Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Bestimmung der multizellulären Chiralität in vitro unter Verwendung der Mikrostrukturierungstechnik. Dieser Assay ermöglicht die automatische Quantifizierung der Links-Rechts-Verzerrungen verschiedener Zelltypen und kann für Screening-Zwecke verwendet werden.
Abstract
Chiralität ist eine intrinsische zelluläre Eigenschaft, die die Asymmetrie in Bezug auf die Polarisation entlang der Links-Rechts-Achse der Zelle darstellt. Da diese einzigartige Eigenschaft aufgrund ihrer wichtigen Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Krankheit zunehmend Aufmerksamkeit erregt, würde eine standardisierte Quantifizierungsmethode zur Charakterisierung der Zellchiralität die Forschung und mögliche Anwendungen vorantreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir einen multizellulären Chiralitätscharakterisierungsassay, der mikrostrukturierte Zellarrays verwendet. Zelluläre Mikromuster werden auf titan/vergoldeten Glasobjektträgern mittels Mikrokontaktdruck hergestellt. Nach der Aussaat auf den geometrisch definierten (z. B. ringförmigen), proteinbeschichteten Inseln wandern die Zellen in direktionale Richtung und bilden eine verzerrte Ausrichtung entweder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, die automatisch analysiert und quantifiziert werden kann durch ein speziell geschriebenes MATLAB-Programm. Hier beschreiben wir detailliert die Herstellung von mikrostrukturierten Substraten, Zellaussaat, Bilderfassung und Datenanalyse und zeigen repräsentative Ergebnisse, die mit den NIH/3T3-Zellen erzielt wurden. Dieses Protokoll wurde zuvor in mehreren veröffentlichten Studien validiert und ist ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung der Zellchiralität in vitro.
Introduction
Die Links-Rechts-Asymmetrie (LR) der Zelle, auch bekannt als zelluläre Händigkeit oder Chiralität, beschreibt die Zellpolarität in der LR-Achse und wird als grundlegende, konservierte, biophysikalische Eigenschaft 1,2,3,4,5 anerkannt. Die Zellchiralität wurde sowohl in vivo als auch in vitro auf mehreren Skalen beobachtet. Frühere Ergebnisse zeigten chirale Verwirbelung des Aktin-Zytoskeletts in einzelnen Zellen, die auf kreisförmigen Inselnausgesät waren 6, verzerrte Migration und Ausrichtung von Zellen innerhalb begrenzter Grenzen 7,8,9,10,11 und asymmetrische Schleife der Hühnerwärmeröhre 12.
Auf der multizellulären Ebene kann die Zellchiralität durch gerichtete Migration oder Ausrichtung, Zellrotation, Zytoskelettdynamik und Zellorganellenpositionierung 7,8,9,10,11,12,13 bestimmt werden. Wir haben einen mikrostrukturbasierten14-Assay etabliert, um die chirale Verzerrung adhärenter Zellen 7,8,9,10 effizient zu charakterisieren. Mit den ringförmigen Mikromustern, die Zellcluster geometrisch einschließen, weisen die Zellen zusammen eine gerichtete Migration und eine verzerrte Ausrichtung auf. Ein MATLAB-Programm wurde entwickelt, um die Zellausrichtung in Phasenkontrastbildern des Rings automatisch zu erkennen und zu messen. Die Richtung der lokalen Zellausrichtung wird mit einem vorgespannten Winkel quantifiziert, abhängig von ihrer Abweichung von der Umfangsrichtung. Nach der statistischen Analyse wird das Ringmuster der Zellen entweder als gegen den Uhrzeigersinn (CCW) Verzerrungen oder im Uhrzeigersinn (CW) als Verzerrungen bezeichnet.
Dieser Assay wurde verwendet, um die Chiralität mehrerer Zellphänotypen zu charakterisieren (Tabelle 1), und die LR-Asymmetrie von Zellen wurde als phänotypspezifisch 7,11,15 befunden. Darüber hinaus kann eine Störung der Aktindynamik und -morphologie zu einer Umkehrung der chiralen Verzerrungführen 7,8, und oxidativer Stress kann auch die Zellchiralität verändern9. Aufgrund der Einfachheit des Verfahrens und der Robustheit des Ansatzes 7,8,9,10 bietet dieser 2D-Chiralitätsassay ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung und Untersuchung der multizellulären Chiralität in vitro.
Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Verwendung dieser Methode zur Charakterisierung der Zellchiralität zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie gemusterte zelluläre Arrays über die Mikrokontaktdrucktechnik hergestellt und Chiralitätsanalysen automatisiert mit dem MATLAB-Programm durchgeführt werden.
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Protocol
1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempeln16
- Zeichnen Sie mit CAD-Software eine Reihe von Mikroskalenringen mit einem Innendurchmesser von 250 μm und einem Außendurchmesser von 450 μm. Das in diesem Protokoll verwendete Muster ist ein 10 x 10-Array mit einem Abstand von 850 μm zwischen den Ringen.
- Drucken Sie eine Transparenzmaske des Musters in der gewünschten Auflösung mit dem Maskendruckservice eines Mikrofabrikationsunternehmens (siehe Materialverzeichnis).
HINWEIS: Die angegebenen Abmessungen des Rings funktionieren nachweislich für viele Zelltypen7. - Führen Sie eine ultraviolette (UV) Photolithographie mit der Maske durch, die die gewünschten Merkmale enthält, um eine Negativ-Fotolackform (z. B. SU-8)8 herzustellen.
- Decken Sie einen Siliziumwafer ab, der mit Fotolack durch die in den Schritten 1.1-1.2 hergestellte Transparenzmaske geschleudert wurde.
- Auf einem UV-Kontakt-Aligner den Fotolack unter transparenten Bereichen der Maske durch UV-Licht polymerisieren.
HINWEIS: Nach dem weiteren Waschen und der Entwicklung wird die Masterform mit den gewünschten Eigenschaften8 hergestellt. Die operativen Details hängen von der spezifischen Ausrüstung ab.
- Bereiten Sie PDMS-Elastomer-Prepolymere vor, indem Sie mit seinem Härter im Verhältnis 10: 1 mischen und dann die Mischung in einer Petrischale auf die Form gießen.
- Stellen Sie die Schale für 30 min in eine Vakuumkammer, um Luftblasen in PDMS zu entfernen, und backen Sie sie in einem Ofen bei 60 ° C für mindestens 2 h.
- Nach vollständiger Aushärtung von PDMS schneiden Sie die Musterarrays in Stempel.
HINWEIS: Dickere Stempel (ca. 1 cm) können aufgrund der einfachen Handhabung bei den späteren Schritten des Mikrokontaktdrucks bevorzugt werden.
2. Beschichtung von Glasobjektträgern
- Reinigen Sie die Glasobjektträger. Die Objektträger in einem 100% igen Ethanolbad einweichen, 5 min beschallen und dann mit Wasser abspülen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt zuerst mit Aceton, dann mit Isopropanol, gefolgt von der Trocknung in einem Stickstoffstrom.
- Verwenden Sie eine Elektronenstrahlverdampfungsausrüstung (E-Beam), um Titan- und Goldschichten auf Glasobjektträgern zu beschichten.
HINWEIS: Für die Titanschicht beträgt die gewünschte Dicke 15 Å (1 Å = 10-10 m). Für die Goldschicht beträgt die gewünschte Dicke 150 Å. Beschichten Sie zuerst Titan und dann Gold, da die Titanschicht als Klebstoff zwischen Gold und dem Glasobjektträger dient. - Legen Sie die gereinigten Objektträger in die Verdampferkammer und legen Sie Gold- und Titantiegel unter die Fensterläden.
- Pumpen Sie die Kammer ab, um ein Vakuum von weniger als 10-5 Pa zu erzeugen, bevor Sie Metalle schmelzen. Fokussieren Sie den Elektronenstrahl auf das Metall und passen Sie die Leistung so an, dass die Abscheiderate für die Kontrolle der Abscheidungsdicke geeignet ist.
- Öffnen Sie den Verschluss, um die Metallabscheidung zu starten. Schließen Sie den Verschluss, wenn die gewünschte Dicke erreicht ist.
