Summary
हम माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का उपयोग करके विट्रो में बहुकोशिकीय चिरलता का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बाएं-दाएं पूर्वाग्रहों के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है और स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
चिरलता एक आंतरिक सेलुलर संपत्ति है, जो सेल के बाएं-दाएं अक्ष के साथ ध्रुवीकरण के संदर्भ में विषमता को दर्शाती है। चूंकि यह अद्वितीय संपत्ति विकास और बीमारी दोनों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण बढ़ते ध्यान को आकर्षित करती है, इसलिए सेल चिरलता की विशेषता के लिए एक मानकीकृत परिमाणीकरण विधि अनुसंधान और संभावित अनुप्रयोगों को आगे बढ़ाएगी। इस प्रोटोकॉल में, हम एक बहुकोशिकीय chirality लक्षण वर्णन परख है कि कोशिकाओं के micropatterned सरणियों का उपयोग करता है का वर्णन. सेलुलर माइक्रोपैटर्न को माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के माध्यम से टाइटेनियम / गोल्ड-लेपित ग्लास स्लाइड पर बनाया जाता है। ज्यामितीय रूप से परिभाषित (जैसे, अंगूठी के आकार के), प्रोटीन-लेपित द्वीपों पर सीडिंग के बाद, कोशिकाएं दिशात्मक रूप से माइग्रेट होती हैं और दक्षिणावर्त या वामावर्त दिशा की ओर एक पक्षपाती संरेखण बनाती हैं, जिसे स्वचालित रूप से एक कस्टम-लिखित MATLAB प्रोग्राम द्वारा विश्लेषण और परिमाणित किया जा सकता है। यहां हम माइक्रोपैटर्न्ड सब्सट्रेट्स, सेल सीडिंग, छवि संग्रह और डेटा विश्लेषण के निर्माण का विस्तार से वर्णन करते हैं और एनआईएच / 3 टी 3 कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल को पहले कई प्रकाशित अध्ययनों में मान्य किया गया है और विट्रो में सेल चिरलिटी का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण है।
Introduction
सेल के बाएं-दाएं (एलआर) विषमता, जिसे सेलुलर हैंडनेस या चिरलिटी के रूप में भी जाना जाता है, एलआर अक्ष में सेल ध्रुवीयता का वर्णन करता है और इसे एक मौलिक, संरक्षित, बायोफिजिकल संपत्ति 1,2,3,4,5 माना जाता है। सेल chirality विवो और इन विट्रो दोनों में कई पैमाने पर देखा गया है। पिछले निष्कर्षों से पता चला कि परिपत्रद्वीपों 6 पर सीडेड एकल कोशिकाओं में एक्टिन साइटोस्केलेटन के चिरल घूमते हुए, पक्षपाती प्रवास और सीमित सीमाओं के भीतर कोशिकाओं का संरेखण 7,8,9,10,11, और चिकन हीट ट्यूब12 के विषम लूपिंग।
बहुकोशिकीय स्तर पर, सेल चिरलता को दिशात्मक प्रवास या संरेखण, सेलुलर रोटेशन, साइटोस्केलेटल गतिशीलता और सेल ऑर्गेनेल पोजिशनिंग 7,8,9,10,11,12,13 से निर्धारित किया जा सकता है। हम एक micropatterning आधारित 14 परख की स्थापना की है कुशलतापूर्वक अनुयायी कोशिकाओं के चिरल पूर्वाग्रह 7,8,9,10 की विशेषता है. रिंग के आकार के माइक्रोपैटर्न ज्यामितीय रूप से सीमित सेल क्लस्टर के साथ, कोशिकाएं सामूहिक रूप से दिशात्मक प्रवास और पक्षपाती संरेखण का प्रदर्शन करती हैं। एक MATLAB कार्यक्रम स्वचालित रूप से पता लगाने और अंगूठी के चरण-विपरीत छवियों में सेल संरेखण को मापने के लिए विकसित किया गया था। स्थानीय सेल संरेखण की दिशा को एक पक्षपाती कोण के साथ परिमाणित किया जाता है, जो परिधीय दिशा से इसके विचलन पर निर्भर करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, कोशिकाओं के रिंग पैटर्न को या तो वामावर्त (सीसीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों या दक्षिणावर्त (सीडब्ल्यू) पूर्वाग्रहों के रूप में नामित किया जाता है।
