Summary
Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.
Abstract
Estudar as propriedades fisiológicas de sinapses específicas no cérebro, e como elas sofrem mudanças plásticas, é um desafio fundamental na neurociência moderna. As técnicas eletrofisiológicas tradicionais in vitro usam estimulação elétrica para evocar a transmissão sináptica. Uma grande desvantagem deste método é a sua natureza inespecífica; todos os axônios na região do eletrodo estimulante serão ativados, dificultando a atribuição de um efeito a uma conexão aferente particular. Este problema pode ser superado substituindo a estimulação elétrica pela estimulação baseada em optogenética. Descrevemos um método para combinar optogenética com registros in vitro patch-praçad. Esta é uma ferramenta poderosa para o estudo da transmissão sináptica basal e da plasticidade sináptica de conexões sinápticas anatomicamente definidas precisas e é aplicável a quase qualquer via no cérebro. Aqui, descrevemos a preparação e o manuseio de um vetor viral que codifica a proteína da canalrodopsina para injeção cirúrgica em uma região pré-sináptica de interesse (córtex pré-frontal medial) no cérebro do roedor e na confecção de fatias agudas de regiões-alvo a jusante (córtex entorrinal lateral). Um procedimento detalhado para combinar registros patch-clamp com ativação sináptica por estimulação luminosa para estudar a plasticidade sináptica de curto e longo prazo também é apresentado. Discutimos exemplos de experimentos que alcançam a especificidade da via e da célula combinando optogenética e marcação celular dependente de Cre. Finalmente, a confirmação histológica da região pré-sináptica de interesse é descrita juntamente com a marcação de biocitina da célula pós-sináptica, para permitir uma identificação mais aprofundada da localização precisa e do tipo de célula.
Introduction
Entender a fisiologia das sinapses e como elas sofrem alterações plásticas é fundamental para entender como as redes cerebrais funcionam no cérebro saudável1 e como elas funcionam mal em distúrbios cerebrais. O uso de fatias cerebrais ex vivo agudas permite o registro da atividade elétrica das sinapses de neurônios individuais com uma alta relação sinal-ruído usando gravações de patch clamp de células inteiras. O controle do potencial de membrana e a manipulação farmacológica direta permitem o isolamento dos subtipos de receptores. Esses registros podem ser feitos com requintada especificidade para identificar o neurônio pós-sináptico, incluindo posição laminar e sub-regional2, morfologia celular3, presença de marcadores moleculares4, suas projeções aferentes5, ou mesmo se ele estava recentemente ativo6.
Alcançar a especificidade das entradas pré-sinápticas é, no entanto, um pouco mais desafiador. O método convencional tem usado eletrodos de estimulação para excitar os axônios que correm em uma lâmina particular. Um exemplo disso é no hipocampo, onde a estimulação local no estrato radiado ativa sinapses que se projetam do subcampo CA3 ao CA17. Neste caso, a especificidade pré-sináptica é alcançada, pois a entrada CA3 representa a única entrada excitatória localizada dentro do estrato radiado que se projeta para células piramidais CA18. Esse alto grau de especificidade de entrada alcançável com a ativação pré-sináptica elétrica convencional dos axônios CA3-CA1 é, no entanto, uma exceção que se reflete no intenso estudo a que essa sinapse tem sido submetida. Em outras regiões do cérebro, axônios de múltiplas vias aferentes coexistem na mesma lâmina, por exemplo, na camada 1 do neocórtex9, tornando impossível a estimulação pré-sináptica específica de entrada com eletrodos estimulantes convencionais. Isso é problemático, pois diferentes entradas sinápticas podem ter propriedades fisiológicas divergentes; portanto, sua co-estimulação pode levar à descaracterização da fisiologia sináptica.
O advento da optogenética, codificação genética de proteínas de membrana fotossensíveis (opsinas), como a canalrodopsina-2 (ChR2), tem permitido uma vasta expansão de possibilidades para o estudo de projeções sinápticas isoladas entre regiões cerebrais10,11. Aqui descrevemos uma solução generalizável e de baixo custo para estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade. Os construtos optogenéticos são entregues de maneira altamente específica usando vetores virais, permitindo um controle extremamente preciso da região pré-sináptica de interesse. Projeções eferentes expressarão o canal ativado pela luz, permitindo a ativação dessas fibras em uma região alvo. Assim, vias anatomicamente difusas de longo alcance que não podem ser ativadas independentemente pela estimulação elétrica tradicional e inespecífica podem ser estudadas.
Descrevemos, como um exemplo de via, a transdução do córtex pré-frontal medial (mPFC) com vírus adenoassociados (AAVs) que codificam opsinas excitatórias de canal catiônico. Em seguida, descrevemos o preparo de cortes agudos do córtex entorrinal lateral (LEC), registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC da camada 5 e ativação evocada por luz de projeções glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). Também descrevemos a avaliação histológica do local da injeção para confirmar a localização da região pré-sináptica de interesse e identificação da morfologia celular pós-sináptica.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos de Animais do Reino Unido (1986) e diretrizes associadas, bem como diretrizes institucionais locais.
1. Injeção viral estereotáxica
NOTA: O protocolo atual requer especificidade anatômica, mas não do tipo de célula pós-sináptica.
- Escolha o animal apropriado. Ratos machos do tipo selvagem Lister com capuz foram utilizados neste protocolo (300-350 g, aproximadamente 3 meses de idade).
