Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma de neuroprotektiva aktiviteterna hos testföreningar i Caenorhabditis elegans, inklusive polyglutaminaggregering, neuronal död och kemoavoidance-beteende, samt en exemplifierande integration av flera fenotyper.
Abstract
Åldersrelaterad felveckning och aggregering av patogena proteiner är ansvariga för flera neurodegenerativa sjukdomar. Till exempel drivs Huntingtons sjukdom (HD) huvudsakligen av en CAG-nukleotidupprepning som kodar för ett expanderat glutaminkanal i huntingtinprotein. Således är hämningen av polyglutamin (polyQ) aggregering och i synnerhet aggregeringsassocierad neurotoxicitet en användbar strategi för förebyggande av HS och andra polyQ-associerade tillstånd. Detta dokument introducerar generaliserade experimentella protokoll för att bedöma testföreningarnas neuroprotektiva kapacitet mot HS med hjälp av etablerade polyQ-transgena Caenorhabditis elegans-modeller . AM141-stammen väljs för polyQ-aggregeringsanalysen eftersom en åldersassocierad fenotyp av diskreta fluorescerande aggregat lätt kan observeras i dess kroppsvägg vid vuxenstadiet på grund av muskelspecifikt uttryck av polyQ::YFP-fusionsproteiner. Däremot används HA759-modellen med starkt uttryck av polyQ-expanderade kanaler i ASH-neuroner för att undersöka neuronal död och kemoavoidance-beteende. För att omfattande utvärdera den neuroprotektiva kapaciteten hos målföreningar presenteras ovanstående testresultat slutligen som ett radardiagram med profilering av flera fenotyper på ett sätt som direkt jämförelse och direkt visning.
Introduction
Progressiv neurodegeneration i HD involverar patogent mutant huntingtin med en onormal sträcka av polyQ kodad av CAG-trinukleotid upprepar 1,2,3. Muterade huntingtinproteiner med mer än 37 glutaminupprepningar är benägna att aggregera och ackumuleras i hjärnan hos HS-patienter och djurmodeller 4,5, vilket i slutändan leder till neurodegeneration6. Trots bristen på klarhet om rollerna för polyQ-aggregat i sjukdomspatologi5 är hämningen av polyQ-aggregering och dess associerade toxicitet en användbar terapeutisk strategi för HS och andra polyQ-sjukdomar 4,7,8.
På grund av bevarandet i neuronala signalvägar och lättkonstruerade transgena sjukdomsmodeller har Caenorhabditis elegans använts i stor utsträckning som en viktig modellorganism för undersökning av neurologiska störningar 9,10,11,12. Till exempel kan transgena C. elegans-modeller som uttrycker aggregeringsbenägna polyQ-expansioner objektivt efterlikna HD-liknande egenskaper såsom selektiv neuronal cellförlust, cytoplasmatisk aggregatbildning och beteendedefekter13. Undersökning av de potentiella effekterna av testprover för att vända dessa fenotyper i etablerade polyQ-nematodmodeller har lett till identifiering av en mängd lovande terapeutiska kandidater, t.ex. polysackarider 7,14,15, oligosackarider16, naturliga små molekyler 17,18 och örtextrakt och formler 19,20.
Här beskrivs två huvudsakliga polyQ C. elegans-modeller och relevanta protokoll för potentiella tillämpningar, vilket exemplifieras av studien på astragalan, en polysackarid isolerad från Astragalus membranaceus7. För polyQ-aggregeringsanalysen i C. elegans är modellen som används den transgena stammen AM141, som visar fluorescerande puncta dispergerad i kroppsväggsmuskeln när den når vuxen ålder på grund av uttrycket av Q40::YFP-fusionsproteinet, ett polyQ-område med 40 rester (polyQ40) smält till gult fluorescerande protein (YFP)21,22 . Stammen HA759 användes för att undersöka neuronal överlevnad och kemoavoidance beteende eftersom det uttrycker både grönt fluorescerande protein (GFP) och Htn-Q150 (en human huntingtin-härledd polyQ-kanal med 150 rester) starkt i ASH-neuroner men svagt i andra neuroner, vilket resulterar i progressiv neurodegeneration och ASH-celldöd 7,13. En omfattande sammanfattning av den neuroprotektiva potentialen hos terapeutiska kandidater tillhandahålls genom att integrera resultat från olika analyser.
Protocol
OBS: Se tabell 1 för recept på lösningar som används i detta protokoll.
