Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.
Abstract
קיפול שגוי הקשור לגיל וצבירה של חלבונים פתוגניים אחראים למספר מחלות נוירודגנרטיביות. לדוגמה, מחלת הנטינגטון (HD) מונעת בעיקר על ידי חזרה על נוקלאוטידים CAG המקודדת מערכת גלוטמין מורחבת בחלבון הנטינגטון. לפיכך, עיכוב של צבירת פוליגלוטמין (polyQ) ובמיוחד, רעילות עצבית הקשורה לצבירה היא אסטרטגיה שימושית למניעת HD ותנאים אחרים הקשורים ל- polyQ. מאמר זה מציג פרוטוקולים ניסיוניים כלליים להערכת יכולת ההגנה הנוירו-טקטיבית של תרכובות בדיקה נגד HD באמצעות מודלים מבוססים של Caenorhabditis elegans מהונדסים של PolyQ. זן AM141 נבחר למבחן הצבירה של PolyQ, שכן ניתן להבחין בקלות בפנוטיפ הקשור לגיל של אגרגטים פלואורסצנטיים בדידים בדופן גופו בשלב הבוגר בשל ביטוי ספציפי לשריר של חלבוני היתוך polyQ::YFP. לעומת זאת, מודל HA759 עם ביטוי חזק של דרכי תנועה מורחבות polyQ בתאי עצב ASH משמש לבחינת מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית. כדי להעריך באופן מקיף את יכולת ההגנה הנוירו-הגנתית של תרכובות המטרה, תוצאות הבדיקה לעיל מוצגות בסופו של דבר כתרשים מכ"ם עם פרופיל של פנוטיפים מרובים באופן של השוואה ישירה וצפייה ישירה.
Introduction
ניוון עצבי מתקדם ב-HD כולל ציד מוטנטי פתוגני עם מתיחה חריגה של פוליQ המקודדת על ידי CAG trinucleotide חוזרת על 1,2,3. חלבוני ציד מוטנטיים עם יותר מ-37 חזרות על גלוטמין נוטים להצטבר ולהצטבר במוחם של חולי HD ומודלים של בעלי חיים 4,5, מה שמוביל בסופו של דבר לניוון עצבי6. למרות חוסר הבהירות לגבי התפקידים של אגרגטים polyQ בפתולוגיה של מחלות5, עיכוב של צבירת polyQ והרעילות הקשורה אליו היא אסטרטגיה טיפולית שימושית עבור HD ומחלות polyQ אחרות 4,7,8.
בשל השימור במסלולי איתות עצביים ובמודלים קלים לבנייה של מחלות מהונדסות, Caenorhabditis elegans נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל מרכזי לחקר הפרעות נוירולוגיות 9,10,11,12. לדוגמה, מודלים מהונדסים של C. elegans המבטאים הרחבות polyQ מועדות לצבירה יכולים לחקות באופן אובייקטיבי תכונות דמויות HD כגון אובדן תאי עצב סלקטיביים, היווצרות צבירה ציטופלסמית ופגמים התנהגותיים13. חקירת ההשפעות הפוטנציאליות של דגימות בדיקה כדי להפוך את הפנוטיפים הללו במודלים מבוססים של נמטודות פוליQ הובילה לזיהוי מגוון מועמדים טיפוליים מבטיחים, למשל, פוליסכרידים 7,14,15, אוליגוסכרידים16, מולקולות קטנות טבעיות 17,18, ותמציות צמחיות ונוסחאות19,20.
מתוארים כאן שני מודלים עיקריים של polyQ C. elegans ופרוטוקולים רלוונטיים ליישומים פוטנציאליים כפי שהודגם על ידי המחקר על אסטרגלן, רב-סוכר שבודד מ- Astragalus membranaceus7. עבור בדיקת הצבירה של polyQ ב- C. elegans, המודל המשמש הוא הזן המהונדס AM141, אשר מראה פונקטה פלואורסצנטית מפוזרת בשריר דופן גופה כאשר מגיעה לבגרות עקב הביטוי של חלבון ההיתוך Q40::YFP, מערכת פוליQ של 40 שאריות (polyQ40) שהתמזגה לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)21,22 . הזן HA759 שימש לבחינת ההישרדות העצבית וההתנהגות הכימואבואידנטית, שכן הוא מבטא הן את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) והן את Htn-Q150 (מערכת פולי-Q שמקורה בצידטין אנושי של 150 שאריות) בחוזקה בתאי עצב ASH אך חלשה בתאי עצב אחרים, וכתוצאה מכך נוצרה ניוון עצבי מתקדם ומוות של תאי ASH 7,13. סיכום מקיף של הפוטנציאל הנוירו-הגנתי של מועמדים טיפוליים מסופק על ידי שילוב תוצאות מבדיקות שונות.