- Escolha a construção viral apropriada. Há vários fatores a serem considerados (consulte Discussão). O protocolo atual utiliza um vírus para expressar o canal optogenético ChETATC 12, para transduzir neurônios excitatórios (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; título: 3,3 x 1013 genomas virais/mL).
- Estabelecer as coordenadas e o volume de injeção usando um atlas cerebral, conforme descrito anteriormente35.
- Injeção estereotáxica da preparação viral
NOTA: Todas as diretrizes nacionais e institucionais relevantes para o uso e cuidado de animais devem ser seguidas. Os vetores virais são injetados estereotaxicamente como descrito anteriormente13 com as seguintes modificações.- Mantenha a preparação viral no gelo durante a anestesiação e preparação do animal.
- Induzir anestesia em câmara de indução anestésica com isoflurano a 4%. Monitore o nível de anestesia indicado pela frequência respiratória regular mais lenta (1 Hz) e ausência de reflexos pedais e corneanos (teste apertando os dedos dos pés e tocando levemente o canto do olho, respectivamente; nenhuma resposta deve ser detectada).
- Administrar analgésico pré-operatório, como meloxicam, pelo menos 30 minutos antes do procedimento invasivo.
- Quando o animal estiver totalmente anestesiado, use cortadores para remover a pele do couro cabeludo. Alterne o fluxo de isoflurano para o cone do nariz do quadro estereotáxico e monte o rato no quadro. Aplique gel lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento.
- A cirurgia deve ser realizada em condições assépticas. Use luvas e instrumentos estéreis durante todo o procedimento. Aplique pomada de lidocaína (5% p/p) antes de desinfetar o couro cabeludo com solução de clorexidina a 4% p/v e, em seguida, cubra o corpo com uma cortina estéril. Usando um bisturi, faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 15 mm de comprimento no couro cabeludo para expor o bregma.
- Carregue uma seringa Hamilton numa bomba de seringa de microinjeção ligada a um braço móvel montado na estrutura estereotáxica.
- Coloque uma alíquota de 5 μL do vírus em um tubo de 0,2 mL e gire por alguns segundos até que todo o volume esteja no fundo do tubo. Pipeta 2 μL da preparação viral para a tampa do tubo.
- Encha a seringa com a preparação viral, primeiro visualizando a ponta da agulha com um microscópio cirúrgico e, em seguida, coloque manualmente o bolo do vírus na ponta da agulha e retire o êmbolo da seringa usando os controles da bomba.
- Ajuste o volume de injeção da bomba para 300 nL e a vazão para 100 nL/min. Execute a bomba e confirme o fluxo adequado observando a gota do vírus na ponta da agulha. Absorva o vírus em um cotonete e limpe suavemente a agulha com etanol a 70%.
- Usando os parafusos ajustadores no quadro estereotáxico, navegue pela ponta da agulha até o bregma (o ponto no crânio onde as suturas coronal e sagital se encontram) e tome nota das medidas estereotáxicas observadas nas três escalas vernier no quadro. As coordenadas relativas ao bregma do mPFC de rato são anteroposterior + 3,1 mm, mediolateral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; adicione/subtraia (conforme indicado) essas distâncias das coordenadas do bregma e, em seguida, navegue pela agulha até as coordenadas anteroposterior e mediolateral e abaixe suavemente a agulha na superfície do crânio.
NOTA: As coordenadas mPFC dadas acima são apropriadas para ratos machos encapuzados de 300-350 g; alterações na estirpe do rato, o tamanho pode exigir alterações a estas coordenadas (ver Discussão). - Levante a agulha da superfície do crânio e marque este ponto com uma caneta de marcador permanente de ponta fina. Faça um furo de rebarba neste ponto usando uma micro broca montada no braço estereotáxico.
- Insira a agulha no cérebro na coordenada dorsoventral pré-determinada e infunda um volume pré-determinado (para mPFC: 300 nL). Deixe a agulha no local por 10 minutos para permitir a difusão do bolo. Após a remoção da agulha, execute a bomba para garantir que a agulha não esteja bloqueada.
NOTA: Insira e remova a agulha lentamente (~ 3 mm / min) para minimizar os danos ao tecido cerebral e o refluxo do vírus para o trato da agulha. - Administrar 2,5 mL de cloreto de sódio aquecido (0,9% p/v) e solução de glicose (5% p/v) por via subcutânea para manter a hidratação.
- Repita a etapa 1.4.12. para o segundo hemisfério.
- Suture a incisão do couro cabeludo e, após a conclusão do procedimento, administre 2,5 mL de solução de cloreto de sódio e glicose e um analgésico apropriado, institucionalmente recomendado, para o controle da dor, por exemplo, buprenorfina ou meloxicam. Não deixe o animal sozinho enquanto estiver inconsciente. Coloque o rato em uma caixa de recuperação aquecida até que ele recupere totalmente a consciência. Só retorne à gaiola de origem com outros animais uma vez totalmente recuperados.
- Siga as diretrizes institucionais para cuidados pós-operatórios e procedimentos de alojamento para roedores transfectados viralmente. Aguarde pelo menos 2 semanas para que o transgene de opsina se expresse adequadamente antes de iniciar o experimento.
NOTA: O tempo necessário para a transdução depende da distância e da força da conexão entre as regiões pré e pós-sináptica. Para mPFC a LEC, são necessárias 4-6 semanas.
2. Preparação de fatias cerebrais agudas
NOTA: Aqui descrevemos um método simples para a preparação de fatias cerebrais que, em nossas mãos, é suficiente para alcançar fatias corticais, hipocampais e talâmicas de alta qualidade de camundongos e ratos adultos.