- Wechseln Sie die Tiegel zwischen der sequentiellen Verdampfung von zwei Metallen.
- Warten Sie, bis die Tiegel wie von der Ausrüstung gefordert abgekühlt sind, entlüften Sie die Kammer und nehmen Sie die vergoldeten Glasschienen heraus.
- Pumpen Sie die Kammer zur Gerätewartung erneut herunter.
HINWEIS: Betriebsdetails können von einem bestimmten E-Beam-Verdampfer abhängen. Eine gut kontrollierte, niedrige Ablagerungsrate von Titan ist wichtig. Eine dicke Titanschicht führt oft zu schlechter Sichtbarkeit, insbesondere bei der Fluoreszenzbildgebung der Zellen. Nach der Beschichtung können die titan-/goldbeschichteten Glasobjektträger mindestens 1 Monat in einer trockenen Vakuumkammer bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Mikrokontaktdruck
- Schneiden Sie den titan-/vergoldeten Objektträger auf Wunsch in kleinere Stücke. Für eine typische Anwendung wird eine quadratische Form von 12 mm x 12 mm empfohlen (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie einen Glasschneider, um über die Oberfläche zu gleiten, um eine verbeulte Spur zu hinterlassen, halten Sie dann den Glasschieber auf beiden Seiten und biegen Sie sich an der Delle, um in kleine Viertel zu brechen. Vermeiden Sie es, die mit Gold beschichtete Oberfläche zu berühren.
HINWEIS: Um visuell zu bestimmen, auf welcher Seite des Glases sich die beschichtete Oberfläche im Falle eines versehentlichen Umkippens befindet, vergleichen Sie die Reflexion des Lichts auf beiden Seiten. Die goldbedeckte Oberfläche zeigt eine hellere Reflexion, während die unbeschichtete Seite eine dunklere Reflexion aufweist (von der Titanschicht auf der anderen Seite des Glases). Eine alternative Möglichkeit besteht darin, die Kanten des Objektträgers zu beobachten, und die Beschichtungsseite kann aus der vertikalen Schnittfläche bestimmt werden. - Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie 100% Ethanol in einer Petrischale mit der Goldseite nach oben auf einem Orbitalschüttler für mindestens 10 min einweichen. Saugen Sie das Ethanol aus und trocknen Sie dann jeden Objektträger durch Blasen mit einem Stickstoffstrom.
- Reinigen Sie die PDMS-Stempel mit Seifenwasser und anschließend mit 100% Ethanol. Trocknen Sie die Stempel mit Stickstoffgas.
- Bereiten Sie 2 mM Octadecanthiol (C18) -Lösung vor, indem Sie 5,74 mg C18-Pulver in 10 ml 100% Ethanol auflösen.
HINWEIS: Verschließen und lagern Sie die C18-Lösung bei Raumtemperatur. Druckmuster mit C18 erzeugen eine selbstkonfektionierte Monoschicht mit Klebstoff, für die das Fibronektin und die Zellen bevorzugt haften. - Die PDMS-Stempel in C18-Lösung mit der gemusterten Oberfläche nach unten für 10 s einweichen und 60 s vorsichtig mit Stickstoffgas trocknen.
HINWEIS: Legen Sie den Strom beim Trocknen zuerst vom Stempel weg (ca. 1 m), bis die meiste Flüssigkeit verdampft ist, und bewegen Sie den Strom dann langsam näher, um den Stempel vollständig zu trocknen. Dies soll verhindern, dass C18-Lösung weggeblasen wird, anstatt auf dem Stempel zu trocknen. - Legen Sie den Stempel vor dem Entfernen 60 s lang mit der Vorderseite nach unten auf die Golddias auf.
- Um eine ordnungsgemäße Prägung zu gewährleisten, klopfen Sie vorsichtig mit der Pinzette auf die Stempel, um die Muster ordnungsgemäß zu übertragen. Drücken Sie nicht zu stark nach unten, und das Gewicht der Pinzette ist in der Regel ausreichend.
HINWEIS: Die visuelle Inspektion des Stempels während des Klopfens stellt sicher, dass der Stempel und der Glasschieber gleichmäßig in Kontakt gekommen sind. - Feuchtekammern vorbereiten.
