Summary
Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Yaşa bağlı yanlış katlanma ve patojenik proteinlerin agregasyonu çeşitli nörodejeneratif hastalıklardan sorumludur. Örneğin, Huntington hastalığı (HD) esas olarak huntingtin proteininde genişlemiş bir glutamin sistemini kodlayan bir CAG nükleotid tekrarı tarafından yönlendirilir. Bu nedenle, poliglutamin (poliQ) agregasyonunun ve özellikle agregasyonla ilişkili nörotoksisitenin inhibisyonu, HD ve diğer poliQ ile ilişkili durumların önlenmesi için yararlı bir stratejidir. Bu yazıda, test bileşiklerinin HD'ye karşı nöroprotektif kapasitesini değerlendirmek için yerleşik poliQ transgenik Caenorhabditis elegans modellerini kullanarak genelleştirilmiş deneysel protokoller tanıtılmaktadır. AM141 suşu, poliQ agregasyon testi için seçilmiştir, çünkü ayrık floresan agregaların yaşa bağlı bir fenotipi, poliQ::YFP füzyon proteinlerinin kaslara özgü ekspresyonu nedeniyle yetişkin aşamasında vücut duvarında kolayca gözlemlenebilir. Buna karşılık, ASH nöronlarında poliQ-genişlemiş yolların güçlü ekspresyonuna sahip HA759 modeli, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışını incelemek için kullanılır. Hedef bileşiklerin nöroprotektif kapasitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için, yukarıdaki test sonuçları nihayetinde doğrudan karşılaştırma ve doğrudan görüntüleme şeklinde çoklu fenotiplerin profillendiği bir radar çizelgesi olarak sunulmaktadır.
Introduction
HD'de ilerleyici nörodejenerasyon, CAG trinükleotid tekrarları 1,2,3 tarafından kodlanan anormal bir poliQ gerilmesi ile patojenik mutant huntingtin'i içerir. 37'den fazla glutamin tekrarına sahip mutant huntingtin proteinleri, HD hastalarının beyinlerinde ve hayvan modellerinde 4,5 birikmeye ve birikmeye eğilimlidir ve bu da sonuçta nörodejenerasyona yol açar6. PoliQ agregalarının hastalık patolojisindeki rolleri konusunda netlik olmamasına rağmen,5, poliQ agregasyonunun inhibisyonu ve ilişkili toksisitesi, HD ve diğer poliQ hastalıkları için yararlı bir terapötik stratejidir 4,7,8.
Nöronal sinyal yolaklarındaki korunum ve yapımı kolay transgenik hastalık modelleri nedeniyle, Caenorhabditis elegans nörolojik bozuklukların araştırılmasında majör bir model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır 9,10,11,12. Örneğin, agregasyona eğilimli poliQ genişlemelerini ifade eden transgenik C. elegans modelleri, seçici nöronal hücre kaybı, sitoplazmik agrega oluşumu ve davranışsal kusurlar gibi HD benzeri özellikleri objektif olarak taklit edebilir13. Test numunelerinin yerleşik poliQ nematod modellerinde bu fenotipleri tersine çevirmek için potansiyel etkilerinin araştırılması, polisakkaritler 7,14,15, oligosakkaritler16, doğal küçük moleküller17,18 ve bitkisel özler ve formüller 19,20 gibi çeşitli umut verici terapötik adayların tanımlanmasına yol açmıştır.
Burada açıklanan iki ana polyQ C. elegans modeli ve Astragalus membranaceus7'den izole edilmiş bir polisakkarit olan astragalan üzerine yapılan çalışmada örneklendiği gibi potansiyel uygulamalar için ilgili protokollerdir. C. elegans'taki poliQ agregasyon testi için kullanılan model, sarı floresan proteinine (YFP) kaynaşmış 40 kalıntıdan (polyQ40) oluşan bir poliQ yolu olan Q40::YFP füzyon proteininin ekspresyonu nedeniyle yetişkinliğe ulaştığında vücut duvarı kasında dağılmış floresan punkta'yı gösteren transgenik suş AM141'dir.21,22 . HA759 suşu, hem yeşil floresan proteini (GFP) hem de Htn-Q150'yi (150 kalıntıdan oluşan insan avcılığından türetilmiş bir poliQ yolu) ASH nöronlarında güçlü bir şekilde ancak diğer nöronlarda zayıf bir şekilde ifade ettiği için nöronal sağkalım ve kemoavoidans davranışını incelemek için kullanıldı ve ilerleyici nörodejenerasyon ve ASH hücresi ölümü 7,13 ile sonuçlandı. Terapötik adayların nöroprotektif potansiyelinin kapsamlı bir özeti, farklı tahlillerden elde edilen sonuçların entegre edilmesiyle sağlanır.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan çözümlerin tarifleri için Tablo 1'e bakın.