1. Beredning av material för Caenorhabditis elegans-analysen
- Underhåll av C. elegans-stammar
- Få C . elegans (AM141 och HA759) och Escherichia coli (OP50 och NA22) stammar (se materialtabellen).
- Behåll nematoderna på plattan för nematodtillväxtmedier (NGM) som är seedade med E. coli OP50 vid 20 °C förAM141 21 eller 15 °C för HA75923.
- Framställning av E. coli OP50 bakteriekultur
- Välj en enda koloni av E. coli OP50 från en Luria-Bertani (LB) strimplatta och inokulera den i 50 ml flytande LB-kultur.
- Inkubera OP50-bakterierna i en shaker vid 37 °C och 200 rpm tills en optisk densitet på ~0,5 vid 570 nm (OD570).
- Förvara OP50-bakteriekulturen vid 4 °C och använd den inom två veckor.
- Beredning av NGM-plattor med OP50-bakterier
- Tillsätt 20 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl och 975 ml avjoniserat vatten till en 1 L autoklaverbar flaska. Autoklav vid 121 °C i 30 min.
- Placera den flytande NGM-agarflaskan på bänken för att svalna till ~60 °C och tillsätt sedan följande sterila stamlösningar: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg/ml kolesterol och 25 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6,0).
- Häll 20 ml NGM i en steril 90 mm petriskål och låt plattorna stå på bänken för att svalna och stelna. Håll plattorna upp och ner och låt dem torka på bänken vid rumstemperatur i 2 dagar.
- Fördela 200 μl av OP50-bakteriekulturen på varje NGM-platta och sprid jämnt med en steril glasbeläggningsstav. Stäng locken och inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
- Förvara NGM-plattorna sådda med OP50 i en plastlåda med lock i rumstemperatur och använd dem inom två veckor.
- Framställning av ålderssynkroniserad C. elegans-population
- Samla gravida vuxna nematoder i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 1000 × g i 1 min. Tvätta tre gånger och återsuspendera nematoderna i M9-buffert.
- Tillsätt en lika stor volym blekmedelslösning och rör om försiktigt i 3-5 minuter. Övervaka blekningen var 15: e sekund under ett dissekeringsmikroskop.
OBS: Blekmedelslösningen måste beredas nyligen före användning genom att blanda lika stora volymer på 10% NaOCl och 1 M NaOH (tabell 1)20. - När de flesta nematoderna är trasiga, stoppa matsmältningen genom att späda ut med M9-buffert. Centrifugera snabbt för att ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i M9-buffert för att upprepa tvätten tre gånger.
- Resuspendera pelleten i S-medium. Låt nematodresterna lägga sig vid tyngdkraften i 2-3 min medan äggen ligger kvar i supernatanten.
- Aspirera supernatanten i ett nytt sterilt mikrocentrifugrör. Samla äggen genom centrifugering vid 1000 × g i 1 min.
- Kassera ~ 80% av supernatanten och överför äggen till en steril kolv som innehåller 20 ml S-medium. Placera kolven i en shaker och inkubera äggen över natten utan mat vid 120 rpm för att erhålla synkroniserade L1-nematoder.
2. PolyQ-aggregeringsanalys
- Beredning av nematoder för polyQ-aggregeringsanalysen
- Överför 300-500 synkroniserade L1-larver av AM141 till varje brunn på en 48-brunnsplatta med 500 μL S-medium innehållande OP50 (OD570 av 0,7-0,8) och 5 mg / ml astragalan, vanligtvis en brunn per behandling under en tidpunkt.
- Försegla plattan med parafilm och inkubera vid 20 °C och 120 rpm i 24, 48, 72 och 96 timmar.
- Skörda nematoderna i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör och tvätta med M9-buffert >3 gånger genom centrifugering (1000 × g i 1 min) för att avlägsna den återstående OP50. Resuspendera AM141-nematoderna i M9-bufferten och håll dem redo för bildinsamling.
- Förvärv av fluorescerande bilder och dataanalys
OBS: Data analyseras automatiskt med detta bildsystem med högt innehåll. Om en automatiserad bildbehandlingsanordning inte är tillgänglig kan en konventionell metod för att förbereda en agarosplatta för bildinsamling användas för att uppnå liknande prestanda genom att använda ett vanligt fluorescerande mikroskop 7,15,17 (se steg 3.2 och 3.3).- Överför 10-15 nematoder till varje brunn i en 384-brunnsplatta (slutlig volym 80 μl per brunn). Ställ in 10 replikatbrunnar för varje behandling.