- Prepare as soluções para dissecação.
- Encha um copo de 250 mL com ~200 mL de solução de corte de sacarose gelada (sacarose de 189 mM, NaHCO3 de 26 mM, D-glicose de 10 mM, MgSO 4 de 5 mM, KCl de 3 mM, NaH 2 PO4 de 1,25 mM e CaCl 2 de0,2mM feita em água ultrapura (UPW) com resistividade de 18,2 MΩ cm a 25 °C) ou um volume suficiente para encher a câmara de tecido vibratomo. Bolha com carbogênio (95% O 2, 5% CO2) e mantenha no gelo.
- Encha uma câmara de coleta de fatias com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glicose,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2 PO 4 e 1 mM MgSO4 feito em UPW) à temperatura ambiente, borbulhado com carbogênio. A câmara de coleta de fatias14 é feita sob medida a partir de um rack de tubo de microcentrífuga colado em uma folha de malha de nylon e colocado em um copo no qual está submerso em aCSF (Figura 2A).
- Encher um tubo de 50 mL com paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão fosfato (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O e 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
CUIDADO: O PFA é tóxico. Use em exaustor.
- Dissecção do cérebro.
- Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando isoflurano a 5% até que a respiração seja lenta e regular (~1 Hz). Para garantir um nível suficiente de teste de anestesia para a ausência de reflexos pedais e corneanos.
- Decapitar o animal usando uma guilhotina.
- Dissecar rapidamente todo o cérebro como descrito anteriormente15 e transferir para a solução de corte de sacarose. Complete a etapa dentro de 90 s de decapitação para uma boa qualidade de fatia e gravação bem-sucedida de células inteiras.
- Usando uma colher de chá de metal, pegue o cérebro, descarte o excesso de solução de corte e coloque-o em um pedaço de papel de filtro na bancada.
- Usando um bisturi ou lâmina de barbear, remova rapidamente o cerebelo e corte o cérebro no plano coronal aproximadamente na metade do seu comprimento; a metade posterior é o bloqueio tecidual LEC. Certifique-se de incluir algum excesso de tecido, além da região a ser cortada para os próximos passos. Devolva este bloco de tecido e o restante do cérebro para a solução de corte de sacarose.
- Coloque uma gota de cola de cianoacrilato em um estágio de tecido vibratome. Espalhe-o em uma camada fina com uma área ligeiramente maior do que o bloco de tecido criado na etapa anterior.
- Pegue o bloco de tecido LEC usando uma colher de chá, descarte o excesso de solução e transfira para o adesivo de tal forma que o corte coronal anterior tenha aderido.
- Instale o estágio na câmara de tecido vibratório e despeje rapidamente uma quantidade suficiente de solução de corte de sacarose para submergir o tecido; borbulhar esta solução com carbogênio. Oriente o bloco de tecido LEC com a superfície ventral em direção à lâmina. Embora a iluminação ambiente da sala seja insuficiente para ativar a opsina, evite usar fontes de luz adicionais que possam estar presentes no vibratome.
- Corte fatias de 350 μm de espessura ventral para dorsal usando uma alta velocidade de oscilação da lâmina (100 Hz) e uma velocidade de avanço lenta da lâmina (0,06 mm/s). Normalmente, sete fatias LEC podem ser obtidas por hemisfério.
- Transfira as fatias para a câmara de coleta de fatias. Após a conclusão da recolha de fatias, transferir a câmara de recolha para um banho-maria de 34 °C durante 1 h antes de regressar à temperatura ambiente. Bolha com carbogênio continuamente. As fatias serão suficientemente saudáveis para gravação por pelo menos 6 h.
- Coloque o restante do cérebro em PFA durante 48 h para exame post-hoc do local de injeção (ver secção 4).
3. Eletrofisiologia e estimulação optogenética
- Identificação da célula de destino.
- Colocar a fatia numa câmara de registo submersa a 34 °C perfundida com um LCR a uma velocidade de 2 ml/min por uma bomba peristáltica. Imobilize a fatia usando uma âncora de fatia.
- Sob a objetiva de baixa ampliação (4x) de um microscópio de campo largo usando iluminação infravermelha oblíqua, navegue até a camada LEC 5. Meça a distância da superfície pial até a camada necessária.
NOTA: A iluminação infravermelha oblíqua foi obtida posicionando um LED infravermelho próximo aproximadamente 3 mm abaixo da tampa da câmara de gravação em um ângulo de ~55° em relação ao plano da tampa (Figura 2B). O contraste de interferência diferencial é uma técnica de imagem alternativa e comumente usada para eletrofisiologia de fatias. - Mude para um objetivo de imersão em água de alta ampliação (40x) e identifique neurônios piramidais. Marque a posição da célula no monitor do computador com fita adesiva.
NOTA: Os neurônios piramidais têm uma morfologia aproximadamente triangular com dendritos apicais proeminentes projetando-se em direção à superfície pial do corte (Figura 3A). A saúde celular pode ser avaliada pela ausência de um núcleo condensado e visível e pela inspeção da membrana plasmática, que deve parecer suave. É improvável que a marcação fluorescente clara dos axônios pela proteína de fusão opsina-fluoróforo seja visível ao usar um microscópio de fluorescência de campo amplo. Para visualizar as projeções axonais, realizar imuno-histoquímica post-hoc usando um anticorpo primário contra o fluoróforo da opsina e amplificar com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo do mesmo comprimento de onda ou similar.