1. Caenorhabditis elegans testi için materyallerin hazırlanması
- C. elegans suşlarının bakımı
- C. elegans (AM141 ve HA759) ve Escherichia coli (OP50 ve NA22) suşlarını elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- E. coli OP50 ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakasındaki nematodları, AM141 21 için 20 °C'de veya HA75923 için 15 °C'de tutun.
- E. coli OP50 bakteri kültürünün hazırlanması
- Bir Luria-Bertani (LB) çizgi plakasından tek bir E. coli OP50 kolonisi seçin ve 50 mL sıvı LB kültürüne aşılayın.
- OP50 bakterilerini 37 ° C ve 200 rpm'de bir çalkalayıcıda, 570 nm'de (OD 570) ~0,5 optik yoğunluğa kadar inkübe edin.
- OP50 bakteri kültürünü 4 °C'de saklayın ve iki hafta içinde kullanın.
- OP50 bakterileri ile NGM plakalarının hazırlanması
- 1 L otoklavlanabilir bir şişeye 20 g agar, 2.5 g pepton, 3.0 g NaCl ve 975 mL deiyonize su ekleyin. 30 dakika boyunca 121 °C'de otoklav.
- Sıvı NGM agar şişesini ~60 ° C'ye soğuması için tezgahın üzerine yerleştirin ve ardından aşağıdaki steril stok çözeltilerini ekleyin: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 mg / mL kolesterol ve 25 mL 1 M potasyum fosfat (pH 6.0).
- Steril 90 mm'lik Petri kabına 20 mL NGM dökün ve soğuması ve katılaşması için tabakları tezgahın üzerinde bırakın. Plakaları baş aşağı tutun ve tezgahta oda sıcaklığında 2 gün kurumasını bekleyin.
- Her bir NGM plakasına 200 μL OP50 bakteri kültürü dağıtın ve steril bir cam kaplama çubuğu ile eşit şekilde yayın. Kapakları kapatın ve plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- OP50 ile tohumlanmış NGM plakalarını oda sıcaklığında kapaklı plastik bir kutuda saklayın ve iki hafta içinde kullanın.
- Yaş senkronize C. elegans popülasyonunun hazırlanması
- Yerçekimi yetişkin nematodlarını steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve 1 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüj yapın. Üç kez yıkayın ve nematodları M9 tamponunda yeniden askıya alın.
- Eşit miktarda ağartıcı çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Ağartmayı her 15 saniyede bir diseksiyon mikroskobu altında izleyin.
NOT: Ağartıcı çözeltisi, %10 NaOCl ve 1 M NaOH (Tablo 1)20'ye eşit hacimlerde karıştırılarak kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. - Nematodların çoğu kırıldıktan sonra, M9 tamponu ile seyrelterek sindirimi durdurun. Süpernatantı çıkarmak için hızlı bir şekilde santrifüj yapın ve yıkamayı üç kez tekrarlamak için peleti M9 tamponunda yeniden askıya alın.
- Peleti S ortamında yeniden askıya alın. Yumurtalar süpernatanda kalırken nematod kalıntılarının 2-3 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı yeni bir steril mikrosantrifüj tüpüne aspire edin. Yumurtaları 1 dakika boyunca 1000 × g'de santrifüjleme ile toplayın.
- Süpernatantın ~% 80'ini atın ve yumurtaları 20 mL S ortamı içeren steril bir şişeye aktarın. Şişeyi bir çalkalayıcıya yerleştirin ve senkronize L1 nematodları elde etmek için yumurtaları gece boyunca yiyeceksiz olarak 120 rpm'de kuluçkaya yatırın.
