Summary
여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
연령과 관련된 병원성 단백질의 미스폴딩 및 응집은 여러 신경 퇴행성 질환에 책임이 있습니다. 예를 들어, 헌팅턴병(HD)은 주로 헌팅틴 단백질에서 확장된 글루타민 관을 인코딩하는 CAG 뉴클레오티드 반복에 의해 유발된다. 따라서, 폴리글루타민(polyQ) 응집의 억제 및, 특히 응집-관련 신경독성은 HD 및 다른 폴리Q 관련 상태의 예방을 위한 유용한 전략이다. 이 논문은 확립 된 polyQ 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans 모델을 사용하여 HD 에 대한 테스트 화합물의 신경 보호 능력을 평가하기위한 일반화 된 실험 프로토콜을 소개합니다. AM141 균주는 polyQ::YFP 융합 단백질의 근육 특이적 발현으로 인해 성인 단계에서 그의 체벽에서 쉽게 관찰될 수 있는 분리된 형광 응집체의 연령 관련 표현형으로서 polyQ 응집 분석을 위해 선택된다. 대조적으로, ASH 뉴런에서 polyQ-expanded tracts의 강한 발현을 갖는 HA759 모델은 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동을 검사하는데 사용된다. 표적 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해, 상기 시험 결과는 궁극적으로 직접 비교 및 직접 관찰의 방식으로 여러 표현형의 프로파일 링과 레이더 차트로 제시됩니다.
Introduction
HD에서의 진행성 신경변성은 CAG 트리뉴클레오타이드 반복 1,2,3에 의해 코딩되는 폴리Q의 비정상적인 스트레치를 갖는 병원성 돌연변이 헌팅틴을 수반한다. 37개 이상의 글루타민 반복을 갖는 돌연변이 헌팅틴 단백질은 헌팅턴병 환자와 동물 모델4,5의 뇌에 응집되어 축적되기 쉬우며, 이는 궁극적으로 신경변성6을 유도한다. 질병 병리학5에서 polyQ 응집체의 역할에 대한 명확성이 부족함에도 불구하고, 폴리Q 응집 및 그의 관련 독성의 억제는 HD 및 다른 폴리Q 질환4,7,8에 유용한 치료 전략이다.
신경 신호 전달 경로의 보존과 구축하기 쉬운 트랜스제닉 질환 모델로 인해, 예쁜꼬마선충은 신경 장애9,10,11,12의 조사를 위한 주요 모델 유기체로서 널리 이용되고 있다. 예를 들어, 응집되기 쉬운 폴리Q 확장을 발현하는 트랜스제닉 C. 엘레간 모델은 선택적 뉴런 세포 손실, 세포질 응집체 형성, 및 행동 결함(13)과 같은 HD 유사 특징을 객관적으로 모방할 수 있다. 확립된 폴리Q 선충류 모델에서 이러한 표현형을 역전시키는 시험 샘플의 잠재적 효과에 대한 조사는 다양한 유망한 치료 후보, 예를 들어, 다당류7,14,15, 올리고당 16, 천연 소분자 17,18, 및 생약 추출물 및 수식 19,20의 동정을 이끌었다.
여기에 설명된 두 가지 주요 polyQ C. elegans 모델 및 Astragalus membranaceus7로부터 분리된 다당류인 아스트라갈란에 대한 연구에 의해 예시된 바와 같은 잠재적 응용을 위한 관련 프로토콜이 기술되어 있다. C. elegans에서의 polyQ 응집 분석의 경우, 사용된 모델은 Q40:YFP 융합 단백질의 발현으로 인해 성인기에 도달했을 때 체벽 근육에 분산된 형광 펑타를 보여주는 트랜스제닉 균주 AM141입니다:YFP 융합 단백질, 노란색 형광 단백질(YFP)21,22에 융합된 40개의 잔기(polyQ40)의 폴리Q 관 . HA759 균주는 ASH 뉴런에서는 녹색 형광 단백질(GFP)과 Htn-Q150(인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관(150개 잔기의 인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관)을 모두 발현하지만 다른 뉴런에서는 약하게 발현하여 진행성 신경변성 및 ASH 세포 사멸 7,13을 초래함에 따라 뉴런 생존 및 화학회피 거동을 검사하는데 사용되었다. 치료 후보물질의 신경 보호 잠재력에 대한 포괄적인 요약은 상이한 분석으로부터의 결과를 통합함으로써 제공된다.
Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 제조법은 표 1 을 참조하십시오.
1. 예쁜꼬마 선충 분석용 물질의 제조
- C. elegans 균주의 유지 보수
- C. elegans (AM141 및 HA759) 및 에스케리치아 콜라이 (OP50 및 NA22) 균주를 얻었다 (표 재료 참조).
- 선충류를 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트 상에 유지시키고 대장균 OP50으로 시딩하여 AM141에 대해 20°C에서21 또는 HA75923에 대해 15°C에서 유지한다.
- 대장균 OP50 세균 배양액의 제조
- Luria-Bertani (LB) 줄무늬 플레이트에서 대장균 OP50의 단일 콜로니를 골라 50 mL의 액체 LB 배양물에 접종하십시오.
- OP50 박테리아를 570 nm에서 ∼0.5의 광학 밀도가 될 때까지 37°C 및 200 rpm의 진탕기에서 인큐베이션한다 (OD570).
- OP50 박테리아 배양물을 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용한다.
- OP50 박테리아를 사용한 NGM 플레이트의 제조
- 한천 20g, 펩톤 2.5g, NaCl 3.0g, 탈이온수 975mL를 1L 오토클레이브 병에 담는다. 121°C에서 30분 동안 오토클레이브.
- 액체 NGM 한천 병을 벤치에 올려 놓고 ~60°C로 냉각한 다음, 1 MCaCl2 1 mL, 1 M MgSO4 1 mL, 5 mg/mL 콜레스테롤 1 mL, 1 M 인산칼륨 25 mL (pH 6.0) 등의 멸균 원액을 첨가한다.
- NGM 20mL를 멸균된 90mm 페트리 접시에 붓고 플레이트를 벤치에 두어 식히고 응고시킵니다. 접시를 거꾸로 유지하고 실온에서 벤치에서 2 일 동안 말리십시오.
- OP50 박테리아 배양물 200 μL를 각 NGM 플레이트 상에 분주하고 멸균 유리 코팅 막대로 고르게 퍼뜨린다. 뚜껑을 닫고 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- OP50으로 시드된 NGM 플레이트를 실온에서 덮개가 있는 플라스틱 박스에 보관하고 2주 이내에 사용하십시오.
- 연령 동기화된 C. elegans 집단의 제조
- 과립성인 선충류를 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 1000 × g 에서 1분 동안 원심분리한다. 세 번 씻고 선충류를 M9 완충액에 재현탁하십시오.
- 같은 양의 표백제를 넣고 3-5 분 동안 부드럽게 교반하십시오. 해부 현미경으로 15 초마다 표백을 모니터링하십시오.
참고: 표백제 용액은 동량의 10% NaOCl과 1M NaOH(표 1)20을 혼합하여 사용 전에 신선하게 준비해야 합니다. - 선충류의 대부분이 부러지면 M9 버퍼로 희석하여 소화를 중단하십시오. 신속하게 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛을 M9 완충액에 재현탁시켜 세척을 세 번 반복한다.
- 펠렛을 S 배지에 재현탁시킨다. 선충류 잔류 물이 중력에 의해 2-3 분 동안 정착하게하고 계란은 상청액에 남아 있습니다.
- 상청액을 새로운 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 흡인하십시오. 1분 동안 1000 × g 에서 원심분리하여 알을 수집한다.
