Summary
Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.
Abstract
L’étude des propriétés physiologiques de synapses spécifiques dans le cerveau et de la façon dont elles subissent des changements plastiques est un défi clé dans les neurosciences modernes. Les techniques électrophysiologiques in vitro traditionnelles utilisent la stimulation électrique pour évoquer la transmission synaptique. Un inconvénient majeur de cette méthode est sa nature non spécifique; Tous les axones de la région de l’électrode stimulante seront activés, ce qui rendra difficile l’attribution d’un effet à une connexion afférente particulière. Ce problème peut être surmonté en remplaçant la stimulation électrique par une stimulation optogénétique. Nous décrivons une méthode pour combiner l’optogénétique avec des enregistrements in vitro patch-clamp. Il s’agit d’un outil puissant pour l’étude de la transmission synaptique basale et de la plasticité synaptique des connexions synaptiques anatomiquement définies avec précision et est applicable à presque toutes les voies du cerveau. Ici, nous décrivons la préparation et la manipulation d’un vecteur viral codant pour la protéine channelrhodopsine pour injection chirurgicale dans une région d’intérêt pré-synaptique (cortex préfrontal médial) dans le cerveau des rongeurs et la fabrication de tranches aiguës de régions cibles en aval (cortex entorhinal latéral). Une procédure détaillée pour combiner des enregistrements patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique à court et à long terme est également présentée. Nous discutons d’exemples d’expériences qui atteignent la spécificité de la voie et de la cellule en combinant l’optogénétique et le marquage cellulaire Cre-dépendant. Enfin, la confirmation histologique de la région d’intérêt pré-synaptique est décrite avec le marquage biocytine de la cellule post-synaptique, afin de permettre une identification plus approfondie de l’emplacement précis et du type de cellule.
Introduction
Comprendre la physiologie des synapses et comment elles subissent des changements plastiques est fondamental pour comprendre comment les réseaux cérébraux fonctionnent dans le cerveau sain1, et comment ils fonctionnent mal dans les troubles cérébraux. L’utilisation de tranches cérébrales ex vivo aiguës permet d’enregistrer l’activité électrique des synapses à partir de neurones individuels avec un rapport signal sur bruit élevé à l’aide d’enregistrements patch-clamp à cellules entières. Le contrôle du potentiel membranaire et la manipulation pharmacologique directe permettent d’isoler les sous-types de récepteurs. Ces enregistrements peuvent être réalisés avec une spécificité exquise pour identifier le neurone post-synaptique, y compris la position laminaire et sous-régionale2, la morphologie cellulaire3, la présence de marqueurs moléculaires4, ses projections afférentes5, ou même s’il était récemment actif6.
Atteindre la spécificité des entrées pré-synaptiques est, cependant, un peu plus difficile. La méthode conventionnelle a utilisé des électrodes de stimulation pour exciter les axones qui courent dans une lame particulière. Un exemple de ceci est dans l’hippocampe où la stimulation locale dans la strate radiane active les synapses qui se projettent du CA3 au sous-champ CA17. Dans ce cas, la spécificité présynaptique est atteinte car l’entrée CA3 représente la seule entrée excitatrice située dans la strate radiale qui se projette vers les cellules pyramidales CA18. Ce haut degré de spécificité d’entrée réalisable avec l’activation électrique présynaptique conventionnelle des axones CA3-CA1 est cependant une exception qui se reflète dans l’étude intense à laquelle cette synapse a été soumise. Dans d’autres régions du cerveau, les axones de plusieurs voies afférentes coexistent dans la même lame, par exemple dans la couche 1 du néocortex9, rendant ainsi impossible la stimulation présynaptique spécifique à l’entrée avec des électrodes de stimulation conventionnelles. Ceci est problématique car différentes entrées synaptiques peuvent avoir des propriétés physiologiques divergentes; Par conséquent, leur co-stimulation peut conduire à une mauvaise caractérisation de la physiologie synaptique.
L’avènement de l’optogénétique, le codage génétique de protéines membranaires photosensibles (opsines) telles que la channelrhodopsine-2 (ChR2), a permis une vaste expansion des possibilités d’étude des projections synaptiques isolées entre les régions du cerveau10,11. Nous décrivons ici une solution généralisable et peu coûteuse pour étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme. Les constructions optogénétiques sont délivrées de manière très spécifique à l’aide de vecteurs viraux permettant un contrôle extrêmement précis de la région pré-synaptique d’intérêt. Les projections efférentes exprimeront le canal activé par la lumière permettant l’activation de ces fibres dans une région cible. Ainsi, les voies anatomiquement diffuses à longue portée qui ne peuvent pas être activées indépendamment par une stimulation électrique traditionnelle et non spécifique peuvent être étudiées.
Nous décrivons, à titre d’exemple, la transduction du cortex préfrontal médian (mPFC) avec des virus adéno-associés (AAV) codant pour les opsines des canaux cationiques excitateurs. Nous décrivons ensuite la préparation de tranches aiguës à partir du cortex entorhinal latéral (LEC), les enregistrements patch-clamp des neurones pyramidaux LEC de couche 5 et l’activation évoquée par la lumière des projections glutamatergiques mPFC-LEC (Figure 1). Nous décrivons également l’évaluation histologique du site d’injection pour confirmer l’emplacement de la région d’intérêt pré-synaptique et l’identification de la morphologie cellulaire post-synaptique.
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Protocol
Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément à la loi britannique sur les procédures scientifiques relatives aux animaux (1986) et aux directives connexes ainsi qu’aux directives institutionnelles locales.
1. Injection virale stéréotaxique
REMARQUE: Le protocole actuel exige une spécificité anatomique, mais pas de type de cellule post-synaptique.
- Choisissez l’animal approprié. Des rats à capuchon Lister mâles de type sauvage ont été utilisés dans ce protocole (300-350 g, âgés d’environ 3 mois).