2. PolyQ toplama testi
- PoliQ agregasyon testi için nematodların hazırlanması
- AM141'in 300-500 senkronize L1 larvasını, OP50 (OD570 / 0.7-0.8) ve 5 mg / mL astragalan, tipik olarak bir zaman noktası için tedavi başına bir kuyucuk içeren 500 μL S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
- Plakayı parafilm ile kapatın ve 24, 48, 72 ve 96 saat boyunca 20 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
- Nematodları steril bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve kalan OP50'yi çıkarmak için santrifüjleme ile M9 tampon >3 kez (1 dakika boyunca 1000 × g) ile yıkayın. AM141 nematodlarını M9 arabelleğinde yeniden askıya alın ve görüntü yakalamaya hazır tutun.
- Floresan görüntülerin elde edilmesi ve veri analizi
NOT: Veriler bu yüksek içerikli görüntüleme sistemi ile otomatik olarak analiz edilir. Otomatik bir görüntüleme cihazı mevcut değilse, görüntü elde etmek için bir agaroz pedi hazırlamak için geleneksel bir yöntem, ortak bir floresan mikroskobu 7,15,17 kullanılarak benzer bir performans elde etmek için kullanılabilir (bkz. adım 3.2 ve 3.3).- 384 kuyucuklu bir plakada her bir kuyucuğa 10-15 nematod aktarın (kuyu başına son hacim 80 μL). Her tedavi için 10 replikasyon kuyusu ayarlayın.
- Nematodları felç etmek ve dibe (5-10 dakika) yerleşmelerini sağlamak için her bir kuyucuğa 10 μL 200 mM sodyum azid ekleyin.
- Floresan görüntüler elde etmek için plakayı yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine yerleştirin (cihaz ve yazılım bilgileri için Malzeme Tablosu'na bakın).
- Görüntü alma yazılımını açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
- Plaka Alma Kurulumu penceresini açın ve yeni bir deneme kümesi ve adı oluşturun.
- Büyütmeyi 2x, Kamera gruplamayı 1 ve Plaka türünü 384 delikli plaka olarak seçin.
- Ziyaret edilecek kuyuları ve siteleri (tek site) ayarlayın.
- Floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresini seçin ve görüntü tabanlı odaklama seçeneklerini etkinleştirin.
- Pozlama'yı 300 ms olarak ayarlayın.
NOT: Yukarıdaki ayarlar, görüntüleme parametrelerini optimize etmek için test edilebilir ve ayarlanabilir. - Görüntü alma ayarlarını kaydedin ve çalıştırmak için Plaka Al düğmesine tıklayın.
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü verilerini analiz edin.
- Plaka Verilerini Gözden Geçir penceresini açın ve görüntü analizi için Test plakasını seçin.
- Görüntüsünü görüntülemek için bir test kutusuna çift tıklayın.
- Analiz yöntemi olarak Çekirdekleri Say'ı seçin ve aşağıdaki ayarlar için bir pencere açmak üzere Ayarları Yapılandır düğmesine tıklayın.
- Kaynak görüntüyü FITC kanalından tanımlayın ve Standart Algoritma'yı seçin.
- Görüntü analizi parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: yaklaşık minimum genişlik = 10 μm (= 2 piksel); yaklaşık maksimum genişlik = 50 μm (= 12 piksel); Yerel arka planın üzerindeki yoğunluk = 1.000-2.000 gri seviye.
- Analiz yöntemini optimize etmek için geçerli ayarları test edin.
- Ayarları kaydedin ve analizi tüm kuyucuklarda çalıştırın.
NOT: Bir 384 kuyucuklu plaka için analizi bitirmek ~ 20 dakika sürer. - Toplam Çekirdekleri, her bir kuyucuktaki toplam Q40::YFP agregası sayısı olarak dışa aktarın.
- Her kuyucuktaki nematodların sayısını sayın.
- Her gruptaki nematod başına ortalama Q40::YFP agregaları sayısını hesaplayın ve her zaman noktasındaki verilere doğrusal olmayan bir eğri uyumu uygulayın.
