5μM河豚毒素和100μM氨基吡啶存在下刺激来对转导途径进行过度bouton激活。如果反应是动作电位依赖性的,则河豚毒素的应用将消除传播,如果oEPSP单突触产生,则随后加入氨基吡啶将部分恢复传输19,20。
- 为了让生物细胞素充满神经元,在进入全细胞配置后等待至少15分钟。在电压钳位中,监视膜电容和输入电阻。
- 沿着接近角缓慢地将移液器从细胞体上抽出,观察电容瞬变和膜电流的缓慢消失,表明细胞膜重新密封并在移液器尖端形成由外的贴片。记下切片的方向和切片中单元格的位置。将切片放入24孔板中的PFA中,并在4°C下孵育过夜,然后转移到0.1M PB中。
注意:切片最多可以存储一周。如果需要更长的储存时间,请定期更换PB或使用含叠氮化钠(叠氮化钠的0.02%-0.2%)。
- 进入电流钳配置。
4. 组织学
- 切片注射部位
- 固定后,在PB中的30%蔗糖(w / v)中冷冻保护组织,直到其下沉(最初将漂浮在蔗糖溶液中),通常在室温下过夜或在4°C下24-48小时。
- 使用最佳切割温度 (OCT) 培养基,将一块组织连接到低温恒温器样品盘上。按照步骤4.1.3至4.1.4冷冻组织块。
- 将异戊烷放入适当的容器中。仅浸没标本盘,确保组织高于异戊烷的水平。将异戊烷容器放入液氮(或干冰)中,让组织冻结。
- 一旦完全冷冻(整个组织块变得苍白和坚硬),将组织块留在-20°C的低温恒温室中30分钟,以使块的温度平衡。
- 在-20°C的低温恒温器中切割40μm厚的切片。 使用细画笔引导刀片上的部分。通过将载玻片接触切片,将冷冻切片粘附在室温,聚L-赖氨酸包被的玻璃显微镜载玻片上。
- 向每张载玻片中加入约 150 μL 封片剂,并用盖玻片盖住;轻轻按压盖玻片以去除任何气泡。盖上载玻片以防止光漂白并在室温下风干至少12小时(或过夜)。使用荧光显微镜检查病毒注射部位的位置。
- 生物细胞素染色方案
注意:此协议可应用于厚截面;切片不需要重新切片。- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS;137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na 2 HPO4和1.8 mM KH2PO4)洗涤脑切片六次,每次洗涤10分钟。每一步后使用移液器清空孔。
- 将切片在PBS中的3%H2O2 (w / v)中孵育30分钟以阻断任何内源性过氧化物酶活性。生成氧气气泡。
- 用PBS清洗脑切片六次,每次洗涤10分钟,或直到没有进一步的氧气气泡可见。将脑切片在含有0.1%(v / v)Triton X-100的PBS中的1%(v / v)亲和素化HRP复合物(ABC)溶液中孵育3小时。
- 用PBS清洗脑切片六次,每次洗涤10分钟。
- 将每个切片在3,3′-二氨基联苯胺(DAB)溶液中孵育几分钟,直到神经元结构的生物细胞素染色变得可见(大约需要5-10分钟)。
注意:轻拍是有毒的。在通风橱中使用。
注意:DAB孵育时间可能无法预测,随着颜色的发展密切监测组织。 - 通过将切片转移到冷(4°C)PBS中来停止反应。用PBS清洗脑切片六次,每次洗涤10分钟。使用刷子将脑切片安装到聚-L-赖氨酸涂层玻璃显微镜载玻片上。
- 用干净的纸巾去除所有多余的PBS。用约 200 μL 封片剂覆盖每个切片;盖上盖玻片,轻轻按压盖玻片以推出气泡。在室温下风干至少12小时(或过夜)。使用光学显微镜检查细胞的位置和形态细节。
注意:生物细胞素也可以使用荧光团偶联的链霉亲和素可视化;然而,成像可能需要切除或使用共聚焦显微镜21。
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Representative Results
在该协议中,我们描述了如何使用光遗传学构建体的病毒递送来研究长距离突触生理学和可塑性。该协议可以很容易地适应研究大脑中几乎所有的远程连接。例如,我们描述了将编码视蛋白的AAV注射到大鼠mPFC中,从LEC制备急性切片,从第5层LEC锥体神经元中膜片钳记录,以及LEC中mPFC末端的光诱发激活(图1)。