- Pipettieren Sie 1 ml 70% Ethanol in einen umgekehrten Petrischalendeckel und legen Sie ein Stück Parafilm ab, um die Oberfläche zu bedecken (verdeckt nach oben).
- Verwenden Sie eine Pinzette zum Anheben, legen Sie Parafilm ab, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen, und entfernen Sie bei Bedarf überschüssiges Ethanol.
- Bereiten Sie 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3)-Lösung vor: Verdünnen Sie 5 μL Stammlösung in 5 ml 100% Ethanol.
HINWEIS: Die verdünnte EG3-Lösung kann bei 4 °C verschlossen und gelagert werden, und unverdünnte EG3-Bestände sollten bei -20 °C gelagert werden. Die EG3-Behandlung wird verwendet, um den Glasbereich ohne C18 nicht an Zellen haftend zu machen. - Mikropipette 40 μL Tröpfchen EG3 für jedes Viertel Glasobjektträger auf den Parafilm in der Feuchtigkeitskammer, so dass genügend Platz zwischen den Tröpfchen bleibt, um den Abstand der Goldobjektträger zu berücksichtigen.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um C18-bedruckte Golddias mit dem Gesicht nach unten auf die Tröpfchen zu legen und sicherzustellen, dass keine Blasen unter den Dias auftreten. Drücken Sie die Dias vorsichtig zusammen, ohne sie anzuheben, um die Verdunstung zu minimieren.
HINWEIS: Platzieren Sie eine Kante des Glases in der Nähe des Tröpfchens nach unten und senken Sie dann langsam das andere Ende des Glases nach unten. Wenn eine Blase vorhanden ist, drücken Sie die Goldrutsche, ohne sie anzuheben, bis die Blase nicht mehr vorhanden ist. - Die Petrischale fest mit Parafilm verschließen und bei Raumtemperatur mindestens 3 h stehen lassen.
HINWEIS: Wenn eine umfangreiche Inkubation gewünscht ist, verschließen Sie die Petrischale doppelt und lassen Sie sie bis zu 24 h stehen. - In einer Biosicherheitskabine Goldobjektträger mit dem Gesicht nach oben in eine Petrischale legen, 3 Mal in 70% Ethanol einweichen und spülen, um EG3 zu entfernen, und dann 10 Minuten zur Sterilisation in Ethanol lassen.
- Saugen Sie das Ethanol aus und ersetzen Sie es durch steriles PBS.
- Bereiten Sie eine weitere Feuchtekammer wie in Schritt 3.9 beschrieben mit PBS anstelle von Ethanol vor.
HINWEIS: Aufgrund des Unterschieds in der Oberflächenspannung ist es einfacher, zuerst 4-5 ml PBS hinzuzufügen, um Parafilm abzulegen und Blasen zu entfernen, und dann den Überschuss abzusaugen. - Bereiten Sie die 50 μg/ml Fibronektinlösung (andere Proteine, falls gewünscht) in sterilem PBS und Mikropipette 50 μL Tröpfchen Fibronektinlösung für jeden Viertelträger auf den Parafilm vor, wobei etwas Platz zwischen den Tröpfchen bleibt.
HINWEIS: Die Fibronektin-Beschichtung erleichtert die Zellhaftung auf gemusterten Oberflächen. - Verwenden Sie eine Waffelpinzette, um die Objektträger mit der Vorderseite nach unten auf die Tröpfchen zu legen und sicherzustellen, dass keine Blasen unter den Dias auftreten. Schieben Sie die Dias vorsichtig zusammen, ohne sie anzuheben.
HINWEIS: Für die Handhabung der Dias werden Glasschieberpinzetten oder Waffelpinzetten mit geraden breiten Spitzen empfohlen. - Die Petrischale 30 min in der Biosicherheitskabine stehen lassen.
- Nach 30 min die Goldschienen nach 3 Maligem Spülen mit der Vorderseite nach oben in PBS legen.
HINWEIS: Fibronektin-gemusterte Objektträger können in PBS bei 4 ° C für etwa einen Monat gelagert werden.