- Aşağıdaki eq (1)'i kullanarak inhibisyon indeksini hesaplayın:
İnhibisyon indeksi =
(1)
Burada Nkontrolü ve Nörneği , sırasıyla kontrol ve tedavi gruplarındaki ortalama Q40::YFP agregaları sayısıdır.
(1)3. PoliQ aracılı nörotoksisite testleri
- C. elegans'ın test numuneleri ile tedavisi
- PoliQ nörotoksisite testine nematodlar hazırlamak için, HA759'un 300-500 senkronize L1 larvasını, OP50 (OD 570 / 0.0.8) ve 5 mg / mL astragalan, tipik olarak her tedavi için üç replikasyonkuyusu içeren 500 μL S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
- Plakayı parafilm ile kapatın ve 3 gün23 boyunca 15 ° C ve 120 rpm'de inkübe edin.
- Nematodları santrifüjleme ile toplayın ve M9 tamponu ile 3-5 kez yıkayın. Nöronal sağkalım ve kaçınma testlerinde kullanılmak üzere M9 tamponundaki nematodları yeniden askıya alın.
- Agaroz pedinin hazırlanması
- 100 mL M9 tamponuna (% 2, w / v) 2 g agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisini bir mikrodalgada kaynamaya yakın bir şekilde ısıtın.
- 2 mm kalınlığında iki cam plaka parçası arasına yerleştirilmiş 1 mm kalınlığında mikroskopi cam slaytının ortasına 0,5 mL eritilmiş agaroz dağıtın. Dikey olarak başka bir slaytla örtün. Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra, üst kaydırağı yavaşça çıkarın.
- ASH nöronal sağkalım testi
- Agaroz pedine bir damla 20 mM sodyum azid ekleyin. 15-20 HA759 nematodları hareketsiz hale getirmek için damlaya aktarın.
- Nematodların üzerine yavaşça bir örtü yerleştirin. Slaytı dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobun altında tutun. Nematodların baş bölgesindeki GFP-pozitif ASH nöronlarını tespit etmek için 40x objektif lens ve FITC filtresi seçin.
- Baş bölgesi7'de GFP etiketli bilateral ASH nöronları olan nematodların sayısını saymak için her grupta rastgele 50'den fazla nematod seçin. Aşağıdaki eq (2) kullanarak ASH nöronlarının hayatta kalma oranını hesaplayın.
Nöronal sağkalım (%) =
(2)
Burada Nsağkalım ve Ntoplamı , sırasıyla GFP-pozitif ASH nöronları olan nematodların sayısı ve her grupta test edilen nematodların toplam sayısıdır.
- Ozmotik kaçınma testi
- Gıda içermeyen bir NGM plakasını (9 cm) normal (N) içine bölün ve ortadaki 8 M gliserol (~ 30 μL) çizgisi ile (T) bölgeleri yakalayın. Gliserol bariyerinden T Bölgesi'ne geçen nematodları felç etmek için gliserol hattından ~1 cm uzakta 200 mM'lik bir sodyum azid (~20 μL) hattı yayın.
- Her biri için üç replika plakasının N Bölgesi'ne ~200 nematod aktarın. Nematodları çekmek için Bölge T'ye (plaka kenarından 1 cm) % 1 bütandion (~ 2 μL) damla ekleyin. Petri kabının kapağını hemen örtün ve 90 dakika boyunca 23 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- Mikroskop altında N ve T bölgelerindeki nematodların sayısını puanlayın. eq (3)20 kullanarak kaçınma endeksini hesaplayın.
Kaçınma indeksi =
(3)
Burada N ve T, sırasıyla N ve T bölgelerindeki nematodların sayısıdır. Veriler, ±3 bağımsız deneyi temsil eden üç kopyanın standart sapmasını (SD) > araçlar olarak sunulmaktadır. - Astragalan ve kontrol gruplarından gelen verileri karşılaştırmak için eşleşmemiş, iki kuyruklu bir t-testi gerçekleştirin.