Protocol
הערה: ראה טבלה 1 לקבלת המתכונים של פתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת חומרים לבדיקת ה-Caenorhabditis elegans
- תחזוקה של זני C. elegans
- השג את הזנים C. elegans (AM141 ו-HA759) ו-Escherichia coli (OP50 ו-NA22) (ראו טבלת החומרים).
- שמור על הנמטודות על לוחית גדילת הנמטודה (NGM) שנזרעה עם E. coli OP50 בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עבור AM14121 או 15 °C עבור HA75923.
- הכנת E. coli OP50 תרבית חיידקים
- בחרו מושבה בודדת של E. coli OP50 מתוך צלחת פס לוריא-ברטאני (LB) וחחסנו אותה ב-50 מ"ל של תרבית LB נוזלית.
- דגירה של חיידקי OP50 בשייקר ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד עד לצפיפות אופטית של כ-0.5 ב-570 ננומטר (OD570).
- אחסנו את תרבית החיידקים OP50 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בה תוך שבועיים.
- הכנת צלחות NGM עם חיידקי OP50
- הוסיפו 20 גרם אגר, 2.5 גרם של פפטון, 3.0 גרם NaCl ו-975 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לבקבוק אוטוקלאב של 1 ליטר. Autoclave ב 121 °C (64 °F) במשך 30 דקות.
- הניחו את בקבוק האגר הנוזלי NGM על הספסל כדי להתקרר ל-~60 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו את תמיסות המלאי הסטריליות הבאות: 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, ו-25 מ"ל של אשלגן פוספט אחד (pH 6.0).
- יוצקים 20 מ"ל של NGM לתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 90 מ"מ, ומשאירים את הצלחות על הספסל כדי להתקרר ולהתמצק. שמרו על הצלחות הפוכות ואפשרו להן להתייבש על הספסל בטמפרטורת החדר למשך יומיים.
- מחלקים 200 μL של תרבית החיידקים OP50 על כל צלחת NGM ומפזרים באופן שווה עם מוט ציפוי זכוכית סטרילי. סגרו את המכסים ודגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- אחסנו את צלחות ה-NGM שנזרעו עם OP50 בקופסת פלסטיק עם כיסוי בטמפרטורת החדר והשתמשו בהן תוך שבועיים.
- הכנת אוכלוסיית C. elegans המסונכרנת לגיל
- אספו נמטודות בוגרות גרבידיות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך דקה אחת. לשטוף שלוש פעמים ולהחיות את הנמטודות בחיץ M9.
- הוסיפו נפח שווה של תמיסת אקונומיקה והתסיסו בעדינות במשך 3-5 דקות. עקוב אחר ההלבנה כל 15 שניות תחת מיקרוסקופ ניתוח.
הערה: יש להכין את תמיסת ההלבנה טרייה לפני השימוש על ידי ערבוב נפחים שווים של 10% NaOCl ו-1 M NaOH (טבלה 1)20. - לאחר שרוב הנמטודות נשברות, עצרו את העיכול על ידי דילול עם חיץ M9. צנטריפוגה מהירה כדי להסיר את הסופרנאטנט ולהחזיר את הכדור למאגר M9 כדי לחזור על הכביסה שלוש פעמים.
- החייאת הכדור במדיום S. תנו לשאריות הנמטודות להתיישב בכוח הכבידה במשך 2-3 דקות בזמן שהביצים נשארות בסופרנאטנט.
- לשאוף את supernatant לתוך צינור microcentrifuge סטרילי חדש. לאסוף את הביצים על ידי צנטריפוגה ב 1000 × גרם במשך דקה אחת.
- משליכים כ-80% מהסופרנטנט ומעבירים את הביצים לבקבוקון סטרילי המכיל 20 מ"ל של מדיום S. מניחים את הבקבוקון בשייקר ומדגרים את הביצים למשך הלילה ללא מזון ב-120 סל"ד כדי להשיג נמטודות L1 מסונכרנות.