4. Aussaat von Zellen auf mikrostrukturierten Objektträgern
- Die Zellkulturmedien und das Trypsin in einem 37 °C warmen Wasserbad aufwärmen.
HINWEIS: Die folgende Beschreibung der Subkultur gilt für NIH / 3T3-Zellen. Die Kulturbedingungen können je nach Zelltyp variieren. - (Optional) Einweichen Sie gemusterte Objektträger in Kulturmedien in einer 12-Well-Platte, erwärmen Sie sich vor der Trypsinisierung der Zellen auf 37 ° C in einem Inkubator für eine bessere Zellbindung.
- Trypsinisieren Sie die Zellen, neutralisieren Sie mit FBS-haltigen Medien, zentrifugieren Sie bei 100 x g für 3 min und resuspendieren Sie dann, indem Sie gut mit frischen Medien mischen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig voneinander getrennt sind. - Zählen Sie die Zellen, verdünnen Sie auf 200.000 Zellen / ml und fügen Sie 0,5 ml der Zellsuspension zu jeder Vertiefung hinzu, die einen Goldobjektträger enthält.
- Schütteln Sie die Brunnenplatte vorsichtig ein paar Mal für eine gleichmäßige Zellaussaat und lagern Sie sie 15 Minuten lang in einem Inkubator, um eine Zellbefestigung zu ermöglichen.
- Überprüfen Sie nach 15 Minuten die Zellbefestigung unter dem Mikroskop. Planen Sie bei Bedarf zusätzliche Zeit ein.
HINWEIS: Die angeschlossenen Zellen breiten sich auf der Oberfläche mit sichtbarem Filopodium oder Abflachung aus und bewegen sich nicht von der Oberfläche, wenn die Wellplatte sanft geklopft oder bewegt wird. - Saugen Sie die Medien, die nicht gebundene Zellen enthalten, aus jedem Vertiefungsraum heraus und fügen Sie 1 ml Kulturmedien hinzu. Für die medikamentöse Behandlung ergänzen Sie in diesem Schritt zusätzliche Reagenzien zu Kulturmedien.
- Kultivieren Sie die Zellen im Inkubator für 24 h und überprüfen Sie die Konfluenz, um festzustellen, ob sich Chiralität gebildet hat.
HINWEIS: Für die meisten Zelltypen wird eine Konfluenz von über 75% empfohlen, und ein Überzusammenfluss kann die Charakterisierung der Chiralität beeinträchtigen.
5. Bildersammlung
- Fixieren Sie die Zellen bei Konfluenz.
- Entfernen Sie Kulturmedien von der Bohrlochplatte und spülen Sie sie einmal mit PBS ab.
- Fügen Sie 4% ige Paraformaldehydlösung hinzu, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten und spülen Sie dann 3 Mal mit PBS ab.
HINWEIS: Wenn die Fixierung die Zellmorphologie signifikant verändert, wird die Bildgebung vor der Fixierung empfohlen
- Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit Kamerafunktionalität, bilden Sie jeden Ring auf den Objektträgern in hoher Auflösung ab (10x Objektobjektiv reicht für die Analyse aus).
6. Charakterisierung der Zellchiralität (Abbildung 2)
- Laden Sie MATLAB-Codedateien für die Chiralitätscharakterisierung aus den Ergänzungsdateien herunter (Ergänzungsdatei 1).
HINWEIS: Der Code wurde für die Verwendung mit MATLAB_R2015b und höheren Versionen sowohl auf Windows- als auch auf macOS-Systemen getestet. Die Toolbox für zirkuläre Statistiken ist auch erforderlich, um die Dateien auszuführen, die in Referenz17 zu finden sind. - Fügen Sie den Codeordner und die Unterordner (mit der Toolbox für zirkuläre Statistiken) zum MATLAB-Pfad hinzu und öffnen Sie die Datei "ROI_selection.m". Ändern Sie in Zeile 4 das Verzeichnis in den gewünschten Datenordner (für Fensterbenutzer wechseln Sie in den Zeilen 4 und 5 "/" in "\").