- Tillsätt 10 μL 200 mM natriumazid till varje brunn för att förlama nematoderna och låt dem sätta sig ner till botten (5-10 min).
- Placera plattan i ett bildsystem med högt innehåll för att få fluorescerande bilder (se materialförteckningen för enhets- och programvaruinformation).
- Öppna programvaran för bildförvärv och ställ in följande parametrar.
- Öppna fönstret Inställningar för plåtanskaffning och skapa en ny experimentuppsättning och ett nytt namn.
- Välj Förstoring som 2x, Kamerafack som 1 och Platttyp som 384-brunnsplatta.
- Ställ in brunnar och platser (en enda plats) som ska besökas.
- Välj filtret fluoresceinitiocyanat (FITC) och aktivera bildbaserade fokuseringsalternativ.
- Ställ in exponeringen som 300 ms.
OBS: Ovanstående inställningar kan testas och justeras för att optimera bildparametrarna. - Spara inställningar för bildförvärv och klicka på knappen Hämta platta för att köra.
- Analysera bilddata med hjälp av bildanalysprogramvaran.
- Öppna fönstret Granska platta data och välj testplattan för bildanalys.
- Dubbelklicka på en testbrunn för att visa dess bild.
- Välj Count Nuclei som analysmetod och klicka på knappen Konfigurera inställningar för att få fram ett fönster för följande inställningar.
- Definiera källbilden från FITC-kanalen och välj standardalgoritmen.
- Ställ in bildanalysparametrarna enligt följande: ungefärlig minsta bredd = 10 μm (= 2 pixlar); ungefärlig maximal bredd = 50 μm (= 12 pixlar); intensitet över lokal bakgrund = 1 000-2 000 grånivåer.
- Testa de aktuella inställningarna för att optimera analysmetoden.
- Spara inställningarna och kör analysen på alla brunnar.
OBS: Det tar ~ 20 minuter att slutföra analysen för en 384-brunnsplatta. - Exportera totalkärnorna som det totala antalet Q40::YFP-aggregat i varje brunn.
- Räkna antalet nematoder i varje brunn.
- Beräkna det genomsnittliga antalet Q40::YFP-aggregat per nematod i varje grupp och tillämpa en olinjär kurva som passar data från varje tidpunkt.
- Beräkna hämningsindex med hjälp av eq (1) nedan:
Hämningsindex =
(1)
DärN-kontroll ochN-prov är det genomsnittliga antalet Q40::YFP-aggregat i kontroll- respektive behandlingsgrupperna.
(1)3. PolyQ-medierade neurotoxicitetsanalyser
- Behandling av C. elegans med testprover
- För att förbereda nematoder för polyQ-neurotoxicitetsanalysen, överför 300-500 synkroniserade L1-larver av HA759 till varje brunn på en 48-brunnsplatta med 500 μL S-medium innehållande OP50 (OD570 av 0,7-0,8) och 5 mg / ml astragalan, vanligtvis tre replikatbrunnar för varje behandling.
- Förslut plattan med parafilm och inkubera vid 15 °C och 120 rpm i 3 dagar23.
- Samla nematoderna genom centrifugering och tvätta 3-5 gånger med M9-buffert. Återsuspendera nematoderna i M9-bufferten för användning i neuronala överlevnads- och undvikande analyser.
- Beredning av agaroskudde
- Tillsätt 2 g agaros till 100 ml M9-buffert (2 %, w/v) och värm agaroslösningen i en mikrovågsugn till nästan kokande.
- Fördela 0,5 ml smält agaros på mitten av en 1 mm tjock mikroskopiglasskiva placerad mellan två bitar av 2 mm tjocka glasplattor. Täck med en annan bild vertikalt. När agarosen har svalnat och stelnat, ta försiktigt bort den övre bilden.
- ASH neuronal överlevnadsanalys
- Tillsätt en droppe 20 mM natriumazid på agarosdynan. Överför 15-20 HA759 nematoder i droppen för att immobilisera dem.
- Placera en täckglas försiktigt över nematoderna. Förvara bilden under ett fluorescensmikroskop utrustat med en digitalkamera. Välj en 40x objektivlins och FITC-filter för att detektera GFP-positiva ASH-neuroner i nematodernas huvudregion.