2. בדיקת צבירה של PolyQ
- הכנת נמטודות לבדיקת הצבירה של polyQ
- העבר 300-500 זחלי L1 מסונכרנים של AM141 לכל באר של צלחת של 48 בארות עם 500 μL של מדיום S המכיל OP50 (OD570 של 0.7-0.8) ו-5 מ"ג/מ"ל של אסטרגלן, בדרך כלל באר אחת לכל טיפול למשך נקודת זמן אחת.
- אטמו את הצלחת בפרפילם ודגרו ב-20 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד ל-24, 48, 72 ו-96 שעות.
- קוצרים את הנמטודות בצינור מיקרו-צנטריפוג' סטרילי של 1.5 מ"ל ושוטפים עם חיץ M9 >3 פעמים על ידי צנטריפוגה (1000 × גרם למשך דקה אחת) כדי להסיר את ה-OP50 הנותרים. בצעו מחדש את הנמטודות AM141 במאגר M9, ושמרו על מוכנותן לרכישת תמונה.
- רכישת תמונות פלואורסצנטיות וניתוח נתונים
הערה: הנתונים מנותחים באופן אוטומטי באמצעות מערכת הדמיה זו בעלת תוכן גבוה. אם התקן הדמיה אוטומטי אינו זמין, ניתן להשתמש בשיטה קונבנציונלית להכנת כרית אגרוז לרכישת תמונה כדי להשיג ביצועים דומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נפוץ 7,15,17 (ראה שלבים 3.2 ו-3.3).- העבר 10-15 נמטודות לתוך כל באר בלוח של 384 בארות (נפח סופי 80 μL לכל באר). הגדר 10 בארות משוכפלות לכל טיפול.
- הוסיפו 10 μL של 200 mM נתרן אזיד לכל באר כדי לשתק את הנמטודות ולאפשר להם להתיישב לתחתית (5-10 דקות).
- מקם את הצלחת במערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות (ראה טבלת החומרים למידע על מכשירים ותוכנה).
- פתח את תוכנת רכישת התמונה והגדר את הפרמטרים הבאים.
- פתח את חלון הגדרת רכישת הצלחת וצור ערכת ניסויים ושם חדשים.
- בחר הגדלה כ - 2x, חיבור מצלמה כ - 1 וסוג לוח כ - 384- צלחת.
- הגדר את הבארות והאתרים (אתר יחיד) לביקור.
- בחר את מסנן האיזותיוציאנט של פלואורסציין (FITC) ואפשר אפשרויות מיקוד מבוססות תמונה.
- הגדר את החשיפה כ - 300 אלפיות השנייה.
הערה: ניתן לבדוק ולהתאים את ההגדרות לעיל כדי למטב את פרמטרי ההדמיה. - שמור הגדרות רכישת תמונה ולחץ על הלחצן 'רכוש צלחת ' כדי לפעול.
- נתח את נתוני התמונה באמצעות תוכנת ניתוח התמונות.
- פתח את החלון נתוני לוח סקירה ובחר את לוחית הבדיקה לניתוח תמונה.
- לחץ פעמיים על בדיקה היטב כדי להציג את התמונה שלה.
- בחר את לספור גרעינים כשיטת הניתוח ולחץ על הלחצן קביעת תצורה של הגדרות כדי להוציא חלון עבור ההגדרות הבאות.
- הגדר את תמונת המקור מערוץ FITC ובחר באלגוריתם הסטנדרטי.
- הגדר את הפרמטרים של ניתוח התמונה באופן הבא: רוחב מינימלי משוער = 10 מיקרומטר (= 2 פיקסלים); רוחב מרבי משוער = 50 מיקרומטר (= 12 פיקסלים); עוצמה מעל רקע מקומי = 1,000-2,000 מדדים אפורים.
- בדוק את ההגדרות הנוכחיות כדי למטב את שיטת הניתוח.
- שמור את ההגדרות והפעל את הניתוח על כל הבארות.
הערה: לוקח ~ 20 דקות לסיים את הניתוח עבור צלחת אחת של 384 בארות. - ייצא את סך הגרעינים כמספר הכולל של צבירה Q40::YFP בכל באר.
- ספרו את מספר הנמטודות בכל באר.