- 상층액의 ~ 80 %를 버리고 계란을 20 mL의 S 배지가 들어있는 멸균 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 진탕기에 넣고 120 rpm에서 음식없이 하룻밤 동안 계란을 배양하여 동기화 된 L1 선충류를 얻었다.
2. PolyQ 응집 분석
- polyQ 응집 분석을 위한 선충류의 제조
- AM141의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50 (0.7-0.8의 OD570) 및 5 mg/mL의 아스트라갈란을 함유하는500 μL의 S 배지와 함께 48-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.
- 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 20°C 및 120 rpm에서 24, 48, 72, 및 96 h 동안 인큐베이션한다.
- 선충류를 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 수확하고 M9 완충액으로 세척하여 >3회 원심분리(1분 동안 1000 × g )하여 잔존하는 OP50을 제거하였다. AM141 선충류를 M9 버퍼에 재현탁하고 이미지 획득 준비를 유지하십시오.
- 형광 이미지 수집 및 데이터 분석
참고: 데이터는 이 고함량 이미징 시스템으로 자동으로 분석됩니다. 자동화된 영상화 장치를 사용할 수 없는 경우, 영상 획득을 위한 아가로스 패드를 제조하는 종래의 방법은 일반적인 형광 현미경 7,15,17을 사용하여 유사한 성능을 달성하는데 사용될 수 있다(단계 3.2 및 3.3 참조).- 10-15 선충류를 384-웰 플레이트 (웰 당 최종 부피 80 μL)의 각 웰로 옮깁니다. 각 치료에 대해 10개의 복제 웰을 설정합니다.
- 각 웰에 200mM 아지드 나트륨 10μL를 첨가하여 선충류를 마비시키고 바닥까지 가라앉히게 한다(5-10분).
- 플레이트를 고함량 이미징 시스템에 배치하여 형광 이미지를 획득하십시오(장치 및 소프트웨어 정보에 대한 자료 표 참조).
- 이미지 수집 소프트웨어를 열고 다음 매개 변수를 설정합니다.
- 플레이트 획득 설정 창을 열고 새 실험 세트와 이름을 생성합니다.
- 배율을 2배로, 카메라 비닝을 1로, 플레이트 유형을 384웰 플레이트로 선택합니다.
- 방문 할 우물과 사이트 (단일 사이트)를 설정하십시오.
- 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 필터를 선택하고 이미지 기반 초점 옵션을 활성화합니다.
- 노출을 300ms로 설정합니다.
참고: 위의 설정은 이미징 파라미터를 최적화하기 위해 테스트하고 조정할 수 있습니다. - 이미지 수집 설정을 저장하고 플레이트 획득 버튼을 클릭하여 실행하십시오.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 데이터를 분석합니다.
- 플레이트 데이터 검토 창을 열고 이미지 분석을 위한 테스트 플레이트를 선택합니다.
- 테스트 웰을 두 번 클릭하여 해당 이미지를 표시합니다.
- 분석 방법으로 핵 수를 선택하고 설정 구성 버튼을 클릭하여 다음 설정에 대한 창을 불러옵니다.
- FITC 채널에서 소스 이미지를 정의하고 표준 알고리즘을 선택합니다.
- 이미지 분석 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 대략적인 최소 폭 = 10 μm (= 2 픽셀); 대략적인 최대 너비 = 50 μm (= 12 픽셀); 지역 배경 위의 강도 = 1,000-2,000 회색 수준.
- 현재 설정을 테스트하여 분석 방법을 최적화합니다.
- 설정을 저장하고 모든 웰에서 분석을 실행합니다.
참고: 하나의 384웰 플레이트에 대한 분석을 완료하는 데 ~20분이 걸립니다. - 총 핵을 각 웰의 Q40::YFP 응집체의 총 수로 내보냅니다.
- 각 우물에있는 선충류의 수를 계산하십시오.