- Välj mer än 50 nematoder i varje grupp slumpmässigt för att räkna antalet nematoder med GFP-märkta bilaterala ASH-neuroner i deras huvudregion7. Beräkna överlevnadsgraden för ASH-neuroner med hjälp av eq (2) nedan.
Neuronal överlevnad (%) =
(2)
DärN-överlevnad och Ntotalt är antalet nematoder med GFP-positiva ASH-neuroner respektive det totala antalet testade nematoder i varje grupp.
- Osmotisk undvikande analys
- Dela en matfri NGM-tallrik (9 cm) i normala (N) och fälla (T) zoner med en 8 M glycerol (~ 30 μL) linje i mitten. Sprid en 200 mM natriumazidlinje (~ 20 μL) vid ~ 1 cm avstånd från glycerollinjen för att förlama nematoderna som passerar genom glycerolbarriären till zon T.
- Överför ~200 nematoder vardera till zon N med tre replikatplattor för varje grupp. Lägg till en droppe på 1% butanedion (~ 2 μL) på zon T (1 cm från plattkanten) för att locka nematoderna. Täck omedelbart över locket på petriskålen och inkubera vid 23 °C i 90 minuter.
- Poäng antalet nematoder på N- och T-zonerna under ett mikroskop. Beräkna undvikandeindex med hjälp av eq (3)20.
Undvikande index =
(3)
Där N och T är antalet nematoder i N- respektive T-zoner. Data presenteras som medel ± standardavvikelse (SD) för tre replikat, representativa för >3 oberoende experiment. - Utför ett oparat, tvåsidigt t-test för att jämföra data från astragalan- och kontrollgrupperna.
(2)
(3)4. Skapa ett radardiagram
- Öppna grafprogramvaran och importera data från olika analyser till ett nytt ark. Ange kolumnen A(X) som rubriker för de radiella axlarna, kolumnen A(Y) som data från kontrollgruppen och kolumnen B(Y) som data från behandlingsgruppen.
- Välj önskad data och klicka på Plot | Specialiserad: Radarknapp i verktygsfältets meny för att generera ett radardiagram.
- Dubbelklicka på den radiella axeln och justera etiketterna Skala, Markera och Markera för varje axel efter behov.
- Klicka på Arkiv i menyn och välj Exportera grafer för att spara bilden som *.tiff.
OBS: Programvaruwebbplatserna i materialtabellen tillhandahåller detaljerade hjälpdokument och videohandledning om hur du skapar radardiagram.
Representative Results
Den transgena polyQ-stammen AM141 uttrycker starkt Q40::YFP-fusionsproteiner i sina kroppsväggsmuskelceller 7,21. Som visas i figur 1A kan den diskreta aggregerade fenotypen för denna stam identifieras med det automatiserade avbildnings- och analysprotokollet som beskrivs i denna artikel. Mängden Q40::YFP-aggregat i AM141-nematoder ökade signifikant efter 48 timmar från L1-stadiet. Denna tendens att öka hämmades dock av astragalanbehandling (figur 1B), vilket visar den skyddande potentialen hos astragalan mot polyQ-aggregering. Vanligtvis kan antingen 72 h eller 96 h bekvämt användas som tidpunkter för att räkna Q40::YFP-aggregat för att utvärdera antiaggregeringseffekten av testprover. I detta protokoll fångades de fluorescerande aggregaten av AM141-nematoden av ett automatiserat bildsystem, även om fluorescensmikroskop också kan användas för detta ändamål7.
C. elegans-stammen HA759 uttrycker både GFP-markören och Htn-Q150 i sina sensoriska ASH-neuroner, vilket leder till progressiv förlust och dysfunktion av dessa nervceller11,13. Nematoderna monterades på 2% agaroskuddar för att bestämma ASH-neuronal livskraften (figur 2A) och visualiserades mikroskopiskt för att detektera ASH-neuronerna. En förlust av GFP-fluorescens i bilaterala ASH-neuroner i huvudregionerna av nematoder indikerar ASH-neuronaldöden (figur 2B). Överlevnaden för ASH-neuroner i HA759-nematoder är <40 % i kontrollgruppen efter inkubation vid 15 °C i 3 dagar 7,20, vilket indikerar polyQ-medierad neurotoxicitet. Därför kan denna ASH-neuronala överlevnadsanalys användas för att visuellt utvärdera effekterna av testföreningar på C. elegans-neuroner, t.ex. den neuroprotektiva effekten av astragalan men inte Poria-glykan (figur 2C).