- חשב את המספר הממוצע של צבירה Q40::YFP לכל נמטודה בכל קבוצה, והחיל עקומה לא ליניארית המתאימה לנתונים מכל נקודת זמן.
- חשב את מדד העיכוב באמצעות eq (1) להלן:
מדד עיכוב =
(1)
כאשרN שליטה ומדגם N הם המספר הממוצע של צברי Q40::YFP בקבוצות הבקרה והטיפול, בהתאמה.
(1)3. מבחני רעילות עצבית בתיווך PolyQ
- טיפול ב - C. elegans עם דגימות בדיקה
- כדי להכין נמטודות לבדיקת הרעילות העצבית של polyQ, העבירו 300-500 זחלי L1 מסונכרנים של HA759 לכל באר של צלחת בת 48 בארות עם 500 μL של מדיום S המכיל OP50 (OD570 של 0.7-0.8) ו-5 מ"ג/מ"ל של אסטרגלן, בדרך כלל שלוש בארות משוכפלות לכל טיפול.
- אטמו את הצלחת עם פרפילם ודגירה ב-15 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד למשך 3 ימיםו-23 ימים.
- לאסוף את הנמטודות על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3-5 פעמים עם חיץ M9. החייאת הנמטודות ב-M9 buffer לשימוש במבחני הישרדות עצביים והימנעות.
- הכנת כרית אגרוז
- הוסיפו 2 גרם אגרוז ל-100 מ"ל של חיץ M9 (2%, w/v) וחממו את תמיסת האגרוס במיקרוגל עד לכמעט רתיחה.
- מחלקים 0.5 מ"ל של אגרוז מומס על מרכז מגלשת זכוכית מיקרוסקופית בעובי 1 מ"מ הממוקמת בין שתי חתיכות של לוחות זכוכית בעובי 2 מ"מ. כסו בשקופית נוספת בצורה אנכית. לאחר שהאגרוזה מתקררת ומתמצקת, הסירו בעדינות את המגלשה העליונה.
- בדיקת הישרדות עצבית של ASH
- מוסיפים טיפה של 20 mM נתרן אזיד על כרית האגרוז. העבר 15-20 נמטודות HA759 לטיפה כדי לשתק אותן.
- מניחים כיסוי בעדינות על הנמטודות. שמור את השקופית מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית. בחר עדשה אובייקטיבית 40x ומסנן FITC כדי לזהות נוירוני ASH חיוביים ל-GFP באזור הראש של הנמטודות.
- בחר יותר מ-50 נמטודות בכל קבוצה באופן אקראי כדי לספור את מספר הנמטודות עם נוירוני ASH דו-צדדיים המסומנים ב-GFP באזור הראש שלהם7. חשב את שיעור ההישרדות של נוירוני ASH באמצעות eq (2) להלן.
הישרדות עצבית (%) =
(2)
כאשרN הישרדות ו-Nבסך הכל הם מספר הנמטודות עם נוירוני ASH חיוביים ל-GFP והמספר הכולל של נמטודות שנבדקו בכל קבוצה, בהתאמה.
- בדיקת הימנעות אוסמוטית
- מחלקים צלחת NGM נטולת מזון (9 ס"מ) לאזורים רגילים (N) ומלכודת (T) בקו של 8 M גליצרול (~30 μL) באמצע. פרשו קו של 200 mM נתרן אזיד (~20 μL) במרחק של כ-1 ס"מ מקו הגליצרול כדי לשתק את הנמטודות החוצות את מחסום הגליצרול לאזור T.
- העבר כ-200 נמטודות כל אחת לאזור N של שלושה לוחות משוכפלים עבור כל קבוצה. הוסיפו טיפה של 1% בוטנדיונה (~2 μL) לאזור T (1 ס"מ מקצה הלוח) כדי למשוך את הנמטודות. מכסים את המכסה של צלחת הפטרי באופן מיידי, ודוגרים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
- דרג את מספר הנמטודות באזורי N ו-T תחת מיקרוסקופ. חשב את מדד ההימנעות באמצעות eq (3)20.
מדד הימנעות =
(3)
כאשר N ו-T הם מספר הנמטודות באזורי N ו-T, בהתאמה. הנתונים מוצגים כאמצעי ± סטיית תקן (SD) של שלושה שכפולים, המייצגים >3 ניסויים בלתי תלויים. - בצע בדיקת t לא מזווגת, בעלת שני זנבות, כדי להשוות את הנתונים מקבוצות האסטרגלן והביקורת.