इस परख का उपयोग कई सेल फेनोटाइप (तालिका 1) की चिरलता को चिह्नित करने के लिए किया गया है, और कोशिकाओं की एलआर विषमता को फेनोटाइप-विशिष्ट 7,11,15 पाया गया है। इसके अलावा, एक्टिन गतिशीलता और आकृति विज्ञान में व्यवधान के परिणामस्वरूप चिरल पूर्वाग्रह 7,8 के उलट हो सकते हैं, और ऑक्सीडेटिव तनाव सेल चिरलिटी को भी बदल सकता है। प्रक्रिया की सादगी औरदृष्टिकोण की मजबूती के कारण 7,8,9,10, यह 2 डी chirality परख निर्धारित करने और विट्रो में बहुकोशिकीय chirality का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सेल चिरलता को चिह्नित करने के लिए इस विधि के उपयोग को प्रदर्शित करना है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग तकनीक के माध्यम से पैटर्न वाले सेलुलर सरणियों को कैसे बनाया जाए और MATLAB प्रोग्राम का उपयोग करके स्वचालित फैशन में चिरलिटी विश्लेषण किया जाए।
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Protocol
1. polydimethylsiloxane (PDMS) टिकटोंके निर्माण 16
- 250 μm के एक आंतरिक व्यास और 450 μm के एक बाहरी व्यास के साथ, सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर माइक्रोस्केल छल्ले की एक सरणी ड्रा। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला पैटर्न एक 10 x 10 सरणी है जिसमें छल्ले के बीच 850 μm दूरी है।
- एक microfabrication कंपनी की मुखौटा मुद्रण सेवा का उपयोग कर वांछित रिज़ॉल्यूशन पर पैटर्न की एक पारदर्शिता मुखौटा मुद्रित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: अंगूठी के प्रदान किए गए आयाम कई सेल प्रकार7 के लिए काम करने के लिए साबित किया गया है। - एक नकारात्मक photoresist मोल्ड (जैसे SU-8) 8 बनाने के लिए वांछित सुविधाओं वाले मुखौटा का उपयोग कर पराबैंगनी (यूवी) फोटोलिथोग्राफी का संचालन करें।
- एक सिलिकॉन वेफर स्पिन-1 कदम 1.1-1.2 में गढ़ा पारदर्शिता मुखौटा द्वारा photoresist के साथ लेपित कवर.
- एक यूवी संपर्क संरेखक पर, यूवी प्रकाश द्वारा मुखौटा के पारदर्शी क्षेत्रों के तहत photoresist polymerize.
नोट: आगे धोने और विकास के बाद, वांछित सुविधाओं के साथ मास्टर मोल्ड8 गढ़ा जाता है। प्रचालनात्मक विवरण उपयोग किए गए विशिष्ट उपकरणों पर निर्भर करता है।
- 10: 1 अनुपात में अपने इलाज एजेंट के साथ मिश्रण करके पीडीएमएस इलास्टोमेरिक प्रीपॉलिमर तैयार करें और फिर मिश्रण को पेट्री डिश में मोल्ड पर डालें।
- पीडीएमएस में हवा के बुलबुले को हटाने के लिए डिश को 30 मिनट के लिए वैक्यूम चैंबर में रखें और कम से कम 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सेंकना।
- पीडीएमएस के पूर्ण इलाज के बाद, पैटर्न सरणियों को टिकटों में काट लें।
नोट: माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के बाद के चरणों में हैंडलिंग में आसानी के कारण मोटे टिकटों (लगभग 1 सेमी) को प्राथमिकता दी जा सकती है।
2. कांच स्लाइड की कोटिंग
- कांच की स्लाइड्स को साफ करें। स्लाइड को 100% इथेनॉल स्नान में भिगोएं, 5 मिनट के लिए sonicate, और फिर पानी से कुल्ला करें।
- इस चरण को पहले एसीटोन के साथ दोहराएं, फिर आइसोप्रोपेनॉल के साथ, इसके बाद नाइट्रोजन स्ट्रीम में सूखने के बाद।
- कांच की स्लाइड पर टाइटेनियम और सोने की परतों को कोट करने के लिए एक इलेक्ट्रॉन बीम (ई-बीम) वाष्पीकरण उपकरण का उपयोग करें।
नोट: टाइटेनियम परत के लिए, वांछित मोटाई 15 Å (1 Å = 10-10 मीटर) है। सोने की परत के लिए, वांछित मोटाई 150 Å है। पहले टाइटेनियम को कोट करें और फिर सोना, क्योंकि टाइटेनियम परत सोने और ग्लास स्लाइड के बीच चिपकने वाला के रूप में कार्य करती है। - साफ स्लाइड्स को वाष्पीकरण कक्ष में रखें और शटर के नीचे सोने और टाइटेनियम क्रूसिबल डालें।
- धातुओं को पिघलाने से पहले 10-5 Pa से कम वैक्यूम बनाने के लिए कक्ष को नीचे पंप करें। इलेक्ट्रॉन बीम को धातु पर केंद्रित करें और शक्ति को समायोजित करें ताकि जमा दर जमाव की मोटाई को नियंत्रित करने के लिए उपयुक्त हो।
