Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий вирусную трансдукцию дискретных областей мозга с оптогенетическими конструкциями, позволяющими синапсеспецифическую электрофизиологическую характеристику в острых срезах мозга грызунов.
Abstract
Изучение физиологических свойств специфических синапсов в мозге и того, как они претерпевают пластические изменения, является ключевой задачей в современной нейробиологии. Традиционные электрофизиологические методы in vitro используют электрическую стимуляцию, чтобы вызвать синаптическую передачу. Основным недостатком данного метода является его неспецифический характер; все аксоны в области стимулирующего электрода будут активированы, что затруднит приписывание эффекта конкретному афферентному соединению. Эту проблему можно преодолеть, заменив электрическую стимуляцию оптогенетической стимуляцией. Описан метод сочетания оптогенетики с записями патч-зажимов in vitro . Это мощный инструмент для изучения как базальной синаптической передачи, так и синаптической пластичности точных анатомически определенных синаптических связей и применим практически к любому пути в головном мозге. Здесь мы описываем подготовку и обработку вирусного вектора, кодирующего канально-мозговой белок, для хирургической инъекции в пресинаптическую область, представляющую интерес (медиальную префронтальную кору) в мозге грызунов и создание острых срезов нисходящих целевых областей (латеральная энторинальная кора). Также представлена подробная процедура комбинирования записей патч-зажима с синаптической активацией путем световой стимуляции для изучения краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности. Мы обсуждаем примеры экспериментов, которые достигают специфичности пути и клеток путем объединения оптогенетики и cre-зависимой маркировки клеток. Наконец, гистологическое подтверждение пресинаптической области, представляющей интерес, описано вместе с маркировкой биоцитина постсинаптической клетки, чтобы обеспечить дальнейшую идентификацию точного местоположения и типа клетки.
Introduction
Понимание физиологии синапсов и того, как они претерпевают пластические изменения, имеет основополагающее значение для понимания того, как мозговые сети функционируют в здоровом мозге1 и как они неисправны при расстройствах мозга. Использование острых срезов мозга ex vivo позволяет регистрировать электрическую активность синапсов от одиночных нейронов с высоким отношением сигнал/шум с использованием записей цельноклеточных патч-зажимов. Контроль мембранного потенциала и простые фармакологические манипуляции позволяют выделить подтипы рецепторов. Эти записи могут быть сделаны с изысканной специфичностью для идентификации постсинаптического нейрона, включая ламинарное и субрегиональное положение2, клеточную морфологию3, наличие молекулярных маркеров4, его афферентные проекции5 или даже если он был недавно активным6.
Достижение специфичности пресинаптических входов, однако, несколько сложнее. Традиционный метод использует стимулирующие электроды для возбуждения аксонов, которые работают в определенной пластине. Примером этого является гиппокамп, где локальная стимуляция в радиатном слое активирует синапсы, которые проецируются из CA3 в подполе CA17. В этом случае достигается пресинаптическая специфичность, поскольку вход CA3 представляет собой единственный возбуждающий вход, расположенный внутри радиатного слоя, который проецируется на пирамидальные ячейки CA18. Однако эта высокая степень входной специфичности, достижимая при обычной электрической пресинаптической активации аксонов CA3-CA1, является исключением, которое отражено в интенсивном исследовании, которому подвергался этот синапс. В других областях мозга аксоны из нескольких афферентных путей сосуществуют в одной и той же пластинке, например, в слое 1 неокортекса9, что делает невозможной пресинаптическую стимуляцию с помощью обычных стимулирующих электродов. Это проблематично, поскольку различные синаптические входы могут иметь расходящиеся физиологические свойства; поэтому их стимуляция может привести к неправильной характеристике синаптической физиологии.
Появление оптогенетики, генетического кодирования фоточувствительных мембранных белков (опсинов), таких как каналродопсин-2 (ChR2), позволило значительно расширить возможности для изучения изолированных синаптических проекций между областями мозга10,11. Здесь мы описываем обобщающее и недорогое решение для изучения долгосрочной синаптической физиологии и пластичности. Оптогенетические конструкции доставляются очень специфическим образом с использованием вирусных векторов, что позволяет чрезвычайно точно контролировать пресинаптическую область, представляющую интерес. Эфферентные проекции будут выражать светоактивированный канал, позволяющий активировать эти волокна в целевой области. Таким образом, могут быть изучены дальние, анатомически диффузные пути, которые не могут быть независимо активированы традиционной, неспецифической, электрической стимуляцией.
В качестве примера мы описываем трансдукцию медиальной префронтальной коры (mPFC) аденоассоциированными вирусами (AAV), кодирующими возбуждающие катион-канальные опсины. Затем мы описываем подготовку острых срезов из латеральной энторинальной коры (LEC), записей зажимов из пирамидных нейронов LEC слоя 5 и световой активации глутаматергических проекций mPFC-LEC (рисунок 1). Мы также описываем гистологическую оценку места инъекции для подтверждения местоположения пресинаптической области, представляющей интерес, и идентификации морфологии постсинаптических клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных проводились в соответствии с Законом Соединенного Королевства о научных процедурах в отношении животных (1986 год) и связанными с ним руководящими принципами, а также местными институциональными руководящими принципами.
1. Стереотаксическая вирусная инъекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол требует анатомической, но не постсинаптической специфичности типа клеток.
- Выберите подходящее животное. В этом протоколе использовались самцы крыс с капюшоном Lister дикого типа (300-350 г, примерно 3 месяца).