(2)
(3)4. יצירת תרשים מכ"ם
- פתח את תוכנת הגרפים ויבא נתונים ממבחנים שונים לגיליון חדש. הזן את העמודה A(X) ככותרות של הצירים הרדיאליים, עמודת A(Y) כנתונים מקבוצת הביקורת, ועמודת B(Y) כנתונים מקבוצת הטיפול.
- בחר את הנתונים הנדרשים ולחץ על | תרשים מתמחה: לחצן מכ"ם בתפריט סרגל הכלים כדי ליצור תרשים מכ"ם.
- לחצו פעמיים על הציר הרדיאלי והתאימו את התוויות 'קנה מידה', 'סמן' ו'סמן' של כל ציר לפי הצורך.
- לחץ על קובץ בתפריט ובחר ייצוא גרפים כדי לשמור את התמונה כ - *.tiff.
הערה: אתרי התוכנה בטבלת החומרים מספקים מסמכי עזרה מפורטים והדרכות וידאו ליצירת תרשימי מכ"ם.
Representative Results
זן הפוליק המהונדס AM141 מבטא בחוזקה את חלבוני ההיתוך Q40::YFP בתאי השריר של דופן גופו 7,21. כפי שניתן לראות באיור 1A, ניתן לזהות את הפנוטיפ המצטבר הבדיד של זן זה על ידי פרוטוקול ההדמיה והניתוח האוטומטי המתואר במאמר זה. כמות הצברים של Q40::YFP בנמטודות AM141 עלתה משמעותית לאחר 48 שעות משלב L1. עם זאת, נטייה זו לעלייה עוכבה על ידי טיפול אסטרגלני (איור 1B), המדגים את הפוטנציאל המגן של אסטרגלן מפני צבירה של polyQ. בדרך כלל ניתן להשתמש בנוחות ב- 72 שעות או ב- 96 שעות כנקודות הזמן לספירת צבירה Q40::YFP כדי להעריך את ההשפעה נגד צבירה של דגימות בדיקה. בפרוטוקול זה, האגרגטים הפלואורסצנטיים של נמטודת AM141 נלכדו על ידי מערכת הדמיה אוטומטית, אם כי ניתן להשתמש במיקרוסקופים פלואורסצנטיים גם למטרה זו7.
זן C. elegans HA759 מבטא הן את סמן ה-GFP והן את ה-Htn-Q150 בתאי העצב החושיים ASH שלו, מה שמוביל לאובדן הדרגתי ולתפקוד לקוי של נוירונים אלה11,13. הנמטודות הורכבו על רפידות אגרוז של 2% כדי לקבוע את הכדאיות העצבית של ASH (איור 2A) והוצגו באופן מיקרוסקופי כדי לזהות את תאי העצב של ASH. אובדן פלואורסצנציה של GFP בתאי עצב דו-צדדיים של ASH באזורי הראש של נמטודות מצביע על המוות העצבי של ASH (איור 2B). שיעור ההישרדות של נוירוני ASH בנמטודות HA759 הוא <40% בקבוצת הביקורת לאחר הדגירה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים 7,20, מה שמעיד על רעילות עצבית בתיווך פוליQ. לפיכך, ניתן להשתמש במבחן ההישרדות העצבי הזה של ASH כדי להעריך באופן חזותי את ההשפעות של תרכובות בדיקה על נוירוני C. elegans, למשל, ההשפעה הנוירו-הגנתית של אסטרגלן אך לא של פוריה גליקאן (איור 2C).
מכיוון שתפקוד לקוי של התנהגות הוא תסמין קליני מרכזי במחלות polyQ, בדיקת ההימנעות הכימוסנסורית (איור 3A) באמצעות מספר גדול של נמטודות HA759 מתוכננת כבדיקה פשוטה כדי לבחון את ההשפעה של דגימות בדיקה על האובדן התפקודי של נוירוני ASH המתווכים על ידי צבירת polyQ. כפי שניתן לראות באיור 3B, מדד ההימנעות מנמטודות HA759 בקבוצת הביקורת שלא טופלה היה ~0.5, בדומה למה שדווח בעבר14. באופן מעניין, מדד ההימנעות עלה ל->0.6 בנמטודות שטופלו באסטרגלן ב-15 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (איור 3B), מה שמדגים השפעה נוירו-מגנה על הפוליסכריד מפני ליקויים התנהגותיים.