- Ändern Sie die Bildgröße in Zeile 14, wobei die ersten beiden Abbildungen die innere Kreisgröße des Rings darstellen, während die anderen beiden die äußere darstellen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Größe aller Bilder in einem zu analysierenden Ordner identisch ist. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den MATLAB-Code "ROI_selection.m" auszuführen, um die Region of Interest (ROI) in Phasenkontrastbildern zu bestimmen.
- Ziehen Sie das Auswahlquadrat manuell an den Ring und doppelklicken Sie dann auf das Bild, um die Auswahl zu bestätigen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Bild im Ordner (das nächste Bild wird automatisch angezeigt, nachdem die ROI-Auswahl eines vorherigen Bildes bestätigt wurde). Es wird eine ".mat"-Datei generiert, um die ROI-Informationen für jedes Bild zu speichern.
- Öffnen Sie die Datei "Analysis_batch.m" und ändern Sie das Verzeichnis des Ordners wie in Schritt 6.2. (Für Fensterbenutzer schalten Sie für die erste Verwendung in den Zeilen 5, 6, 124 und 130 "/" in "\" um.)
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den Code "Analysis_batch.m" auszuführen, um die Chiralität mehrerer zellulärer Ringmuster zu bestimmen. Es wird eine "datatoexcel.txt"-Datei generiert, die kreisförmige Statistiken für jeden Ring sowie die Anzahl der Ringe im Uhrzeigersinn, nicht-chiralen und gegen den Uhrzeigersinn enthält.
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Representative Results
Fünfzehn Minuten nach der Aussaat von NIH/3T3-Zellen wurde die Zelladhäsion auf dem Ringmuster durch Phasenkontrastbildgebung visuell bestätigt. Nach der anschließenden Kultur von 24 h wurden die Zellen auf den Mustern konfluent und verlängerten sich mit deutlich asymmetrischen Ausrichtungen, die in Richtung Uhrzeigersinn verzerrt waren (Abbildung 2). Die gerichtete Migration der angehängten Zellen wird durch Zeitraffer-Bildgebung aufgezeichnet, die Zellmotilität und die Morphogenese können mit weiteren Analysen des Videos quantifiziert werden. Zur Durchführung der Chiralitätsanalyse werden nach der Fixierung hochauflösende Phasenkontrastbilder aufgenommen (Abbildung 2A-C) und in das MATLAB-Programm eingespeist. Das Programm erkennt Intensitätsgradienten und berechnet entsprechende Zellausrichtungen auf dem Ring. Dann wird die Zellchiralität basierend auf der zirkulären Statistik der Zellausrichtung bestimmt, die von der Umfangsrichtung der Ringe abweicht. Die Zellen können daher als im Uhrzeigersinn (CW), gegen den Uhrzeigersinn (CCW) oder nicht-chiral (NC) bezeichnet werden (Abbildung 2D). Nach der Verarbeitung zeigte die Analyse, dass die Mehrheit der Ringe eine dominante CW-Verzerrung aufweist, was darauf hindeutet, dass 3T3-Zellen eine starke CW-Chiralität aufweisen. Generierte zirkuläre Statistiken liefern bei Bedarf auch zusätzliche Informationen über verzerrte Winkel für weitere Analysen (Abbildung 2E).