- 각 그룹의 선충류 당 Q40::YFP 응집체의 평균 수를 계산하고 각 시점의 데이터에 비선형 곡선을 적용합니다.
- 아래의 eq (1)을 사용하여 억제 지수를 계산하십시오.
억제 지수 =
(1)
여기서 N 대조군 및 N샘플은 각각대조군 및 치료군에서의 Q40::YFP 응집체의 평균 수이다.
(1)3. PolyQ 매개 신경독성 분석
- 시험 표본을 사용한 C. elegans의 치료
- polyQ 신경독성 분석을 위한 선충류를 제조하기 위해, HA759의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50 (0.7-0.8의 OD570) 및 5 mg/mL의 아스트라갈란을 포함하는500 μL의 S 배지가 있는 48-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.
- 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 15°C 및 120 rpm에서 3일 동안23일 동안 인큐베이션한다.
- 원심분리로 선충류를 수집하고 M9 완충액으로 3-5 번 세척하십시오. 선충류를 M9 완충액에 재현탁시켜 뉴런 생존 및 회피 분석에 사용하십시오.
- 아가로스 패드의 제조
- M9 버퍼 100mL(2%, w/v)에 아가로스 2g을 넣고 전자레인지에서 아가로스 용액을 가열하여 거의 끓인다.
- 용융된 아가로오스 0.5 mL를 2mm 두께의 유리판 두 조각 사이에 놓인 1mm 두께의 현미경 유리 슬라이드의 중앙에 분배한다. 다른 슬라이드로 세로로 덮습니다. 아가로스가 식고 응고되면 상단 슬라이드를 부드럽게 제거하십시오.
- ASH 뉴런 생존 분석
- 아가로스 패드 상에 20 mM 소듐 아지드의 방울을 첨가한다. 15-20 HA759 선충류를 방울로 옮겨 고정시킵니다.
- 커버 슬립을 선충류 위에 부드럽게 놓습니다. 슬라이드를 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 보관하십시오. 40x 대물 렌즈와 FITC 필터를 선택하여 선충류의 머리 영역에서 GFP 양성 ASH 뉴런을 검출하십시오.
- 각 그룹에서 50 개 이상의 선충류를 무작위로 선택하여 머리 영역에 GFP 표지 된 양측 ASH 뉴런이있는 선충류의 수를 계산하십시오7. 아래의 eq (2)를 사용하여 ASH 뉴런의 생존율을 계산하십시오.
뉴런 생존율(%) =
(2)
여기서 N생존 및 N총 계는 GFP 양성 ASH 뉴런을 가진 선충류의 수와 각 그룹에서 각각 시험된 선충류의 수이다.
- 삼투압 회피 분석
- 무식품 NGM 플레이트 (9cm)를 중간에 8M 글리세롤 (~ 30 μL) 라인으로 정상 (N) 및 트랩 (T) 구역으로 나눕니다. 글리세롤 라인으로부터 ∼1 cm 떨어진 곳에 200 mM 소듐 아지드(∼20 μL) 라인을 퍼뜨려 글리세롤 장벽을 통과하여 구역 T로 횡단하는 선충류를 마비시킨다.
- 각 그룹에 대해 세 개의 복제 플레이트의 영역 N에 각각 ~ 200 개의 선충류를 옮깁니다. 선충류를 유인하기 위해 Zone T (플레이트 가장자리에서 1cm)에 1 % 부탄디온 (~ 2 μL)을 떨어 뜨립니다. 페트리 접시의 뚜껑을 즉시 덮고, 23°C에서 90분 동안 인큐베이션한다.
- 현미경으로 N 및 T 구역의 선충류 수를 채점하십시오. eq (3)20을 사용하여 회피 지수를 계산하십시오.