- Выберите подходящую вирусную конструкцию. Есть несколько факторов, которые следует учитывать (см. Обсуждение). Текущий протокол использует вирус для экспрессии оптогенетического канала ChETATC12, для передачи возбуждающих нейронов (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; титр: 3,3 х 1013 вирусных геномов / мл).
- Установите координаты и объем инъекции с помощью атласа мозга, какописано ранее 35.
- Стереотаксическая инъекция вирусного препарата
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать все соответствующие национальные и институциональные руководящие принципы использования животных и ухода за ними. Вирусные векторы стереотаксически вводятся, как описано ранее13 со следующими изменениями.- Держите вирусный препарат на льду во время обезболивания и подготовки животного.
- Индуцировать анестезию в анестетической индукционной камере с 4% изофлураном. Контролировать уровень анестезии можно по более медленному регулярному дыханию (1 Гц) и отсутствию педальных и роговичных рефлексов (тест путем защемления пальцев ног и легкого прикосновения к уголку глаза соответственно; реакция не должна быть обнаружена).
- Вводите предоперационный анальгетик, такой как мелоксикам, по крайней мере, за 30 минут до инвазивной процедуры.
- Когда животное будет полностью обезболено, используйте кусачки, чтобы удалить шерсть с кожи головы. Переключите поток изофлурана на носовой конус стереотаксической рамки и установите крысу в кадр. Нанесите смазывающий гель для глаз на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры.
- Операция должна проводиться в асептических условиях. Используйте стерильные перчатки и инструменты на протяжении всей процедуры. Применяют лидокаиновую мазь (5% мас./мас.) перед дезинфекцией кожи головы 4% мас./об. раствором хлоргексидина, а затем накрывают тело стерильной драпировкой. Используя скальпель, сделайте продольный разрез длиной примерно 15 мм на коже головы, чтобы обнажить брегму.
- Загрузите шприц Гамильтона в микроинъекционный шприцевой насос, прикрепленный к подвижному рычагу, установленному на стереотаксической раме.
- Поместите 5 мкл аликвоты вируса в трубку объемом 0,2 мл и вращайте в течение нескольких секунд, пока весь объем не окажется в нижней части трубки. Пипетка 2 мкл вирусного препарата попадает в крышку пробирки.
- Заполните шприц вирусным препаратом, сначала рассмотрев кончик иглы хирургическим микроскопом, а затем вручную поместите болюс вируса на кончик иглы и выньте плунжер шприца с помощью органов управления насосом.
- Установите объем впрыска насоса на 300 нЛ и расход на 100 нл/мин. Запустите насос и подтвердите правильное течение, наблюдая за каплей вируса на кончике иглы. Впитать вирус на ватную палочку и аккуратно очистить иглу 70% этанолом.
- Используя винты регулятора на стереотаксической раме, перейдите кончиком иглы к брегме (точке на черепе, где встречаются корональный и сагиттальный швы) и обратите внимание на стереотаксические измерения, наблюдаемые на трех шкалах Вернье на раме. Координаты относительно брегмы крыс mPFC передне-задние + 3,1 мм, медиолатеральные ± 0,7 мм, дорсовентральные - 4,5 мм; сложите/вычтите (как указано) эти расстояния от координат брегмы, а затем переместите иглу к передне-задним и медиолатеральным координатам и осторожно опустите иглу на поверхность черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше координаты mPFC подходят для самцов крыс с капюшоном весом 300-350 г; изменения штамма крыс, размера могут потребовать изменения этих координат (см. Обсуждение). - Поднимите иглу с поверхности черепа и отметьте эту точку перманентной маркерной ручкой с тонким наконечником. Сделайте отверстие для заусенцев в этой точке с помощью микросверла, установленного на стереотаксическом рычаге.
- Вводят иглу в мозг по заранее определенной дорсовентральной координате и вводят заранее определенный объем (для mPFC: 300 нЛ). Оставьте иглу на месте в течение 10 минут, чтобы обеспечить диффузию болюса. После извлечения иглы запустите насос, чтобы убедиться, что игла не заблокирована.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставляйте и извлекайте иглу медленно (~3 мм/мин), чтобы свести к минимуму повреждение мозговой ткани и обратный поток вируса в игольчатый тракт. - Вводите 2,5 мл подкожного раствора хлорида натрия (0,9% мас./об.) и глюкозы (5% мас./об.) для поддержания гидратации.
- Повторите шаг 1.4.12. для второго полушария.
- Зашить разрез кожи головы и по завершении процедуры ввести 2,5 мл раствора хлорида натрия и глюкозы и соответствующий, рекомендованный в установленном законом, анальгетик для лечения боли, например, бупренорфин или мелоксикам. Не оставляйте животное без присмотра в бессознательном состоянии. Поместите крысу в нагретую спасательную коробку до тех пор, пока она полностью не придет в сознание. Возвращайтесь в домашнюю клетку только после полного выздоровления с другими животными.
- Следуйте институциональным руководящим принципам послеоперационного ухода и процедур содержания инфицированных вирусом грызунов. Подождите не менее 2 недель, пока трансген опсина адекватно экспрессируется, прежде чем начинать эксперимент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для трансдукции, зависит от расстояния и прочности связи между пре- и постсинаптическими областями. Для перехода от mPFC к LEC требуется 4-6 недель.
2. Подготовка острых срезов мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем простой метод приготовления срезов мозга, которых в наших руках достаточно для получения высококачественных кортикальных, гиппокампальных и таламических срезов от взрослых мышей и крыс.