- Formação de patch-clamp de células inteiras.
- Fabricar uma micropipeta de vidro borossilicato usando um extrator de pipeta e encher com solução de gravação intracelular filtrada (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA e 0,25% de biocitina feita em UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque a micropipeta cheia no suporte do eletrodo no headstage do amplificador patch-clamp, garantindo que o fio do eletrodo esteja em contato com a solução intracelular.
- Aplique pressão positiva por via oral soprando com força em um bocal (como uma seringa de 1 mL com o êmbolo removido) conectado por tubulação à porta lateral do suporte do eletrodo e mantenha a pressão fechando uma válvula de três vias em linha. Levante a objetiva do microscópio de tal forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que ele possa ser visto no microscópio.
- Abra a janela Teste de vedação no WinLTP16 (ou outro software/osciloscópio de aquisição) e, com o amplificador no modo tensão-braçadeira, aplique um pulso quadrado de 5 mV para determinar se a resistência da pipeta é de 3-6 MΩ.
- Aproxime-se e toque na célula identificada com a ponta da pipeta; isso deve resultar em um recuo na membrana celular (Figura 3A; painel direito) e um pequeno aumento na resistência da pipeta (0,1 MΩ).
- Liberar pressão positiva e aplicar pressão negativa aplicando sucção moderada no bocal; isso deve resultar em um grande aumento na resistência da pipeta (>1000 MΩ). A pressão agora pode ser deixada neutra. Aplique pressão negativa em uma rampa gradualmente crescente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de célula inteira.
- Registrar eventos sinápticos optogeneticamente evocados.
- Insira a configuração de grampo atual.
NOTA: Na maioria dos casos, a transmissão sináptica de longo alcance é glutamatérgica, portanto, o registro em potenciais de membrana próximos ao potencial de reversão de cloreto isolará melhor a transmissão mediada pelo receptor AMPA (AMPAR) e minimizará a medição de qualquer inibição de feed-forward (FFI) evocada. A reversão de cloreto depende da composição da solução de registro intracelular e do aCSF e pode ser calculada usando a equação de Goldman-Hodgkin-Katz; para as soluções acima, foi de -61,3 mV. Os neurônios piramidais LEC da camada 5 tinham um potencial médio de membrana em repouso de -62 mV e, quando necessário, eram mantidos nesse potencial por injeção de corrente constante. Alternativamente, as células podem ser presas à tensão ao potencial desejado. Para registrar projeções inibitórias de longo alcance16 ou para registrar FFI, pinça de tensão no potencial de reversão de cátions para isolar a condutância de cloreto GABAérgico. Quando os neurônios de pinçamento de voltagem em potenciais de membrana acima do limiar do potencial de ação, uma solução intracelular à base de césio contendo bloqueadores de canal de sódio dependentes de voltagem é usada para melhorar a pinça de voltagem e prevenir o início de potenciais de ação (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloreto,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% de biocitina feita em UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - Usando o software de aquisição de dados, envie sinais lógicos de transistor-transistor (TTL) para um driver de LED para ativar um LED montado de 470 nm. O LED montado é direcionado para o caminho da luz do microscópio usando cubos de filtro e óptica apropriada (Figura 2B) para aplicar pulsos de luz à fatia através da objetiva de 40x para evocar potenciais pós-sinápticos excitatórios optogenéticos (oEPSPs).
NOTA: Os pulsos de luz podem ser aplicados perisomaticamente / sobre os dendritos, o que resultará na ativação de opsinas nos axônios e no bouton pré-sináptico, ou o investigador pode mover o objetivo para os axônios para longe da célula registrada para evitar a estimulação excessiva de bouton (ver Discussão). A amplitude máxima da oEPSP depende da força da projeção sináptica, da eficácia das injeções virais e da opsina utilizada. As oEPSPs podem ser tituladas para a amplitude desejada variando a intensidade e/ou duração da luz18; variar a duração dos pulsos de luz (duração típica entre 0,2-5 ms na potência máxima do LED, o que resulta em densidade de luz de 4,4 mW/mm19) fornece amplitudes de oEPSP mais consistentes do que alterar a saída de potência do LED. - Investigar as propriedades de liberação pré-sináptica (mudança de tensão) fornecendo trens de múltiplos pulsos de luz com diferentes intervalos interestímulos (Figura 3E); deve-se ter cuidado ao interpretar a transmissão optogeneticamente evocada (ver Discussão).
- Investigar a plasticidade a longo prazo, evocando repetidamente oEPSPs19 ou a aplicação de ligantes. Monitore a amplitude da oEPSP por 5-10 min para garantir a estabilidade antes da indução da plasticidade e, em seguida, monitore até que uma amplitude estável seja atingida (tipicamente 30-40 min).
NOTA: A maioria das opsinas atuais não é capaz de evocar de forma confiável múltiplos potenciais de ação em altas frequências, por exemplo, 100 estímulos entregues a 100 Hz, como é tipicamente usado para induzir LTP. - Para confirmar que as oEPSPs são monossinápticas, realize a ativação sobre-bouton da via transduzida posicionando a objetiva sobre o mandril dendrítico e estimulando na presença de tetrodotoxina 0,5 μM e aminopiridina 100 μM. A aplicação de tetrodotoxina abolirá a transmissão se as respostas forem dependentes do potencial de ação e a subsequente inclusão da aminopiridina restaurará parcialmente a transmissão se as oEPSPs forem geradas monossinapticamente19,20.