회피 지수 =
(3)
여기서 N과 T는 각각 N 및 T 구역 내의 선충류의 수이다. 데이터는 ±3 독립적인 실험을 대표>는 3번의 반복실험의 표준 편차(SD)의 평균으로 제시된다. - 쌍을 이루지 않은 두 꼬리 t-검정을 수행하여 황기와 대조군의 데이터를 비교합니다.
(2)
(3)4. 레이더 차트 만들기
- 그래프 소프트웨어를 열고 다른 분석의 데이터를 새 시트로 가져옵니다. A(X) 열을 방사형 축의 제목으로, A(Y) 열을 대조군의 데이터로, B(Y) 열을 치료 그룹의 데이터로 입력합니다.
- 필요한 데이터를 선택하고 플롯을 클릭 | 전문화: 도구 모음 메뉴의 레이더 버튼을 사용하여 레이더 차트를 생성합니다.
- 방사형 축을 두 번 클릭하고 필요에 따라 각 축의 배율, 눈금 및 눈금 레이블을 조정합니다.
- 메뉴에서 파일을 클릭하고 그래프 내보내기를 선택하여 이미지를 *.tiff로 저장합니다.
참고: 자료 표의 소프트웨어 웹 사이트는 레이더 차트 작성에 대한 자세한 도움말 문서 및 비디오 자습서를 제공합니다.
Representative Results
형질전환 폴리Q 균주 AM141은 그의 체벽 근육 세포 7,21에서 Q40::YFP 융합 단백질을 강하게 발현한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 이 균주의 분리된 응집체 표현형은 본 문서에 기술된 자동화된 이미징 및 분석 프로토콜에 의해 확인될 수 있다. AM141 선충류에서 Q40::YFP 응집체의 양은 L1 단계에서 48 시간 후에 유의하게 증가하였다. 그러나, 이러한 증가 경향은 황기 처리에 의해 억제되었고(도 1B), 폴리Q 응집에 대한 황기의 보호 가능성을 입증하였다. 일반적으로 72 h 또는 96 h는 시험 샘플의 응집 방지 효과를 평가하기 위해 Q40::YFP 응집체를 계수하는 시점으로 편리하게 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, AM141 선충류의 형광 응집체는 자동화된 이미징 시스템에 의해 포획되었지만, 형광 현미경은 또한 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다7.
C. elegans 균주 HA759는 감각 ASH 뉴런에서 GFP 마커 및 Htn-Q150을 모두 발현하여 이러한 뉴런11,13의 점진적 손실 및 기능 장애를 유발합니다. 선충류를 ASH 뉴런 생존력을 확인하기 위해 2% 아가로스 패드에 장착하고(도 2A), ASH 뉴런을 검출하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 선충류의 머리 영역에서 양측 ASH 뉴런에서 GFP 형광의 손실은 ASH 뉴런 사멸을 나타낸다(도 2B). HA759 선충류에서 ASH 뉴런의 생존율은 15°C에서 3일 동안 배양한 후 대조군에서 <40%이며, 7,20%이며, 이는 polyQ 매개 신경독성을 나타낸다. 따라서, 이러한 ASH 뉴런 생존 분석은 C. elegans 뉴런에 대한 시험 화합물의 효과, 예를 들어, 포리아 글리칸이 아닌 황기의 신경 보호 효과를 시각적으로 평가하는데 사용될 수 있다(도 2C).
행동 기능 장애는 polyQ 질환에서 주요 임상 증상이기 때문에, 많은 수의 HA759 선충류를 사용하는 화학 감각 회피 분석 (도 3A)은 polyQ 응집에 의해 매개되는 ASH 뉴런의 기능적 손실에 대한 시험 샘플의 효과를 조사하기 위해 단순화 된 테스트로 설계되었습니다. 도 3B에 나타난 바와 같이, 미처리 대조군에서 HA759 선충류의 회피지수는 ∼0.5였으며, 이는 이전에 보고된것과 유사한 14이었다. 흥미롭게도, 회피지수는 3일 동안 15°C에서 황기로 처리된 선충류에서 >0.6으로 증가하였고(도 3B), 행동 장애에 대한 다당류의 신경 보호 효과를 입증하였다.