- Подготовьте растворы для рассечения.
- Наполните стакан объемом 250 мл ~200 мл ледяного раствора для резки сахарозы (189 мМ сахарозы, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 5 мМ MgSO4, 3 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4 и 0,2 мМ CaCl2 , изготовленных в сверхчистой воде (UPW) с удельным сопротивлением 18,2 МОм см при 25 °C) или достаточным объемом для заполнения камеры вибратомной ткани. Пузырьки с карбогеном (95% O2, 5% CO2) и держат на льду.
- Наполните камеру сбора срезов искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF; 124 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 3 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1,25 мМ2PO4 и 1 мМ MgSO4 , изготовленной в UPW) при комнатной температуре, пузырьков карбогеном. Камера14 для сбора срезов изготовлена на заказ из стойки для микроцентрифуги, наклеенной на лист нейлоновой сетки и помещенной в стакан, в который она погружена в aCSF (фиг.2A).
- Заполните трубку объемом 50 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буфере (PB; 75,4 мМ Na2HPO 4,7H 2O и 24,6 мМ2PO4. Н2О).
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Используйте в вытяжном шкафу.
- Рассечение головного мозга.
- Обезболивайте крысу в индукционной камере, используя 5% изофлурана, пока дыхание не станет медленным и регулярным (~1 Гц). Для обеспечения достаточного уровня анестезии проверяют на отсутствие педальных и роговичных рефлексов.
- Обезглавить животное с помощью гильотины.
- Быстро рассекают весь мозг, как описано ранее15 и переносят в раствор сахарозы. Выполните шаг в течение 90 с после обезглавливания для хорошего качества срезов и успешной записи целых клеток.
- Используя металлическую чайную ложку, поднимите мозг, выбросьте лишний режущий раствор и поместите его на лист фильтровальной бумаги на столешнице.
- С помощью скальпеля или лезвия бритвы быстро удалить мозжечок и разрезать головной мозг в корональной плоскости примерно на полпути по его длине; задняя половина представляет собой тканевый блок LEC. Обязательно включите некоторую избыточную ткань в дополнение к области, которая будет разрезана для следующих шагов. Верните как этот тканевой блок, так и остальную часть мозга в раствор для резки сахарозы.
- Поместите каплю цианоакрилатного клея на стадию ткани вибратома. Распределите его тонким слоем с площадью, немного большей, чем тканевый блок, созданный на предыдущем этапе.
- Возьмите блок ткани LEC с помощью чайной ложки, выбросьте лишний раствор и переложите на клеевой пластырь так, чтобы передний корональный срез прилип.
- Установите ступень в тканевую камеру вибратома и быстро налейте достаточное количество режущего раствора сахарозы для погружения ткани; пузырьковый этот раствор с карбогеном. Направьте тканевый блок LEC вентральной поверхностью к лезвию. В то время как окружающее освещение комнаты недостаточно для активации опсина, избегайте использования дополнительных источников света, которые могут присутствовать на вибратоме.
- Нарезайте срезы толщиной 350 мкм от вентрального до дорсального с использованием высокой скорости колебаний лезвия (100 Гц) и медленной скорости продвижения лезвия (0,06 мм/с). Как правило, на полушарие можно получить семь срезов LEC.
- Перенесите ломтики в камеру сбора ломтиков. По завершении сбора срезов переведите камеру сбора на водяную баню 34 °C в течение 1 ч, прежде чем вернуться к комнатной температуре. Пузырь с карбогеном непрерывно. Ломтики будут достаточно здоровыми для записи в течение не менее 6 ч.
- Поместите оставшуюся часть мозга в PFA в течение 48 ч для пост-специального обследования места инъекции (см. раздел 4).
3. Электрофизиология и оптогенетическая стимуляция
- Идентификация клетки-мишени.
- Поместите срез в погружную регистрирующую камеру при 34 °C, перфузионную с aCSF со скоростью 2 мл/мин перистальтическим насосом. Обездвижите фрагмент с помощью привязки фрагмента.
- Под объективом с низким увеличением (4x) широкоугольного микроскопа с использованием наклонного инфракрасного освещения перейдите к уровню LEC 5. Измерьте расстояние от поверхности пиала до требуемого слоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Косая инфракрасная подсветка была достигнута путем размещения вблизи инфракрасного светодиода примерно на 3 мм ниже крышки регистрирующей камеры под углом ~55° к плоскости крышки (рисунок 2B). Дифференциальный интерференционный контраст является альтернативным и широко используемым методом визуализации для электрофизиологии срезов. - Перейдите на объектив погружения в воду с большим увеличением (40x) и определите пирамидальные нейроны. Отметьте положение ячейки на мониторе компьютера лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пирамидальные нейроны имеют примерно треугольную морфологию с выдающимися апикальными дендритами, выступающими к пиальной поверхности среза (рисунок 3A). Здоровье клеток можно оценить по отсутствию конденсированного, видимого ядра и осмотру плазматической мембраны, которая должна казаться гладкой. Маловероятно, что четкая флуоресцентная маркировка аксонов белком слияния опсин-флуорофора будет видна при использовании широкопольного флуоресцентного микроскопа. Для визуализации аксональных проекций выполняют иммуногистохимию пост-хок с использованием первичного антитела против флуорофора опсина и амплируют вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором той же или аналогичной длины волны.
- Формирование цельноклеточного пластыря-зажима.
- Изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла с помощью съемника пипетки и заполните фильтрованным внутриклеточным регистрирующим раствором (120 мМ k-глюконата, 40 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 2 мМ NaCl, 2 мМ MgATP, 1 мМ MgCl, 0,3 мМ NaGTP, 0,2 мМ EGTA и 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, рН 7,25, 285-300 мОсм). Поместите заполненную микропипетку в держатель электрода на головную ступень усилителя с патч-зажимом, чтобы провод электрода контактировал с внутриклеточным раствором.
- Применяйте положительное давление ртом, сильно вдувая мундштук (например, шприц объемом 1 мл со снятым плунжером), соединенный трубкой со боковым портом держателя электрода, и поддерживайте давление, закрывая линейный трехсторонний клапан. Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск, пока его не увидят на микроскопе.
- Откройте окно Seal Test в WinLTP16 (или другом программном обеспечении/осциллографе) и с усилителем в режиме зажима напряжения примените квадратный импульс 5 мВ, чтобы определить, составляет ли сопротивление пипетки 3-6 МОм.
- Подойдите и прикоснитесь к идентифицированной ячейке кончиком пипетки; это должно привести к углублению в клеточной мембране (рисунок 3A; правая панель) и небольшому увеличению сопротивления пипетки (0,1 МОм).
- Освободите положительное давление и примените отрицательное давление, применяя умеренное всасывание на мундштуке; это должно привести к значительному увеличению сопротивления пипетки (>1000 МОм). Давление теперь можно оставить нейтральным. Применяйте отрицательное давление в постепенно увеличивающейся рампе до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости цельноклеточной клетки.
- Записывайте оптогенетически вызванные синаптические события.
- Введите конфигурацию тока-зажима.
ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев синаптическая передача на большие расстояния является глутаматергической, поэтому регистрация на мембранных потенциалах, близких к потенциалу разворота хлоридов, наилучшим образом изолирует передачу, опосредованную рецептором AMPA (AMPAR), и минимизирует измерение любого вызванного ингибирования прямой передачи (FFI). Разворот хлорида зависит от состава внутриклеточного регистрирующего раствора и aCSF и может быть рассчитан с использованием уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца; для вышеуказанных решений это было -61,3 мВ. Пирамидальные нейроны LEC 5-го слоя имели средний мембранный потенциал покоя -62 мВ и, при необходимости, поддерживались на этом уровне путем впрыска постоянного тока. Альтернативно, ячейки могут быть зажаты напряжением до желаемого потенциала. Для регистрации ингибирующих проекций16 на большие расстояния или для регистрации FFI, зажим напряжения при потенциале разворота катионов для выделения проводимости ГАМКергического хлорида. При напряжении зажимных нейронов на мембранных потенциалах выше порога потенциала действия внутриклеточный раствор на основе цезия, содержащий блокаторы натриевых каналов с напряжением, для улучшения напряжения-зажима и предотвращения инициирования потенциалов действия (130 мМ CsMeSO4, 10 мМ HEPES, 8 мМ NaCl, 5 мМ QX 314 хлорида, 4 мМ MgATP, 0,5 мМ EGTA, 0,3 мМ NaGTP, 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, pH 7,25, 285-300 мОсм). - Используя программное обеспечение для сбора данных, отправляйте сигналы транзистор-транзисторной логики (TTL) на светодиодный драйвер для активации установленного светодиода 470 нм. Установленный светодиод направляется в световой путь микроскопа с помощью фильтрующих кубов и соответствующей оптики (рисунок 2B) для подачи световых импульсов на срез через 40-кратный объектив для вызова оптогенетических возбуждающих постсинаптических потенциалов (oEPSP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Световые импульсы могут быть применены перисоматически / над дендритами, что приведет к активации опсинов в аксонах и пресинаптическом бутоне, или исследователь может переместить цель в аксоны подальше от зарегистрированной клетки, чтобы избежать чрезмерной стимуляции бутона (см. Обсуждение). Максимальная амплитуда oEPSP зависит от силы синаптической проекции, эффективности вирусных инъекций и используемого опсина. oEPSP могут титроваться до желаемой амплитуды путем изменения интенсивности света и/или длительности18; изменение длительности световых импульсов (типичная продолжительность между 0,2-5 мс при максимальной выходной мощности светодиода, что приводит к плотности света 4,4 мВт / мм19) дает более последовательные амплитуды oEPSP, чем изменение выходной мощности светодиода. - Исследовать пресинаптические свойства высвобождения (изменение напряжения) путем подачи потоков множественных световых импульсов с различными межстимульными интервалами (рисунок 3E); следует соблюдать осторожность при интерпретации оптогенетически вызванной передачи (см. Обсуждение).
- Исследуйте долгосрочную пластичность либо путем повторного вызова oEPSP19 , либо путем применения лигандов. Контролируйте амплитуду oEPSP в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить стабильность до индукции пластичности, а затем контролируйте до достижения стабильной амплитуды (обычно 30-40 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство современных опсинов не способны надежно вызывать множественные потенциалы действия на высоких частотах, например, 100 стимулов, подаваемых при 100 Гц, как это обычно используется для индуцирования LTP. - Чтобы подтвердить, что oEPSP являются моносинаптическими, выполните чрезмерную активацию бутона трансдуцированного пути, расположив объектив над дендритной беседкой и стимулируя в присутствии 0,5 мкМ тетродотоксина и 100 мкМ аминопиридина. Применение тетродотоксина отменит передачу, если реакции зависят от потенциала действия, а последующее включение аминопиридина частично восстановит передачу, если oEPSP генерируются моносинаптически19,20.