找到并修补健康的锥体细胞(例如, 图3A)。在本mPFC到LEC示例中,突触后细胞未被标记;如果需要突触后细胞鉴定,则应使用宽场光学器件定位表达荧光标记物的细胞(例如, 图3B)。在实验之前,应通过红外光学评估细胞的健康状况。为了激活LEC中的mPFC轴突,通过显微镜物镜 将 LED直接放置在第5层细胞体和近端树突上(图1),2 ms的单光脉冲产生简单的波形oEPSP(图3C);可以测量oEPSP的峰值幅度。为了检查突触的短期可塑性,应用了5,10和20 Hz的光刺激序列(图3E)。为了研究长期可塑性,在监测基线oEPSP振幅10分钟后,将胆碱能激动剂carbachol添加到循环aCSF中10分钟。这导致了长期抑郁,在去除配体后40分钟仍然很明显(图3D)。
在电生理记录实验之后,对含有病毒注射部位的脑组织进行切片,并检查注射部位的长度(图4A)。荧光报告基因mCherry定位于边缘前皮层和边缘下皮层(啮齿动物mPFC的组成区域)的深层。这些层是有针对性的,因为对LEC的投影已被证明主要来自更深的皮层22。也可以看到mCherry阳性纤维加入白质束。在优化病毒注射放置的试点实验中,取并检查了 LEC 的 40 μm 切片;在LEC的第5层中可以看到mCherry阳性纤维(图4B)。最后,对充满生物细胞素的细胞进行染色,从而确认其位置和形态(图4C,D)。
图 1:实验概述。 (A)病毒载体注射到内侧前额叶皮层(mPFC)中,具有光遗传学构建体的mPFC细胞的转导以及构建体向外嗅皮层(LEC)末端的转运示意图。(B)急性LEC切片中第5层锥体神经元的全细胞记录和 通过显微镜物镜光 激活mPFC末端的示意图。缩写:CA = 角氨;PERI = 鼻周皮层;TR = 过渡区域。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:切片收集室和光学配置,用于可视化的全细胞记录、光遗传学激发和 tdTomato 阳性神经元的鉴定。 (A)切片收集室14由粘在尼龙网片上的微量离心管架定制制成,并放入浸没在aCSF中的烧杯中(B) 用于激发 ChR2 (470 nm) 和 tdTomato (565 nm) 的 LED 通过非球面聚光镜引导光线,565 nm 光通过带通滤光片发射,以实现 tdTomato 激发和发射光谱的光谱分离。它们与长通二向色镜结合,并用波长较长的第二个长通二向色镜指向切片。然后通过物镜将光线聚焦在切片上。在存在tdTomato标记神经元的实验中,发射的荧光通过二向色镜和发射滤光片,并通过消色差透镜聚焦到相机传感器上。切片的非荧光特征通过从切片室下方施加的倾斜折射近红外 (NIR) 光可视化;这种光将光学元件传递到相机,从而消除了在荧光和近红外成像之间更换滤光片立方体的需要。请点击此处查看此图的大图。
图3:近红外/荧光成像下的神经元可视化和oEPSP的代表性示例 。 (A)左:用近红外光可视化的具有锥体形态的神经元示例。右:相同的神经元与贴片移液器正压引起的凹陷形成。(B)tdTomato在单个神经元中的cre-重组酶依赖性表达。(C)锥体细胞中LEC第5层的代表oEPSP。(D)添加10μm卡巴酚(CCh)后监测oEPSP随时间变化的长期塑性实验示例。虚线表示药物添加前基线期间的平均oEPSP振幅。(E) 5、10 和 20 Hz 刺激序列的代表性痕迹。 蓝色箭头表示光激活。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4:注射部位的组织学验证和生物细胞素填充细胞的回收 。 (A)冠状显微照片显示mPFC中的病毒注射部位,距bregma+3.00毫米。(B)LEC的薄冠状截面,说明mCherry+纤维。(C) 350 μm 厚的急性切片的低倍图像,距布雷格玛 -6.2 mm,LEC 中含有充满生物细胞素的锥体细胞。虚线框以较高的放大倍率显示在D.(D)LEC锥体细胞中;顶端枝晶可以在图像的右侧朝向第 1 层。虚线表示区域边界。缩写:IL = 边缘下皮层;PL = 边缘前皮层;WM = 白质。比例尺 = 250 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里介绍的方案描述了一种探索高度特异性的远程突触投影的方法,该方法结合了立体定位手术来提供编码光遗传学构建体的AAV,以及急性脑切片中的电生理学(图1)。这些技术共同提供了工具,可以在以前使用传统的非特异性电刺激无法获得的远程和解剖弥漫通路中高精度地表征脑回路的生理学和可塑性。与细胞特异性分子标记相结合,可以表征从一个大脑区域到另一个区域中不同定义的细胞群的投影23。