시험 화합물의 전반적인 신경 보호 능력을 평가하기 위해, 상기 개별 분석의 데이터를 통합하고 여러 표현형에 대한 레이더 차트로 제시할 수 있으며, 이는 직접 비교 및 직접 보기에 적합한 폴리Q 표현형의 통일된 특징이 된다. 도 4에 나타난 바와 같이, 황기 처리군에서의 삼각형의 면적은 대조군의 면적보다 크고, 다당류의 항-polyQ 효과를 나타낸다.
도 1: polyQ40 응집에 대한 황기의 효과 . (A) 20°C에서 96시간 동안 황기 유무에 관계없이 처리한 후 AM141 선충류의 대표적인 이미지. 형광 이미지 (왼쪽 패널)는 고함량 이미징 및 분석 시스템을 사용하여 384 웰 플레이트에서 획득되었으며 Q40 : : YFP 응집체 (오른쪽 패널)는 시스템에 의해 자동으로 식별되었습니다. 인셋은 polyQ 응집체를 보여주는 선충류 이미지의 확대 된 뷰입니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) Q40::YFP 응집체의 정량화. AM141 선충류 중의 Q40::YFP 응집체의 수를 20°C에서 황기 유무에 관계없이 처리한 후 4일 동안 매 24h마다 고함량 이미징 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 각 그룹에서 대략 100-150 선충류가 각 시점에서 집계에 대해 점수가 매겨졌다. 결과는 선충류당 평균 응집체 수를 기준으로 적합곡선으로 나타내었다. 약어: 폴리Q = 폴리글루타민; YFP = 황색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: Htn-Q150 매개 ASH 뉴런 사멸에 대한 황기의 효과. (A) 아가로스 슬라이드 제제의 개략도. (b) 400x 배율을 이용한 ASH 뉴런 생존 및 사멸을 갖는 HA759 선충류의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 20 μm. HA759 선충류를 L1로부터 3일 동안 15°C에서 황기 유무에 관계없이 처리한 후 형광현미경을 이용하여 촬영하였다. (C) 폴리Q 매개 ASH 뉴런 사멸에 대한 황기의 보호 효과. 복령술, 복령의 다당류인 복령을 대조군으로 사용하였다. 데이터는 세 개 이상의 독립적인 실험을 대표±는 세 번의 반복실험의 SD를 의미한다. 통계적 분석은 대조군의 데이터를 황기 및 복령 글리칸 그룹의 데이터와 비교하기 위해 쌍을 이루지 않은 두 꼬리 t-검정을 사용하여 수행되었다. *p < 0.05; ns = 유의하지 않음. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: Htn-Q150-매개된 행동 기능장애에 대한 황기의 효과. (A) 회피 분석 플레이트의 모식도. (B) 회피 분석의 대표적인 결과. 회피 지수는 N 구역 내의 선충류와 플레이트 상의 선충류의 총 수의 비로서 정의되었다. 결과는 세 번의 독립적인 실험을 대표±는 세 번의 반복실험의 SD를 의미한다. 회피 지수의 통계적 분석은 짝을 이루지 않은, 두 꼬리 t-검정을 사용하여 수행되었다. **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 아스트라갈란의 전반적인 신경 보호 능력. 세 가지 다른 분석의 데이터를 OriginPro 소프트웨어로 가져와 레이더 차트를 만들고, 이 차트는 polyQ에 의해 매개되는 여러 표현형에 대한 황기의 일반적인 효과를 프로파일링하기 위해 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
polyQ 응집 및 단백질 독성은 헌팅턴병13과 같은 polyQ 장애의 중요한 특징이므로, AM141 균주의 polyQ 응집 분석, HA759 균주에서의 ASH 뉴런 생존 분석, HA759 균주에서의 화학감각 회피 검정을 포함하는 시험 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해 여러 모델 및 방법의 사용을 권장합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 polyQ 응집 및 관련 신경 독성 7,14,15,16,17,19,20에 대한 억제 효과를 포함하여 polyQ 독성에 대한 테스트 샘플의 신경 보호 능력을 평가하는 데 사용되어 HD 및 기타 polyQ 질환에 대한 약물 발견에서의 잠재력을 입증합니다.