- धातु के जमाव को शुरू करने के लिए शटर खोलें। वांछित मोटाई तक पहुँचने पर शटर बंद करें।
- दो धातुओं के अनुक्रमिक वाष्पीकरण के बीच क्रूसिबल्स स्विच करें।
- उपकरण द्वारा आवश्यक रूप से क्रूसिबल्स को ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें, कक्ष को वेंट करें, और सोने-लेपित ग्लास स्लाइड को बाहर निकालें।
- उपकरण रखरखाव के लिए फिर से कक्ष नीचे पंप।
नोट:: परिचालन विवरण एक विशिष्ट ई-बीम वाष्पीकरण पर निर्भर हो सकता है। टाइटेनियम की एक अच्छी तरह से नियंत्रित, कम जमा दर होना महत्वपूर्ण है। एक मोटी टाइटेनियम परत अक्सर खराब दृश्यता की ओर ले जाती है, खासकर कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए। कोटिंग के बाद, टाइटेनियम / सोने-लेपित ग्लास स्लाइड को कम से कम 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर एक सूखे वैक्यूम कक्ष में संग्रहीत किया जा सकता है।
3. Microcontact मुद्रण
- टाइटेनियम / सोने के लेपित स्लाइड को छोटे टुकड़ों में काटें, यदि वांछित हो। एक विशिष्ट अनुप्रयोग (चित्रा 1B) के लिए 12 मिमी x 12 मिमी का एक वर्गाकार आकार अनुशंसित है।
- एक डेंटेड ट्रैक छोड़ने के लिए सतह पर स्लाइड करने के लिए एक ग्लास कटर का उपयोग करें, फिर ग्लास स्लाइड को दोनों तरफ रखें और छोटे क्वार्टर में तोड़ने के लिए डेंट पर झुकें। सोने के साथ लेपित सतह को छूने से बचें।
नोट: नेत्रहीन रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि कांच का कौन सा पक्ष आकस्मिक टिपिंग के मामले में लेपित सतह है, दोनों तरफ प्रकाश के प्रतिबिंब की तुलना करें। सोने से ढकी सतह एक उज्ज्वल प्रतिबिंब दिखाएगी, जबकि गैर-लेपित पक्ष में एक डिमर प्रतिबिंब होगा (कांच के दूसरी तरफ टाइटेनियम परत से)। एक वैकल्पिक तरीका स्लाइड के किनारों का निरीक्षण करना है, और कोटिंग पक्ष को ऊर्ध्वाधर काटने की सतह से निर्धारित किया जा सकता है। - कम से कम 10 मिनट के लिए एक कक्षीय शेकर पर सोने की तरफ के साथ एक पेट्री डिश में 100% इथेनॉल में भिगोकर स्लाइड को साफ करें। इथेनॉल को बाहर निकालें, फिर नाइट्रोजन स्ट्रीम के साथ उड़ाकर प्रत्येक स्लाइड को सुखाएं।
- साबुन के पानी और फिर 100% इथेनॉल के साथ PDMS टिकटों को साफ करें। नाइट्रोजन गैस के साथ टिकटों को सुखाएं।
- 100% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में 5.74 मिलीग्राम सी 18 पाउडर को भंग करके 2 एमएम ऑक्टाडेकेनथिओल (सी 18) समाधान तैयार करें।
नोट: सील और कमरे के तापमान पर C18 समाधान की दुकान। C18 के साथ प्रिंटिंग पैटर्न एक चिपकने वाला स्व-इकट्ठा मोनोलेयर बनाता है जिसके लिए फाइब्रोनेक्टिन और कोशिकाएं अधिमानतः संलग्न होंगी। - PDMS टिकटों को C18 समाधान में भिगोएं, जिसमें पैटर्न वाली सतह 10 s के लिए नीचे की ओर सामना कर रही है और 60 s के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ धीरे से सूखी है।
नोट: सूखते समय, स्ट्रीम को पहले स्टैंप से दूर रखें (लगभग 1 मीटर) जब तक कि अधिकांश तरल वाष्पित न हो जाए और फिर धीरे-धीरे धारा को पूरी तरह से टिकट को सूखने के करीब ले जाएं। यह C18 समाधान से बचने के लिए है जो टिकट पर सूखने के बजाय उड़ा दिया जा रहा है। - हटाने से पहले 60 s के लिए सोने की स्लाइड पर स्टांप चेहरा नीचे रखें।
- उचित मुद्रांकन सुनिश्चित करने के लिए, पैटर्न को ठीक से स्थानांतरित करने के लिए टिकटों पर चिमटी को धीरे से टैप करें। बहुत कठिन धक्का न दें, और चिमटी का वजन आमतौर पर पर्याप्त होता है।
नोट: टैपिंग के दौरान स्टैंप का दृश्य निरीक्षण यह सुनिश्चित करेगा कि स्टैंप और ग्लास स्लाइड ने समान रूप से संपर्क किया है। - आर्द्रता कक्षों को तैयार करें।