为了充分利用该技术的高精度特性,必须验证通路特异性。这是分几个步骤完成的;在记录过程中,确保所研究的突触是单突触(步骤3.3.5)。在此之后,组织学检查注射部位,以确保病毒局限于预期的突触前感兴趣区域,并评估突触后生物细胞素染色的位置和形态,以确保其符合预期。
病毒选择和实现细胞特异性
该技术适应性强,适用于小鼠和大鼠。需要解剖特异性的实验可以用野生型啮齿动物进行。如果无法根据形态或位置识别细胞,则需要突触后细胞类型特异性的实验可能需要转基因啮齿动物品系。例如,为了靶向表达小白蛋白(PV)的中间神经元,可以使用PV-Cre敲入转基因小鼠系,其中Cre-重组酶在表达PV的神经元中表达。为了可视化这些细胞,可以将PV-Cre系与报告小鼠系交叉,以在Cre介导的重组后表达荧光蛋白。或者,可以通过病毒引入Cre依赖性荧光报告基因。ChR2-荧光团融合蛋白仅限于细胞膜,当在急性切片中用宽场显微镜观察时,可能显示为神经元的轮廓,这使得鉴定细胞以进行全细胞记录比使用胞质荧光团更具挑战性。如果使用 ChR2 鉴定细胞,则可以使用 biicitronic 载体24 实现 ChR2 和荧光团的分离。如果使用荧光报告基因识别靶神经元进行全细胞记录,理想情况下其激发波长不应与视蛋白的活化波长重叠;这将避免在搜索要记录的神经元时长时间激活转导的传入。同样,突触前和突触后报告基因应该在光谱上是分开的。常见的报告基因是mCherry,绿色荧光蛋白(GFP)和增强黄色荧光蛋白(eYFP)。
使用的病毒构建体有几个不同的成分,每个成分都会影响实验的成功,因此必须考虑每个元素。应首先重视视蛋白的选择。对于突触前激活,理想的视蛋白具有大光电流(可靠地使轴突达到动作电位阈值),快速的开和关动力学,以及缓慢的脱敏速率,以允许高频重复刺激。通常,快速动力学通常以较小的光电流为代价25;然而,分子筛选和工程为视蛋白提供了大的光电流。目前的协议使用ChR2(E123T/T159C)ChETATC12,但Chronos 26,CheRiff 27,oChIEFAC28和ChRmine 29也适用。此外,存在具有红移(ChrimsonR)26或紫移(CheRiff)活化波长的兴奋性视蛋白,可能需要避免与用于细胞鉴定的荧光团的激发光谱重叠(见上文)。
AAV的血清型可以影响载体转导不同大脑区域和细胞类型的能力,以及顺行和逆行方向的轴突运输程度30。常用于神经元转导的血清型为 1、2、5、8 和 9。文献检索可以表明哪种血清型在任何给定地区都已成功使用。例如,AAV9已被推荐用于皮质神经元的转导31。
促进器允许指定视蛋白表达的细胞类型。促销员分为几类。一般促进剂,例如CAG或EF1a,可在大多数细胞类型中表达。神经元特异性促进子,例如突触蛋白,在所有神经元类型中产生表达。CaMKIIa通常用于限制兴奋性神经元的表达,尽管它已被证明是渗漏的 - 在中间神经元中观察到一些表达32。mDlx增强子元件将表达限制在GABA能中间神经元33。突触前细胞类型的特异性可以使用Cre-mouse系实现(如上所述的突触后细胞)。在这种情况下,将需要依赖Cre的遗传构建体来限制视蛋白表达对表达Cre的细胞。
滴度是病毒制剂中病毒颗粒的数量。同样,文献检索可能表明滴度在特定区域产生了足够的转导。当使用Cre依赖性系统时,滴度可能特别重要,因为高病毒滴度可以在非Cre表达细胞中转导表达34。
优化病毒传递
将病毒精确递送到感兴趣的区域对这种方法至关重要。突触前区域的注射坐标可以通过查阅文献和/或适当物种的脑图谱来估计35,36。然后,实验者应花时间优化和完善精确的注射坐标和体积,以确保病毒注射仅限于其感兴趣的突触前区域。当相邻区域也投影到记录站点时,这一点尤其重要。我们建议使用少量病毒作为执行此操作的有效方法。如果需要特别小的注射部位,使用玻璃微量移液器代替注射器和针头可能是有利的13。将注射针留在 原位 足够长的时间并缓慢取出注射针对于防止病毒逃逸到针道至关重要。为了确认注射的准确性,最佳做法是在可能的情况下通过电生理学检查使用每种动物的组织学验证注射部位,并排除病毒转导脱靶的数据。在我们手中,上述协议已被证明可以推广到许多不同的远程连接,包括从腹侧中线丘脑核、海马、中丘脑和 LEC 到 PFC 的投影;从PFC到LEC和中丘脑的投影;从LEC和腹侧中线丘脑核到海马体的投影(布里斯托大学Zafar Bashir实验室,未发表的观察结果19)。这些不同途径的光遗传学标记只需要细化注射坐标和体积。