כדי להעריך את היכולת הנוירו-הגנתית הכוללת של תרכובות הבדיקה, ניתן לשלב את הנתונים מהבדיקות הבודדות הנ"ל ולהציגם כתרשים מכ"ם עבור פנוטיפים מרובים, מה שהופך אותם לתכונה מאחדת של פנוטיפים של polyQ המתאימים להשוואה ישירה ולצפייה ישירה. כפי שניתן לראות באיור 4, שטח המשולש בקבוצת הטיפול האסטרגלנית גדול מזה של קבוצת הביקורת, מה שמעיד על ההשפעות האנטי-פולי-פולי-Q של הרב-סוכר.
איור 1: ההשפעה של אסטרגלן על צבירת polyQ40. (A) תמונות מייצגות של נמטודות AM141 לאחר טיפול עם או בלי אסטרגלן במשך 96 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. התמונות הפלורסנטיות (לוחות שמאליים) נרכשו מלוחות של 384 בארות באמצעות מערכת הדמיה וניתוח בעלת תוכן גבוה, וצברי Q40::YFP (לוחות ימניים) זוהו באופן אוטומטי על ידי המערכת. סטים הם התצוגות המוגדלות של תמונות נמטודה המציגות את אגרגטי ה-polyQ. סרגלי קנה מידה = 500 μm. (B) כימות של אגרגטים Q40::YFP. מספר הצברים של Q40::YFP בנמטודות AM141 היה מנוטר באמצעות מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה כל 24 שעות במשך 4 ימים לאחר הטיפול עם או בלי אסטרגלן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כ-100-150 נמטודות בכל קבוצה הובקעו עבור אגרגטים בכל נקודת זמן. התוצאות מוצגות כעקומות מותאמות המבוססות על מספר האגרגטים הממוצע לכל נמטודה. קיצורים: polyQ = פוליגלוטמין; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; FITC = פלואורסציין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ההשפעה של אסטרגלן על מוות עצבי של ASH בתיווך Htn-Q150. (A) דיאגרמה סכמטית של הכנת שקופית אגרוז. (B) מיקרוגרפים מייצגים של נמטודות HA759 עם הישרדות עצבית של ASH ומוות באמצעות הגדלה של פי 400. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. הנמטודות HA759 צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר טיפול עם או בלי אסטרגלן בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים מ-L1. (C) השפעה מגנה של אסטרגלן מפני מוות עצבי של ASH בתיווך פולי-Q. פוריה גליקאן, רב-סוכר מפוריה קוקוס, שימש כבקרה. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD של שלושה שכפולים, המייצגים יותר משלושה ניסויים בלתי תלויים. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t דו-זנב לא מזווג, דו-זנב, כדי להשוות נתונים של קבוצת הביקורת עם אלה של קבוצות האסטרגלן והפורייה גליקן. *עמ' < 0.05; ns = אין משמעותי. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ההשפעה של אסטרגלן על תפקוד התנהגותי לקוי בתיווך Htn-Q150. (A) דיאגרמה סכמטית של לוחית בדיקת ההימנעות. (ב) תוצאות מייצגות של בדיקת הימנעות. מדד ההימנעות הוגדר כיחס בין הנמטודות באזור N למספר הכולל של הנמטודות על הלוח. התוצאות מוצגות כאמצעים ± SD של שלושה שכפולים, המייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי של מדד ההימנעות בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג, בעל שני זנבות. **עמ' < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: יכולת ההגנה העצבית הכוללת של אסטרגלן. נתונים משלושה מבחנים שונים מיובאים לתוכנת OriginPro כדי ליצור תרשים מכ"ם, המוצג כדי ליצור פרופיל של ההשפעה הכללית של אסטרגלן על פנוטיפים מרובים המתווכים על ידי polyQ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
מכיוון שצבירת polyQ ופרוטאוטוקסיות הן תכונות חשובות של הפרעות polyQ, כגון מחלת הנטינגטון13, אנו ממליצים על שימוש במספר מודלים ושיטות כדי להעריך באופן מקיף את יכולת ההגנה הנוירו-טכנולוגית של תרכובות הבדיקה, כולל בדיקת הצבירה של polyQ בזן AM141, מבחן ההישרדות העצבי ASH בזן HA759, ומבחן ההימנעות הכימוסנסורית בזן HA759. הפרוטוקולים שהוצגו כאן שימשו להערכת יכולות ההגנה הנוירו-טקרטיבית של דגימות בדיקה מפני רעילות polyQ, כולל השפעות מעכבות הן על צבירת polyQ והן על רעילות עצבית נלווית 7,14,15,16,17,19,20, מה שמדגים את הפוטנציאל שלהם בגילוי תרופות עבור HD ומחלות פוליQ אחרות.