- एक उल्टे पेट्री डिश ढक्कन में 70% इथेनॉल के पिपेट 1 एमएल और सतह को कवर करने के लिए पैराफिल्म का एक टुकड़ा बिछाएं (कवर किए गए चेहरे को ऊपर)।
- उठाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, कोई हवा के बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए पैराफिल्म बिछाएं, और यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें।
- 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) समाधान तैयार करें: 100% इथेनॉल के 5 mL में 5 μL स्टॉक समाधान को पतला करें।
नोट: पतला EG3 समाधान सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और undiluted EG3 स्टॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। ईजी 3 उपचार का उपयोग कोशिकाओं के लिए C18 गैर-चिपकने वाले के बिना ग्लास क्षेत्र बनाने के लिए किया जाता है। - आर्द्रता कक्ष में पैराफिल्म पर प्रत्येक तिमाही ग्लास स्लाइड के लिए ईजी 3 की माइक्रोपिपेट 40 μL बूंदें, सोने की स्लाइड की रिक्ति के लिए खाते के लिए बूंदों के बीच पर्याप्त स्थान छोड़ देती हैं।
- C18-मुद्रित सोने की स्लाइड्स को बूंदों पर नीचे की ओर रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें और स्लाइड के नीचे कोई बुलबुले सुनिश्चित न करें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए उन्हें उठाने के बिना स्लाइड को धीरे से एक साथ धक्का दें।
नोट: कांच स्लाइड के एक किनारे को बूंद के पास नीचे रखें, और फिर धीरे-धीरे ग्लास स्लाइड के दूसरे छोर को कम करें। यदि एक बुलबुला मौजूद है, तो सोने की स्लाइड को तब तक उठाएं जब तक कि बुलबुला अब मौजूद न हो, तब तक इसे उठाए बिना धक्का दें। - पेत्री डिश को पैराफिल्म के साथ कसकर सील करें और इसे कम से कम 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
नोट: यदि व्यापक इनक्यूबेशन वांछित है, तो पेट्री डिश को डबल सील करें और इसे 24 घंटे तक छोड़ दें। - एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, सोने की स्लाइड को पेट्री डिश में चेहरा रखें, ईजी 3 को हटाने के लिए 70% इथेनॉल में 3 बार भिगोएं और कुल्ला करें, फिर नसबंदी के लिए 10 मिनट के लिए इथेनॉल में छोड़ दें।
- इथेनॉल को बाहर निकालें और इसे बाँझ पीबीएस के साथ बदलें।
- इथेनॉल के बजाय पीबीएस के साथ चरण 3.9 में वर्णित एक और आर्द्रता कक्ष तैयार करें।
नोट: सतह तनाव में अंतर के कारण, पैराफिल्म को बिछाने और बुलबुले को हटाने के लिए पहले पीबीएस के 4-5 मिलीलीटर जोड़ना आसान है, फिर अतिरिक्त को बाहर निकालना। - बाँझ पीबीएस में 50 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन समाधान (अन्य प्रोटीन, यदि वांछित हो) तैयार करें और पैराफिल्म पर प्रत्येक तिमाही स्लाइड के लिए फाइब्रोनेक्टिन समाधान के माइक्रोपिपेट 50 μL बूंदों को तैयार करें, जिससे बूंदों के बीच कुछ जगह जा सके।
नोट: फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग पैटर्न वाली सतहों के लिए सेल आसंजन की सुविधा प्रदान करता है। - ड्रॉपलेट्स पर स्लाइड्स का सामना करने और स्लाइड्स के नीचे कोई बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए वेफर चिमटी का उपयोग करें। धीरे से उन्हें उठाने के बिना स्लाइड्स को एक साथ धक्का दें।
नोट: सीधे चौड़े सुझावों के साथ ग्लास स्लाइड चिमटी या वेफर चिमटी स्लाइड को संभालने के लिए अनुशंसित हैं। - 30 मिनट के लिए biosafety कैबिनेट में पेट्री पकवान छोड़ दें।
- 30 मिनट के बाद, 3 बार के लिए कुल्ला करने के बाद सोने की स्लाइड्स को पीबीएस में चेहरा रखें।
नोट: फाइब्रोनेक्टिन-पैटर्न वाली स्लाइड्स को पीबीएस में लगभग एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
4. micropatterned स्लाइड पर सीडिंग कोशिकाओं