Die Zellchiralität hängt von ihrem Phänotyp ab. Es wurde nachgewiesen, dass der Ringchiralitätstest mit mehreren Zelltypen 7,8,9,10 kompatibel ist, einschließlich Zelllinien und Primärzellen wie Fibroblasten, Myoblasten, Endothelzellen und Stammzellen (Tabelle 1). Da die Zellchiralität aus den Funktionalitäten des Aktinzytoskeletts stammt, können Veränderungen in der Aktindynamik interessanterweise die chirale Verzerrung von Zellen beeinflussen. Mit Maus-Myoblasten-C2C12-Zellen fanden wir heraus, dass die Zellen durch die Störung der Aktinpolymerisation mit 50 nM Latrunculin A-Behandlung eine Veränderung der chiralen CCW-Bias in CW aufwiesen (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigten humane Nabelschnur-Gefäßendothelzellen (hUVECs), die mit einem niedermolekularen Wirkstoff, 12-o-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), zur Aktivierung der Proteinkinase c behandelt wurden, eine dosisabhängige Verschiebung der Zellchiralität von CW zu CCW (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse zeigen den experimentellen Nutzen des entwickelten Ringmuster-Chiralitäts-Assays sowie die Empfindlichkeit dieses Assays gegenüber Veränderungen im Zytoskelett.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der zellulären Mikrostrukturierung. (A) Verfahren der Mikrofabrikation und des Mikrokontaktdrucks für die Zellstrukturierung. Eine Negativ-Fotolackform wurde durch ultraviolette (UV) Vernetzung von Fotolack über eine Maske mit Mikrostrukturierungsmerkmalen (1-2) hergestellt. Polydimethylsiloxan (PDMS) elastomere Prepolymere wurden auf die Form gegossen, um Stempel zu erzeugen (3-4). Dann wurde eine klebende Selbstorganisations-Monoschicht (SAM), Octa-Decanethiol (C18), auf den Stempel aufgetragen und mittels Mikrokontaktdruck (5-7) auf vergoldete Glasobjektträger übertragen, gefolgt von der Beschichtung von nicht klebendem Ethylenglykol-terminiertem SAM, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) und Fibronektin (9). Die Zellen wurden dann gesät, um sie an die Muster zu binden (10). (B) Fotos zeigen die wichtigsten Schritte der Zellmikrostrukturierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Workflow der bildgebenden Analysen. (A) Bildersammlung. Erfassen Sie Phasenkontrastbilder jedes Rings. (B) Eingabe von Daten in das MATLAB-Programm durch Ausführen des Dateieinstellungsverzeichnisses und der Bildgröße "ROI_Selection.m". (C) Wählen Sie die Regionen von Interesse (ROIs) aus, indem Sie das Auswahlquadrat ziehen, um es an den Mobilfunkring anzupassen, und doppelklicken Sie, um dies zu bestätigen. (D) Bestimmen Sie die Zellausrichtung und die chiralen Verzerrungen, indem Sie die Datei "Analysis_Batch.m" ausführen. (E) Beispielausgaben mit einer Zusammenfassung der verzerrten Ringzahlen und zirkulären Statistiken für jeden Ring. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der Chiralität von Zellen unter medikamentöser Behandlung. (A) Phasenkontrastbilder und Chiralitätscharakterisierungsergebnisse von Maus-Myoblasten-C2C12-Zellen: Control (links) und 50 nM Latrunculin A behandelte Gruppen (rechts). Fette rote Schrift zeigt dominante Chiralität bei p < 0,05 nach Rangtest an. Maßstabsstäbe: 100 μm. (B) Phasenkontrastbilder und chirale Charakterisierungsergebnisse von humanen Nabelschnur-Gefäßendothelzellen (hUVECs) auf mikrostrukturierten Ringen: Kontroll- (links) und 30 nM TPA-behandelte Gruppen (rechts). Fette rote Schrift zeigt dominante Chiralität bei p < 0,05 nach Rangtest an. Maßstabsstäbe: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| CW voreingenommen | CCW voreingenommen |
| · NIH/3T3 Zellen (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · MC3T3-E1 Zellen (ATCC CRL-2593) | · Menschliche Skelettmuskelzellen (Lonza CC-2661) |
| · Herzfibroblasten der Ratte | · Eine menschliche Hautkrebs-Fibroblastenlinie (ATCC CRL-7762) |
| · Menschliche primäre Hautfibroblasten (ATCC PCS-201-012) | · Madin-Darby-Nierenepithelzellen des Hundes (ATCC CCL-34) |
| · Menschliche aus Fett gewonnene Stammzellen | |
| · Humane mesenchymale Stammzellen | |
| · Menschliche Nabelschnur-Gefäß-Endothelzellen (Lonza CC-2935) | |
| · Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns (Zellsysteme ACBRI-376) |
Tabelle 1. Chirale Verzerrungen verschiedener Zelltypen, die durch den Mikrostrukturierungsassay gekennzeichnet sind. CW: im Uhrzeigersinn; CCW: gegen den Uhrzeigersinn.