מערכת הדמיה וניתוח אוטומטית מוצגת לזיהוי וספירה של אגרגטים של polyQ במבחן הצבירה של polyQ. לשיטה זו יש את היתרונות של היותה בתפוקה גבוהה וחסכונית בזמן ומביאה לירידה משמעותית בשגיאות סובייקטיביות בתהליך הספירה המייגע. עבור צלחת שלמה של 384 בארות, לוקח רק <1 שעות כדי לסיים את הרכישה והניתוח של התמונה. עם זאת, שיטת ההדמיה המיקרוסקופית הקונבנציונלית הראתה גם ביצועים דומים במעבדה זו ללא שימוש במכשיר ההדמיה האוטומטי7.
סך של 100-150 נמטודות לכל טיפול מומלצות במבחן צבירה טיפוסי Q40::YFP עבור כל נקודת זמן, אשר ניתן לבצע בבארות משוכפלות המכילות 10-15 נמטודות כל אחת. עם זאת, יש לציין כי זחלי L1 עשויים להיות רגישים יותר לטיפולים מסוימים או לריכוזים גבוהים יותר. לכן, מינונים גבוהים יותר של תרכובות בדיקה עשויים לעכב את גדילתן, מה שיוביל לתוצאות חיוביות כוזבות עקב צמיחה איטית, ולכן, צבירת polyQ מאוחרת. בדרך כלל, ניתן לבצע בדיקת פינוי מזון כדי לתת מענה לחשש זה ולהבטיח את טווח הריכוזים המתאים של תרכובותהבדיקה 23.
הנמטודות המהונדסות HA759 המשמשות בבדיקות נוירוטוקסיות של polyQ מבטאות את OSM-10::GFP ו- Htn-Q150, מה שמאפשר לזהות באופן חד משמעי נוירונים חושיים של ASH דו-צדדיים. לפיכך, הישרדות הנוירונים של ASH מוערכת על ידי נוכחות או היעדר ביטוי GFP; בדרך כלל, כ-40-75% מתאי העצב של ASH בנמטודות הבקרה מתים23,24. באופן מעניין, הרקע המוטנטי הגנטי pqe-1 (משפר פוליגלוטמין-1) בזן HA759 (pqe-1; Htn-Q150) מאיץ רעילות בתיווך פולי-Q, מה שמוביל למותם של רוב נוירוני ה-ASH תוך שלושה ימים, אפילו ב-15 מעלות צלזיוס, ולכן זן זה גדל ב-15 מעלות צלזיוס עבור בדיקת ההישרדות העצבית, כפי שדווח בעבר23,24.
אובדן תפקודי של נוירוני ASH בנמטודות HA759 עלול להתרחש לפני גילוי מוות תאי וצבירת חלבונים13; לפיכך, בדיקת התנהגות ההימנעות האוסמוטית חיונית להערכת רעילות בתיווך polyQ. כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של נמטודות HA759 פחות פעילות בטמפרטורה נמוכה על ניסויים התנהגותיים, לוחות בדיקת ההימנעות מודגרים באינקובטור לח של 23 מעלות צלזיוס ולא בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס כמו במבחן ההישרדות העצבי באמצעות זן זה. בנוסף, דווח כי נמטודות מהונדסות Htn-Q150/OSM-10::GFP רגישות מאוד למגע באף; לפיכך, זיהוי חלופי של תפקוד נוירוני ASH הוא מבחן מגע האף13.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לחברים לשעבר במעבדת הואנג שעזרו לפתח ולשפר את הפרוטוקולים המשמשים במאמר זה, במיוחד להנרוי ג'אנג, לינגיון שיאו ויאנשיה שיאנג. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט 111 (מענק מספר B17018) והקרן למדעי הטבע של מחוז חביי (מענק מספר H202020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