- Чтобы биоцитин заполнил нейрон, подождите не менее 15 минут после входа в полноклеточную конфигурацию. В напряжении-зажиме, контролируйте емкость мембраны и входное сопротивление.
- Медленно отведите пипетку вдоль угла подхода подальше от сомы клетки, наблюдая медленное исчезновение емкостных переходных процессов и мембранного тока, что указывает на повторное уплотнение клеточной мембраны и образование внешнего пятна на кончике пипетки. Обратите внимание на ориентацию фрагмента и расположение ячеек внутри фрагмента. Поместите ломтик в PFA в 24-луночную пластину и инкубируйте в течение ночи при 4 °C, а затем переведите в 0,1 М ПБ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты могут храниться до недели. Если требуется более длительное хранение, регулярно меняйте ПБ или используйте ПБ, содержащий азид натрия (0,02%-0,2% азида натрия).
- Введите конфигурацию тока-зажима.
4. Гистология
- Место нарезки инъекции
- После фиксации криозащитите ткань в 30% сахарозе (мас./об.) в ПБ до тех пор, пока она не утонет (первоначально она будет плавать в растворе сахарозы), обычно на ночь при комнатной температуре или через 24-48 ч при 4 °C.
- Используя среду с оптимальной температурой резания (OCT), прикрепите блок ткани к диску образца криостата. Заморозьте тканевый блок в соответствии с шагами 4.1.3-4.1.4.
- Поместите изопентан в соответствующий контейнер. Погрузите только диск образца, гарантируя, что ткань находится выше уровня изопентана. Опустите контейнер изопентана в жидкий азот (или сухой лед) и дайте ткани замерзнуть.
- После полной заморозки (весь тканевый блок становится бледным и твердым), оставьте тканевый блок в криостатной камере при -20 ° C в течение 30 минут, чтобы температура блока уравновешивалась.
- Вырежьте в криостате участки толщиной 40 мкм при -20 °C. Используйте тонкую кисть, чтобы направить участки от лезвия. Приклейте замороженные срезы к комнатной температуре, с поли-L-лизином покрытием, стеклянный микроскоп скользит, касаясь слайда к секциям.
- Добавьте около 150 мкл монтажного носителя на каждый слайд и крышку с крышкой; удалите пузырьки воздуха, осторожно надавливая на крышку. Накройте слайды для защиты от фотоотбеливания и высушите воздухом при комнатной температуре не менее 12 ч (или ночью). Используя флуоресцентный микроскоп, исследуйте местоположение места вирусной инъекции.
- Протокол окрашивания биоцитином
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к толстым сечениям; срезы не нуждаются в повторном секционировании.- Промывайте срезы мозга фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4) шесть раз в течение 10 мин за одну промывку. Используйте передаточную пипетку для опорожнения скважин после каждого шага.
- Инкубировать ломтики в 3% H2O2 (мас./об.) в PBS в течение 30 мин, чтобы блокировать любую эндогенную активность пероксидазы. При этом образуются пузырьки кислорода.
- Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку или до тех пор, пока не будут видны новые пузырьки кислорода. Инкубируют срезы мозга в 1% (v/v) авидин-биотинилированном растворе HRP комплекса (ABC) в PBS, содержащем 0,1% (v/v) Triton X-100 при комнатной температуре в течение 3 ч.
- Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку.
- Инкубируйте каждый ломтик в растворе 3,3'-диаминобензидина (DAB) в течение нескольких минут, пока не станет видно окрашивание биоцитином нейронных структур (занимает около 5-10 мин).
ВНИМАНИЕ: DAB токсичен. Используйте в вытяжном шкафу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации DAB может быть непредсказуемым, внимательно следите за тканями по мере развития цвета. - Остановите реакцию, перенеся срезы в холодные (4 °C) PBS. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку. Используйте щетку для крепления срезов мозга на стеклянные стекла микроскопа с поли-L-лизином.
- Удалите все излишки PBS чистой тканью. Накройте каждый срез примерно 200 мкл монтажной среды; накройте крышкой и осторожно надавите на крышку, чтобы вытолкнуть пузырьки воздуха. Высушивают на воздухе при комнатной температуре не менее 12 ч (или на ночь). Используя световой микроскоп, изучите местоположение и морфологические детали клетки (клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Биоцитин может быть альтернативно визуализирован с использованием флуорофор-конъюгированного стрептавидина; однако для визуализации может потребоваться резекция или использование конфокального микроскопа21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе мы описываем, как изучать долгосрочную синаптическую физиологию и пластичность с использованием вирусной доставки оптогенетических конструкций. Протокол может быть очень легко адаптирован для изучения практически любой дальней связи в мозге. В качестве примера мы описываем инъекцию AAV, кодирующих опсин, в крысиный mPFC, приготовление острых срезов из LEC, записи зажимов из пирамидальных нейронов LEC слоя 5 и световой активации терминалов mPFC в LEC (рисунок 1).