Ergänzende Datei 1: MATLAB-Codedateien zur Chiralitätscharakterisierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusätzliche Codierungsdateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der hier beschriebene ringförmige Musterungsassay bietet ein einfach zu bedienendes Werkzeug zur quantitativen Charakterisierung der multizellulären Chiralität, das in der Lage ist, äußerst zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen. Die schnelle Generierung identisch definierter Mikroumgebungen und die unvoreingenommene Analyse ermöglichen eine automatisierte Hochdurchsatzverarbeitung großer Proben. Dieses Protokoll diskutiert die Herstellung der Ringmikromuster, die Zellstrukturierung und die automatische Analyse der verzerrten Zellausrichtung und der Richtungsbewegung. Diese Methode ist kompatibel mit Lebendbildgebungstechniken zur Untersuchung der Zellmotilität und der chiralen Morphogenese und kann möglicherweise in andere Planformen für den Toxizitätsnachweis9 oder Arzneimittelscreening-Anwendungen integriert werden.
Es gibt ein paar zusätzliche Tipps zum Teilen. Zuerst muss der Stempel im Mikrokontaktdruckschritt auf der Goldseite des Glases hergestellt werden (es kann schwierig sein, ihn zu unterscheiden, nachdem das Substrat in Stücke geschnitten wurde), und Doppeldruck sollte vermieden werden. Zweitens können für die Zellen, die andere Proteine für die richtige Anheftung benötigen, die bevorzugten Proteine in Schritt 3.17 verwendet werden. Drittens sollte für die Zellkultur die Zelldichte nicht zu hoch sein, und die Zellen sollten nicht über den Zusammenfluss der Muster gezüchtet werden. Andernfalls könnten Zellen die innere Grenze durchbrechen und den Ring in einen festen Kreis füllen. Viertens, wenn Zellmuster nach der Aussaat gebrochen oder unvollständig sind, kann dies auf eine unvollständige Übertragung des C18-Musters während des Kontaktdrucks zurückzuführen sein (Schritte 3.7-3.8). Die PDMS-Stempel sollten auf Mängel untersucht werden. Etwas höhere Kraft beim Aufstempeln auf Dias kann ebenfalls hilfreich sein. Wenn sich Zellen schließlich ohne sichtbare Muster an der gesamten Oberfläche des Glasobjektträgers anlagern, kann die in Schritt 3.8 angewendete Kraft zu hoch sein, was dazu führt, dass die gesamte Oberfläche mit C18 gestempelt wird. Es ist auch möglich, dass die Dias defekt sind oder zu lange in PBS gelagert wurden. Muster von selbstorganisierenden Monolayern (d.h. C18 und EG3) sollten innerhalb eines Monats nach dem Druck verwendet werden.
Obwohl der vorgeschlagene Assay ein praktisches Werkzeug für eine robuste Chiralitätscharakterisierung bietet, gibt es einige Einschränkungen. Erstens ist der Musterungsassay nur mit adhärenten Zellen kompatibel. Die Chiralität von nicht adhärenten Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen, Adipozyten oder Nicht-Säugetierzellen, könnte möglicherweise mit der 3D-Matrigel-Doppelschichtmethode18,19 analysiert werden. Zweitens könnte bei Zelltypen, die eine natürliche Kopfsteinpflasterform haben und keine signifikante Dehnung aufweisen, die Analysegenauigkeit verringert werden. Die Chiralität dieser Zelltypen kann jedoch durch Live-Bildgebung und Verfolgung der Migrationsverzerrung7 charakterisiert werden. Schließlich ist der Mikrostrukturierungsassay eine Endpunktanalysemethode, die nicht für die langfristige Zellkultur vorgesehen ist. Experimente wie die medikamentöse Behandlung sollten 72 h nach dem Aussäen auf Muster nicht überschreiten. Für Anwendungen, die eine längere Behandlungszeit erfordern, sollten Sie eine Vorbehandlung der Zellen vor der Aussaat in Betracht ziehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 und NHBLI R01HL148104) finanziert. Leo Q. Wan ist Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), unterstützt von den Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wird durch das American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
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