- Para permitir que a biocitina preencha o neurônio, aguarde pelo menos 15 minutos depois de entrar na configuração de células inteiras. Na braçadeira de tensão, monitore a capacitância da membrana e a resistência de entrada.
- Retire lentamente a pipeta ao longo do ângulo de aproximação para longe do soma da célula, observando o lento desaparecimento dos transientes de capacitância e da corrente de membrana, indicando a re-vedação da membrana celular e a formação de um remendo externo na ponta da pipeta. Observe a orientação da fatia e a localização da(s) célula(s) dentro da fatia. Colocar a fatia em PFA numa placa de 24 poços e incubar durante a noite a 4 °C e, em seguida, transferir para 0,1 M PB.
NOTA: As fatias podem ser armazenadas por até uma semana. Se for necessário um armazenamento mais longo, troque o PB regularmente ou use PB contendo azida de sódio (0,02%-0,2% de azida de sódio).
- Insira a configuração de grampo atual.
4. Histologia
- Local de injeção de fatiamento
- Após a fixação, crioproteger o tecido em sacarose a 30% (p/v) em PB até afundar (inicialmente flutuará na solução de sacarose), geralmente durante a noite à temperatura ambiente ou 24-48 h a 4 °C.
- Usando o meio de temperatura de corte ideal (OCT), prenda um bloco de tecido ao disco da amostra de criostato. Congelar o bloco de tecidos seguindo os passos 4.1.3 a 4.1.4.
- Coloque isopentano em um recipiente apropriado. Submerja apenas o disco da amostra, garantindo que o tecido esteja acima do nível do isopentano. Abaixe o recipiente de isopentano em nitrogênio líquido (ou gelo seco) e deixe o tecido congelar.
- Uma vez completamente congelado (todo o bloco de tecido torna-se pálido e duro), deixe o bloco de tecido na câmara de criostato a -20 °C durante 30 minutos para permitir que a temperatura do bloco se equilibre.
- Cortar secções de 40 μm de espessura no criostato a -20 °C. Use um pincel fino para guiar as seções para fora da lâmina. Aderir seções congeladas a uma temperatura ambiente, poli-L-lisina revestida, lâmina de microscópio de vidro, tocando a lâmina para as seções.
- Adicionar cerca de 150 μL de meio de montagem a cada lâmina e cobrir com uma folha de cobertura; remova quaisquer bolhas de ar pressionando suavemente a tampa. Cubra as lâminas para proteger contra o fotobranqueamento e seque ao ar livre à temperatura ambiente por pelo menos 12 h (ou durante a noite). Usando um microscópio de fluorescência, examine a localização do local da injeção viral.
- Protocolo de coloração de biocitotina
NOTA: Este protocolo pode ser aplicado a seções espessas; as fatias não precisam ser resseccionadas.- Lave as fatias cerebrais com solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO4 e 1,8 mM KH2PO4) seis vezes por 10 minutos por lavagem. Use uma pipeta de transferência para esvaziar os poços após cada etapa.
- Incubar os cortes em 3% H 2 O2(p/v) em PBS por 30 min para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase. Isso gera bolhas de oxigênio.
- Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem ou até que não haja mais bolhas de oxigênio visíveis. Incubar as fatias cerebrais em solução de complexo HRP (ABC) avidina-biotinilada a 1% em PBS contendo Triton X-100 a 0,1% (v/v) à temperatura ambiente por 3 h.
- Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem.
- Incubar cada fatia em solução de 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) por vários minutos até que a coloração de biocitina das estruturas neuronais se torne visível (leva cerca de 5-10 min).
CUIDADO: DAB é tóxico. Use em exaustor.
NOTA: Os tempos de incubação do DAB podem ser imprevisíveis, monitore o tecido de perto à medida que a cor se desenvolve. - Parar a reacção transferindo as fatias para PBS frio (4 °C). Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem. Use uma escova para montar as fatias cerebrais em lâminas de microscópio de vidro revestidas com poli-L-lisina.
- Remova todo o excesso de PBS com um tecido limpo. Cubra cada fatia com cerca de 200 μL de meio de montagem; cubra com folhas de cobertura e pressione suavemente a tampa para empurrar as bolhas de ar. Seque ao ar livre à temperatura ambiente por pelo menos 12 h (ou durante a noite). Usando um microscópio de luz, examine a localização e os detalhes morfológicos da(s) célula(s).
NOTA: A biocitina pode alternativamente ser visualizada usando estreptavidina conjugada com fluoróforo; no entanto, a imagem pode exigir ressecção ou o uso de microscópio confocal21.
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Representative Results
Neste protocolo, descrevemos como estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade usando a entrega viral de construtos optogenéticos. O protocolo pode ser muito facilmente adaptado para estudar quase qualquer conexão de longo alcance no cérebro. Como exemplo, descrevemos a injeção de AAVs codificando uma opsina em mPFC de ratos, a preparação de fatias agudas de LEC, registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC de camada 5 e ativação evocada por luz de terminais mPFC em LEC (Figura 1).