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेल संस्कृति मीडिया और ट्रिप्सिन को गर्म करें।
नोट:: उपसंस्कृति का निम्न वर्णन NIH/3T3 कक्षों के लिए है। संस्कृति की स्थिति सेल प्रकारों के आधार पर भिन्न हो सकती है। - (वैकल्पिक) एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृति मीडिया में पैटर्न स्लाइड को भिगोएं, बेहतर सेल अनुलग्नक के लिए कोशिकाओं के ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
- कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें, एफबीएस युक्त मीडिया के साथ बेअसर करें, 3 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर ताजा मीडिया के साथ अच्छी तरह से मिश्रण करके फिर से निलंबित करें।
नोट:: सुनिश्चित करें कि कक्षों को एक दूसरे से पूरी तरह से अलग कर रहे हैं। - कोशिकाओं की गणना करें, 200,000 कोशिकाओं / एमएल को पतला करें और एक सोने की स्लाइड वाले प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 0.5 एमएल जोड़ें।
- धीरे से अच्छी तरह से प्लेट को वर्दी सेल सीडिंग के लिए कुछ बार हिलाएं और सेल अनुलग्नक के लिए अनुमति देने के लिए इसे 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में स्टोर करें।
- 15 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे सेल अनुलग्नक की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त समय की अनुमति दें।
नोट: संलग्न कोशिकाएं दिखाई देने वाले फिलोपोडियम या सपाट के साथ सतह पर फैल जाएंगी और सतह से आगे नहीं बढ़ेंगी जब अच्छी तरह से प्लेट को धीरे से टैप किया जाता है या स्थानांतरित किया जाता है। - प्रत्येक अच्छी तरह से असंबद्ध कोशिकाओं वाले मीडिया को बाहर निकालें और संस्कृति मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। दवा उपचार के लिए, इस चरण में संस्कृति मीडिया के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों के पूरक।
- 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति दें और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या चिरलता का गठन हुआ है, यह निर्धारित करने के लिए confluency की जांच करें।
नोट: 75% confluency से ऊपर अधिकांश सेल प्रकारों के लिए अनुशंसित है, और over-confluency chirality लक्षण वर्णन को प्रभावित कर सकता है।
5. छवि संग्रह
- confluency पर कोशिकाओं को ठीक करें।
- अच्छी तरह से प्लेट से संस्कृति मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।
- 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान जोड़ें, 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला करें।
नोट:: यदि निर्धारण काफी सेल आकृति विज्ञान बदलता है, तो निर्धारण से पहले इमेजिंग की सिफारिश की जाती है
- कैमरा कार्यक्षमता के साथ एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, उच्च रिज़ॉल्यूशन पर स्लाइड पर प्रत्येक अंगूठी को छवि दें (10x ऑब्जेक्ट लेंस विश्लेषण के लिए पर्याप्त है)।
6. सेल chirality लक्षण वर्णन (चित्रा 2)
- अनुपूरक फ़ाइलों (अनुपूरक फ़ाइल 1) से chirality लक्षण वर्णन के लिए MATLAB कोड फ़ाइलें डाउनलोड करें।
नोट:: कोड दोनों Windows और macOS सिस्टम पर MATLAB_R2015b और बाद के संस्करणों के साथ काम करने के लिए परीक्षण किया गया है। परिपत्र सांख्यिकी टूलबॉक्स भी फ़ाइलों को चलाने के लिए आवश्यक है, जो संदर्भ17 में पाया जा सकता है। - MATLAB पथ के लिए कोड फ़ोल्डर और उप-फ़ोल्डर (अंदर परिपत्र आँकड़े टूलबॉक्स के साथ) जोड़ें और "ROI_selection.m" फ़ाइल खोलें। पंक्ति 4 में, निर्देशिका को इच्छित डेटा फ़ोल्डर में परिवर्तित करें (विंडो उपयोगकर्ताओं के लिए, पंक्ति4 और 5 में "/" में "/" स्विच करें).