协议限制
快速解剖大脑和仔细切片对于这些实验的成功至关重要。这里描述的切片方案产生健康的急性切片,而不适应不同的大脑区域;然而,据报道,切片培养基和切片后孵育温度的变化28 进一步改善了切片的健康。此外,我们还能够在病毒转导单个区域后从两个大脑区域获取急性切片,从而减少使用的动物数量。我们发现,在解剖学密集的途径中,病毒转导和记录之间的短短7天的时间足以唤起适合全细胞膜片钳记录的稳健的oEPSP。在较长期或更稀疏的预测中,较长的延迟是有利的。
在解释光遗传诱发活性的结果时应谨慎,特别是在短期可塑性方面。先前的结果表明,光遗传诱发的传输在重复刺激下可能比电刺激经历更明显的突触抑制,这可能是由于多种因素引起的。首先,视蛋白脱敏25 可能导致突触前轴突尖峰数量减少,导致突触后反应减少。最近发现的视蛋白和经过分子工程的视蛋白(见上文)的改善通道动力学在减轻脱敏影响方面取得了相当大的进展;然而,100 Hz刺激仍然超出许多视蛋白的范围,这可能会阻碍某些长期可塑性诱导方案的使用(尽管见37)。其次,视蛋白的缓慢动力学可能扩大动作电位18 ,导致递质释放延长和囊泡耗竭;这也可能是由于兴奋性视蛋白11的钙渗透性引起的;这些问题可以通过避免过度的光活化来缓解38。第三,使用AAV载体转导神经元也可能导致某些突触中突触前释放特性的改变;但是,这可以通过使用 AAV9 血清型38 来缓解。尽管存在这些限制,但谨慎使用,光遗传学激活可以模拟电刺激19,38 ,因此是研究未研究突触通路生理学的宝贵工具。我们还注意到, 图3E 中显示的数据评估了电流钳中的短期可塑性,因此受制于突触电位和固有膜特性的相互作用,这可以通过在电压钳中进行等效实验来避免。
未来方向
不断扩大的光遗传学工具箱提出了将该技术应用于同一制备的两个突触途径的可能性,通过使用一对具有发散激发光谱的视蛋白。这是通过使用视蛋白ChrimsonR26实现的,与ChR2不同,它被红色波长的光激活。ChrimsonR对蓝光保持低敏感性,因此为了避免交叉途径激活,它可以与红色不敏感的视蛋白结合使用,这些视蛋白是紫色移动的(CheRiff 27)和/或对蓝光的敏感性高几个数量级(Chronos26)。这允许使用蓝色/紫色光刺激,这些刺激太弱而无法显着激活ChrimsonR,因此允许激活两个途径39,40,这可能会增加实验通量,允许检查收敛途径相互作用,并允许从内源源释放神经调节剂41。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了惠康赠款206401/Z/17/Z的支持。我们要感谢扎法尔·巴希尔的专家指导和克莱尔·布斯博士的技术援助和对手稿的评论。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
Carbachol | Tocris | 2810 | |
Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
EGTA | Millpore | 324626 | |
Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
Emission filter | Chroma | 59022m | |
Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
Suture | Ethicon | W577H | |
Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
Solution | |||
aCSF | |||
sucrose cutting solution | |||
PFA | |||
Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016). - Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).