Eftersom beteendedysfunktion är ett viktigt kliniskt symptom vid polyQ-sjukdomar, är den kemosensoriska undvikande analysen (figur 3A) med ett stort antal HA759-nematoder utformad som ett förenklat test för att undersöka effekten av testprover på den funktionella förlusten av ASH-neuroner medierade av polyQ-aggregering. Som visas i figur 3B var undvikandeindexet för HA759 nematoder i den obehandlade kontrollgruppen ~0,5, liknande det som rapporterades tidigare14. Intressant nog ökade undvikandeindexet till >0,6 i nematoderna som behandlades med astragalan vid 15 °C i 3 dagar (figur 3B), vilket visar en neuroprotektiv effekt av polysackariden mot beteendestörningar.
För att utvärdera den totala neuroprotektiva kapaciteten hos testföreningar kan data från ovanstående individuella analyser integreras och presenteras som ett radardiagram för flera fenotyper, vilket gör det till en förenande egenskap hos polyQ-fenotyper som är lämpliga för direkt jämförelse och direkt visning. Som visas i figur 4 är triangelns yta i astragalanbehandlingsgruppen större än kontrollgruppens, vilket indikerar poly-polyQ-effekterna av polysackariden.
Figur 1: Effekt av astragalan på polyQ40-aggregering. De fluorescerande bilderna (vänstra paneler) förvärvades från 384-brunnsplattor med hjälp av ett bild- och analyssystem med högt innehåll, och Q40: : YFP-aggregaten (högra paneler) identifierades automatiskt av systemet. Infällningar är de förstorade vyerna av nematodbilder som visar polyQ-aggregaten. Skalstaplar = 500 μm. (B) Kvantifiering av Q40::YFP-aggregat. Antalet Q40::YFP-aggregat i AM141-nematoder övervakades med hjälp av höginnehållsavbildningssystemet var 24:e timme i 4 dagar efter behandling med eller utan astragalan vid 20 °C. Cirka 100-150 nematoder i varje grupp poängsattes för aggregat vid varje tidpunkt. Resultaten visas som anpassade kurvor baserat på det genomsnittliga antalet aggregat per nematod. Förkortningar: polyQ = polyglutamin; YFP = gult fluorescerande protein; FITC = fluoresceinitiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av astragalan på Htn-Q150-medierad ASH-neuronal död. (B) Representativa mikrografer av HA759 nematoder med ASH neuronal överlevnad och död med 400x förstoring. Skalstänger = 20 μm. HA759-nematoderna fotograferades med ett fluorescensmikroskop efter behandling med eller utan astragalan vid 15 °C i 3 dagar från L1. (C) Skyddande effekt av astragalan mot polyQ-medierad ASH-neuronal död. Poria glykan, en polysackarid från Poria cocos, användes som kontroll. Data presenteras som medel ± SD av tre replikat, representativa för mer än tre oberoende experiment. Statistisk analys utfördes med hjälp av ett oparat, tvåsidigt t-test för att jämföra data från kontrollgruppen med data från astragalan- och Poria-glykangrupperna. *p < 0,05; ns = ingen signifikant. Förkortning: GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekt av astragalan på Htn-Q150-medierad beteendemässig dysfunktion. (B) Representativa resultat av undvikande analys. Undvikande index definierades som förhållandet mellan nematoder i N-zonen och det totala antalet nematoder på plattan. Resultaten presenteras som medel ± SD av tre replikat, representativa för tre oberoende experiment. Statistisk analys av undvikande index utfördes med hjälp av ett oparat, tvåsidigt t-test. **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Total neuroprotektiv kapacitet hos astragalan. Data från tre olika analyser importeras till OriginPro-programvaran till ett skapa radardiagram, som presenteras för att profilera den allmänna effekten av astragalan på flera fenotyper medierade av polyQ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Eftersom polyQ-aggregering och proteotoxicitet är viktiga egenskaper hos polyQ-störningar, såsom Huntingtons sjukdom13, rekommenderar vi användning av flera modeller och metoder för att omfattande utvärdera testföreningarnas neuroprotektiva kapacitet, inklusive polyQ-aggregeringsanalysen i AM141-stammen, ASH-neuronala överlevnadsanalysen i HA759-stammen och den kemosensoriska undvikande analysen i HA759-stammen. Protokollen som presenteras här har använts för att utvärdera testprovernas neuroprotektiva kapacitet mot polyQ-toxicitet, inklusive hämmande effekter på både polyQ-aggregering och associerad neurotoxicitet 7,14,15,16,17,19,20, vilket visar deras potential i läkemedelsupptäckt för HS och andra polyQ-sjukdomar.