- Choisissez la construction virale appropriée. Il y a plusieurs facteurs à considérer (voir la discussion). Le protocole actuel utilise un virus pour exprimer le canal optogénétique ChETATC 12, pour transduire les neurones excitateurs (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titre: 3,3 x10 13 génomes viraux/mL).
- Établir les coordonnées et le volume d’injection à l’aide d’un atlas cérébral tel que décrit précédemment35.
- Injection stéréotaxique de la préparation virale
REMARQUE : Toutes les directives nationales et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation et les soins des animaux doivent être suivies. Les vecteurs viraux sont injectés stéréotaxiquement comme décrit précédemment13 avec les modifications suivantes.- Gardez la préparation virale sur la glace pendant l’anesthésie et la préparation de l’animal.
- Induire l’anesthésie dans une chambre d’induction anesthésique avec 4% d’isoflurane. Surveiller le niveau d’anesthésie indiqué par une respiration régulière plus lente (1 Hz) et l’absence de réflexes pédales et cornéens (test en pinçant les orteils et en touchant légèrement le coin de l’œil, respectivement; aucune réponse ne doit être détectée).
- Administrer un analgésique préopératoire tel que le méloxicam au moins 30 minutes avant la procédure invasive.
- Lorsque l’animal est complètement anesthésié, utilisez des tondeuses pour enlever la fourrure du cuir chevelu. Basculez le flux d’isoflurane vers le cône de nez du cadre stéréotaxique et montez le rat dans le cadre. Appliquez un gel lubrifiant pour les yeux sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant la procédure.
- La chirurgie doit être entreprise dans des conditions aseptiques. Utilisez des gants et des instruments stériles tout au long de la procédure. Appliquez une pommade à la lidocaïne (5% p / p) avant de désinfecter le cuir chevelu avec une solution de chlorhexidine à 4% p / v, puis couvrez le corps avec un champ stérile. À l’aide d’un scalpel, faites une incision longitudinale d’environ 15 mm de longueur sur le cuir chevelu pour exposer le bregma.
- Chargez une seringue Hamilton dans une pompe à seringue à microinjection fixée à un bras mobile monté sur le cadre stéréotaxique.
- Placez une partie aliquote de 5 μL du virus dans un tube de 0,2 mL et faites tourner pendant quelques secondes jusqu’à ce que tout le volume soit dans le fond du tube. Pipeter 2 μL de la préparation virale dans le couvercle du tube.
- Remplissez la seringue avec la préparation virale en regardant d’abord l’extrémité de l’aiguille avec un microscope chirurgical, puis placez manuellement le bolus du virus à l’extrémité de l’aiguille et retirez le piston de la seringue à l’aide des commandes de la pompe.
- Réglez le volume d’injection de la pompe à 300 nL et le débit à 100 nL/min. Faites fonctionner la pompe et confirmez le bon débit en observant la gouttelette du virus à l’extrémité de l’aiguille. Absorbez le virus sur un coton-tige et nettoyez délicatement l’aiguille avec de l’éthanol à 70%.
- À l’aide des vis de réglage sur le cadre stéréotaxique, naviguez la pointe de l’aiguille vers le bregma (le point sur le crâne où les sutures coronales et sagittales se rencontrent) et notez les mesures stéréotaxiques observées sur les trois échelles de vernier sur le cadre. Les coordonnées relatives au bregma du mPFC chez le rat sont antéro-postérieur + 3,1 mm, médiolatéral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm ; Ajoutez/soustrayez (comme indiqué) ces distances des coordonnées de Bregma, puis naviguez l’aiguille vers les coordonnées antérieure-postérieure et médiolatérale et abaissez doucement l’aiguille sur la surface du crâne.
NOTA: Les coordonnées mPFC indiquées ci-dessus sont appropriées pour les rats à capuchon mâles de 300 à 350 g; les changements dans la souche et la taille du rat peuvent nécessiter des modifications de ces coordonnées (voir la discussion). - Soulevez l’aiguille de la surface du crâne et marquez ce point avec un marqueur permanent à pointe fine. Faites un trou de bavure à cet endroit à l’aide d’une micro-perceuse montée sur le bras stéréotaxique.
- Insérez l’aiguille dans le cerveau à la coordonnée dorso-ventrale prédéterminée et perfuser un volume prédéterminé (pour mPFC: 300 nL). Laisser l’aiguille in situ pendant 10 min pour permettre la diffusion du bol alimentaire. Lors du retrait de l’aiguille, faites fonctionner la pompe pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bloquée.
REMARQUE : Insérez et retirez l’aiguille lentement (~3 mm/min) pour minimiser les dommages au tissu cérébral et le reflux du virus dans le tractus de l’aiguille. - Administrer 2,5 mL de solution de chlorure de sodium réchauffé (0,9 % p/v) et de glucose (5 % p/v) par voie sous-cutanée pour maintenir l’hydratation.
- Répétez l’étape 1.4.12. pour le deuxième hémisphère.
- Suturer l’incision du cuir chevelu et, à la fin de la procédure, administrer 2,5 mL de chlorure de sodium et de solution de glucose et un analgésique approprié, recommandé par l’institution, pour la gestion de la douleur, par exemple la buprénorphine ou le méloxicam. Ne laissez pas l’animal sans surveillance pendant qu’il est inconscient. Placez le rat dans une boîte de récupération chauffée jusqu’à ce qu’il reprenne complètement conscience. Ne retournez dans la cage familiale avec d’autres animaux qu’une fois complètement rétablis.
- Suivez les lignes directrices de l’établissement pour les soins postopératoires et les procédures d’hébergement pour les rongeurs transfectés par viraux. Attendez au moins 2 semaines que le transgène d’opsine s’exprime adéquatement avant de commencer l’expérience.
REMARQUE: Le temps nécessaire à la transduction dépend de la distance et de la force de la connexion entre les régions pré et post-synaptiques. Pour mPFC à LEC, 4-6 semaines sont nécessaires.