Uma célula piramidal saudável foi localizada e remendada (por exemplo, Figura 3A). No presente exemplo de mPFC para LEC, as células pós-sinápticas não foram marcadas; se for necessária a identificação de células pós-sinápticas, uma célula que expresse o marcador fluorescente deve ser localizada usando óptica de campo largo (por exemplo, Figura 3B). A saúde da célula deve ser avaliada por óptica infravermelha antes da experimentação. Para ativar os axônios mPFC no LEC, um LED foi colocado diretamente sobre a camada 5 de soma celular e dendritos proximais através da objetiva do microscópio (Figura 1), pulsos de luz simples de 2 ms resultaram em oEPSPs de forma de onda simples (Figura 3C); a amplitude de pico da EPSP pode ser medida. Para examinar a plasticidade a curto prazo da sinapse, foram aplicados trens de estimulação luminosa de 5, 10 e 20 Hz (Figura 3E). Para investigar a plasticidade a longo prazo, após o monitoramento da amplitude basal da oEPSP por 10 min, o agonista colinérgico, carbachol, foi adicionado ao aCSF circulante por 10 min. Isso causou depressão a longo prazo que ainda era evidente 40 min após a remoção do ligante (Figura 3D).
Após experimentos de registro eletrofisiológico, o tecido cerebral contendo o local de injeção viral foi seccionado e o comprimento do local de injeção foi examinado (Figura 4A). O repórter fluorescente, mCherry, está localizado nas camadas mais profundas do córtex pré-límbico e infralímbico (regiões constituintes do mPFC de roedores). Essas camadas foram direcionadas, uma vez que a projeção para LEC demonstrou se originar predominantemente das camadas corticais mais profundas22. Fibras positivas mCherry também podem ser vistas juntando-se ao trato de substância branca. Em um experimento piloto para otimizar a colocação de injeção viral, 40 μm de seções de LEC foram tomadas e examinadas; Fibras positivas para mCherry podem ser observadas na camada 5 do LEC (Figura 4B). Por fim, a célula preenchida com biocitina foi corada, permitindo que sua localização e morfologia fossem confirmadas (Figura 4C,D).
Figura 1: Visão geral experimental. (A) Esquema de injeção de vetores virais no córtex pré-frontal medial (mPFC), transdução de células mPFC com construção optogenética e transporte de construto para terminais no córtex entorrinal lateral (LEC). (B) Representação esquemática do registro de células inteiras de neurônios piramidais da camada 5 em um corte agudo de LEC e ativação luminosa de terminais mPFC via objetiva de microscópio. Abreviaturas: CA = cornu ammonis; PERI = córtex peririnal; TR = região de transição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Câmara de coleta de fatias e configuração óptica para registros visualizados de células inteiras, excitação optogenética e identificação de neurônios positivos para tdTomate. (A) A câmara de coleta de fatias14 é feita sob medida a partir de um rack de tubo de microcentrífuga colado em uma folha de malha de nylon e colocada em um copo no qual está submerso em aCSF (B ) LEDs para excitação de ChR2 (470 nm) e tdTomato (565 nm) são direcionados através de uma lente condensadora asférica para colimar a luz, a luz de 565 nm é irradiada através de um filtro passa-banda para alcançar a separação espectral dos espectros de excitação e emissão de tdTomato. Estes são combinados com um espelho dicroico de passagem longa e direcionados para a fatia com um segundo espelho dicroico de passagem longa de um comprimento de onda mais longo. A luz é então focada na fatia através da lente objetiva. Em experimentos em que os neurônios marcados com tdTomato estão presentes, a luz fluorescente emitida passa através do espelho dicroico e do filtro de emissão e é focada no sensor da câmera por uma lente acromática. As características não fluorescentes da fatia são visualizadas por luz oblíqua refratada perto do infravermelho (NIR) aplicada sob a câmara de corte; esta luz passa a óptica para a câmera, negando assim a necessidade de mudar os cubos de filtro entre imagens fluorescentes e NIR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualização de neurônios sob NIR/imagem fluorescente e exemplos representativos de oEPSPs. (A) Esquerda: Exemplo de neurônio com morfologia piramidal visualizada com luz NIR. Direita: Mesmo neurônio com a formação de covinha côncava causada pela pressão positiva da pipeta de patch. (B) Expressão dependente de tdTomate Cre-recombinase em um único neurônio. (C) OEPSP representativa da camada 5 da LEC na célula piramidal. (D) Exemplo de experimento de plasticidade de longo prazo monitorando oEPSP ao longo do tempo após a adição de 10 μm de carbachol (CCh). A linha pontilhada indica amplitude média da EPSP durante o período basal antes da adição do medicamento. (E) Traços representativos de trens de estimulação a 5, 10 e 20 Hz. Setas azuis denotam ativação da luz. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Verificação histológica do local de injeção e recuperação da célula cheia de biocitotina . (A) Fotomicrografia coronal mostrando o local de injeção viral em mPFC, a +3,00 mm do bregma. (B) Seção coronal fina de LEC ilustrando fibras mCherry+. (C) Imagem de baixa potência de corte agudo de 350 μm de espessura, -6,2 mm de bregma, com célula piramidal preenchida com biocitina em LEC. A caixa tracejada é mostrada em maior ampliação na célula piramidal D. (D) LEC; o dendrito apical pode ser visto à direita da imagem em direção à camada 1. Linhas tracejadas denotam fronteiras regionais. Abreviaturas: IL = córtex infralímbico; PL = córtex pré-límbico; wm = substância branca. Barras de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve um método para explorar projeções sinápticas de longo alcance altamente específicas usando uma combinação de cirurgia estereotáxica para fornecer AAVs codificando construções optogenéticas e eletrofisiologia em cortes cerebrais agudos (Figura 1). Juntas, essas técnicas oferecem ferramentas para caracterizar a fisiologia e a plasticidade dos circuitos cerebrais com alta precisão em vias de longo alcance e anatomicamente difusas que antes eram inacessíveis usando estimulação elétrica tradicional e não específica. A combinação com marcadores moleculares específicos de células permite a caracterização de projeções de uma região do cérebro para diferentes populações celulares definidas em outra região23.