Ett automatiserat avbildnings- och analyssystem introduceras för detektion och räkning av polyQ-aggregat i polyQ-aggregeringsanalysen. Denna metod har fördelarna med att vara hög genomströmning och tidseffektiv och resulterar i signifikant minskade subjektiva fel i den mödosamma räkningsprocessen. För en hel 384-brunnsplatta tar det bara <1 h att slutföra bildförvärv och analys. Den konventionella mikroskopiska avbildningsmetoden har emellertid också visat liknande prestanda i detta laboratorium utan att använda den automatiserade bildanordningen7.
Totalt 100-150 nematoder per behandling rekommenderas i en typisk Q40::YFP-aggregeringsanalys för varje tidpunkt, som kan utföras i replikatbrunnar som innehåller 10-15 nematoder vardera. Det bör dock noteras att L1-larver kan vara känsligare för vissa behandlingar eller högre koncentrationer. Därför kan högre doser av testföreningar hämma deras tillväxt, vilket leder till falskt positiva resultat på grund av långsam tillväxt och därmed fördröjd polyQ-aggregering. Vanligtvis kan en analys av livsmedelsgodkännande utföras för att ta itu med detta problem och säkerställa lämpligt koncentrationsintervall för testföreningar23.
HA759-transgena nematoder som används i polyQ-neurotoxicitetsanalyser coexpress OSM-10: GFP och Htn-Q150, vilket gör det möjligt att entydigt identifiera bilaterala ASH-sensoriska neuroner. Därför utvärderas ASH-neuronöverlevnad genom närvaron eller frånvaron av GFP-uttryck; vanligtvis är ~ 40-75% av ASH-neuronerna i kontrollnematoderna döda23,24. Intressant är att pqe-1 (polyglutaminförstärkare-1) genetisk mutantbakgrund i HA759-stammen (pqe-1; Htn-Q150) accelererar polyQ-medierad toxicitet, vilket leder till att de flesta ASH-neuroner dör inom tre dagar, även vid 15 °C, och därför odlas denna stam vid 15 °C för den neuronala överlevnadsanalysen, som tidigare rapporterats 23,24.
Funktionell förlust av ASH-neuroner i HA759-nematoder kan inträffa före detektion av celldöd och proteinaggregat13; Därför är analysen av osmotiskt undvikande beteende avgörande för bedömningen av polyQ-medierad toxicitet. För att minimera den potentiella effekten av mindre aktiva HA759-nematoder vid låg temperatur på beteendeexperiment inkuberas undvikande analysplattorna i en fuktad 23 °C-inkubator snarare än vid 15 °C som i neuronala överlevnadsanalysen med hjälp av denna stam. Dessutom har det rapporterats att Htn-Q150/OSM-10::GFP transgena nematoder är mycket känsliga för näsberöring; därför är en alternativ detektion av ASH-neuronfunktionen näskontaktanalysen13.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar tidigare medlemmar i Huang Lab som har hjälpt till att utveckla och förbättra de protokoll som används i detta dokument, särskilt Hanrui Zhang, Lingyun Xiao och Yanxia Xiang. Detta arbete stöddes av 111-projektet (bidragsnummer B17018) och Natural Science Foundation of Hebei Province (bidragsnummer H2020207002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | |||
| AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/AM141 | |
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] |
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli strains | |||
| NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| Reagent | |||
| Agar | Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Butanedione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0 |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| Glycerol | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| Peptone | Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| Sodium azide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| Sodium hypochlorite solution | Guangzhou Chemical Reagent Factory | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| Equipment | |||
| 384-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 761001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 48-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85 |
| 90 mm Petri dish | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Dissecting microscope | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| Fluorescence microscope | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | Mshot MF31-LED | https://www.mshot.com/article/442.html |
| High-content imaging system | Molecular Devices | ImageXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging |
| Microcentrifuge | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Microscope digital camera | Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. | MS60 | https://www.mshot.com/article/677.html |
| Microwave | Midea Corp. | M1-211A | https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product |
| Shaker | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
| Software | |||
| Image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress |
| OriginPro | OriginLab Corp. | Version 9.8.5.204 | 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813 |
References
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
- Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L.
- Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).
- Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
- Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
- Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
- Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
- Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
- Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
- Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
- Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
- Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
- Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
- Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
- Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
- Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
- Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
- Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
- Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).