2. Préparation de tranches de cerveau aiguës
REMARQUE: Nous décrivons ici une méthode simple pour la préparation de tranches de cerveau qui, entre nos mains, est suffisante pour obtenir des tranches corticales, hippocampiques et thalamiques de haute qualité provenant de souris et de rats adultes.
- Préparer les solutions pour la dissection.
- Remplir un bécher de 250 mL avec ~200 mL de solution de coupe de saccharose glacée (189 mM de saccharose, 26 mM de NaHCO3, 10 mM de D-glucose, 5 mM de MgSO 4, 3 mM de KCl, 1,25 mM de NaH 2 PO4 et 0,2 mM de CaCl 2 fabriqué dans de l’eau ultrapure (UPW) avec une résistivité de 18,2 MΩ cm à 25 °C) ou un volume suffisant pour remplir la chambre tissulaire du vibratome. Buller avec du carbogène (95% O 2, 5% CO2) et garder sur la glace.
- Remplir une tranche de la chambre de collecte avec du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucose,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 et 1 mM MgSO4 fabriqué en UPW) à température ambiante, bulle de carbogène. La chambre de collecte des tranches14 est fabriquée sur mesure à partir d’un support de tubes microcentrifugés collés sur une feuille de maille de nylon et placés dans un bécher dans lequel il est immergé dans un CSF (Figure 2A).
- Remplir un tube de 50 mL avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O et 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
ATTENTION : Le PFA est toxique. Utiliser dans la hotte.
- Dissection du cerveau.
- Anesthésier le rat dans une chambre à induction en utilisant 5% d’isoflurane jusqu’à ce que la respiration soit lente et régulière (~1 Hz). Assurer un niveau suffisant de test d’anesthésie pour l’absence de réflexes pédales et cornéens.
- Décapitez l’animal à l’aide d’une guillotine.
- Disséquer rapidement tout le cerveau comme décrit précédemment15 et transférer dans une solution de coupe de saccharose. Terminez l’étape dans les 90 s suivant la décapitation pour une bonne qualité de tranche et un enregistrement complet réussi.
- À l’aide d’une cuillère à café en métal, ramassez le cerveau, jetez l’excès de solution de coupe et placez-le sur un morceau de papier filtre sur la paillasse.
- À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, retirez rapidement le cervelet et coupez le cerveau dans le plan coronal environ à mi-chemin sur sa longueur; la moitié postérieure est le bloc tissulaire LEC. Assurez-vous d’inclure un excès de tissu en plus de la région à trancher pour les prochaines étapes. Retournez à la fois ce bloc tissulaire et le reste du cerveau à la solution de coupe de saccharose.
- Déposer une goutte de colle cyanoacrylate sur une scène de tissu de vibratome. Étalez-le en une fine couche avec une zone légèrement plus grande que le bloc de tissu créé à l’étape précédente.
- Ramassez le bloc de tissu LEC à l’aide d’une cuillère à café, jetez l’excès de solution et transférez-le sur le patch de colle de sorte que la coupe coronale antérieure ait adhéré.
- Installez la scène dans la chambre tissulaire du vibratome et versez rapidement une quantité suffisante de solution de coupe de saccharose pour submerger le tissu; Buller cette solution avec du carbogen. Orientez le bloc tissulaire LEC avec la surface ventrale vers la lame. Bien que l’éclairage ambiant de la pièce soit insuffisant pour activer l’opsine, évitez d’utiliser des sources lumineuses supplémentaires qui pourraient être présentes sur le vibratome.
- Couper des tranches de 350 μm d’épaisseur du ventral au dorsal en utilisant une vitesse d’oscillation élevée de la lame (100 Hz) et une vitesse d’avancement lente de la lame (0,06 mm/s). En règle générale, sept tranches LEC peuvent être obtenues par hémisphère.
- Transférer les tranches dans la chambre de collecte des tranches. Une fois la collecte des tranches terminée, transférer la chambre de collecte dans un bain-marie à 34 °C pendant 1 h avant de revenir à température ambiante. Bulle avec carbogen en continu. Les tranches seront suffisamment saines pour être enregistrées pendant au moins 6 h.
- Placer le reste du cerveau dans du PFA pendant 48 heures pour un examen post-hoc du site d’injection (voir rubrique 4).
3. Électrophysiologie et stimulation optogénétique
- Identification de la cellule cible.
- Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement immergée à 34 °C perfusée avec du LCa à un débit de 2 mL/min par une pompe péristaltique. Immobiliser la tranche à l’aide d’une ancre de tranche.
- Sous l’objectif à faible grossissement (4x) d’un microscope grand champ utilisant un éclairage infrarouge oblique, naviguez jusqu’à la couche LEC 5. Mesurez la distance entre la surface de la pile et la couche requise.
REMARQUE : L’éclairage infrarouge oblique a été obtenu en positionnant une LED proche infrarouge à environ 3 mm sous le couvercle de la chambre d’enregistrement à un angle de ~55° par rapport au plan de la lamelle de couverture (figure 2B). Le contraste interférentiel différentiel est une technique d’imagerie alternative et couramment utilisée pour l’électrophysiologie des coupes. - Passez à un objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement (40x) et identifiez les neurones pyramidaux. Marquez la position de la cellule sur l’écran de l’ordinateur avec du ruban adhésif.
NOTE: Les neurones pyramidaux ont une morphologie à peu près triangulaire avec des dendrites apicales proéminentes projetant vers la surface piale de la tranche (Figure 3A). La santé cellulaire peut être évaluée par l’absence d’un noyau condensé et visible et l’inspection de la membrane plasmique qui devrait apparaître lisse. Il est peu probable que le marquage fluorescent clair des axones par la protéine de fusion opsine-fluorophore soit visible lors de l’utilisation d’un microscope à fluorescence à grand champ. Pour visualiser les projections axonales, effectuer une immunohistochimie post-hoc en utilisant un anticorps primaire contre le fluorophore de l’opsine et amplifier avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore de longueur d’onde identique ou similaire.