Здоровую пирамидальную клетку находили и латали (например, рисунок 3А). В настоящем примере от mPFC до LEC постсинаптические клетки не были помечены; если требуется постсинаптическая идентификация клеток, клетка, экспрессирующая флуоресцентный маркер, должна быть локализована с использованием широкоугольной оптики (например, рисунок 3B). Здоровье клетки должно быть оценено инфракрасной оптикой перед экспериментами. Для активации аксонов mPFC в LEC светодиод помещали непосредственно над сомой клеток 5 и проксимальными дендритами через объектив микроскопа (рисунок 1), одиночные световые импульсы 2 мс приводили к простой форме сигнала oEPSP (рисунок 3C); пиковая амплитуда oEPSP может быть измерена. Для исследования кратковременной пластичности синапса применяли 5, 10 и 20 Гц шлейфов световой стимуляции (рис. 3Е). Чтобы исследовать долгосрочную пластичность, после мониторинга исходной амплитуды oEPSP в течение 10 мин холинергический агонист, карбахол, добавляли к циркулирующей aCSF в течение 10 мин. Это вызвало долгосрочную депрессию, которая все еще была очевидна через 40 минут после удаления лиганда (рисунок 3D).
После экспериментов с электрофизиологической записью ткань мозга, содержащую место вирусной инъекции, была разделена и исследована длина места инъекции (рисунок 4A). Флуоресцентный репортер, mCherry, локализуется в более глубоких слоях прелимбической и инфралимбической коры (составные области грызунов mPFC). Эти слои были нацелены, поскольку было показано, что проекция на LEC происходит преимущественно из более глубоких корковых слоев22. Положительные волокна вишни также можно увидеть, присоединяясь к тракту белого вещества. В пилотном эксперименте по оптимизации размещения вирусных инъекций были взяты и исследованы 40 мкм участков LEC; Положительные волокна вишни можно увидеть в слое 5 LEC (рисунок 4B). Наконец, заполненную биоцитином клетку окрашивали, что позволяло подтвердить ее местоположение и морфологию (рисунок 4C, D).
Рисунок 1: Экспериментальный обзор. (A) Схема введения вирусных векторов в медиальную префронтальную кору (mPFC), трансдукции клеток mPFC с оптогенетической конструкцией и транспорта конструкции к терминалам в латеральной энторинальной коре (LEC). (B) Схематическое изображение записи цельноклеточной записи из пирамидальных нейронов слоя 5 в остром срезе LEC и световой активации терминалов mPFC через объектив микроскопа. Сокращения: CA = cornu ammonis; PERI = периринальная кора; TR = регион с переходной экономикой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Камера сбора срезов и оптическая конфигурация для визуализации записи цельных клеток, оптогенетического возбуждения и идентификации положительных нейронов tdTomato. (A) Камера сбора срезов14 изготовлена на заказ из стойки для трубки микроцентрифуги, наклеенной на лист нейлоновой сетки и помещенной в стакан, в который она погружена в aCSF (B ) Светодиоды для возбуждения ChR2 (470 нм) и tdTomato (565 нм) направлены через асферическую конденсаторную линзу на коллимацию света, свет 565 нм излучается через полосовой фильтр для достижения спектрального разделения спектров возбуждения и излучения tdTomato. Они объединены с длиннопроходным дихроичным зеркалом и направлены к срезу со вторым длиннопроходным дихроичным зеркалом с большей длиной волны. Затем свет фокусируется на срезе через объектив. В экспериментах, где присутствуют помеченные tdTomato нейроны, излучаемый флуоресцентный свет проходит через дихроичное зеркало и эмиссионный фильтр и фокусируется на датчике камеры ахроматической линзой. Нефлуоресцентные особенности среза визуализируются косым преломленным вблизи инфракрасного (NIR) светом, подаваемым из-под срезовой камеры; этот свет пропускает оптику на камеру, тем самым сводя на нет необходимость изменения фильтров-кубов между флуоресцентной и NIR-визуализацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация нейронов при NIR/флуоресцентной визуализации и репрезентативные примеры oEPSP. (A) Слева: Пример нейрона с пирамидальной морфологией, визуализированной с помощью NIR-света. Справа: Тот же нейрон с образованием вогнутой ямочки, вызванной положительным давлением от пластыря пипетки. (B) Cre-recombinase зависимая экспрессия tdTomato в одном нейроне. (C) Репрезентативный oEPSP из слоя 5 LEC в пирамидальной клетке. (D) Пример долгосрочного эксперимента по мониторингу пластичности oEPSP с течением времени после добавления 10 мкм карбахола (CCh). Пунктирная линия указывает на среднюю амплитуду oEPSP в течение исходного периода до добавления препарата. (E) Репрезентативные следы поездов стимуляции при 5, 10 и 20 Гц. Синие стрелки обозначают активацию света. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологическая проверка места инъекции и восстановление заполненной биоцитином клетки. (А) Корональная микрофотография, показывающая место инъекции вируса в mPFC, +3,00 мм от брегмы. (B) Тонкое корональное сечение LEC, иллюстрирующее волокна mCherry+. (C) Маломощное изображение острого среза толщиной 350 мкм, -6,2 мм от брегмы, с заполненной биоцитином пирамидальной клеткой в LEC. Пунктирная рамка показана при большем увеличении в пирамидальной ячейке D. (D) LEC; апикальный дендрит можно увидеть справа от изображения, направляющегося к слою 1. Пунктирные линии обозначают региональные границы. Сокращения: IL = инфралимбическая кора; PL = прелимбическая кора; wm = белое вещество. Шкала = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленный здесь, описывает метод исследования высокоспецифичных синаптических проекций дальнего действия с использованием комбинации стереотаксической хирургии для доставки AAV, кодирующих оптогенетические конструкции, и электрофизиологии в острых срезах мозга (рисунок 1). Вместе эти методы предлагают инструменты для характеристики физиологии и пластичности схем головного мозга с высокой точностью в дальних и анатомически диффузных путях, которые ранее были недоступны с использованием традиционной, неспецифической, электрической стимуляции. Комбинация с клеточными молекулярными маркерами позволяет характеризовать проекции из одной области мозга в различные определенные клеточные популяции в другой области23.