(2)
(3)4. Radar grafiği oluşturma
- Grafik yazılımını açın ve farklı tahlillerdeki verileri yeni bir sayfaya aktarın. Radyal eksenlerin başlıkları olarak A(X) sütununu, kontrol grubundaki veriler olarak A(Y) sütununu ve tedavi grubundaki veriler olarak B(Y) sütununu girin.
- Gerekli verileri seçin ve Plot | Uzmanlaşmış: Bir radar grafiği oluşturmak için araç çubuğu menüsündeki radar düğmesi.
- Radyal eksene çift tıklayın ve her eksenin Ölçek, Onay ve İşaretle etiketlerini gerektiği gibi ayarlayın.
- Menüde Dosya'ya tıklayın ve görüntüyü *.tiff olarak kaydetmek için Grafikleri Dışa Aktar'ı seçin.
NOT: Malzeme Tablosundaki yazılım web siteleri, radar çizelgeleri oluşturma konusunda ayrıntılı yardım belgeleri ve video eğitimleri sağlar.
Representative Results
Transgenik poliQ suşu AM141, vücut duvarı kas hücrelerinde Q40::YFP füzyon proteinlerini güçlü bir şekilde ifade eder 7,21. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, bu suşun ayrık agrega fenotipi, bu makalede açıklanan otomatik görüntüleme ve analiz protokolü ile tanımlanabilir. AM141 nematodlarındaki Q40::YFP agregalarının miktarı, L1 aşamasından 48 saat sonra önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, bu artış eğilimi astragalan tedavisi ile inhibe edilmiştir (Şekil 1B), astragalanın poliQ agregasyonuna karşı koruyucu potansiyelini göstermiştir. Tipik olarak 72 saat veya 96 saat, test numunelerinin toplanma önleyici etkisini değerlendirmek için Q40::YFP agregalarını saymak için zaman noktaları olarak rahatlıkla kullanılabilir. Bu protokolde, AM141 nematodunun floresan agregaları otomatik bir görüntüleme sistemi tarafından yakalanmıştır, ancak floresan mikroskoplar da bu amaç için kullanılabilir7.
C. elegans suşu HA759, duyusal ASH nöronlarında hem GFP belirtecini hem de Htn-Q150'yi eksprese eder ve bu nöronların ilerleyici kaybına ve işlev bozukluğuna yol açar11,13. Nematodlar, ASH nöronal canlılığını belirlemek için% 2 agaroz pedlerine monte edildi (Şekil 2A) ve ASH nöronlarını tespit etmek için mikroskobik olarak görselleştirildi. Nematodların baş bölgelerindeki bilateral ASH nöronlarında GFP floresan kaybı, ASH nöronal ölümünü gösterir (Şekil 2B). HA759 nematodlarındaki ASH nöronlarının sağkalım oranı, 3 gün boyunca 15 ° C'de inkübasyondan sonra kontrol grubunda% <40'tır 7,20, poliQ aracılı nörotoksisiteyi gösterir. Bu nedenle, bu ASH nöronal sağkalım testi, test bileşiklerinin C. elegans nöronları üzerindeki etkilerini, örneğin astragalan'ın nöroprotektif etkisini, ancak Poria glikanının değil, görsel olarak değerlendirmek için kullanılabilir (Şekil 2C).
Davranış bozukluğu poliQ hastalıklarında önemli bir klinik semptom olduğundan, çok sayıda HA759 nematodu kullanan kemosensoriyel kaçınma testi (Şekil 3A), test örneklerinin poliQ agregasyonunun aracılık ettiği ASH nöronlarının fonksiyonel kaybı üzerindeki etkisini incelemek için basitleştirilmiş bir test olarak tasarlanmıştır. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, tedavi edilmemiş kontrol grubundaki HA759 nematodlarının kaçınma indeksi, daha önce14 olarak bildirilenlere benzer şekilde ~ 0.5 idi. İlginç bir şekilde, kaçınma indeksi 3 gün boyunca 15 ° C'de astragalan ile tedavi edilen nematodlarda >0.6'ya yükselmiştir (Şekil 3B), polisakkaritin davranışsal bozukluklara karşı nöroprotektif bir etkisini göstermiştir.