- Formation de patch-clamp à cellules entières.
- Fabriquer une micropipette en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de pipette et remplir avec une solution d’enregistrement intracellulaire filtrée (120 mM de k-gluconate, 40 mM HEPES, 10 mM de KCl, 2 mM de NaCl, 2 mM de MgATP, 1 mM de MgCl, 0,3 mM de NaGTP, 0,2 mM d’EGTA et 0,25 % de biocytine fabriquée en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Placez la micropipette remplie dans le porte-électrode sur la tête de l’amplificateur à pince patch en veillant à ce que le fil d’électrode soit en contact avec la solution intracellulaire.
- Appliquez une pression positive par la bouche en soufflant fort dans un embout buccal (comme une seringue de 1 mL avec le piston retiré) relié par un tube à l’orifice latéral du porte-électrode et maintenez la pression en fermant une valve à trois voies en ligne. Soulevez l’objectif du microscope de telle sorte qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle puisse être vue au microscope.
- Ouvrez la fenêtre Test d’étanchéité dans WinLTP16 (ou un autre logiciel d’acquisition/oscilloscope) et avec l’amplificateur en mode tension-pince, appliquez une impulsion carrée de 5 mV pour déterminer si la résistance de la pipette est de 3 à 6 MΩ.
- Approchez et touchez la cellule identifiée avec l’embout de la pipette; cela devrait entraîner une indentation dans la membrane cellulaire (Figure 3A; panneau de droite) et une légère augmentation de la résistance de la pipette (0,1 MΩ).
- Relâchez la pression positive et appliquez une pression négative en appliquant une aspiration modérée à l’embout buccal; cela devrait entraîner une augmentation considérable de la résistance des pipettes (>1000 MΩ). La pression peut maintenant être laissée neutre. Appliquez une pression négative dans une rampe progressivement croissante jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière.
- Enregistrer les événements synaptiques évoqués optogénétiquement.
- Entrez la configuration de la pince de courant.
REMARQUE : Dans la plupart des cas, la transmission synaptique à longue distance est glutamatergique, par conséquent, l’enregistrement à des potentiels membranaires proches du potentiel d’inversion du chlorure permettra d’isoler au mieux la transmission médiée par le récepteur AMPA (AMPAR) et de minimiser la mesure de toute inhibition du flux vers l’avant (FFI) évoquée. L’inversion du chlorure dépend de la composition de la solution d’enregistrement intracellulaire et du LCa et peut être calculée à l’aide de l’équation de Goldman-Hodgkin-Katz; pour les solutions ci-dessus, il s’agissait de -61,3 mV. Les neurones pyramidaux LEC de couche 5 avaient un potentiel membranaire au repos moyen de -62 mV et, si nécessaire, étaient maintenus à ce potentiel par injection de courant constant. Alternativement, les cellules peuvent être serrées en tension au potentiel souhaité. Pour enregistrer des projections inhibitrices à longue portée16 ou pour enregistrer FFI, pince de tension au potentiel d’inversion cationique pour isoler la conductance du chlorure GABAergique. Lorsque les neurones de serrage de tension à des potentiels membranaires supérieurs au seuil de potentiel d’action, une solution intracellulaire à base de césium contenant des inhibiteurs des canaux sodiques voltage-dépendants est utilisée pour améliorer la pince de tension et empêcher l’initiation des potentiels d’action (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 chlorure,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% de biocytine fabriquée en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). - À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données, envoyez des signaux de logique transistor-transistor (TTL) à un pilote LED pour activer une LED 470 nm montée. La LED montée est dirigée dans le trajet lumineux du microscope à l’aide de cubes filtrants et d’optiques appropriées (Figure 2B) pour appliquer des impulsions lumineuses à la tranche via l’objectif 40x pour évoquer des potentiels post-synaptiques optogénétiques (oEPSP).
REMARQUE: Les impulsions lumineuses peuvent être appliquées périsomatiquement / sur les dendrites, ce qui entraînera l’activation des opsines dans les axones et le bouton présynaptique, ou l’investigateur peut déplacer l’objectif vers les axones loin de la cellule enregistrée pour éviter la stimulation par sur-bouton (voir Discussion). L’amplitude maximale de l’oEPSP dépend de la force de la projection synaptique, de l’efficacité des injections virales et de l’opsine utilisée. les oEPSP peuvent être titrés à l’amplitude souhaitée en faisant varier l’intensité et/ou la durée de la lumière18; La variation de la durée des impulsions lumineuses (durée typique comprise entre 0,2 et 5 ms à la puissance maximale de sortie de la LED, ce qui donne une densité lumineuse de 4,4 mW/mm19) donne des amplitudes oEPSP plus constantes que la modification de la puissance de sortie de la LED. - Étudier les propriétés de libération présynaptique (changement de tension) en délivrant des trains d’impulsions lumineuses multiples avec différents intervalles inter-stimulus (figure 3E); Des précautions doivent être prises lors de l’interprétation de la transmission optogénétiquement évoquée (voir Discussion).
- Étudier la plasticité à long terme soit en évoquant de manière répétitive les oEPSP19 ou en appliquant des ligands. Surveillez l’amplitude oEPSP pendant 5 à 10 minutes pour assurer la stabilité avant l’induction de la plasticité, puis surveillez jusqu’à ce qu’une amplitude stable soit atteinte (généralement 30 à 40 minutes).
REMARQUE: La plupart des opsines actuelles ne sont pas capables d’évoquer de manière fiable des potentiels d’action multiples à des fréquences élevées, par exemple, 100 stimuli délivrés à 100 Hz, comme c’est généralement le cas pour induire la LTP. - Pour confirmer que les EPSP sont monosynaptiques, effectuer une activation sur-bouton de la voie transduite en positionnant l’objectif au-dessus de la tonnelle dendritique et en stimulant en présence de tétrodotoxine 0,5 μM et d’aminopyridine 100 μM. L’application de tétrodotoxine abolira la transmission si les réponses dépendent du potentiel d’action et l’inclusion subséquente d’aminopyridine rétablira partiellement la transmission si les PSEP sont générées de manière monosynaptique19,20.