Чтобы в полной мере воспользоваться преимуществами высокоточного характера этого метода, важно проверить специфичность пути. Это делается в несколько этапов; во время записи убедитесь, что исследуемый синапс является моносинаптическим (шаг 3.3.5). После этого гистологически исследуйте место инъекции, чтобы убедиться, что вирус ограничен предполагаемой пресинаптической областью, представляющей интерес, и оцените местоположение и морфологию окрашенной биоцитином постсинаптической клетки, чтобы убедиться, что это так, как ожидалось.
Выделение вируса и достижение клеточной специфичности
Техника обладает высокой адаптируемостью и подходит для использования как у мышей, так и у крыс. Эксперименты, требующие анатомической специфичности, могут проводиться с грызунами дикого типа. Эксперименты, требующие постсинаптической специфичности типа клеток, могут потребовать генетически модифицированного штамма грызунов, если клетки не идентифицируются на основе морфологии или местоположения. Например, для нацеливания на парвалбумин (PV), экспрессирующий интернейроны, может быть использована трансгенная линия мыши PV-Cre, в которой Cre-рекомбиназа экспрессируется в PV-экспрессирующих нейронах. Чтобы визуализировать эти клетки, линия PV-Cre может быть пересечена репортерной линией мыши для экспрессии флуоресцентного белка после Cre-опосредованной рекомбинации. В качестве альтернативы, cre-зависимый флуоресцентный репортерный ген может быть введен вирусно. Белки слияния ChR2-флуорофоров ограничены клеточной мембраной и могут выглядеть как контур нейрона при просмотре с помощью широкоугольной микроскопии в острых срезах, что делает идентификацию клеток для регистрации цельноклеточной более сложной, чем использование цитозольных флуорофоров. Если ChR2 используется для идентификации клеток, разделение ChR2 и флуорофора может быть достигнуто с использованием бицистронных векторов24. При использовании флуоресцентного репортера для идентификации нейронов-мишеней для записи всей клетки его длина волны возбуждения в идеале не должна перекрываться с длиной волны активации опсина; это позволит избежать длительной активации трансдуцированных афферентов при поиске нейронов для записи. Точно так же до- и постсинаптические репортеры должны быть спектрально разделены. Распространенными репортерами являются mCherry, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP).
Используемая вирусная конструкция имеет несколько различных компонентов, каждый из которых может повлиять на успех эксперимента, и поэтому необходимо учитывать каждый элемент. Первостепенное значение следует придавать выбору опсина. Для пресинаптической активации идеальный опсин имеет большие фототоки (чтобы надежно довести аксоны до порога потенциального действия), быструю кинетику включения и выключения и медленную скорость десенсибилизации, чтобы обеспечить высокочастотную повторную стимуляцию. Как правило, быстрая кинетика часто достигается за счет меньших фототоков25; однако молекулярный скрининг и инженерия обеспечили опсины большими фототоками. Текущий протокол использует ChR2(E123T/T159C) ChETATC12, однако также подходят Chronos26, CheRiff27, oChIEFAC28 и ChRmine29 . Кроме того, существуют возбуждающие опсины с длинами волн активации с красным смещением (ChrimsonR)26 или фиолетовым сдвигом (CheRiff), которые могут потребоваться, чтобы избежать перекрытия со спектрами возбуждения флуорофоров, используемых для идентификации клеток (см. Выше).
Серотип AAV может влиять на способность вектора трансдуцировать различные области мозга и типы клеток, а также на степень аксонального транспорта как в антероградном, так и в ретроградном направлениях30. Серотипы, обычно используемые для нейрональной трансдукции: 1, 2, 5, 8 и 9. Поиск литературы может дать указание на то, какой серотип был успешно использован в любом данном регионе. Например, AAV9 был рекомендован для трансдукции корковых нейронов31.
Промотор позволяет указать тип клетки, в которой будет экспрессироваться опсин. Промоторы делятся на несколько классов. Общие промоторы, например, CAG или EF1a, приводят к экспрессии в большинстве типов клеток. Нейрон-специфические промоторы, например, синапсин, генерируют экспрессию во всех типах нейронов. CaMKIIa обычно используется для ограничения экспрессии возбуждающими нейронами, хотя было показано, что он протекает - некоторая экспрессия наблюдалась в интернейронах32. Энхансерный элемент mDlx ограничивает экспрессию ГАМкергическими интернейронами33. Специфичность типа пресинаптических клеток может быть достигнута с помощью линии Cre-mouse (как описано выше для постсинаптической клетки). В этом случае потребуется cre-зависимая генетическая конструкция, чтобы ограничить экспрессию опсина Cre-экспрессирующими клетками.
Титр – это количество вирусных частиц в вирусном препарате. Опять же, поиск литературы может дать указание на титр, который вызвал достаточную трансдукцию в определенном регионе. При использовании Cre-зависимой системы титр может быть особенно важен, поскольку высокие вирусные титры могут трансдуцировать экспрессию в некре-экспрессирующих клетках34.