Para tirar o máximo proveito da natureza altamente precisa desta técnica, é essencial verificar a especificidade da via. Isso é feito em várias etapas; durante a gravação, certifique-se de que a sinapse sob investigação é mono-sináptica (passo 3.3.5). Depois disso, examine histologicamente o local de injeção para garantir que o vírus esteja confinado à região pré-sináptica de interesse pretendida e avalie a localização e a morfologia da célula pós-sináptica corada com biocitina para garantir que seja como previsto.
Seleção de vírus e obtenção de especificidade celular
A técnica é altamente adaptável e adequada para uso em camundongos e ratos. Experimentos que requerem especificidade anatômica podem ser realizados com roedores do tipo selvagem. Experimentos que exigem especificidade do tipo de célula pós-sináptica podem exigir uma cepa de roedores geneticamente modificada se as células não forem identificáveis com base na morfologia ou localização. Por exemplo, para atingir interneurônios que expressam parvalbumina (PV), uma linha de camundongo transgênico PV-Cre na qual a Cre-recombinase é expressa em neurônios que expressam PV poderia ser usada. Para visualizar essas células, a linha PV-Cre pode ser cruzada com uma linha de camundongo repórter para expressar uma proteína fluorescente após a recombinação mediada por Cre. Alternativamente, um gene repórter fluorescente dependente de Cre pode ser introduzido por via viral. As proteínas de fusão de ChR2-fluoróforo são restritas à membrana celular e podem aparecer como um contorno do neurônio quando vistas com microscopia de campo largo em fatias agudas, tornando a identificação de células para registro de células inteiras mais desafiadora do que o uso de fluoróforos citosólicos. Se o ChR2 está sendo usado para identificar células, a separação de ChR2 e fluoróforo pode ser alcançada usando vetores bicistrônicos24. Se estiver usando um repórter fluorescente para identificar neurônios-alvo para gravação de células inteiras, seu comprimento de onda de excitação idealmente não deve se sobrepor ao comprimento de onda de ativação da opsina; isso evitará a ativação prolongada de aferentes transduzidos durante a busca de neurônios para gravar. Da mesma forma, os repórteres pré e pós-sinápticos devem ser espectralmente separados. Repórteres comuns são mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente amarela aprimorada (eYFP).
A construção viral utilizada tem vários componentes diferentes, cada um pode impactar o sucesso do experimento e, portanto, deve-se considerar cada elemento. Deve ser dada importância primária à escolha da opsina. Para a ativação pré-sináptica, a opsina ideal tem grandes fotocorrentes (para trazer de forma confiável os axônios ao limiar do potencial de ação), cinética rápida dentro e fora e uma taxa lenta de dessensibilização para permitir a estimulação repetida de alta frequência. Como regra geral, a cinética rápida geralmente vem à custa de fotocorrentes menores25; no entanto, a triagem molecular e a engenharia forneceram às opsinas grandes fotocorrentes. O protocolo atual usa ChR2(E123T/T159C) ChETATC12, no entanto, Chronos26, CheRiff 27, oChIEFAC28 e ChRmine29 também são adequados. Além disso, existem opsinas excitatórias com comprimentos de onda de ativação com desvio para o vermelho (ChrimsonR)26 ou violeta (CheRiff), o que pode ser necessário para evitar a sobreposição com espectros de excitação de fluoróforos usados para identificação celular (ver acima).
O sorotipo dos AAVs pode afetar a capacidade do vetor de transduzir diferentes regiões cerebrais e tipos celulares, bem como a extensão do transporte axonal nas direções anterógrada e retrógrada30. Os sorotipos comumente usados para transdução neuronal são 1, 2, 5, 8 e 9. Uma pesquisa bibliográfica pode dar uma indicação de qual sorotipo foi usado com sucesso em qualquer região. Por exemplo, o AAV9 tem sido recomendado para a transdução de neurônios corticais31.
O promotor permite a especificação do tipo de célula em que a opsina será expressa. Os promotores se enquadram em várias classes. Promotores gerais, por exemplo, CAG ou EF1a, resultam em expressão na maioria dos tipos de células. Promotores específicos de neurônios, por exemplo, sinapsina, geram expressão em todos os tipos de neurônios. CaMKIIa é comumente usado para restringir a expressão a neurônios excitatórios, embora tenha se mostrado vazado – alguma expressão tem sido observada em interneurônios32. O elemento potenciador mDlx limita a expressão aos interneurônios GABAérgicos33. A especificidade do tipo de célula pré-sináptica pode ser alcançada usando uma linha Cre-mouse (como descrito acima para a célula pós-sináptica). Neste caso, uma construção genética dependente de Cre será necessária para limitar a expressão de opsina a células que expressam Cre.
Título é o número de partículas virais na preparação viral. Novamente, uma pesquisa bibliográfica pode dar uma indicação de um título que gerou transdução suficiente em uma determinada região. Ao usar um sistema dependente de Cre, o título pode ser particularmente importante, pois altos títulos virais podem transduzir a expressão em células que não expressam Cre34.