자동화된 이미징 및 분석 시스템이 polyQ 응집체 분석에서 폴리Q 응집체의 검출 및 계수를 위해 도입된다. 이 방법은 높은 처리량과 시간 효율적이라는 장점이 있으며 까다로운 계산 프로세스에서 주관적인 오류를 크게 줄입니다. 전체 384웰 플레이트의 경우 이미지 수집 및 분석을 완료하는 데 <1시간 밖에 걸리지 않습니다. 그러나, 종래의 현미경 영상화 방법도 자동화 영상화 장치(7)를 사용하지 않고 이 실험실에서 유사한 성능을 나타내었다.
치료 당 총 100-150 선충류는 각 시점마다 전형적인 Q40::YFP 응집 분석에서 권장되며, 이는 각각 10-15 개의 선충류를 함유 한 복제 웰에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 L1 유충은 일부 치료 또는 더 높은 농도에 더 민감 할 수 있습니다. 따라서, 시험 화합물의 더 높은 투여량은 그들의 성장을 억제할 수 있고, 느린 성장으로 인한 위양성 결과를 초래할 수 있고, 따라서, 지연된 polyQ 응집으로 인해. 보통, 식품 클리어런스 분석은 이러한 우려를 해결하고 시험 화합물23의 적절한 농도 범위를 보장하기 위해 수행될 수 있다.
polyQ 신경독성 분석에 사용되는 HA759 형질전환 선충류는 OSM-10::GFP 및 Htn-Q150을 공동 발현하므로 양측 ASH 감각 뉴런을 명확하게 식별할 수 있습니다. 따라서, ASH 뉴런 생존은 GFP 발현의 존재 또는 부재에 의해 평가되고; 일반적으로 통제 선충류의 ASH 뉴런의 ~ 40-75 %는23,24 명이 사망했습니다. 흥미롭게도, HA759 균주에서 pqe-1(폴리글루타민 인핸서-1) 유전적 돌연변이 배경(pqe-1; Htn-Q150)은 polyQ 매개 독성을 가속화하여 15°C에서도 3일 이내에 대부분의 ASH 뉴런의 사멸을 유도하며, 따라서 이 균주는 이전에 보고된23,24와 같이 뉴런 생존 분석을 위해 15°C에서 성장한다.
HA759 선충류에서 ASH 뉴런의 기능적 손실은 세포 사멸 및 단백질 응집체의 검출 전에 발생할 수 있다13; 따라서, 삼투압 회피 거동 분석은 폴리Q 매개 독성의 평가에 필수적이다. 저온에서 덜 활성인 HA759 선충류가 행동 실험에 미치는 잠재적 영향을 최소화하기 위해, 회피 분석 플레이트는 이 균주를 사용하는 뉴런 생존 분석에서와 같이 15°C에서가 아니라 가습된 23°C 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 또한, Htn-Q150/OSM-10::GFP 형질전환 선충류는 코 접촉에 매우 민감하다는 것이 보고되었다; 따라서, ASH 뉴런 기능의 대안적인 검출은 코 터치 분석(13)이다.
Disclosures
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는이 논문에 사용 된 프로토콜을 개발하고 개선하는 데 도움을 준 Huang Lab의 전 회원, 특히 Hanrui Zhang, Lingyun Xiao 및 Yanxia Xiang에게 감사드립니다. 이 작업은 111 프로젝트 (보조금 번호 B17018)와 허베이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 H2020207002)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
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