Оптимизация доставки вирусов
Точная доставка вируса в интересующий регион имеет решающее значение для этого подхода. Инъекционные координаты пресинаптической области могут быть оценены путем обращения к литературе и/или атласу мозга для соответствующих видов35,36. Затем экспериментатор должен потратить время на оптимизацию и уточнение точных координат инъекции и объема, используемых для обеспечения того, чтобы вирусная инъекция была ограничена их пресинаптической областью, представляющей интерес. Это особенно важно, когда соседние регионы также проецируют на место записи. Мы рекомендуем использовать небольшие объемы вируса в качестве эффективного метода для этого. Если требуется особенно маленькое место инъекции, использование стеклянных микропипетт вместо шприца и иглы может быть предпочтительным13. Оставление инъекционной иглы in situ в течение достаточного периода времени и медленное снятие инъекционной иглы имеет решающее значение для предотвращения проникновения вируса в игольчатый тракт. Чтобы подтвердить точность инъекций, лучше всего гистологически проверить место инъекции каждого животного, используемого с помощью электрофизиологии, где это возможно, и исключить данные, когда вирусная трансдукция не является целевой. В наших руках протокол, описанный выше, оказался обобщаемым для многих различных дальних соединений, включая проекции от вентральных таламических ядер средней линии, гиппокампа, медиодорсального таламуса и LEC до PFC; прогнозы от PFC до LEC и медиодорсального таламуса; проекции от LEC и вентральных таламических ядер средней линии к гиппокампу (лаборатория Зафара Башира, Бристольский университет, неопубликованные наблюдения19). Оптогенетическая маркировка этих различных путей просто требовала уточнения координат и объемов инъекций.
Ограничения протокола
Быстрое рассечение мозга и тщательная нарезка критически важны для успеха этих экспериментов. Протокол нарезки, описанный здесь, дает здоровые острые срезы без адаптации к различным областям мозга; однако сообщалось, что изменения в среде нарезки и температуре инкубации после нарезки, описанные в другом месте28 , еще больше улучшают здоровье срезов. Кроме того, мы также смогли взять острые срезы из двух областей мозга после вирусной трансдукции одной области, тем самым уменьшая количество используемых животных. Мы обнаружили, что в анатомически плотных путях периодов, коротких до 7 дней между вирусной трансдукцией и записью, достаточно, чтобы вызвать надежные oEPSP подходящей величины для записей цельноклеточных зажимов. При более отдаленных или более разреженных прогнозах преимуществами являются более длительные задержки.
Следует проявлять осторожность при интерпретации результатов оптогенетически вызванной активности, особенно в отношении кратковременной пластичности. Предыдущие результаты показали, что оптогенетически вызванная передача может претерпевать более выраженную синаптическую депрессию при повторной стимуляции, чем электрическая стимуляция, которая может возникнуть из-за ряда факторов. Во-первых, десенсибилизация опсина25 может привести к уменьшению количества пресинаптических аксонов, что приводит к снижению постсинаптических реакций. Улучшенная кинетика каналов недавно обнаруженных опсинов и тех, которые подверглись молекулярной инженерии (см. Выше), значительно снизила эффекты десенсибилизации; однако стимуляция 100 Гц остается вне досягаемости многих опсинов, что может препятствовать использованию некоторых долгосрочных протоколов индукции пластичности (хотя см.37). Во-вторых, медленная кинетика опсинов может расширять потенциалы действия18, что приводит к длительному высвобождению передатчика и истощению везикул; это может также быть результатом кальциевой проницаемости возбуждающих опсинов11; эти проблемы можно смягчить, избегая фотоактивации чрезмерного бутона38. В-третьих, трансдукция нейронов с использованием векторов AAV может также привести к изменению пресинаптических свойств высвобождения в определенных синапсах; однако это может быть смягчено с помощью серотипаAAV9 38. Несмотря на эти ограничения, при осторожном использовании оптогенетическая активация может имитировать электрическую стимуляцию19,38 и, следовательно, является бесценным инструментом в исследовании физиологии неизученных синаптических путей. Отметим также, что данные, показанные на фиг.3Е, оценивают кратковременную пластичность в ток-зажиме и, следовательно, подвержены взаимодействию синаптических потенциалов и свойств внутренней мембраны, этого можно избежать, выполнив эквивалентные эксперименты в зажиме напряжения.
Будущие направления деятельности
Постоянно расширяющийся набор оптогенетических инструментов повысил возможность применения этой технологии в двух синаптических путях в одном и том же препарате, используя пару опсинов с расходящимися спектрами возбуждения. Это стало возможным благодаря использованию опсина ChrimsonR26, который, в отличие от ChR2, фотоактивируется красным светом длин волны. ChrimsonR сохраняет низкую чувствительность к синему свету, поэтому, чтобы избежать активации поперечного пути, его можно использовать в сочетании с красно-нечувствительными опсинами, которые являются фиолетовыми смещенными (CheRiff 27) и / или имеют на порядки более высокую чувствительность к синему свету (Chronos26). Это позволяет использовать стимулы синего/фиолетового света, которые слишком слабы, чтобы значительно активировать ChrimsonR и, следовательно, позволяют активировать два пути39,40, что может увеличить экспериментальную пропускную способность, позволить исследовать конвергентные взаимодействия путей и позволить высвобождение нейромодуляторов из эндогенных источников41.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантом Wellcome 206401/Z/17/Z. Мы хотели бы поблагодарить Зафара Башира за его экспертное наставничество и доктора Клэра Бута за техническую помощь и комментарии к рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