- पंक्ति 14 में छवि का आकार बदलें, पहले दो आंकड़े अंगूठी के आंतरिक सर्कल आकार का प्रतिनिधित्व करते हैं जबकि अन्य दो बाहरी का प्रतिनिधित्व करते हैं।
नोट:: सुनिश्चित करें कि विश्लेषण करने के लिए किसी फ़ोल्डर में सभी छवियों के आकार समान हैं। - चरण-विपरीत छवियों में ब्याज (ROI) के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए MATLAB कोड "ROI_selection.m" निष्पादित करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
- रिंग को फिट करने के लिए चयन वर्ग को मैन्युअल रूप से खींचें, फिर चयन की पुष्टि करने के लिए छवि पर डबल क्लिक करें।
- फ़ोल्डर में प्रत्येक छवि के लिए इस चरण को दोहराएं (अगली छवि पिछले छवि के ROI चयन की पुष्टि करने के बाद स्वचालित रूप से पॉप अप हो जाएगी); एक ".mat" फ़ाइल प्रत्येक छवि के लिए ROI जानकारी को संग्रहीत करने के लिए उत्पन्न किया जाएगा।
- "Analysis_batch.m" फ़ाइल खोलें और चरण 6.2 के समान फ़ोल्डर की निर्देशिका परिवर्तित करें। (विंडो उपयोगकर्ताओं के लिए, पहली बार उपयोग के लिए, पंक्ति5, 6, 124 और 130 में "/" को "\" में स्विच करें)
- एकाधिक सेलुलर रिंग पैटर्न की चिरलता निर्धारित करने के लिए कोड "Analysis_batch.m" को निष्पादित करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें। एक "datatoexcel.txt" फ़ाइल उत्पन्न की जाएगी, जिसमें प्रत्येक रिंग के लिए परिपत्र आँकड़े के साथ-साथ दक्षिणावर्त, गैर-चिरल और एंटी-क्लॉकवाइज रिंगों की संख्या भी शामिल होगी।
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Representative Results
एनआईएच / 3टी 3 कोशिकाओं के सीडिंग के पंद्रह मिनट बाद, रिंग पैटर्न पर सेल आसंजन को चरण-विपरीत इमेजिंग द्वारा नेत्रहीन रूप से पुष्टि की गई थी। 24 घंटे की बाद की संस्कृति के बाद, पैटर्न पर कोशिकाएं स्पष्ट रूप से विषम संरेखण के साथ confluent और लम्बी हो गईं, दक्षिणावर्त दिशा (चित्रा 2) की ओर पक्षपाती। संलग्न कोशिकाओं के दिशात्मक प्रवास को समय-अंतराल इमेजिंग द्वारा दर्ज किया जाता है, सेल गतिशीलता और मॉर्फोजेनेसिस को वीडियो के आगे के विश्लेषण के साथ परिमाणित किया जा सकता है। Chirality विश्लेषण का संचालन करने के लिए, उच्च संकल्प चरण-विपरीत छवियों को निर्धारण (चित्रा 2A-C) के बाद लिया जाता है और MATLAB कार्यक्रम में खिलाया जाता है। कार्यक्रम तीव्रता gradients का पता लगाता है और अंगूठी पर संबंधित सेल संरेखण दिशाओं की गणना करता है। फिर सेल चिरलता को सेल संरेखण के परिपत्र आंकड़ों के आधार पर निर्धारित किया जाता है जो छल्ले की परिधीय दिशा से विचलित होता है। इसलिए, कोशिकाओं को दक्षिणावर्त (CW), वामावर्त (CCW), या गैर-चिरल (NC) (चित्रा 2D) के रूप में नामित किया जा सकता है। प्रसंस्करण के बाद, विश्लेषण से पता चला कि अधिकांश छल्ले में एक प्रमुख सीडब्ल्यू पूर्वाग्रह होता है, जो इंगित करता है कि 3टी 3 कोशिकाओं में एक मजबूत सीडब्ल्यू चिरलिटी होती है। उत्पन्न परिपत्र आँकड़े भी यदि आवश्यक हो तो आगे के विश्लेषण के लिए पक्षपाती कोणों की अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं (चित्रा 2 ई)।
सेल चिरलता इसके फेनोटाइप पर निर्भर करती है। रिंग chirality परख को कई सेल-प्रकार 7,8,9,10 के साथ संगत होने के लिए सत्यापित किया गया है, जिसमें सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं, जैसे फाइब्रोब्लास्ट, मायोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और स्टेम कोशिकाओं (तालिका 1) दोनों शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि, क्योंकि सेल चिरलिटी एक्टिन साइटोस्केलेटन की कार्यक्षमताओं से उत्पन्न होती है, एक्टिन गतिशीलता में परिवर्तन कोशिकाओं के चिरल पूर्वाग्रह को प्रभावित कर सकता है। माउस मायोब्लास्ट C2C12 कोशिकाओं के साथ, हमने पाया कि 50 nM Latrunculin A उपचार के साथ एक्टिन पोलीमराइजेशन को बाधित करके, कोशिकाओं ने CW (चित्रा 3A) में CCW चिरल पूर्वाग्रह के परिवर्तन का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, मानव नाभि संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (hUVECs) को एक छोटे अणु दवा, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-एसीटेट (TPA) के साथ इलाज किया जाता है, प्रोटीन किनेज को सक्रिय करने के लिए ccw से CCW (चित्रा 3B) तक सेल चिरलता की एक खुराक-निर्भर बदलाव प्रदर्शित किया। इन निष्कर्षों विकसित अंगूठी पैटर्न chirality परख प्रयोगात्मक रूप से के रूप में अच्छी तरह से साइटोस्केलेटन में परिवर्तन के लिए इस परख की संवेदनशीलता की उपयोगिता का प्रदर्शन.