Test bileşiklerinin genel nöroprotektif kapasitesini değerlendirmek için, yukarıdaki bireysel tahlillerden elde edilen veriler entegre edilebilir ve çoklu fenotipler için bir radar çizelgesi olarak sunulabilir, bu da onu doğrudan karşılaştırma ve doğrudan görüntüleme için uygun poliQ fenotiplerinin birleştirici bir özelliği haline getirir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, astragalan tedavi grubundaki üçgenin alanı, polisakkaritin anti-poliQ etkilerini gösteren kontrol grubununkinden daha büyüktür.
Resim 1: Astragalanın poliQ40 agregasyonu üzerindeki etkisi . (A) 20 °C'de 96 saat boyunca astragalan ile veya astragalan olmadan tedaviden sonra AM141 nematodlarının temsili görüntüleri. Floresan görüntüler (sol paneller), yüksek içerikli bir görüntüleme ve analiz sistemi kullanılarak 384 kuyucuklu plakalardan elde edildi ve Q40::YFP agregaları (sağ paneller) sistem tarafından otomatik olarak tanımlandı. İç kümeler, poliQ agregalarını gösteren nematod görüntülerinin büyütülmüş görünümleridir. Ölçek çubukları = 500 μm. (B) Q40::YFP agregalarının nicelleştirilmesi. AM141 nematodlarındaki Q40::YFP agregalarının sayısı, 20 ° C'de astragalanlı veya astragalansız tedaviden sonra 4 gün boyunca her 24 saatte bir yüksek içerikli görüntüleme sistemi kullanılarak izlendi. Her grupta yaklaşık 100-150 nematod, her zaman noktasında agregalar için puanlandı. Sonuçlar, nematod başına ortalama agrega sayısına dayanan takılı eğriler olarak gösterilir. Kısaltmalar: polyQ = poliglutamin; YFP = sarı floresan protein; FITC = floresein izotiyosiyanat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Astragalanın Htn-Q150 aracılı ASH nöronal ölümüne etkisi. (A) Agaroz slayt hazırlığının şematik diyagramı. (B) 400x büyütme kullanılarak ASH nöronal sağkalım ve ölüm ile HA759 nematodlarının temsili mikrografları. Ölçek çubukları = 20 μm. HA759 nematodları, L1'den 3 gün boyunca 15 ° C'de astragalanlı veya astragalansız tedaviden sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak fotoğraflandı. (C) Astragalan'ın poliQ aracılı ASH nöronal ölümüne karşı koruyucu etkisi. Poria kokolarından bir polisakkarit olan Poria glikan, kontrol olarak kullanılmıştır. Veriler, üçten fazla bağımsız deneyi temsil eden üç kopyanın ± SD aracı olarak sunulmaktadır. İstatistiksel analiz, kontrol grubunun verilerini astragalan ve Poria glikan gruplarınınkilerle karşılaştırmak için eşleşmemiş, iki kuyruklu bir t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. *p < 0,05; ns = önemli değil. Kısaltma: GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Astragalan'ın Htn-Q150 aracılı davranışsal disfonksiyon üzerine etkisi . (A) Kaçınma tahlil plakasının şematik diyagramı. (B) Kaçınma testinin temsili sonuçları. Kaçınma indeksi, N bölgesindeki nematodların plakadaki toplam nematod sayısına oranı olarak tanımlandı. Sonuçlar, üç bağımsız deneyi temsil eden üç kopyanın ± SD aracı olarak sunulmaktadır. Kaçınma indeksinin istatistiksel analizi, eşleşmemiş, iki kuyruklu bir t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. **p 0,01 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Astragalanın genel nöroprotektif kapasitesi. Üç farklı tahlilden elde edilen veriler, astragalan'ın poliQ aracılık ettiği çoklu fenotipler üzerindeki genel etkisini profillemek için sunulan bir radar şemasına OriginPro yazılımına aktarılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
PoliQ agregasyonu ve proteotoksisite, Huntington hastalığı 13 gibi poliQ bozukluklarının önemli özellikleri olduğundan,AM141 suşunda poliQ agregasyon testi, HA759 suşunda ASH nöronal sağkalım testi ve HA759 suşunda kemosensoriyel kaçınma testi dahil olmak üzere test bileşiklerinin nöroprotektif kapasitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için birden fazla model ve yöntemin kullanılmasını öneriyoruz. Burada sunulan protokoller, hem poliQ agregasyonu hem de ilişkili nörotoksisite 7,14,15,16,17,19,20 üzerindeki inhibitör etkiler de dahil olmak üzere, test numunelerinin poliQ toksisitesine karşı nöroprotektif kapasitelerini değerlendirmek için kullanılmış ve HD ve diğer poliQ hastalıkları için ilaç keşfindeki potansiyellerini göstermiştir.