- Pour permettre à la biocytine de remplir le neurone, attendez au moins 15 minutes après être entré dans la configuration de la cellule entière. Dans la pince de tension, surveillez la capacité de la membrane et la résistance d’entrée.
- Retirez lentement la pipette le long de l’angle d’approche loin du soma de la cellule, en observant la lente disparition des transitoires capacitifs et du courant membranaire indiquant le re-scellement de la membrane cellulaire et la formation d’un patch extérieur à l’extrémité de la pipette. Notez l’orientation de la tranche et l’emplacement de la ou des cellules dans la tranche. Mettre la tranche dans PFA dans une plaque de 24 puits et incuber pendant la nuit à 4 °C, puis transférer à 0,1 M PB.
REMARQUE: Les tranches peuvent être stockées jusqu’à une semaine. Si un stockage plus long est nécessaire, changez le PB régulièrement ou utilisez du PB contenant de l’azoture de sodium (0,02% -0,2% d’azoture de sodium).
- Entrez la configuration de la pince de courant.
4. Histologie
- Site d’injection de tranchage
- Après la fixation, cryoprotéger le tissu dans 30% de saccharose (p/v) dans PB jusqu’à ce qu’il coule (il flottera initialement dans la solution de saccharose), généralement pendant la nuit à température ambiante ou 24-48 h à 4 ° C.
- À l’aide d’un milieu à température de coupe optimale (TCM), fixer un bloc de tissu au disque de l’échantillon cryostatique. Congeler le bloc tissulaire en suivant les étapes 4.1.3 à 4.1.4.
- Placer l’isopentane dans un contenant approprié. Immergez uniquement le disque de l’échantillon, en vous assurant que le tissu est au-dessus du niveau de l’isopentane. Abaissez le récipient d’isopentane dans de l’azote liquide (ou de la glace sèche) et laissez le tissu geler.
- Une fois complètement congelé (le bloc tissulaire entier devient pâle et dur), laissez le bloc tissulaire dans la chambre du cryostat à -20 °C pendant 30 minutes pour permettre à la température du bloc de s’équilibrer.
- Couper des profilés de 40 μm d’épaisseur dans le cryostat à -20 °C. Utilisez un pinceau fin pour guider les sections de la lame. Collez les sections congelées à une lame de microscope en verre revêtue de poly-L-lysine à température ambiante en touchant la lame aux sections.
- Ajouter environ 150 μL de support de montage à chaque glissière et couvrir avec une lame; Retirez les bulles d’air en appuyant doucement sur la lamelle de couverture. Couvrir les lames pour les protéger contre le photoblanchiment et sécher à l’air libre à température ambiante pendant au moins 12 h (ou toute la nuit). À l’aide d’un microscope à fluorescence, examiner l’emplacement du site d’injection virale.
- Protocole de coloration à la biocytine
REMARQUE : Ce protocole peut être appliqué à des sections épaisses ; Les tranches n’ont pas besoin d’être resectionnées.- Laver les tranches de cerveau avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 et 1,8 mM KH2PO4) six fois pendant 10 minutespar lavage. Utilisez une pipette de transfert pour vider les puits après chaque étape.
- Incuber les tranches dans 3% H 2 O2(p / v) dans PBS pendant 30 min pour bloquer toute activité endogène de la peroxydase. Cela génère des bulles d’oxygène.
- Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage ou jusqu’à ce qu’aucune autre bulle d’oxygène ne soit visible. Incuber les tranches de cerveau dans une solution de complexe HRP (ABC) biotinylé à 1% (v / v) dans du PBS contenant 0,1% (v / v) Triton X-100 à température ambiante pendant 3 heures.
- Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage.
- Incuber chaque tranche dans une solution de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la coloration biocytine des structures neuronales devienne visible (prend environ 5-10 min).
ATTENTION : Le DAB est toxique. Utiliser dans la hotte.
REMARQUE: Les temps d’incubation DAB peuvent être imprévisibles, surveillez de près le tissu au fur et à mesure que la couleur se développe. - Arrêter la réaction en transférant les tranches dans du PBS froid (4 °C). Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage. Utilisez un pinceau pour monter les tranches de cerveau sur des lames de microscope en verre revêtu de poly-L-lysine.
- Enlevez tout excès de PBS avec un mouchoir propre. Couvrir chaque tranche avec environ 200 μL de support de montage; Couvrir avec des lamelles de couverture et appuyer doucement sur la lamelle de couverture pour expulser les bulles d’air. Sécher à l’air libre à température ambiante pendant au moins 12 h (ou toute la nuit). À l’aide d’un microscope optique, examiner l’emplacement et les détails morphologiques de la ou des cellules.
REMARQUE: La biocytine peut également être visualisée à l’aide de streptavidine conjuguée au fluorophore; Cependant, l’imagerie peut nécessiter une résection ou l’utilisation d’un microscope confocal21.
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Representative Results
Dans ce protocole, nous décrivons comment étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme en utilisant l’administration virale de constructions optogénétiques. Le protocole peut être très facilement adapté à l’étude de presque toutes les connexions à longue distance dans le cerveau. À titre d’exemple, nous décrivons l’injection d’AAV codant pour une opsine dans le mPFC du rat, la préparation de tranches aiguës à partir de LEC, les enregistrements patch-clamp à partir de neurones pyramidaux LEC de couche 5 et l’activation évoquée par la lumière des terminaux mPFC dans LEC (Figure 1).