चित्र 1. सेलुलर माइक्रोपैटर्निंग की योजनाबद्ध. (ए) सेल पैटर्निंग के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग की प्रक्रिया। एक नकारात्मक photoresist मोल्ड पराबैंगनी (यूवी) माइक्रोपैटर्निंग सुविधाओं (1-2) युक्त एक मुखौटा के माध्यम से photoresist के crosslinking द्वारा बनाया गया था। Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomeric prepolymers को मोल्ड पर डाली गई थी ताकि टिकटों (3-4) को बनाया जा सके। फिर, एक चिपकने वाला स्व-असेंबली मोनोलेयर (एसएएम), ऑक्टा-डेकेनथिओल (सी 18), को स्टांप पर लेपित किया गया था और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग (5-7) के माध्यम से सोने-लेपित ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित किया गया था, इसके बाद गैर-चिपकने वाला एथिलीन ग्लाइकोल-समाप्त एसएएम, एचएस-(सीएच2) 11-ईजी 3 (ईजी3 ) (8), और फाइब्रोनेक्टिन (9) की कोटिंग की गई थी। कोशिकाओं को तब पैटर्न (10) से संलग्न करने के लिए बीज दिया गया था। (बी) तस्वीरें सेल माइक्रोपैटर्निंग के प्रमुख चरणों को प्रदर्शित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. इमेजिंग विश्लेषण का वर्कफ़्लो. (क) छवि संग्रह। प्रत्येक अंगूठी के चरण-विपरीत छवियों को प्राप्त करें। (B) MATLAB प्रोग्राम में इनपुट डेटा "ROI_Selection.m" फ़ाइल सेटिंग निर्देशिका और छवि आकार चलाकर। (C) सेलुलर रिंग को फिट करने के लिए चयन वर्ग को खींचकर ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें और पुष्टि करने के लिए डबल क्लिक करें। (D) "Analysis_Batch.m" फ़ाइल चलाकर सेल संरेखण और चिरल पूर्वाग्रहों का निर्धारण करें। (ई) प्रत्येक अंगूठी के लिए पक्षपाती अंगूठी संख्याओं और परिपत्र आंकड़ों के सारांश के साथ उदाहरण आउटपुट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. दवा उपचार के तहत कोशिकाओं की चिरलता के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) माउस मायोब्लास्ट C2C12 कोशिकाओं के चरण-विपरीत छवियों और chirality लक्षण वर्णन परिणाम: नियंत्रण (बाएं) और 50 nM Latrunculin एक इलाज समूहों (दाएं)। बोल्ड लाल फ़ॉन्ट रैंक परीक्षण द्वारा पी < 0.05 पर प्रमुख chirality इंगित करता है। स्केल बार: 100 μm. (बी) चरण-विपरीत छवियों और माइक्रो-पैटर्न वाले छल्ले पर मानव नाभि संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (hUVECs) के चिरलता लक्षण वर्णन परिणाम: नियंत्रण (बाएं) और 30 एनएम टीपीए उपचारित समूह (दाएं)। बोल्ड लाल फ़ॉन्ट रैंक परीक्षण द्वारा पी < 0.05 पर प्रमुख chirality इंगित करता है। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
| CW पक्षपाती | CCW पक्षपाती |
| · NIH/3T3 कोशिकाएं (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · MC3T3-E1 कोशिकाएं (ATCC CRL-2593) | · मानव कंकाल मांसपेशी कोशिकाओं (Lonza CC-2661) |
| · चूहे कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स | · एक मानव त्वचा कैंसर फाइब्रोब्लास्ट लाइन (ATCC CRL-7762) |
| · मानव प्राथमिक त्वचा fibroblasts (ATCC PCS-201-012) | · मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी उपकला कोशिकाएं (ATCC CCL-34) |
| · मानव वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं | |
| · मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं | |
| · मानव नाभि संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (Lonza CC-2935) | |
| · मानव मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (सेल सिस्टम ACBRI-376) |
तालिका 1. विभिन्न सेल प्रकार के चिरल पूर्वाग्रहों micropatterning परख की विशेषता है. CW: दक्षिणावर्त; CCW: काउंटर-दक्षिणावर्त.