Otimização da entrega de vírus
A entrega viral precisa para a região de interesse é de importância crítica para esta abordagem. As coordenadas de injeção da região pré-sináptica podem ser estimadas consultando-se a literatura e/ou um atlas cerebral para as espécies apropriadas35,36. O experimentador deve então levar tempo para otimizar e refinar as coordenadas precisas de injeção e o volume usado para garantir que a injeção viral seja restrita à sua região pré-sináptica de interesse. Isso é especialmente crítico quando as regiões vizinhas também se projetam para o local de gravação. Recomendamos o uso de pequenos volumes do vírus como um método eficaz de fazer isso. Se for necessário um local de injeção particularmente pequeno, a utilização de micropipetas de vidro no lugar de uma seringa e agulha pode ser vantajosa13. Deixar a agulha de injeção no local por um período adequado e a retirada lenta da agulha de injeção é fundamental para evitar que o vírus escape para o trato da agulha. Para confirmar a precisão das injeções, é uma prática recomendada verificar histologicamente o local de injeção de cada animal utilizado através da eletrofisiologia, sempre que possível, e excluir os dados em que a transdução viral está fora do alvo. Em nossas mãos, o protocolo descrito acima provou ser generalizável para muitas conexões diferentes de longo alcance, incluindo projeções de núcleos talâmicos da linha média ventral, hipocampo, tálamo mediodorsal e LEC para PFC; projeções de PFC para LEC e tálamo mediodorsal; projeções de LEC e núcleos talâmicos da linha média ventral para o hipocampo (laboratório Zafar Bashir, Universidade de Bristol, observações não publicadas19). A marcação optogenética dessas diferentes vias exigiu apenas o refinamento das coordenadas e volumes de injeção.
Limitações do protocolo
A dissecção rápida do cérebro e o corte cuidadoso são extremamente importantes para o sucesso desses experimentos. O protocolo de fatiamento aqui descrito produz cortes agudos saudáveis sem adaptação para diferentes regiões cerebrais; no entanto, a variação no meio de corte e na temperatura de incubação pós-corte descrita em outros lugares28 foi relatada para melhorar ainda mais a saúde do fatiamento. Além disso, também conseguimos tirar fatias agudas de duas regiões cerebrais após a transdução viral de uma única área, reduzindo assim o número de animais usados. Descobrimos que, em vias anatomicamente densas, períodos tão curtos quanto 7 dias entre a transdução viral e o registro são suficientes para evocar oEPSPs robustos de magnitude adequada para registros de patch clamp de células inteiras. Em projeções de longo alcance ou mais esparsas, atrasos mais longos são vantajosos.
Deve-se ter cuidado ao interpretar os resultados da atividade optogeneticamente evocada, particularmente no que diz respeito à plasticidade de curto prazo. Resultados anteriores mostraram que a transmissão optogeneticamente evocada pode sofrer depressão sináptica mais pronunciada após estimulação repetida do que a estimulação elétrica, que pode surgir devido a uma série de fatores. Em primeiro lugar, a dessensibilização da opsina25 pode levar a um número reduzido de axônios pré-sinápticos, levando a respostas pós-sinápticas reduzidas. A cinética de canal melhorada das opsinas recentemente descobertas e daquelas que foram submetidas a engenharia molecular (ver acima) percorreu um caminho considerável para mitigar os efeitos da dessensibilização; no entanto, a estimulação de 100 Hz permanece fora do alcance de muitas opsinas, o que pode impedir o uso de certos protocolos de indução de plasticidade a longo prazo (embora ver37). Em segundo lugar, a cinética lenta das opsinas pode ampliar os potenciais de ação18, levando à liberação prolongada do transmissor e à depleção vesicular; isso também pode resultar da permeabilidade ao cálcio das opsinas excitatórias11; esses problemas podem ser mitigados evitando-se a fotoativação excessiva de bouton38. Em terceiro lugar, a transdução de neurônios usando vetores AAV também pode levar a propriedades de liberação pré-sináptica alteradas em certas sinapses; no entanto, isso pode ser atenuado pelo uso do sorotipo38 da AAV9. Apesar dessas limitações, com o uso cuidadoso, a ativação optogenética pode mimetizar a estimulação elétrica19,38 e é, portanto, uma ferramenta inestimável na investigação da fisiologia de vias sinápticas não estudadas. Observamos também que os dados mostrados na Figura 3E avaliam a plasticidade de curto prazo na pinça de corrente e, portanto, estão sujeitos à interação de potenciais sinápticos e propriedades intrínsecas da membrana, o que pode ser evitado com a realização de experimentos equivalentes em tensão-braçadeira.
Direções futuras
A caixa de ferramentas optogenéticas em constante expansão levantou a possibilidade de aplicar essa tecnologia em duas vias sinápticas na mesma preparação, usando um par de opsinas com espectros de excitação divergentes. Isso é possível graças ao uso de um opsin ChrimsonR26, que, ao contrário do ChR2, é fotoativado pela luz vermelha de comprimento de onda. ChrimsonR retém baixa sensibilidade à luz azul, portanto, para evitar a ativação de vias cruzadas, pode ser usado em combinação com opsinas insensíveis ao vermelho, que são violetas deslocadas (CheRiff 27) e / ou têm ordens de magnitude maior sensibilidade à luz azul (Chronos26). Isso permite o uso de estímulos de luz azul/violeta que são muito fracos para ativar significativamente o ChrimsonR e, portanto, permitem a ativação de duas vias39,40, o que pode aumentar o rendimento experimental, permitir o exame de interações de vias convergentes e permitir a liberação de neuromoduladores de fontes endógenas 41.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Gostaríamos de agradecer a Zafar Bashir por sua orientação especializada e ao Dr. Clair Booth pela assistência técnica e comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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