Une cellule pyramidale saine a été localisée et rapiécée (p. ex. figure 3A). Dans l’exemple actuel de mPFC à LEC, les cellules post-synaptiques n’étaient pas marquées ; si l’identification post-synaptique de la cellule est requise, une cellule exprimant le marqueur fluorescent doit être localisée à l’aide d’une optique à grand champ (p. ex. figure 3B). La santé de la cellule doit être évaluée par optique infrarouge avant l’expérimentation. Pour activer les axones mPFC dans la LEC, une LED a été placée directement sur les soma cellulaires de couche 5 et les dendrites proximales via l’objectif du microscope (Figure 1), des impulsions lumineuses uniques de 2 ms ont donné des oEPSP de forme d’onde simples (Figure 3C); l’amplitude de crête de l’oEPSP peut être mesurée. Pour examiner la plasticité à court terme de la synapse, des trains de stimulation lumineuse de 5, 10 et 20 Hz ont été appliqués (Figure 3E). Pour étudier la plasticité à long terme, après avoir surveillé l’amplitude initiale de l’oEPSP pendant 10 minutes, l’agoniste cholinergique, le carbachol, a été ajouté au aCSF circulant pendant 10 min. Cela a provoqué une dépression à long terme qui était encore évidente 40 minutes après le retrait du ligand (Figure 3D).
À la suite d’expériences d’enregistrement électrophysiologique, le tissu cérébral contenant le site d’injection virale a été sectionné et la longueur du site d’injection a été examinée (figure 4A). Le rapporteur fluorescent, mCherry, est localisé dans les couches plus profondes du cortex prélimbique et infralimbique (régions constitutives du mPFC chez les rongeurs). Ces couches ont été ciblées car il a été démontré que la projection vers LEC provenait principalement des couches corticales plus profondes22. Des fibres positives mCherry peuvent également être vues rejoignant le tractus de substance blanche. Dans le cadre d’une expérience pilote visant à optimiser l’implantation des injections virales, des sections de 40 μm de LEC ont été prélevées et examinées; Les fibres positives mCherry peuvent être vues dans la couche 5 de LEC (Figure 4B). Enfin, la cellule remplie de biocytine a été colorée, ce qui a permis de confirmer son emplacement et sa morphologie (Figure 4C,D).
Figure 1 : Vue d’ensemble expérimentale. (A) Schéma de l’injection de vecteurs viraux dans le cortex préfrontal médian (mPFC), de la transduction des cellules mPFC avec construction optogénétique et du transport de la construction vers les terminaux du cortex entorhinal latéral (LEC). (B) Représentation schématique de l’enregistrement de cellules entières à partir de neurones pyramidaux de couche 5 dans une tranche LEC aiguë et activation lumineuse des terminaux mPFC via un objectif de microscope. Abréviations : CA = cornu ammonis ; PERI = cortex périrhinal; TR = région de transition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Chambre de collecte des tranches et configuration optique pour les enregistrements visualisés de cellules entières, l’excitation optogénétique et l’identification des neurones tdTomato positifs. (A) La chambre de collecte des tranches14 est fabriquée sur mesure à partir d’un support à tubes microcentrifugés collé sur une feuille de maille de nylon et placé dans un bécher dans lequel il est immergé dans un aCSF (B ) Les LED pour l’excitation de ChR2 (470 nm) et tdTomato (565 nm) sont dirigées à travers une lentille asphérique à condensateur pour collimater la lumière, la lumière de 565 nm est transmise à travers un filtre passe-bande pour obtenir une séparation spectrale des spectres d’excitation et d’émission tdTomato. Ceux-ci sont combinés avec un miroir dichroïque passe-long et dirigés vers la tranche avec un second miroir dichroïque passe-long d’une longueur d’onde plus longue. La lumière est ensuite focalisée sur la tranche via l’objectif objectif. Dans les expériences où des neurones marqués par tdTomato sont présents, la lumière fluorescente émise traverse le miroir dichroïque et le filtre d’émission et est focalisée sur le capteur de la caméra par une lentille achromatique. Les caractéristiques non fluorescentes de la tranche sont visualisées par une lumière oblique réfractée proche infrarouge (NIR) appliquée sous la chambre de tranche; cette lumière transmet l’optique à la caméra, éliminant ainsi le besoin de changer de cube filtre entre l’imagerie fluorescente et l’imagerie NIR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Visualisation des neurones sous imagerie NIR/fluorescente et exemples représentatifs d’oEPSP. (A) À gauche : Exemple de neurone à morphologie pyramidale visualisé avec la lumière NIR. À droite : Même neurone avec la formation d’une fossette concave causée par la pression positive de la pipette patch. (B) Expression dépendante de la cre-recombinase de tdTomato dans un seul neurone. (C) Représentant oEPSP de la couche LEC 5 dans la cellule pyramidale. (D) Exemple d’expérience de plasticité à long terme de surveillance de l’EPSP dans le temps après addition de 10 μm de carbachol (CCh). La ligne pointillée indique l’amplitude moyenne de l’OESP au cours de la période de référence avant l’ajout de médicaments. (E) Des traces représentatives de trains de stimulation à 5, 10 et 20 Hz. Les flèches bleues indiquent l’activation de la lumière. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vérification histologique du site d’injection et récupération de la cellule remplie de biocytine. (A) Photomicrographie coronale montrant le site d’injection virale dans mPFC, +3,00 mm du bregma. (B) Fine section coronale de LEC illustrant les fibres mCherry+. (C) Image de faible puissance d’une tranche aiguë de 350 μm d’épaisseur, -6,2 mm à partir de bregma, avec cellule pyramidale remplie de biocytine dans la LEC. La boîte en pointillés est représentée à un grossissement plus élevé dans la cellule pyramidale D. (D) LEC; La dendrite apicale peut être vue à droite de l’image se dirigeant vers la couche 1. Les lignes pointillées indiquent les frontières régionales. Abréviations : IL = cortex infralimbique; PL = cortex prélimbique; wm = substance blanche. Barres d’échelle = 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici décrit une méthode pour explorer des projections synaptiques à longue distance très spécifiques en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique pour délivrer des AAV codant pour des constructions optogénétiques et d’électrophysiologie dans des coupes cérébrales aiguës (Figure 1). Ensemble, ces techniques offrent des outils pour caractériser la physiologie et la plasticité des circuits cérébraux avec une grande précision dans des voies à longue portée et anatomiquement diffuses qui étaient auparavant inaccessibles en utilisant la stimulation électrique traditionnelle et non spécifique. La combinaison avec des marqueurs moléculaires spécifiques aux cellules permet de caractériser les projections d’une région du cerveau vers différentes populations cellulaires définies dans une autre région23.