अनुपूरक फ़ाइल 1: chirality लक्षण वर्णन के लिए MATLAB कोड फ़ाइलें. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
पूरक कोडिंग फ़ाइलें. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ वर्णित अंगूठी के आकार के पैटर्निंग परख बहुकोशिकीय chirality के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग उपकरण प्रदान करता है, अत्यधिक विश्वसनीय और repeatable परिणामों का उत्पादन करने में सक्षम है. समान परिभाषित माइक्रोएन्वायरमेंट्स और निष्पक्ष विश्लेषण की तेजी से पीढ़ी नमूनों के बड़े आकार के स्वचालित उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण को सक्षम बनाती है। यह प्रोटोकॉल रिंग माइक्रोपैटर्न्स, सेल पैटर्निंग, और पक्षपाती सेल संरेखण और दिशात्मक गति के स्वचालित विश्लेषण के निर्माण पर चर्चा करता है। यह विधि सेल गतिशीलता और चिरल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए लाइव-इमेजिंग तकनीकों के साथ संगत है और संभावित रूप से विषाक्तता का पता लगाने9 या दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए अन्य प्लानफॉर्म में एकीकृत किया जा सकता है।
साझा करने के लिए कुछ अतिरिक्त सुझाव हैं। सबसे पहले, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग चरण में, स्टैंप को ग्लास के सोने की तरफ बनाया जाना चाहिए (सब्सट्रेट को टुकड़ों में काटने के बाद अंतर करना मुश्किल हो सकता है), और डबल प्रिंट से बचा जाना चाहिए। दूसरा, उन कोशिकाओं के लिए जिन्हें उचित लगाव के लिए अन्य प्रोटीन की आवश्यकता होती है, पसंदीदा प्रोटीन का उपयोग चरण 3.17 पर किया जा सकता है। तीसरा, सेल संस्कृति के लिए, सेल घनत्व बहुत अधिक नहीं होना चाहिए, और कोशिकाओं को पैटर्न पर ओवर-संगम नहीं उगाया जाना चाहिए। अन्यथा, कोशिकाएं आंतरिक सीमा को तोड़ सकती हैं और अंगूठी को एक ठोस सर्कल में भर सकती हैं। चौथा, यदि सीडिंग के बाद सेल पैटर्न टूट जाते हैं या अधूरे होते हैं, तो यह संपर्क मुद्रण (चरण 3.7-3.8) के दौरान C18 के पैटर्न के अधूरे हस्तांतरण के कारण हो सकता है। खामियों के लिए पीडीएमएस टिकटों की जांच की जानी चाहिए। स्लाइड पर मुद्रांकन करते समय थोड़ा अधिक बल लागू करना भी सहायक हो सकता है। अंत में, यदि कोशिकाएं दृश्यमान पैटर्न के बिना ग्लास स्लाइड की पूरी सतह से जुड़ी होती हैं, तो चरण 3.8 पर लागू बल बहुत अधिक हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप पूरी सतह को C18 के साथ मुहर लगाई जा सकती है। यह भी संभव है कि स्लाइड दोषपूर्ण हैं या बहुत लंबे समय तक पीबीएस में संग्रहीत किए गए हैं। स्व-असेंबली मोनोलेयर्स (यानी, C18 और EG3) के पैटर्न का उपयोग मुद्रण के बाद एक महीने के भीतर किया जाना चाहिए।
यद्यपि प्रस्तावित परख मजबूत chirality लक्षण वर्णन के लिए एक सुविधाजनक उपकरण प्रदान करता है, वहाँ कुछ सीमाओं रहे हैं. सबसे पहले, पैटर्निंग परख केवल अनुयायी कोशिकाओं के साथ संगत है। गैर-अनुयायी कोशिकाओं की चिरलता, जैसे कि ट्यूमर कोशिकाओं, एडिपोसाइट्स, या गैर-स्तनधारी कोशिकाओं को प्रसारित करना, संभवतः 3 डी मैट्रिगेल बाईलेयर विधि18,19 का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरा, सेल प्रकारों के लिए जिनके पास एक प्राकृतिक कॉबल आकार होता है और महत्वपूर्ण बढ़ाव नहीं दिखाते हैं, विश्लेषण सटीकता कम हो सकती है। हालांकि, इन सेल प्रकारों की चिरलता को लाइव इमेजिंग का संचालन करने और माइग्रेशन पूर्वाग्रह 7 को ट्रैक करने की विशेषता हो सकतीहै। अंत में, micropatterning परख एक समापन बिंदु विश्लेषण विधि है, लंबे समय तक सेल संस्कृति के लिए इरादा नहीं है. दवा उपचार जैसे प्रयोगों को पैटर्न पर सीडिंग के बाद 72 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। उन अनुप्रयोगों के लिए जिन्हें लंबे समय तक उपचार के समय की आवश्यकता होती है, सीडिंग से पहले कोशिकाओं के इलाज पर विचार करें।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (OD / NICHD DP2HD083961 और NHBLI R01HL148104) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लियो क्यू वान बायोमेडिकल साइंसेज (PEW 00026185) में एक प्यू स्कॉलर है, जो प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। हाओकांग झांग अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन प्रीडॉक्टोरल फैलोशिप (20PRE35210243) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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