PolyQ toplama tahlilinde poliQ agregalarının tespiti ve sayımı için otomatik bir görüntüleme ve analiz sistemi tanıtılmıştır. Bu yöntem, yüksek verimli ve zaman verimli olma avantajlarına sahiptir ve zahmetli sayım işleminde önemli ölçüde azaltılmış öznel hatalarla sonuçlanır. 384 delikli bir plakanın tamamı için, görüntü alma ve analizinin tamamlanması yalnızca <1 saat sürer. Bununla birlikte, geleneksel mikroskobik görüntüleme yöntemi de bu laboratuvarda otomatik görüntüleme cihazıkullanılmadan benzer bir performans göstermiştir 7.
Her zaman noktası için tipik bir Q40::YFP toplama testinde tedavi başına toplam 100-150 nematod önerilir ve bu da her biri 10-15 nematod içeren replika kuyucuklarda gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, L1 larvalarının bazı tedavilere veya daha yüksek konsantrasyonlara karşı daha duyarlı olabileceği belirtilmelidir. Bu nedenle, daha yüksek dozlarda test bileşikleri büyümelerini engelleyebilir, bu da yavaş büyüme nedeniyle yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir ve böylece poliQ agregasyonunu geciktirebilir. Genellikle, bu endişeyi gidermek ve test bileşiklerinin uygun konsantrasyon aralığını sağlamak için bir gıda temizleme testi yapılabilir23.
PoliQ nörotoksisite testlerinde kullanılan HA759 transgenik nematodları, koekspres OSM-10::GFP ve Htn-Q150'yi test ederek bilateral ASH duyusal nöronlarını net bir şekilde tanımlamayı mümkün kılar. Bu nedenle, ASH nöron sağkalımı GFP ekspresyonunun varlığı veya yokluğu ile değerlendirilir; Genellikle, kontrol nematodlarındaki ASH nöronlarının ~% 40-75'i ölmüştür23,24. İlginçtir ki, HA759 suşunda pqe-1 (poliglutamin arttırıcı-1) genetik mutant arka planı (pqe-1; Htn-Q150), poliQ aracılı toksisiteyi hızlandırır, çoğu ASH nöronunun üç gün içinde, hatta 15 ° C'de bile ölümüne yol açar ve bu nedenle bu suş, daha önce bildirildiği gibi nöronal sağkalım testi için 15 ° C'de yetiştirilir23,24.
HA759 nematodlarında ASH nöronlarının fonksiyonel kaybı, hücre ölümü ve protein agregalarının saptanmasından önce ortaya çıkabilir13; Bu nedenle, ozmotik kaçınma davranışı testi, poliQ aracılı toksisitenin değerlendirilmesi için gereklidir. Düşük sıcaklıkta daha az aktif HA759 nematodlarının davranışsal deneyler üzerindeki potansiyel etkisini en aza indirmek için, kaçınma testi plakaları, bu suşu kullanan nöronal sağkalım testinde olduğu gibi 15 ° C'de değil, nemlendirilmiş 23 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edilir. Ek olarak, Htn-Q150 / OSM-10: GFP transgenik nematodlarının burun dokunuşuna karşı oldukça hassas olduğu bildirilmiştir; Bu nedenle, ASH nöron fonksiyonunun alternatif bir tespiti burun dokunma testi13'tür.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu makalede kullanılan protokollerin geliştirilmesine ve iyileştirilmesine yardımcı olan Huang Lab'ın eski üyelerine, özellikle Hanrui Zhang, Lingyun Xiao ve Yanxia Xiang'a teşekkür ederiz. Bu çalışma 111 Projesi (hibe numarası B17018) ve Hebei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası H2020207002) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