Pour tirer pleinement parti de la grande précision de cette technique, il est essentiel de vérifier la spécificité des parcours. Cela se fait en plusieurs étapes; Pendant l’enregistrement, s’assurer que la synapse étudiée est monosynaptique (étape 3.3.5). Ensuite, examiner histologiquement le site d’injection pour s’assurer que le virus est confiné à la région d’intérêt pré-synaptique prévue et évaluer l’emplacement et la morphologie de la cellule post-synaptique colorée à la biocytine pour s’assurer qu’elle est conforme aux prévisions.
Sélection du virus et réalisation de la spécificité cellulaire
La technique est hautement adaptable et convient à une utilisation chez les souris et les rats. Des expériences nécessitant une spécificité anatomique peuvent être réalisées avec des rongeurs de type sauvage. Les expériences nécessitant une spécificité post-synaptique du type de cellule peuvent nécessiter une souche de rongeur génétiquement modifiée si les cellules ne sont pas identifiables en fonction de la morphologie ou de l’emplacement. Par exemple, pour cibler les interneurones exprimant la parvalbumine (PV), une lignée de souris transgéniques PV-Cre dans laquelle la Cre-recombinase est exprimée dans les neurones exprimant PV pourrait être utilisée. Pour visualiser ces cellules, la lignée PV-Cre peut être croisée avec une lignée de souris rapporteure pour exprimer une protéine fluorescente après une recombinaison médiée par Cre. Alternativement, un gène rapporteur fluorescent Cre-dépendant peut être introduit par voie virale. Les protéines de fusion ChR2-fluorophore sont limitées à la membrane cellulaire et peuvent apparaître comme un contour du neurone lorsqu’elles sont observées par microscopie à grand champ dans des tranches aiguës, ce qui rend l’identification des cellules pour l’enregistrement des cellules entières plus difficile que l’utilisation de fluorophores cytosoliques. Si ChR2 est utilisé pour identifier les cellules, la séparation de ChR2 et du fluorophore peut être réalisée à l’aide de vecteurs bicistroniques24. Si vous utilisez un rapporteur fluorescent pour identifier les neurones cibles pour l’enregistrement de cellules entières, sa longueur d’onde d’excitation ne devrait idéalement pas chevaucher la longueur d’onde d’activation de l’opsine; Cela évitera l’activation prolongée des afférences transduites lors de la recherche de neurones à enregistrer. De même, les rapporteurs pré-et post-synaptiques devraient être séparés spectralement. Les rapporteurs courants sont mCherry, la protéine fluorescente verte (GFP) et la protéine fluorescente jaune améliorée (eYFP).
La construction virale utilisée comporte plusieurs composantes différentes, chacune pouvant avoir un impact sur le succès de l’expérience et il faut donc tenir compte de chaque élément. Une importance primordiale doit être accordée au choix de l’opsine. Pour l’activation présynaptique, l’opsine idéale a de grands photocourants (pour amener de manière fiable les axones au seuil de potentiel d’action), une cinétique et une cinétique rapide et un taux lent de désensibilisation pour permettre une stimulation répétée à haute fréquence. En règle générale, la cinétique rapide se fait souvent au détriment de photocourants plus petits25; Cependant, le criblage moléculaire et l’ingénierie ont fourni aux opsines de grands photocourants. Le protocole actuel utilise ChR2 (E123T / T159C) ChETATC12, mais Chronos 26, CheRiff 27, oChIEFAC28 et ChRmine 29 conviennent également. De plus, il existe des opsines excitatrices avec des longueurs d’onde d’activation décalées vers le rouge (ChrimsonR)26 ou violettes (CheRiff), qui peuvent être nécessaires pour éviter le chevauchement avec les spectres d’excitation des fluorophores utilisés pour l’identification cellulaire (voir ci-dessus).
Le sérotype des AAV peut affecter la capacité du vecteur à transduire différentes régions du cerveau et différents types de cellules, ainsi que l’étendue du transport axonal dans les directions antérograde et rétrograde30. Les sérotypes couramment utilisés pour la transduction neuronale sont 1, 2, 5, 8 et 9. Une recherche documentaire peut donner une indication du sérotype qui a été utilisé avec succès dans une région donnée. Par exemple, AAV9 a été recommandé pour la transduction des neurones corticaux31.
Le promoteur permet de spécifier le type de cellule dans lequel l’opsine sera exprimée. Les promoteurs se répartissent en plusieurs catégories. Les promoteurs généraux, par exemple CAG ou EF1a, entraînent une expression dans la plupart des types de cellules. Les promoteurs spécifiques aux neurones, par exemple la synapsine, génèrent une expression dans tous les types de neurones. CaMKIIa est couramment utilisé pour restreindre l’expression aux neurones excitateurs, bien qu’il ait été démontré qu’il fuyait – une certaine expression a été observée dans les interneurones32. L’élément amplificateur mDlx limite l’expression aux interneurones GABAergiques33. La spécificité du type de cellule pré-synaptique peut être obtenue à l’aide d’une lignée Cre-souris (comme décrit ci-dessus pour la cellule post-synaptique). Dans ce cas, une construction génétique Cre-dépendante sera nécessaire pour limiter l’expression de l’opsine aux cellules exprimant Cre.
Le titre est le nombre de particules virales dans la préparation virale. Encore une fois, une recherche documentaire peut donner une indication d’un titre qui a généré une transduction suffisante dans une région particulière. Lors de l’utilisation d’un système Cre-dépendant, le titre peut être particulièrement important car des titres viraux élevés peuvent transduire l’expression dans des cellules non exprimant Cre34.
Optimisation de la diffusion de virus
L’administration virale précise dans la région d’intérêt est d’une importance cruciale pour cette approche. Les coordonnées d’injection de la région pré-synaptique peuvent être estimées en consultant la littérature et/ou un atlas cérébral pour l’espèce appropriée35,36. L’expérimentateur doit ensuite prendre le temps d’optimiser et d’affiner les coordonnées précises et le volume d’injection utilisés pour s’assurer que l’injection virale est limitée à sa région présynaptique d’intérêt. Ceci est particulièrement important lorsque les régions voisines projettent également sur le site d’enregistrement. Nous recommandons d’utiliser de petits volumes du virus comme méthode efficace pour ce faire. Si un site d’injection particulièrement petit est nécessaire, l’utilisation de micropipettes en verre à la place d’une seringue et d’une aiguille peut être avantageuse13. Il est essentiel de laisser l’aiguille d’injection in situ pendant une période adéquate et de retirer lentement l’aiguille d’injection pour empêcher le virus de s’échapper dans le tractus de l’aiguille. Pour confirmer l’exactitude des injections, il est recommandé de vérifier histologiquement le site d’injection de chaque animal utilisé par électrophysiologie lorsque cela est possible et d’exclure les données où la transduction virale est hors cible. Entre nos mains, le protocole décrit ci-dessus s’est avéré généralisable à de nombreuses connexions à longue portée, y compris les projections des noyaux thalamiques ventrals médians, de l’hippocampe, du thalamus médiodorsal et du LEC au PFC; projections du PFC au LEC et au thalamus médiodorsal; projections des LEC et des noyaux thalamiques médians ventraux à l’hippocampe (laboratoire Zafar Bashir, Université de Bristol, observations non publiées19). Le marquage optogénétique de ces différentes voies n’a nécessité que l’affinement des coordonnées et des volumes d’injection.
Limitations du protocole
La dissection rapide du cerveau et un découpage soigneux sont d’une importance cruciale pour le succès de ces expériences. Le protocole de tranchage décrit ici donne des tranches aiguës saines sans adaptation aux différentes régions du cerveau; Cependant, la variation du milieu de tranchage et de la température d’incubation après le tranchage décrite ailleurs28 a été signalée pour améliorer davantage la santé des tranches. De plus, nous avons également pu prélever des tranches aiguës de deux régions du cerveau après la transduction virale d’une seule zone, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous avons constaté que dans les voies anatomiquement denses, des périodes aussi courtes que 7 jours entre la transduction virale et l’enregistrement sont suffisantes pour évoquer des EPSP robustes d’une ampleur appropriée pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières. Dans les projections à plus long terme ou plus clairsemées, des délais plus longs sont avantageux.
Il convient d’être prudent lors de l’interprétation des résultats de l’activité optogénétiquement évoquée, en particulier en ce qui concerne la plasticité à court terme. Des résultats antérieurs ont montré que la transmission optogénétiquement évoquée peut subir une dépression synaptique plus prononcée lors d’une stimulation répétée que la stimulation électrique, qui peut survenir en raison d’un certain nombre de facteurs. Tout d’abord, la désensibilisation à l’opsine25 peut entraîner une réduction du nombre d’axones présynaptiques, entraînant une réduction des réponses postsynaptiques. L’amélioration de la cinétique des canaux des opsines récemment découvertes et de celles ayant subi un génie moléculaire (voir ci-dessus) a considérablement contribué à atténuer les effets de la désensibilisation; cependant, la stimulation à 100 Hz reste hors de portée de nombreuses opsines, ce qui peut empêcher l’utilisation de certains protocoles d’induction de plasticité à long terme (bien que voir37). Deuxièmement, la cinétique lente des opsines peut élargir les potentiels d’action18 conduisant à une libération prolongée de l’émetteur et à une déplétion vésiculeuse; Cela peut également résulter de la perméabilité au calcium des opsines excitatrices11; Ces problèmes peuvent être atténués en évitant la photoactivation excessivedu bouton 38. Troisièmement, la transduction des neurones à l’aide de vecteurs AAV peut également entraîner une altération des propriétés de libération présynaptique dans certaines synapses; toutefois, cette situation peut être atténuée en utilisant le sérotypeAAV9 38. Malgré ces limitations, avec une utilisation prudente, l’activation optogénétique peut imiter la stimulation électrique19,38 et constitue donc un outil inestimable pour étudier la physiologie des voies synaptiques non étudiées. Nous notons également que les données présentées à la figure 3E évaluent la plasticité à court terme dans la pince de courant et sont donc sujettes à l’interaction des potentiels synaptiques et des propriétés intrinsèques de la membrane, ce qui peut être évité en effectuant des expériences équivalentes en tension-pince.
Orientations futures
La boîte à outils optogénétique en constante expansion a soulevé la possibilité d’appliquer cette technologie dans deux voies synaptiques dans la même préparation, en utilisant une paire d’opsines avec des spectres d’excitation divergents. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’une opsine ChrimsonR26, qui, contrairement à ChR2, est photoactivée par la lumière rouge de longueur d’onde. ChrimsonR conserve une faible sensibilité à la lumière bleue, donc pour éviter l’activation de voies transversales, il peut être utilisé en combinaison avec des opsines insensibles au rouge, qui sont décalées violet (CheRiff 27) et / ou ont des ordres de grandeur plus sensibles à la lumière bleue (Chronos26). Cela permet l’utilisation de stimuli de lumière bleu/violet qui sont trop faibles pour activer significativement ChrimsonR et donc permettre l’activation de deux voies39,40, ce qui peut augmenter le débit expérimental, permettre l’examen des interactions des voies convergentes et permettre la libération de neuromodulateurs à partir de sources endogènes 41.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la subvention Wellcome 206401/Z/17/Z. Nous tenons à remercier Zafar Bashir pour son mentorat expert et le Dr Clair Booth pour son assistance technique et ses commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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